JP2021007309A - 形質転換体およびそれを用いたd−乳酸の生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)エンテロコッカス・フェカリスのldhL1遺伝子を破壊する工程と、
(2)工程(1)で作製されたエンテロコッカス・フェカリスのldhL1遺伝子破壊株に、ldhD遺伝子の発現系、すなわちエンテロコッカス・フェカリスのldhL1遺伝子のプロモーター領域の下流にldhD遺伝子を融合させた遺伝子を導入する工程を有する。
ラクトバチルス・デルブリュッキー(Lactobacillus delbrueckii)のldhD遺伝子を用いて作製したプラスミドpAM-PldhL1-ldhDLDをエンテロコッカス・フェカリス OG1RF株由来のΔldhL1株に形質転換したΔldhL1(ldhDLD +)株およびエンテロコッカス・フェカリス W11株由来のΔldhL1株に形質転換したΔldhL1(ldhDLD +)株を使用した。
前培養には、ラクトースを含まないM17培地(M17lac−培地;Becton, Dickinson and Co.)を使用し、本培養には表1に示すMRS改変培地を使用した。いずれの培地にも少量のジメチルホルムアミドに溶解させたクロラムフェニコールを終濃度で20mg/Lになるように添加した。これらの培地成分を脱イオン水で溶解し、6.0mol/Lの塩酸水溶液でpHを7.5に調整後、121℃で15分間オートクレーブ滅菌を行った。pHの調整はpHメーター(pH Meter F-21;堀場製作所、京都)を用いた。
前培養として、M17lac−平板培地上に形成されたコロニーから菌体を白金耳によって同液体培地に接種し、好気条件下30℃で12時間培養した。その後、培養液を0.05%(v/v)の割合で本培養液1.0Lに接種して回分培養を72時間行った。本培養は、1.5L容のジャーファーメンター(MA−1000A;東京理化器械株式会社、東京)を用いて30℃、攪拌速度300rpmで行い、培養液にはエアーコンプレッサー(Aeration Unit MAU-1;東京理化器械株式会社)を用いて空気を1.0vvm(volume-culture/volume-Air minute)で供給した。培地のpHは、pHコントローラー(DJ−1023P;エイブル、東京)を用いて15mol/L水酸化カリウム水溶液を自動添加することで常に7.45〜7.50の間を示すように設定した。また、培養中には過剰な発泡を抑制するためにごく少量の消泡剤を適時添加した。
菌体濃度は培養液の濁度(OD600)を分光光度計(GENESYSTM 10S UV-Vis;サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、東京)により測定した。培養液中のグリセロール、D−乳酸、およびL−乳酸の濃度は、サンプルを遠心分離(4℃、15,000rpm、15分間)して得られた上清をBF−7バイオセンサ(王子計測、兵庫)に供して定量した。
エンテロコッカス・フェカリス OG1RF株由来のΔldhL1(ldhDLD +)株およびエンテロコッカス・フェカリス W11株由来のΔldhL1(ldhDLD +)株の生育と培地中のグリセロール、D−乳酸、L−乳酸の濃度の測定結果を図2に示す。図2の結果は、いずれのΔldhL1(ldhDLD +)株も培養開始から72時間で1.0mol/Lグリセロールを資化して0.90mol/L以上のD−乳酸を生産することを示した。OG1RF株はAmerican Type Culture Collectionから販売されているエンテロコッカス・フェカリス(ATCC[登録商標] 47077TM)であり、W11株は特許文献2において自然界から分離および同定されたエンテロコッカス・フェカリスである。OG1RF株およびW11株は、高濃度のグリセロール存在下において好気性乳酸生産を行うことがすでに非特許文献5で示されている。このことから、これらの結果は、本発明を用いることでグリセロールからD−乳酸のみを90%以上の変換効率で生産できること、さらに本発明で使用するエンテロコッカス・フェカリスはグリセロールから好気性乳酸生産を行うことができれば特に限定されないことを示した。
コントロールとして実施例1に記載したエンテロコッカス・フェカリス W11株由来のΔldhL1(ldhDLD +)株、検証用としてエンテロコッカス・フェカリス W11株由来のΔldhL1株にラクトバチルス・ペントーサスのldhD遺伝子を用いて作製したプラスミドpAM-PldhL1-ldhDを形質転換したΔldhL1(ldhDLP +)株およびエシェリヒア・コリのldhD遺伝子を用いて作製したプラスミドpAM-PldhL1-ldhDを形質転換したΔldhL1(ldhDEC +)株を使用した。
実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
培地中のグリセロール、D−乳酸、およびL−乳酸の定量は実施例1と同様にして行い、酢酸およびエタノールはF−kit(F. Hoffmann-La Roche Ltd.、Basel、Switzerland)を用いて、アセトインはGrundyらの方法(Mol Microbiol, 1993, vol.10, pp.259-271)に従って定量した。
ΔldhL1(ldhDLD +)株、ΔldhL1(ldhDLP +)株、ΔldhL1(ldhDEC +)株によって生産された代謝産物の組成を表2に示す。ΔldhL1(ldhDLP +)株およびΔldhL1(ldhDEC +)株は、ΔldhL1(ldhDLD +)株と同様に培養開始から72時間で1.0mol/Lグリセロールを資化して0.88〜0.94mol/LのD−乳酸を生産した。これらの結果は、プラスミドpAM-PldhL1-ldhDの作製に使用するldhD遺伝子として、微生物由来かつNADを補酵素として利用するD−乳酸デヒドロゲナーゼをコードしているldhD遺伝子であれば、特に限定されないことを示唆した。
実施例1に記載したエンテロコッカス・フェカリス W11株由来のΔldhL1(ldhDLD +)株を使用した。
前培養には、M17lac−培地(Becton, Dickinson and Co.)を使用し、本培養には表1に示したMRS改変培地および表3から表8に示す検証培地1〜6を使用した。培地の作製および調整は実施例1と同様にして行った。
前培養として、M17lac−平板培地上に形成されたコロニーから菌体を白金耳によってM17lac−液体培地に接種し、好気条件下30℃で12時間培養した。その後、前培養液を0.05%(v/v)の割合で本培養液40mLに接種して回分培養を48時間行った。本培養は、シリコ栓(信越ポリマー株式会社、東京)を用いて栓をした200mL容のバッフル付き三角フラスコを用いて30℃、140rpmで行った。培地のpHはコンパクトpHメーター(PH−11B;堀場製作所)を用いて測定し、8.0mol/L水酸化カリウム水溶液を用いて6時間おきにpH8.0に調整した。
実施例1と同様にして行った。
各培地で培養されたΔldhL1(ldhDLD +)株の生育(OD600)を図3および図4に示す。検証培地1を用いて培養されたΔldhL1(ldhDLD +)株の生育速度および最大細胞濃度(最大OD600)はMRS改変培地で培養されたΔldhL1(ldhDLD +)株のそれらとほとんど同等であった。このことは、酢酸ナトリウムおよびポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートの添加が不要であること、そしてクエン酸鉄アンモニウムは塩化アンモニウムで代替可能であることを示した。一方、検証培地1に含まれる肉エキスを省いた検証培地2を用いて培養されたΔldhL1(ldhDLD +)株の生育速度と最大細胞濃度は著しく低下したが、それらの低下は含まれる乾燥酵母エキスの量を倍加させた検証培地3を用いることで大幅に改善され、さらに最大細胞濃度は検証培地3に含まれる塩化アンモニウムの量を2.0g/Lから5.0g/Lまで増加させた検証培地4を用いることでMRS改変培地におけるそれを上回るまで向上した。ただし、図4に示すように、含まれる塩化アンモニウムの量を10g/Lまで増加させた検証培地5を用いてもΔldhL1(ldhDLD +)株の最大細胞濃度は検証培地4におけるそれと同等であった。肉エキスにはL−乳酸が含まれていることからD−乳酸生産用の培地成分としては不適切である。これらの結果は、肉エキスを乾燥酵母エキスと塩化アンモニウムで代替可能であることを示し、検証培地4が本発明で使用する最適培地のひとつであることを示唆した。また、pH緩衝剤として添加されているリン酸塩の濃度を0.2mol/Lから0.1mol/Lに低下させた検証培地6を用いると、ΔldhL1(ldhDLD +)株の生育と最大細胞濃度は大きく低下した。この結果は、pH調整の方法・頻度にかかわらず、培地に添加するリン酸塩の濃度は0.2mol/L以上が好適であることを示した。
実施例1に記載したエンテロコッカス・フェカリスW11株由来のΔldhL1(ldhDLD +)株を使用した。
前培養には、M17lac−培地(Becton, Dickinson and Co.)を使用し、本培養には表6に示した検証培地4を使用した。培地の作製および調整は実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
実施例1および2と同様にして行った。
ΔldhL1(ldhDLD +)株の生育と培地中のグリセロール、D−乳酸、L−乳酸の濃度の測定結果を図5に、生産された代謝産物の組成を表9に示す。図5が示すように、検証培地4を用いて培養されたΔldhL1(ldhDLD +)株は、1.0mol/Lグリセロールを72時間で資化して0.85mol/LのD−乳酸を生産した。このD−乳酸生産量は、実施例1で示したMRS改変培地を用いて培養されたΔldhL1(ldhDLD +)株が示すそれよりもやや低い。表9の結果は、この低下の原因は酢酸の生産量がやや増加したことに起因することを示した。なお、図5および表9のいずれの結果からも、培地中にL−乳酸の存在はほとんど認められなかった。これらの結果は、本発明における検証培地4の適性、すなわち検証培地4を使用してΔldhL1(ldhDLD +)株を培養すると若干のD−乳酸生産量の低下を伴うものの、MRS改変培地を用いた場合よりも高い光学純度でD−乳酸を生産することが可能であることを実証した。
実施例1に記載したエンテロコッカス・フェカリス W11株由来のΔldhL1(ldhDLD +)株を使用した。
前培養には、M17lac−培地(Becton, Dickinson and Co.)を使用し、本培養には実施例3の表6に示した検証培地4に含まれるグリセロール濃度を0.25mol/Lまたは0.50mol/Lに変更した培地をそれぞれ使用した。培地の作製および調整は実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。ただし、0.25mol/Lのグリセロールを含む検証培地4を用いた場合は24時間、0.05mol/Lのグリセロールを含む検証培地4を用いた場合は48時間培養を行った。
実施例1と同様にして行った。
各グリセロール濃度下で培養されたΔldhL1(ldhDLD +)株が生産したD−乳酸量を表10に示す。ΔldhL1(ldhDLD +)株によるグリセロールからD−乳酸への変換率は、培地に含まれるグリセロール濃度の上昇に伴って向上していき、0.50mol/L以上のグリセロールを含む培地で最大値である約85%を示した。これらの結果は、ΔldhL1(ldhDLD +)株によってグリセロールからD−乳酸を高効率で生産するには0.50mol/L以上のグリセロールを含む培地で培養を開始することが好適であることを示した。
実施例1に記載したエンテロコッカス・フェカリス W11株由来のΔldhL1(ldhDLD +)株を使用した。
前培養には、M17lac−培地(Becton, Dickinson and Co.)を使用し、本培養には実施例3の表6に示した検証培地4に含まれるグリセロールをバイオディーゼル廃液由来のそれに変更した培地を使用した。培地の作製および調整は実施例1と同様にして行った。なお、培地に添加したバイオディーゼル廃液からの廃棄グリセロールの分離は、上記の非特許文献5に記載の方法に従って行った。
実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
ΔldhL1(ldhDLD +)株の生育と培地中のグリセロール、D−乳酸、L−乳酸の濃度の測定結果を図6に示す。その生育およびグリセロール資化速度は、純粋なグリセロールを使用した結果(図5)と比較して若干低下した。それに伴ってD−乳酸の生産速度にも低下が認められたが、結果としてΔldhL1(ldhDLD +)株は1.0mol/L相当のグリセロールから0.80mol/LのD−乳酸を生産した。廃棄グリセロールを基質に用いた場合、純粋なグリセロールを基質に用いた場合と比較してエンテロコッカス・フェカリスの乳酸生産量が若干低下することはすでに非特許文献5で報告されている。これらは、ΔldhL1(ldhDLD +)株によってバイオディーゼル廃液由来の廃棄グリセロールからもD−乳酸を生産することが可能であることを示した。
実施例1に記載したエンテロコッカス・フェカリス W11株由来のΔldhL1(ldhDLD +)株を使用した。
前培養には、M17lac−培地(Becton, Dickinson and Co.)を使用し、本培養には実施例3の表6に示した検証培地4を使用した。培地の作製および調整は実施例1と同様にして行った。
前培養を実施例1と同様にして行った。本培養は攪拌速度200rpm、300rpmあるいは500rpmでそれぞれ行い、それ以外は実施例1と同様にして行った。培養液中の溶存酸素濃度はDOコントローラー(DJ−1033;エイブル)を用いて計測した。
実施例1と同様にして行った。
各撹拌速度条件下で培養されたΔldhL1(ldhDLD +)株の生育と培地中の溶存酸素濃度およびグリセロール濃度の測定結果を図7に、72時間後の培地中のD−乳酸の濃度を表11に示す。図7の結果は、撹拌速度300rpmでは生育期にあるΔldhL1(ldhDLD +)株の生物化学的酸素要求量(BDO;Biochemical oxygen demand)とほぼ同等の酸素量が、撹拌速度500rpmでは常にΔldhL1(ldhDLD +)株のBDOを上回る酸素量が培地に供給されていたのに対して、撹拌速度200rpmにおける酸素供給量は常にΔldhL1(ldhDLD +)株のBDOを下回っていたことを示した。続いてグリセロールの資化速度においては、撹拌速度300rpmまたは500rpmで培養されたΔldhL1(ldhDLD +)株は培養開始から72時間で1.0mol/Lのグリセロールを全て資化したのに対し、撹拌速度200rpmで培養されたΔldhL1(ldhDLD +)株が72時間で資化したグリセロール濃度はおよそ0.40mol/L程度であった。併せると、これらの結果は、ΔldhL1(ldhDLD +)株を用いてグリセロールからD−乳酸を生産するにはそのBDO以上の酸素の供給が必要であることを実証した。ただし、表11に示したように、攪拌速度500rpmで培養されたΔldhL1(ldhDLD +)株のD−乳酸生産量は300rpmで培養されたΔldhL1(ldhDLD +)株のそれよりもやや少なかった。この結果は、BDOを過剰に上回る酸素供給よりはBDOをやや上回る程度の酸素供給量の方が好ましいことを示した。
実施例1に記載したエンテロコッカス・フェカリスW11株由来のΔldhL1(ldhDLD +)株を使用した。
前培養には、M17lac−培地(Becton, Dickinson and Co.)を使用し、本培養には実施例3の表6に示した検証培地4を使用した。培地の作製および調整は実施例1と同様にして行った。
前培養を実施例1と同様にして行った。本培養の培地のpHはpHセンサー(DJ−1023P;エイブル)を用いて15mol/L水酸化カリウム水溶液を自動添加することで常に6.45〜6.50、7.45〜7.50、8.45〜8.50の間を示すようにそれぞれ設定し、それ以外は実施例1と同様にして行った。
実施例1および2と同様にして行った。
各pH条件下で培養されたΔldhL1(ldhDLD +)株によって生産された代謝産物の測定結果を表12に示す。pH7.5で培養されたΔldhL1(ldhDLD +)株と比較して酸性側(pH6.5)および塩基性側(pH8.5)で培養されたΔldhL1(ldhDLD +)株はいずれもグリセロールの資化速度が低下し、さらに酢酸やアセトインなどの代謝産物の生産量が増加した結果、D−乳酸の生産量は大きく低下した。これらの結果は、ΔldhL1(ldhDLD +)株によってグリセロールからD−乳酸を生産するには、pH 7.5付近が好適であることを示した。
実施例1に記載したエンテロコッカス・フェカリス W11株由来のΔldhL1(ldhDLD +)株を使用した。
前培養には、M17lac−培地(Becton, Dickinson and Co.)あるいは実施例3の表6に示した検証培地4を使用し、本培養には検証培地4のみを使用した。培地の作製および調整は実施例1と同様にして行った。
前培養を実施例1と同様にして行い、その前培養液を本培養液の濁度(OD600)が0.001、0.01あるいは0.1になるようにそれぞれ接種して回分培養を72時間行った。本培養は実施例1と同様にして行った。
実施例1および2と同様にして行った。
本培養開始時の菌体濃度を0.001、0.01、および0.1にそれぞれ調整されたΔldhL1(ldhDLD +)株によって生産された代謝産物の測定結果を表13に示す。前培養に用いた培地がM17lac−培地あるいは検証培地4にかかわらず、初期菌体濃度を0.01以下に設定して本培養を開始したΔldhL1(ldhDLD +)株はいずれもグリセロールを資化してD−乳酸を生産した。一方、初期菌体濃度を0.1に設定した場合、M17lac−培地で前培養されたΔldhL1(ldhDLD +)株はほとんどグリセロールを資化せず、D−乳酸をはじめとした各代謝産物も生産しなかった。これらの結果は、ΔldhL1(ldhDLD +)株によってグリセロールからD−乳酸を生産するには、本培養開始時の菌体濃度が0.01以下であることが好適であることを示した。
実施例1に記載したエンテロコッカス・フェカリス W11株由来のΔldhL1(ldhDLD +)株を使用した。
前培養には、M17lac−培地(Becton, Dickinson and Co.)を使用し、本培養には実施例3の表6に示した検証培地4を使用した。培地の作製および調整は実施例1と同様にして行った。
前培養を実施例1と同様にして行い、その前培養液を0.05%(v/v)の割合で本培養液0.8Lに接種して回分培養を行った。本培養は実施例1と同様にして行い、さらに菌株のグリセロールの資化に伴って培地総量の0.5molに相当する量のグリセロールを新たに添加した。
実施例1と同様にして行った。
ΔldhL1(ldhDLD +)株の生育と培地中のグリセロール、D−乳酸、L−乳酸の濃度の測定結果を図8に、生産された代謝産物の測定結果を表13に示す。ΔldhL1(ldhDLD +)株はその生育が定常期に達した48時間目以降もグリセロールの資化とD−乳酸の生産を続け、最終的に1.86mol/Lのグリセロールを資化して1.71mol/LのD−乳酸を生産した。なお、表14に示すように、グリセロールから生産されたL−乳酸は0.02mol/Lであった。これらの結果は、ΔldhL1(ldhDLD +)株を好適条件下で培養することで、98%以上の光学純度を示すD−乳酸をグリセロールから90%以上の変換効率で少なくとも1.71mol/L(157g/L)生産することが可能であることを実証した。
本実施例においては、エンテロコッカス・フェカリス由来のΔldhL1株にプラスミドpAM-PldhL1-ldhDを導入したΔldhL1(ldhD+)株のうち、特にW11株由来のΔldhL1(ldhDLD +)株を用いてグリセロールからD−乳酸を効率的に生産する方法を検討した。その結果、好適条件下、すなわちΔldhL1(ldhDLD +)株を菌体濃度0.01以下になるように接種した検証培地4を用いて、30℃、pH7.5、生育期の菌体のBDO以上の酸素供給下で培養することによって、1.8mol/L以上のグリセロールから90%以上の変換効率で98%以上の光学純度を示すD−乳酸を生産することが可能であることが明らかになった。
Claims (10)
- 主要なL−乳酸デヒドロゲナーゼ(ldhL1)遺伝子を破壊したΔldhL1株にプラスミドを用いてD−乳酸デヒドロゲナーゼ(ldhD)遺伝子の発現系を導入したΔldhL1(ldhD+)株であることを特徴とするエンテロコッカス・フェカリス。
- 前記ldhD遺伝子を発現させるために、当該エンテロコッカス・フェカリスは、その前記ldhL1遺伝子由来のプロモーター領域が用いられている請求項1に記載のエンテロコッカス・フェカリス。
- エンテロコッカス・フェカリスを用いてグリセロールからD−乳酸を生産することを特徴とする方法。
- 前記エンテロコッカス・フェカリスは、主要なL−乳酸デヒドロゲナーゼ(ldhL1)遺伝子を破壊したΔldhL1株にプラスミドを用いてD−乳酸デヒドロゲナーゼ(ldhD)遺伝子の発現系を導入したΔldhL1(ldhD+)株である請求項3に記載の生産方法。
- 前記LdhD遺伝子を発現させるために、前記エンテロコッカス・フェカリスの前記LdhL1遺伝子由来のプロモーター領域を用いる請求項4に記載の生産方法。
- 当該生産方法において、初発基質として0.5mol/L以上の前記グリセロールを添加して、生育期にある前記エンテロコッカス・フェカリスの生物化学的酸素要求量を満たす量の酸素を供給する請求項3ないし5のいずれか1項に記載の生産方法。
- 前記グリセロールは、バイオディーゼル廃液由来の廃棄グリセロールである請求項6に記載の生産方法。
- 当該生産方法において、ペプトン、乾燥酵母エキス、アンモニウム塩、およびリン酸緩衝液を含む培地を使用する請求項6または7に記載の生産方法。
- 前記培地は、そのpHが7.0以上8.0以下に保たれる請求項8に記載の生産方法。
- 前記培地中の前記グリセロール濃度の低下に伴って、新たに前記グリセロールを追加添加する請求項8または9に記載の生産方法。
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