CN111500517A

CN111500517A - 产l-乳酸的重组菌株及其构建方法和发酵产l-乳酸的方法及应用

Info

Publication number: CN111500517A
Application number: CN202010463397.3A
Authority: CN
Inventors: 佟毅; 李义; 张媛; 陈博; 王小艳; 安泰
Original assignee: Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd; Jilin COFCO Bio Chemical Co Ltd; Cofco Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd; Jilin COFCO Bio Chemical Co Ltd; Cofco Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-05-27
Filing date: 2020-05-27
Publication date: 2020-08-07
Anticipated expiration: 2040-05-27
Also published as: CN111500517B

Abstract

本发明涉及基因工程领域和微生物发酵领域，公开了一种产L‑乳酸的重组菌株及其构建方法和发酵产L‑乳酸的方法及应用，该重组菌株由出发菌株经遗传改造获得，相比于出发菌株，所述重组菌株的D‑乳酸脱氢酶的活性减弱或失活且L‑乳酸脱氢酶的活性增强；构建方法包括对出发菌株进行遗传改造以使出发菌株的D‑乳酸脱氢酶的活性减弱或失活并使出发菌株的L‑乳酸脱氢酶的活性增强；发酵产L‑乳酸方法包括将上述重组菌株接种前述的方法构建重组菌株，并将得到的重组菌株接种至产酸发酵培养基中进行发酵；采用该方法显著提高了发酵效果、以及L‑乳酸产率和和产物L‑乳酸的光学纯度。

Description

产L-乳酸的重组菌株及其构建方法和发酵产L-乳酸的方法及应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域和微生物发酵领域，具体涉及一种产L-乳酸的重组菌株及其构建方法和发酵产L-乳酸的方法及应用。

背景技术

聚乳酸(Polylactic acid，PLA)是一种由乳酸单体缩聚而成的可生物降解的高分子聚合物，主要是以微生物的发酵产物L-乳酸作为单体通过聚合反应而获得。PLA其原料为可再生的生物资源，因此是理想的绿色高分子材料，并且被产业界一致认定为新型“生物基材料”。此外，由PLA制成的产品的光泽度、透明性、手感和耐热性好，还具有一定的耐菌、阻燃和抗紫外的特性，并具有较高的光泽度和加工性能；PLA还具有无毒、无刺激性和良好的生物相容性等特点。因此，PLA具有广阔的市场前景，用途十分广泛。目前聚乳酸主要用于服装、建筑、农业、林业、造纸和医疗卫生等多个领域中。

聚乳酸主要包括聚L-乳酸(PLLA)、聚D-乳酸(PDLA)和聚DL-乳酸(PDLLA)三种。由于人和许多哺乳动物只能代谢L-乳酸，因此L-乳酸被专门用于食品、医药、兽药和饲料工业，作为生产原料或产品添加剂。更具体而言，以光学纯度大于98％的L-乳酸为原料聚合而成的聚乳酸材料，更引起人们的重视，对工农业生产和人民的生活均具有更重要的意义。迄今为止，L-乳酸主要通过化学合成法和微生物发酵法获得。化学合成法存在环境污染、成本昂贵、技术复杂、光学纯度较低等棘手问题，难以满足实际应用要求。相比之下，微生物发酵法利用葡萄糖等可再生资源为原料生产L-乳酸，具有生产成本低、产物光学纯度和安全性高、生产条件温和、污染小等优点，因此，目前全世界的L-乳酸工业生产绝大部分都是通过微生物发酵法进行的。大多数乳酸菌均是同时生产L-乳酸和D-乳酸，但L-乳酸的产率和光学纯度难以满足实际需求。

目前，在通过微生物发酵法大规模工业生产L-乳酸时，可选择的菌株仍然十分有限，已知的L-乳酸发酵生产中常采用的生产菌株有凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、干酪乳杆菌菌株(Lactobacillus casei)和鼠李糖乳杆菌菌株(Lactobacillusrhamnosus)等。因此需要进一步选育高产菌株，不断发掘新菌种，以期实现产量增加、纯度提高、成本降低、效益提高等目标。对于乳酸发酵菌株的筛选和改造，主要聚焦于如下三个方面：高产菌株的获得；耐环境胁迫菌株的选育；以及转基因工程菌株的构建。

其中，增强乳酸发酵菌株对环境胁迫的抵抗能力是提高乳酸发酵能力的重要手段之一。已有研究表明，通过提高乳酸乳杆菌菌株(Lactobacillus lactis)的耐高糖浓度和耐高乳酸钙浓度的能力，可以提高其乳酸产量和产物光学纯度；通过提高鼠李糖乳杆菌菌株的耐酸和耐糖能力，可以提高其乳酸产量和生物量。就此而言，在乳酸发酵工业中，耐高温菌株可以带来极大的优势，例如，利用耐高温菌株可以达到缩短生产周期、减少发酵生产中控温所需的能耗、节约冷却用水以及减少杂菌污染的可能性等有益效果。另一方面，采用基因工程手段对高产菌株进行改造以进一步提高其产酸效率或产物光学纯度等性能，从而获得符合期望的有用菌株也是本领域始终在追求的目标。

因此，对于能够以高产率和高光学纯度生产L-乳酸的耐高温重组L-乳酸生产菌株而言，目前还存在极大的改善空间。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的微生物发酵得到的L-乳酸产率和光学纯度较低问题，提供一种产L-乳酸的重组菌株及其构建方法和发酵产L-乳酸的方法，该重组菌株用于发酵产L-乳酸具有较高的L-乳酸产率和产物L-乳酸光学纯度，以及发酵成本较低、可缩短生产周期、减少发酵生产中控温所需的能耗、节约冷却用水、减少杂菌污染以及环境友好的优势。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种产L-乳酸的重组菌株，其中，该重组菌株由出发菌株经遗传改造获得，相比于出发菌株，所述重组菌株的D-乳酸脱氢酶的活性减弱或失活且L-乳酸脱氢酶的活性增强。

本发明第二方面提供一种构建重组菌株的方法，其中，该方法包括：对出发菌株进行遗传改造以使出发菌株的D-乳酸脱氢酶的活性减弱或失活并使出发菌株的L-乳酸脱氢酶的活性增强。

本发明第三方面提供一种发酵产L-乳酸的方法，其中，该方法包括：将如前所述的重组菌株接种至产酸发酵培养基中进行发酵；

或者，按照如前所述的方法构建重组菌株，并将得到的重组菌株接种至产酸发酵培养基中进行发酵。

第四方面，本发明提供了如前所述的重组菌株或如前所述的方法在制备L-乳酸或聚L-乳酸中的应用。

通过上述技术方案，本发明能够有效提高提高L-乳酸的产量。而且，本发明的发酵成本较低、可缩短生产周期、减少发酵生产中控温所需的能耗、节约冷却用水、减少杂菌污染以及环境友好。

在本发明最优选实施方式中，重组鼠李糖乳杆菌菌株Lr-ALTHT-DBC和重组鼠李糖乳杆菌菌株Lr-ALTHT-DLC发酵48h得到的发酵液中乳酸含量分别为216g/L和215.3g/L，糖酸转化率为97％和96.5％，L-乳酸光学纯度为99.8和99.5％，更加显著提高了发酵效果，以及L-乳酸产率和产物L-乳酸的光学纯度。

生物保藏

本发明的鼠李糖乳杆菌Lr-ALTHT-DBC，于2020年3月25日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.19507。

本发明的鼠李糖乳杆菌Lr-ALTHT-DLC，于2020年3月25日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.19508。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明使用的术语“增加”、“提高”、“增强”或“活化”通常都意味着统计学显著量的增加。然而，为避免疑义，术语“增加”、“提高”、“增强”或“活化”表示相比参比水平(例如出发菌株中的水平)增加至少10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或上至并包括增加100％、或相比参比水平增加在10％到100％之间的任意量；或相比参比水平至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的增加、或在2倍和10倍之间的任意量的增加、或是更大量的增加。

本发明使用的术语“减弱”或“失活”指的是酶催化反应的能力降低至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％、或完全失去催化反应的能力。

第一方面，本发明提供了一种产L-乳酸的重组菌株，其中，该重组菌株由出发菌株经遗传改造获得，相比于出发菌株，所述重组菌株的D-乳酸脱氢酶的活性减弱或失活且L-乳酸脱氢酶的活性增强。

本发明中，优选地，所述出发菌株是鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，更优选是保藏编号为CGMCC No.16834的鼠李糖乳杆菌，该菌株已在CN109628339A中公开。

本发明中，为了提高所述重组菌株的L-乳酸产率和产物L-乳酸的光学纯度，优选地，所述重组菌株中的至少部分D-乳酸脱氢酶基因被敲除。更优选地，敲除的D-乳酸脱氢酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。进一步优选地，敲除的D-乳酸脱氢酶基因的序列如SEQ ID NO：16所示。本发明的发明人发现，敲除出发菌株是鼠李糖乳杆菌CGMCCNo.16834中编码序列如SEQ ID NO：15所示的D-乳酸脱氢酶的基因能够更加显著的提高发酵产物L-乳酸的光学纯度。

和/或，所述重组菌株中含有编码凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)的L-乳酸脱氢酶的基因和/或编码干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的L-乳酸脱氢酶的基因。

本发明的发明人研究发现，所述重组菌株中的至少部分D-乳酸脱氢酶基因被敲除，和所述重组菌株中含有编码凝结芽孢杆菌的L-乳酸脱氢酶的基因和/或编码干酪乳杆菌的L-乳酸脱氢酶的基因，可进一步提高L-乳酸的产率和光学纯度。

进一步优选地，所述重组菌株中的至少部分D-乳酸脱氢酶基因被敲除从而使得所述重组菌株中的敲除的D-乳酸脱氢酶基因被替换为编码凝结芽孢杆菌的L-乳酸脱氢酶的基因和/或编码干酪乳杆菌的L-乳酸脱氢酶的基因。

敲除即基因敲除，指的是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。

本发明中，优选地，所述重组菌株中含有编码氨基酸序列如SEQ ID NO：11和/或SEQ ID NO：13所示的L-乳酸脱氢酶的基因。

优选地，所述重组菌株中含有基因序列如SEQ ID NO：12和/或SEQ ID NO：14所示的L-乳酸脱氢酶基因。

根据本发明优选的实施方式，所述重组菌株的保藏编号为CGMCC No.19507或CGMCC No.19508。

第二方面，本发明提供了一种构建重组菌株的方法，其中，该方法包括：对出发菌株进行遗传改造以使出发菌株的D-乳酸脱氢酶的活性减弱或失活并使出发菌株的L-乳酸脱氢酶的活性增强。

本发明中，优选地，所述出发菌株是鼠李糖乳杆菌，更优选是保藏编号为CGMCCNo.16834的鼠李糖乳杆菌，该菌株已在CN109628339A中公开。

本发明中，优选地，使出发菌株的D-乳酸脱氢酶的活性减弱或失活的方式为基因敲除。更优选地，敲除的D-乳酸脱氢酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。进一步优选地，敲除的D-乳酸脱氢酶基因的序列如SEQ ID NO：16所示。

和/或，使出发菌株的L-乳酸脱氢酶的活性增强的方式为外源引入凝结芽孢杆菌的L-乳酸脱氢酶基因和/或干酪乳杆菌的L-乳酸脱氢酶基因。

本发明的发明人研究发现，通过基因敲除所述重组菌株中的至少部分D-乳酸脱氢酶基因，和外源引入凝结芽孢杆菌的L-乳酸脱氢酶基因和/或干酪乳杆菌的L-乳酸脱氢酶基因，可进一步提高L-乳酸的产率和光学纯度。

进一步优选地，通过基因敲除所述重组菌株中的至少部分D-乳酸脱氢酶基因使得所述重组菌株中敲除的D-乳酸脱氢酶的基因被替换为编码凝结芽孢杆菌的L-乳酸脱氢酶的基因和/或编码干酪乳杆菌的L-乳酸脱氢酶的基因。

本发明中，优选通过基因敲除的方式敲除鼠李糖乳杆菌的基因组中的特定开放阅读框序列或启动子序列。

本发明中，所述基因敲除使用的同源序列片段可以通过如下方式获得：根据本领域公知的数据库(例如GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/))中公开的鼠李糖乳杆菌中的靶基因(例如ldhD基因)上下游片段序列进行人工合成作为同源臂；或者利用PCR的方法从出发菌株(如鼠李糖乳杆菌CGMCC No.16834)的基因组上扩增靶基因的上下游片段序列作为同源臂，从而获得靶基因的初始同源序列片段，但本发明不限于此。靶基因的部分或全部初始同源序列是指含有上述靶基因的序列。同源敲入使用的外源基因序列片段(涉及例如同源敲入凝结芽孢杆菌的Bcldh基因和干酪乳杆菌的LcldhL基因)也可通过类似的方式获得，但本发明不限于此。

同源敲入即基因敲入指的是利用基因同源重组，将外源有功能基因(目标细胞的基因组原先不存在、或已失活的基因)，转入细胞后与该细胞基因组中的同源序列进行同源重组，插入到基因组中，在细胞内获得表达的技术。

可以理解的是，在对靶基因进行敲除的同时伴随着外源基因序列片段的敲入。

本发明中，可以先构建重组载体，该重组载体能够将出发菌株(如鼠李糖乳杆菌CGMCC No.16834)的D-乳酸脱氢酶基因敲除，并外源引入L-乳酸脱氢酶基因。该重组载体可在大肠杆菌中复制，在乳酸菌中的复制由温度控制，并且具有可用于大肠杆菌和植物乳杆菌中的红霉素和氯霉素抗性基因，以及用于大肠杆菌和鼠李糖杆菌中的氯霉素抗性基因。本领域已知构建重组载体的各种方法，以用来将目的基因片段连接至表达载体来制备重组载体，例如但不限于，经典的“酶切-连接”方法、Invitrogen公司开发的Gateway克隆系统、Clontech公司开发的Creator克隆系统、Stephen Elledge实验室开发的Univector克隆系统以及基于IIs型限制性内切酶的Golden Gate克隆法(诸如，采用ThermoFisher提供的GeneArt Type IIs Assembly Kits试剂盒)。

例如，可采用重组酶方法构建得到本发明的重组载体：基于出发菌株(如鼠李糖乳杆菌CGMCC No.16834)的基因组，采用PCR方法扩增得到靶向插入部位的上下游同源臂序列；将待插入基因序列、上下游同源臂序列及抗性基因表达盒等串联连接，得到重组载体，但本发明不限于此。

随后，可采用本领域的常规方法将该重组载体导入出发菌株(如鼠李糖乳杆菌CGMCC No.16834)中，例如但不限于显微注射、基因枪、转化(例如电转化)、感染或转染。上述显微注射、基因枪、转化、感染或转染均为本领域常规操作。例如，转化是指通过采用分子生物学和基因工程中的一些已知方法处理细胞，使经处理后的细胞处于感受态，并由此与外源DNA接触，从而使外源DNA进入处于感受态的细胞中。常用的转化方法包括原生质体转化法、化学转化法和电穿孔转化法。感染是指用经人工改造的噬菌体活病毒作载体，将该载体与目的DNA序列重组后，在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA包装成有活力的噬菌体或病毒，从而以感染的方式使重组DNA进入宿主细胞中。转染是指通过CaCl₂、电穿孔等方法将细胞处理成感受态细胞，然后使该感受态细胞接受重组的噬菌体DNA。

在将重组载体导入出发菌株(如鼠李糖乳杆菌CGMCC No.16834)中之后，可通过筛选标记(例如抗性基因)筛选出阳性克隆，并通过基因组PCR进行验证、或者通过对基因组DNA测序进行验证，从而得到所述的产L-乳酸的重组菌株。

本发明中，优选地，使出发菌株的L-乳酸脱氢酶的活性增强的方式为外源引入编码氨基酸序列如SEQ ID NO：11和/或SEQ ID NO：13所示的L-乳酸脱氢酶的基因。

更优选地，使出发菌株的L-乳酸脱氢酶的活性增强的方式为外源引入基因序列如SEQ ID NO：12和/或SEQ ID NO：14所示的L-乳酸脱氢酶基因。

第三方面，本发明提供了一种发酵产L-乳酸的方法，其中，该方法包括：将如前所述的重组菌株接种至产酸发酵培养基中进行发酵；

本发明中，优选地，先将所述重组菌株制备成种子液，然后将所述种子液接种至产酸发酵培养基中进行发酵，得到发酵液。

本发明中，所述种子液的OD₆₀₀的值达到5以上，表明菌株生长正常，为了提高发酵效果，优选地，所述种子液中的OD₆₀₀为10-15。

其中，OD₆₀₀指的是种子液在分光光度计中在600nm波长处的吸光值。

本发明中，优选地，所述种子液的制备方法包括：挑取所述重组菌株的单菌落接种于种子培养基中进行种子培养，得到所述种子液。

本发明中，对所述种子培养基没有特别的限制，可以为本领域常规使用的用于制备鼠李糖乳杆菌种子液的种子培养基，优选地，所述种子培养基为MRS液体培养基。

优选地，所述种子培养的条件包括：转速为100-180rpm，更优选为120-150rpm；温度为37-40℃；时间为12-24h。

优选地，所述重组菌株的单菌落可以选自新鲜制备的所述重组菌株或低温冻存的所述重组菌株(例如在甘油冻存管中冻存于例如-80℃冰箱中的L-乳酸生产菌株)。

本发明中，对所述发酵的方法没有特别的限制，可以为本领域常规使用的发酵产L-乳酸的方法，例如将所述种子液接种至所述产酸发酵培养基中(例如装有所述产酸发酵培养基的摇瓶或发酵罐中)进行发酵培养得到发酵液。

本发明中，为了提高L-乳酸的产率，优选地，相对于100体积份的所述产酸发酵培养基，所述种子液的接种量为5-10体积份。

本发明中，为了提高L-乳酸的产率，优选地，所述发酵的条件包括：先在转速为100-180rpm，优选为120-150rpm，温度为37-40℃下，发酵4-6h，优选为5-6h；然后在转速为100-180rpm，优选为120-150rpm，温度为42-48℃，更优选45-48℃，进一步优选为46-48℃下，发酵40-44h，优选为42-44h，得到发酵液。

本发明中，优选地，所述产酸发酵培养基包含葡萄糖、有机氮源(例如酵母提取物)、乙酸钠、磷酸盐、微量元素和中和剂。

更优选地，相对于1L所述产酸发酵培养基，所述产酸发酵培养基包含：葡萄糖160-200g/L、酵母提取物8-12g/L、乙酸钠1-3g/L、KH₂PO₄0.3-0.7g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5-1g/L、MnSO₄ 0.1-0.2g/L、吐温80 0.5-1.5ml/L和中和剂。

本发明中，优选地，所述产酸发酵培养基中中和剂的含量与葡萄糖含量的重量比值不小于0.5，更优选为0.5-0.7:1。

本发明的优选实施方式中，所述中和剂选自CaCO₃、NaOH和Ca(OH)₂中的至少一种，优选为CaCO₃。

本发明中，更优选地，相对于1L所述产酸发酵培养基，所述产酸发酵培养基包含：葡萄糖180-200g/L、酵母提取物9-11g/L、乙酸钠1.5-2.5g/L、KH₂PO₄0.4-0.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5-1g/L、MnSO₄ 0.1-0.2g/L、吐温800.8-1.2ml/L以及CaCO₃ 90-100g/L。但本发明并不限于此。

本发明中，可以通过已知的方法分离所得发酵液中的L-乳酸，例如，先将所述发酵液中的细胞除去，然后将除去细胞后的发酵液进行浓缩使产物结晶，或进行离子交换层析等诸如此类的方法分离L-乳酸。

本发明中，还可以通过已知方法对所述发酵液中的L-乳酸或从所述发酵液中分离得到的L-乳酸进行检测。例如，可以通过高效液相色谱法和诸如此类的方法来对L-乳酸的产量和光学纯度进行检测。

第四方面，本发明提供了上述的重组菌株或上述的方法在制备L-乳酸或聚L-乳酸中的应用。

SEQ ID NO：11

MKKVNRIAVVGTGAVGTSYCYAMINQGVAEELVLIDINEAKAEGEAMDLNHGLPFAPTPTRVWKGDYSDCGTADLVVITAGSPQKPGETRLDLVAKNAKIFKGMIKSIMDSGFNGIFLVASNPVDILTYVTWKESGLPKEHVIGSGTVLDSARLRNSLSAHFGIDPRNVHAAIIGEHGDTELPVWSHTTIGYDTIESYLQKGTIDQKTLDDIFVNTRDAAYHIIERKGATFYGIGMSLTRITRAILNNENSVLTVSAFLEGQYGNSDVYIGVPAVINRQGVREVVEIELNDKEQEQFSHSVKVLKETMAPVL

SEQ ID NO：12

Gene ID：11173582

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SEQ ID NO：13

MASITDKDHQKVILVGDGAVGSSYAYAMVLQGIAQEIGIVDIFKDKTKGDAIDLSNALPFTSPKKIYSAEYSDAKDADLVVITAGAPQKPGETRLDLVNKNLKILKSIVDPIVDSGFNGIFLVAANPVDILTYATWKLSGFPKNRVVGSGTSLDTARFRQSIAEMVNVDARSVHAYIMGEHGDTEFPVWSHANIGGVTIAEWVKAHPEIKEDKLVKMFEDVRDAAYEIIKLKGATFYGIATALARISKAILNDENAVLPLSVYMDGQYGLNDIYIGTPAVINRNGIQNILEIPLTDHEEESMQKSASQLKKVLTDAFAKNDIETRQ

SEQ ID NO：14

Gene ID：31583240

Atggcaagtattacggataaggatcaccaaaaagttattctcgttggtgacggcgccgttggttcaagttatgcctatgcaatggtattgcaaggtattgcacaagaaatcgggatcgttgacatttttaaggacaagacgaagggtgacgcgattgacttatcgaacgcgctgccattcaccagcccaaagaagatttattcagctgaatacagcgatgccaaggatgctgatctggttgttatcactgctggtgctcctcagaagccaggcgaaacccgcttggatctggttaacaagaacttgaagatcttgaagtccattgttgatccgattgtggattctggctttaacggtatcttcttggttgctgccaacccagttgatatcttgacctatgcaacttggaaactttccggcttcccgaagaaccgggttgttggttcaggtacttcattggataccgcacgtttccgtcagtccattgctgaaatggttaacgttgatgcacgttcggtccatgcttacatcatgggtgaacatggtgacactgaattccctgtatggtcacacgctaacatcggtggcgttactattgccgaatgggttaaagcacatccggaaatcaaggaagacaagcttgttaagatgtttgaagacgttcgtgacgctgcttacgaaatcatcaaactcaagggcgcaaccttctatggtatcgcaactgctttggcacgtatctccaaggctatcctgaacgatgaaaatgctgttctgccactgtccgtttacatggatggtcaatatggcttgaacgacatctacatcggtaccccagctgtgatcaaccgaaatggtatccagaacattctggaaattccattgaccgaccacgaagaggaatccatgcagaaatctgcttcacaattgaagaaggttctgactgatgccttcgcgaagaacgacatcgaaacccgtcagtaa

SEQ ID NO：15

MKIIAYGARVDEIQYFKQWAKETGNTLEYHTEFLDEHTVEWAKGFDGINSLQTTPYAAGVFEKMHEYGIKFLTIRNVGTDNIDMTAMKKYGIRLSNVPAYSPAAIAEFALTDTLYLLRNMGKVQAQLHAGDYEKASTFIGKELGQQTVGVMGTGHIGRVAIKLFKGFGAKVIAYDPYPMKGDHPDFEYVSLEELFKQSDIIDLHVPGIKQNTHIINEAAFDLMKPGAIVINTARPNLIDTQAMLSNLKSGKLAGVGIDTYEYETEDLLNLAKHGSFKDPLWDELLAMPNVVLSPHIAYYTETAVHNMVYFSLQNLVDFLTRGETNTEVTAPAK

SEQ ID NO：16

Gene ID：8422578

ATGAAGATTATTGCATATGGTGCACGCGTGGATGAGATCCAATATTTCAAACAGTGGGCTAAGGAAACCGGCAACACGCTGGAATATCATACGGAATTTCTTGATGAGCATACCGTTGAATGGGCAAAGGGATTTGACGGCATTAACTCACTACAAACGACGCCATACGCAGCTGGTGTGTTTGAAAAAATGCACGAATATGGCATCAAGTTTCTCACCATCCGCAATGTCGGAACCGACAATATCGATATGACGGCGATGAAAAAATACGGCATTCGCTTAAGTAATGTTCCGGCGTATTCACCGGCTGCCATTGCTGAATTTGCGCTAACCGATACGTTATATCTACTTCGCAACATGGGAAAGGTTCAAGCACAGCTACATGCAGGCGACTACGAAAAAGCCAGCACCTTCATCGGCAAAGAACTTGGTCAGCAAACAGTCGGCGTGATGGGGACCGGACACATTGGCCGCGTTGCCATCAAGCTCTTCAAAGGTTTTGGTGCCAAAGTGATTGCTTACGATCCATATCCGATGAAAGGCGATCATCCGGACTTTGAATATGTCAGCTTGGAAGAACTATTCAAACAAAGTGACATCATTGATCTTCACGTTCCGGGCATTAAACAAAATACCCACATTATCAACGAGGCCGCGTTTGATCTTATGAAGCCAGGCGCGATCGTAATTAACACCGCGCGGCCGAACCTGATTGATACCCAGGCGATGCTCAGCAACCTGAAGTCCGGTAAACTGGCCGGCGTCGGAATCGATACGTACGAATACGAAACCGAAGATCTGTTGAACCTCGCCAAACACGGTAGCTTCAAGGATCCGTTATGGGATGAACTGCTCGCGATGCCAAATGTTGTTCTCAGCCCGCATATTGCGTACTACACAGAAAACCGCCGTGCACAACATGGTTTACTTCTCACTGCAGAATTTAGTCGACTTTTTGACAAGGGGAGAGACGAATACTGAAGTGACAGCACCGGCGAAATAA

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。但这些实施例仅用于说明本发明而不用来限制本发明的范围。以下实施例中，除非另有说明，所使用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法，例如可利用下列文献资料中描述的标准程序来实施：‘Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，USA(2001)’；‘Davis等，Basic Methods in MolecularBiology，Elsevier Science Publishing，Inc.，New York，USA(1995)’；以及‘CurrentProtocols in Cell Biology(CPCB)(Juan S.Bonifacino等著，John Wiley and Sons，Inc.)’。

除非特别说明，所用试剂、培养基均为市售商品，所用方法均为常规方法。

重组鼠李糖杆菌菌株Lr-ALTHT-DBC的保藏编号为CGMCC No.19507；

重组鼠李糖杆菌菌株Lr-ALTHT-DLC的保藏编号为CGMCC No.19508；

1、培养基与试剂

MRS+CaCO₃平板：MRS固体培养基+10g/L CaCO₃；

高糖MRS+CaCO₃平板：MRS固体培养基+10g/L CaCO₃+180g/L葡萄糖；

筛选培养基：MRS液体培养基+10g/L CaCO₃；

MRS液体培养基：蛋白胨10g、酵母浸粉5g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸二铵2g、无水乙酸钠5g、硫酸锰0.25g、硫酸镁0.58g、吐温80 1mL、蒸馏水1000mL，pH6.5，121℃灭菌20min；

MRS固体培养基：在上述MRS液体培养基中添加琼脂，相对于1000mL蒸馏水，琼脂的用量为18g，调节pH为6.5，121℃灭菌20min；

产酸发酵培养基：葡萄糖180g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠2g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、MnSO₄ 0.2g/L、吐温80 1ml/L、CaCO₃90 g/L。

2、乳酸含量通过高效液相色谱法进行检测：

色谱仪：Agilent Technologies 1260Infinity II；

检出器：RID；

分离柱：Aminex HPX-87H Column 300×7.8mm；

流动相：0.05M硫酸；

流量：0.5mL/min；

进样量：20μL；

乳酸保留时间为14min左右。

3、葡萄糖和L-乳酸的含量通过生物传感器进行检测：

仪器：SBA-40E型生物传感器；

酶膜：D-葡萄糖酶膜和L-乳酸酶膜；

进样量：25μL。

4、乳酸的光学纯度通过高效液相色谱法进行检测：

色谱仪：Agilent Technologies 1260 Infinity；

检出器：波长254nm，灵敏度0.32AUFS；

分离柱：MCI GEL-CRS10 W(3u)4.6ID×50mm；

流动相：0.002M硫酸铜；

流量：0.5mL/min；

进样量：20μL。

将样品稀释至总乳酸浓度为0.5-1g/L再进行检测。D-乳酸保留时间为11min左右，L-乳酸保留时间为13min左右，根据其峰面积计算L-乳酸的光学纯度。

糖酸转化率的计算公式为：发酵结束时刻的乳酸总质量/初始的葡萄糖质量。

5、repA mut基因序列：(SEQ ID NO：17，下划线部分为突变后的基因序列)

atggctattaaaaatactaaagctagaaattttggatttttattatatcctgactcaattcctaatgattggaaagaaaaattagagagtttgggcgtatctatggctgtcagtcctttacacgatatggacgaaaaaaaagataaagatacatggaataatagtaatattatacaaaatggaaagcactataaaaaaccacactatcacgttatatatattgcacgaaatcctgtaacaatagaaagcgttaggaacaagattaagcgaaaattggggaatagttcagttgctcatgttgagatacttgattatatcaaaggttcatatgaatatttgactcatgaatcaaaggacgctattgctaagaataaacatatatacgacaaaaaagatattttgaacattaatgattttgatattgaccgctatataacacttgatgaaagccaaaaaagagaattgaagaatttacttttagatatagtggatgactataatttggtaaatacaaaagatttaatggcttttattcgccttaggggagcggagtttggaattttaaatacgaatgatgtaaaagatattgtttcaacaaactctagcgcctttagattatggtttgagggcaattatcagtgtggatatagagcaagttatgcaaaggttcttgatgctgaaacgggggaaataaaatga

实施例1

重组质粒构建

基因敲除质粒构建：分别扩增大肠杆菌复制子p15Aori(序列来自商业载体pACYC)、红霉素抗性基因(序列来自商业载体pMG36e)、repA mut基因(序列来自载体pWV01，参见‘Maguin E¹，Duwat P，Hege T，Ehrlich D，Gruss A.New thermosensitive plasmidfor gram-positive bacteria，Journal of bacteriology，1992Sep；174(17):5633-8’；repA mut基因中的突变基因序列(下划线部分的序列)使其对温度敏感)，使用DNAAssembly重组试剂盒(购于Transgen公司)组装成为基因敲除质粒pNZ5319TS。该基因敲除质粒可在大肠杆菌中复制，不可在乳酸菌中复制，并且具有可用于大肠杆菌和植物乳杆菌中的红霉素和氯霉素抗性基因。

基因替换质粒构建：

(1)通过PCR方法获得待敲除基因ldhD(Gene ID：8422578)上、下游各1000bp序列，同时分别加入SacI和SphI酶切位点(序列扩增自鼠李糖乳杆菌菌株CGMCC No.16834的基因组)，合成待替换基因凝结芽孢杆菌菌株的BcldhL基因(Gene ID：11173582序列扩增自凝结芽孢杆菌的基因组)和干酪乳杆菌菌株的LcldhL基因(Gene ID：31583240序列扩增自干酪乳杆菌的基因组)。

(2)将ldhD上游扩增片段、BcldhL基因片段或LcldhL基因片段、ldhD下游扩增片段使用重叠延伸扩增的方法将三个片段依次连接，得到待替换片段ldhD-BcldhL和ldhD-LcldhL。

(3)使用SacI和SphI双酶切获得待插入基因的片段；将前面构建的pNZ5319TS质粒同样用SacI和SphI双酶切获得具有氯霉素抗性基因的片段。

(4)将经过同样双酶切并纯化后的载体和基因片段连接后获得基因替换质粒。该基因替换质粒可在大肠杆菌中复制，不可在乳酸菌中复制，并且具有可用于大肠杆菌和鼠李糖杆菌中的氯霉素抗性基因。为将ldhD基因替换为凝结芽孢杆菌的BcldhL基因和干酪乳杆菌的LcldhL基因，分别构建了pNZ5319TS-ldhD-BcldhL和pNZ5319TS-ldhD-LcldhL两个基因替换质粒。

ldhD-BcldhL片段扩增：

ldhD-BcldhL-up-F

ATGAGCTCGGCACCTTGAACAGTGTAACCA(SEQ ID NO.1)

ldhD-BcldhL-up-R：

CCACTGCAATACGATTGACCTTTTTCATATTCTCAATATCTCCTTGATTTCGATTTGTCC(SEQ IDNO.2)

ldhD-BcldhL-bc-F

GGACAAATCGAAATCAAGGAGATATTGAGAATATGAAAAAGGTCAATCGTATTGCA GTG G(SEQ IDNO.3)

ldhD-BcldhL-bc-R：

TGCTTATTTTTGCAGCTTAAAGGATCCTTACAATACAGGTGCCATCGTTTCTTTT(SEQ ID NO.4)

ldhD-BcldhL-down-F

AAAAGAAACGATGGCACCTGTATTGTAAGGATCCTTTAAGCTGCAAAAATAAGCA(SEQ ID NO.5)

ldhD-BcldhL-down-R：

ATGCATGC AGA CTC AGC TCT TGG CGG CCT TT(SEQ ID NO.6)

ldhD-LcldhL片段扩增

ldhD-LcldhL-up-F

ATGAGCTCGGCACCTTGAACAGTGTAACCA(SEQ ID NO.1)

ldhD-LcldhL-up-R：

GGTGATCCTTATCCGTAATACTTGCCATATTCTCAATATCTCCTTGATTTCGATTTGTCC(SEQ IDNO.7)

ldhD-LcldhL-lc-F

GGACAAATCGAAATCAAGGAGATATTGAGAATATGGCAAGTATTACGGATAAGGATCACC(SEQ IDNO.8)

ldhD-LcldhL-lc-R：

TGCTTATTTTTGCAGCTTAAAGGATCCTTACTGACGGGTTTCGATGTCGTTCT(SEQ ID NO.9)

ldhD-LcldhL-down-F

AGAACGACATCGAAACCCGTCAGTAAGGATCCTTTAAGCTGCAAAAATAAGCA(SEQ ID NO.10)

ldhD-LcldhL-down-R：

ATGCATGC AGA CTC AGC TCT TGG CGG CCT TT(SEQ ID NO.6)

实施例2

1)菌株同源重组：

鼠李糖乳杆菌菌株电转化方案：接种平板活化的鼠李糖乳杆菌菌株CGMCCNo.16834(Lr-ALTHT)的单菌落于4mL MRS培养基中37℃过夜培养，按照初始OD₆₀₀＝0.2转接至100mL含1％甘氨酸的MRS培养基中，37℃摇床培养至OD₆₀₀＝0.6；菌液冰浴20min，4℃、8000×g离心15min收集菌体；用100mL 4℃预冷的1mM MgCl₂和30％PEG1000依次冲洗菌体各1次；用1mL 4℃预冷的30％PEG1000重悬菌体，每份分装100μL感受态。每份感受态细胞加入1-5μg实施例1中制备的相应基因替换质粒，冰浴10min，使用0.2cm电转杯，1.75-2kV电击，迅速加入0.8mL MRS-SM培养基(在MRS培养基中加入0.5M蔗糖和0.1M MgCl₂)，37℃复苏培养2h，离心1min，去掉部分上清后重悬涂布于含对应抗生素的MRS平板上，42℃培养3天获得单菌落。

2)菌株Lr-ALTHT-DBC和菌株Lr-ALTHT-DLC

Lr-ALTHT-DBC基因替换菌株制备：在实施例1中得到的基因替换质粒pNZ5319TS-ldhD-BcldhL转入鼠李糖杆菌菌株Lr-ALTHT中，15μg/ml氯霉素抗性且42℃培养筛选获得阳性转化子，挑选1-2个阳性转化子不含有抗性的MRS液体培养基传代培养用于筛选第二次交换的菌株，经菌落PCR及测序确认ldhD基因已替换为BcldhL基因，即获得重组鼠李糖杆菌菌株Lr-ALTHT-DBC。

Lr-ALTHT-DLC基因替换菌株制备：在实施例1中得到的基因替换质粒pNZ5319TS-ldhD-LcldhL转入鼠李糖杆菌菌株Lr-ALTHTV中，15μg/ml氯霉素抗性且42℃培养筛选获得阳性转化子，挑选1-2个阳性转化子不含有抗性的MRS液体培养基传代培养用于筛选第二次交换的菌株，经菌落PCR及测序确认ldhD基因已替换为LcldhL基因，即获得重组鼠李糖杆菌菌株Lr-ALTHT-DLC。

实施例3

重组菌株发酵产L-乳酸

挑取实施例2中得到的重组鼠李糖乳杆菌菌株Lr-ALTHT-DBC和Lr-ALTHT-DLC的单菌落分别接种于MRS培养基，37℃、150rpm过夜培养获得OD₆₀₀均为12的重组鼠李糖乳杆菌菌株Lr-ALTHT-DBC种子液和重组鼠李糖乳杆菌菌株Lr-ALTHT-DLC种子液。然后，在200mL产酸发酵培养基中按照10％(v/v)的比例接种上述种子液，37℃、150rpm摇床培养6小时让菌株生长，然后升温到48℃，继续以150rpm摇床培养42小时获得发酵液(总发酵时长48小时)。发酵结束后通过高效液相色谱测定乳酸总产量和L-乳酸光学纯度。

其结果是，在200mL摇瓶水平下48℃发酵时，重组鼠李糖乳杆菌菌株Lr-ALTHT-DBC和重组鼠李糖乳杆菌菌株Lr-ALTHT-DLC发酵48h得到的发酵液中乳酸含量分别为216g/L和215.3g/L，糖酸转化率为97％和96.5％，L-乳酸光学纯度为99.8％和99.5％。

对比例1

按照实施例3的方法发酵产乳酸，不同的是，将重组鼠李糖乳杆菌菌株Lr-ALTHT-DBC(或者Lr-ALTHT-DLC)替换为出发菌株鼠李糖乳杆菌菌株CGMCC No.16834(Lr-ALTHTV)；

结果得到的发酵液中乳酸含量为157g/L，L-乳酸光学纯度为99％。

以上重组菌株Lr-ALTHT-DBC和Lr-ALTHT-DLC产物光学纯度达到99.5％，提供了可满足工业需求的又一选择。比较实施例3与对比例1可以看出，采用本发明的方法使用凝结芽孢杆菌的BcldhL基因(Gene ID：11173582序列扩增自凝结芽孢杆菌的基因组)和干酪乳杆菌菌株的LcldhL基因(Gene ID：31583240序列扩增自干酪乳杆菌的基因组)对出发菌株鼠李糖乳杆菌菌株CGMCC No.16834的D-乳酸脱氢酶(ldhD)基因敲除进行遗传改造得到的重组菌株发酵产乳酸能够更显著提升的发酵效果，得到的发酵液中的乳酸含量可分别达到216g/L和215.3g/L，糖酸转化率分别为97％和96.5％，L-乳酸光学纯度分别为99.8和99.5％，显著提高了L-乳酸的产率和产物L-乳酸的光学纯度。

工业实用性

以上研究表明，本发明的重组菌株Lr-ALTHT-DBC和Lr-ALTHT-DLC在L-乳酸的产率和产物光学纯度方面优于出发菌株鼠李糖杆菌Lr-ALTHT，因此，本发明提供了一种发酵成本低、环境友好、L-乳酸生产速度快并且产物光学纯度高的新型生产菌株，为L-乳酸的工业化微生物发酵生产提供了更优的潜在选择。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林中粮生化有限公司

中粮营养健康研究院有限公司

中粮生物科技股份有限公司

<120> 产L-乳酸的重组菌株及其构建方法和发酵产L-乳酸的方法及应用

<130> 快I62095COF

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> primer

<400> 1

atgagctcgg caccttgaac agtgtaacca 30

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> primer

<400> 2

ccactgcaat acgattgacc tttttcatat tctcaatatc tccttgattt cgatttgtcc 60

<210> 3

<211> 60

<212> DNA

<213> primer

<400> 3

ggacaaatcg aaatcaagga gatattgaga atatgaaaaa ggtcaatcgt attgcagtgg 60

<210> 4

<211> 55

<212> DNA

<213> primer

<400> 4

tgcttatttt tgcagcttaa aggatcctta caatacaggt gccatcgttt ctttt 55

<210> 5

<211> 55

<212> DNA

<213> primer

<400> 5

aaaagaaacg atggcacctg tattgtaagg atcctttaag ctgcaaaaat aagca 55

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> primer

<400> 6

atgcatgcag actcagctct tggcggcctt t 31

<210> 7

<211> 60

<212> DNA

<213> primer

<400> 7

ggtgatcctt atccgtaata cttgccatat tctcaatatc tccttgattt cgatttgtcc 60

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> primer

<400> 8

ggacaaatcg aaatcaagga gatattgaga atatggcaag tattacggat aaggatcacc 60

<210> 9

<211> 53

<212> DNA

<213> primer

<400> 9

tgcttatttt tgcagcttaa aggatcctta ctgacgggtt tcgatgtcgt tct 53

<210> 10

<211> 53

<212> DNA

<213> primer

<400> 10

agaacgacat cgaaacccgt cagtaaggat cctttaagct gcaaaaataa gca 53

<210> 11

<211> 312

<212> PRT

<213> Bacillus coagulans

<400> 11

Met Lys Lys Val Asn Arg Ile Ala Val Val Gly Thr Gly Ala Val Gly

1 5 10 15

Thr Ser Tyr Cys Tyr Ala Met Ile Asn Gln Gly Val Ala Glu Glu Leu

20 25 30

Val Leu Ile Asp Ile Asn Glu Ala Lys Ala Glu Gly Glu Ala Met Asp

35 40 45

Leu Asn His Gly Leu Pro Phe Ala Pro Thr Pro Thr Arg Val Trp Lys

50 55 60

Gly Asp Tyr Ser Asp Cys Gly Thr Ala Asp Leu Val Val Ile Thr Ala

65 70 75 80

Gly Ser Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp Leu Val Ala Lys

85 90 95

Asn Ala Lys Ile Phe Lys Gly Met Ile Lys Ser Ile Met Asp Ser Gly

100 105 110

Phe Asn Gly Ile Phe Leu Val Ala Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr

115 120 125

Tyr Val Thr Trp Lys Glu Ser Gly Leu Pro Lys Glu His Val Ile Gly

130 135 140

Ser Gly Thr Val Leu Asp Ser Ala Arg Leu Arg Asn Ser Leu Ser Ala

145 150 155 160

His Phe Gly Ile Asp Pro Arg Asn Val His Ala Ala Ile Ile Gly Glu

165 170 175

His Gly Asp Thr Glu Leu Pro Val Trp Ser His Thr Thr Ile Gly Tyr

180 185 190

Asp Thr Ile Glu Ser Tyr Leu Gln Lys Gly Thr Ile Asp Gln Lys Thr

195 200 205

Leu Asp Asp Ile Phe Val Asn Thr Arg Asp Ala Ala Tyr His Ile Ile

210 215 220

Glu Arg Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Gly Met Ser Leu Thr Arg

225 230 235 240

Ile Thr Arg Ala Ile Leu Asn Asn Glu Asn Ser Val Leu Thr Val Ser

245 250 255

Ala Phe Leu Glu Gly Gln Tyr Gly Asn Ser Asp Val Tyr Ile Gly Val

260 265 270

Pro Ala Val Ile Asn Arg Gln Gly Val Arg Glu Val Val Glu Ile Glu

275 280 285

Leu Asn Asp Lys Glu Gln Glu Gln Phe Ser His Ser Val Lys Val Leu

290 295 300

Lys Glu Thr Met Ala Pro Val Leu

305 310

<210> 12

<211> 939

<212> DNA

<213> Bacillus coagulans

<400> 12

atgaaaaagg tcaatcgtat tgcagtggtt ggaacgggtg cagttggtac aagttactgc 60

tacgccatga ttaatcaggg tgttgcagaa gagcttgttt taatcgatat taacgaagca 120

aaagcagaag gggaagccat ggacctgaac cacggcctgc catttgcgcc tacgccgacc 180

cgcgtttgga aaggagatta ttccgattgc ggcactgccg atcttgttgt cattacggca 240

ggttccccgc aaaaaccggg cgaaacaagg cttgatcttg ttgccaaaaa cgcaaaaatt 300

tttaaaggca tgattaagag catcatggac agcggcttta acgggatttt tcttgttgcc 360

agcaacccgg ttgacatttt gacatatgta acttggaaag agtccggcct gccgaaagaa 420

catgttatcg gttcgggcac agtgcttgac tccgcgcgtc tccgcaactc tttgagcgcc 480

cacttcggaa ttgacccgcg caatgtccat gccgcaatta tcggcgaaca cggcgacacg 540

gaacttccgg tttggagcca tacaacgatc ggttatgaca ccattgaaag ctatctgcaa 600

aagggaacca ttgaccaaaa aacattagat gatatttttg tcaacacgag agatgcggct 660

taccatatca ttgaacgaaa aggggccaca ttttacggca tcgggatgtc tctgactcgg 720

atcacaagag cgatcctgaa caatgaaaac agtgttttga cagtctctgc ctttttggaa 780

ggccagtacg gaaacagcga tgtgtacatt ggtgttcctg ccgttattaa ccgccaaggc 840

gtccgtgaag tggttgaaat cgagctgaac gacaaagaac aggaacaatt tagccattct 900

gttaaagtat taaaagaaac gatggcacct gtattgtaa 939

<210> 13

<211> 326

<212> PRT

<213> Lactobacillus casei

<400> 13

Met Ala Ser Ile Thr Asp Lys Asp His Gln Lys Val Ile Leu Val Gly

1 5 10 15

Asp Gly Ala Val Gly Ser Ser Tyr Ala Tyr Ala Met Val Leu Gln Gly

20 25 30

Ile Ala Gln Glu Ile Gly Ile Val Asp Ile Phe Lys Asp Lys Thr Lys

35 40 45

Gly Asp Ala Ile Asp Leu Ser Asn Ala Leu Pro Phe Thr Ser Pro Lys

50 55 60

Lys Ile Tyr Ser Ala Glu Tyr Ser Asp Ala Lys Asp Ala Asp Leu Val

65 70 75 80

Val Ile Thr Ala Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp

85 90 95

Leu Val Asn Lys Asn Leu Lys Ile Leu Lys Ser Ile Val Asp Pro Ile

100 105 110

Val Asp Ser Gly Phe Asn Gly Ile Phe Leu Val Ala Ala Asn Pro Val

115 120 125

Asp Ile Leu Thr Tyr Ala Thr Trp Lys Leu Ser Gly Phe Pro Lys Asn

130 135 140

Arg Val Val Gly Ser Gly Thr Ser Leu Asp Thr Ala Arg Phe Arg Gln

145 150 155 160

Ser Ile Ala Glu Met Val Asn Val Asp Ala Arg Ser Val His Ala Tyr

165 170 175

Ile Met Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Phe Pro Val Trp Ser His Ala

180 185 190

Asn Ile Gly Gly Val Thr Ile Ala Glu Trp Val Lys Ala His Pro Glu

195 200 205

Ile Lys Glu Asp Lys Leu Val Lys Met Phe Glu Asp Val Arg Asp Ala

210 215 220

Ala Tyr Glu Ile Ile Lys Leu Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Ala

225 230 235 240

Thr Ala Leu Ala Arg Ile Ser Lys Ala Ile Leu Asn Asp Glu Asn Ala

245 250 255

Val Leu Pro Leu Ser Val Tyr Met Asp Gly Gln Tyr Gly Leu Asn Asp

260 265 270

Ile Tyr Ile Gly Thr Pro Ala Val Ile Asn Arg Asn Gly Ile Gln Asn

275 280 285

Ile Leu Glu Ile Pro Leu Thr Asp His Glu Glu Glu Ser Met Gln Lys

290 295 300

Ser Ala Ser Gln Leu Lys Lys Val Leu Thr Asp Ala Phe Ala Lys Asn

305 310 315 320

Asp Ile Glu Thr Arg Gln

325

<210> 14

<211> 981

<212> DNA

<213> Lactobacillus casei

<400> 14

atggcaagta ttacggataa ggatcaccaa aaagttattc tcgttggtga cggcgccgtt 60

ggttcaagtt atgcctatgc aatggtattg caaggtattg cacaagaaat cgggatcgtt 120

gacattttta aggacaagac gaagggtgac gcgattgact tatcgaacgc gctgccattc 180

accagcccaa agaagattta ttcagctgaa tacagcgatg ccaaggatgc tgatctggtt 240

gttatcactg ctggtgctcc tcagaagcca ggcgaaaccc gcttggatct ggttaacaag 300

aacttgaaga tcttgaagtc cattgttgat ccgattgtgg attctggctt taacggtatc 360

ttcttggttg ctgccaaccc agttgatatc ttgacctatg caacttggaa actttccggc 420

ttcccgaaga accgggttgt tggttcaggt acttcattgg ataccgcacg tttccgtcag 480

tccattgctg aaatggttaa cgttgatgca cgttcggtcc atgcttacat catgggtgaa 540

catggtgaca ctgaattccc tgtatggtca cacgctaaca tcggtggcgt tactattgcc 600

gaatgggtta aagcacatcc ggaaatcaag gaagacaagc ttgttaagat gtttgaagac 660

gttcgtgacg ctgcttacga aatcatcaaa ctcaagggcg caaccttcta tggtatcgca 720

actgctttgg cacgtatctc caaggctatc ctgaacgatg aaaatgctgt tctgccactg 780

tccgtttaca tggatggtca atatggcttg aacgacatct acatcggtac cccagctgtg 840

atcaaccgaa atggtatcca gaacattctg gaaattccat tgaccgacca cgaagaggaa 900

tccatgcaga aatctgcttc acaattgaag aaggttctga ctgatgcctt cgcgaagaac 960

gacatcgaaa cccgtcagta a 981

<210> 15

<211> 333

<212> PRT

<213> Lactobacillus rhamnosus

<400> 15

Met Lys Ile Ile Ala Tyr Gly Ala Arg Val Asp Glu Ile Gln Tyr Phe

1 5 10 15

Lys Gln Trp Ala Lys Glu Thr Gly Asn Thr Leu Glu Tyr His Thr Glu

20 25 30

Phe Leu Asp Glu His Thr Val Glu Trp Ala Lys Gly Phe Asp Gly Ile

35 40 45

Asn Ser Leu Gln Thr Thr Pro Tyr Ala Ala Gly Val Phe Glu Lys Met

50 55 60

His Glu Tyr Gly Ile Lys Phe Leu Thr Ile Arg Asn Val Gly Thr Asp

65 70 75 80

Asn Ile Asp Met Thr Ala Met Lys Lys Tyr Gly Ile Arg Leu Ser Asn

85 90 95

Val Pro Ala Tyr Ser Pro Ala Ala Ile Ala Glu Phe Ala Leu Thr Asp

100 105 110

Thr Leu Tyr Leu Leu Arg Asn Met Gly Lys Val Gln Ala Gln Leu His

115 120 125

Ala Gly Asp Tyr Glu Lys Ala Ser Thr Phe Ile Gly Lys Glu Leu Gly

130 135 140

Gln Gln Thr Val Gly Val Met Gly Thr Gly His Ile Gly Arg Val Ala

145 150 155 160

Ile Lys Leu Phe Lys Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp Pro

165 170 175

Tyr Pro Met Lys Gly Asp His Pro Asp Phe Glu Tyr Val Ser Leu Glu

180 185 190

Glu Leu Phe Lys Gln Ser Asp Ile Ile Asp Leu His Val Pro Gly Ile

195 200 205

Lys Gln Asn Thr His Ile Ile Asn Glu Ala Ala Phe Asp Leu Met Lys

210 215 220

Pro Gly Ala Ile Val Ile Asn Thr Ala Arg Pro Asn Leu Ile Asp Thr

225 230 235 240

Gln Ala Met Leu Ser Asn Leu Lys Ser Gly Lys Leu Ala Gly Val Gly

245 250 255

Ile Asp Thr Tyr Glu Tyr Glu Thr Glu Asp Leu Leu Asn Leu Ala Lys

260 265 270

His Gly Ser Phe Lys Asp Pro Leu Trp Asp Glu Leu Leu Ala Met Pro

275 280 285

Asn Val Val Leu Ser Pro His Ile Ala Tyr Tyr Thr Glu Thr Ala Val

290 295 300

His Asn Met Val Tyr Phe Ser Leu Gln Asn Leu Val Asp Phe Leu Thr

305 310 315 320

Arg Gly Glu Thr Asn Thr Glu Val Thr Ala Pro Ala Lys

325 330

<210> 16

<211> 1003

<212> DNA

<213> Lactobacillus rhamnosus

<400> 16

atgaagatta ttgcatatgg tgcacgcgtg gatgagatcc aatatttcaa acagtgggct 60

aaggaaaccg gcaacacgct ggaatatcat acggaatttc ttgatgagca taccgttgaa 120

tgggcaaagg gatttgacgg cattaactca ctacaaacga cgccatacgc agctggtgtg 180

tttgaaaaaa tgcacgaata tggcatcaag tttctcacca tccgcaatgt cggaaccgac 240

aatatcgata tgacggcgat gaaaaaatac ggcattcgct taagtaatgt tccggcgtat 300

tcaccggctg ccattgctga atttgcgcta accgatacgt tatatctact tcgcaacatg 360

ggaaaggttc aagcacagct acatgcaggc gactacgaaa aagccagcac cttcatcggc 420

aaagaacttg gtcagcaaac agtcggcgtg atggggaccg gacacattgg ccgcgttgcc 480

atcaagctct tcaaaggttt tggtgccaaa gtgattgctt acgatccata tccgatgaaa 540

ggcgatcatc cggactttga atatgtcagc ttggaagaac tattcaaaca aagtgacatc 600

attgatcttc acgttccggg cattaaacaa aatacccaca ttatcaacga ggccgcgttt 660

gatcttatga agccaggcgc gatcgtaatt aacaccgcgc ggccgaacct gattgatacc 720

caggcgatgc tcagcaacct gaagtccggt aaactggccg gcgtcggaat cgatacgtac 780

gaatacgaaa ccgaagatct gttgaacctc gccaaacacg gtagcttcaa ggatccgtta 840

tgggatgaac tgctcgcgat gccaaatgtt gttctcagcc cgcatattgc gtactacaca 900

gaaaaccgcc gtgcacaaca tggtttactt ctcactgcag aatttagtcg actttttgac 960

aaggggagag acgaatactg aagtgacagc accggcgaaa taa 1003

<210> 17

<211> 699

<212> DNA

<213> pWV01

<400> 17

atggctatta aaaatactaa agctagaaat tttggatttt tattatatcc tgactcaatt 60

cctaatgatt ggaaagaaaa attagagagt ttgggcgtat ctatggctgt cagtccttta 120

cacgatatgg acgaaaaaaa agataaagat acatggaata atagtaatat tatacaaaat 180

ggaaagcact ataaaaaacc acactatcac gttatatata ttgcacgaaa tcctgtaaca 240

atagaaagcg ttaggaacaa gattaagcga aaattgggga atagttcagt tgctcatgtt 300

gagatacttg attatatcaa aggttcatat gaatatttga ctcatgaatc aaaggacgct 360

attgctaaga ataaacatat atacgacaaa aaagatattt tgaacattaa tgattttgat 420

attgaccgct atataacact tgatgaaagc caaaaaagag aattgaagaa tttactttta 480

gatatagtgg atgactataa tttggtaaat acaaaagatt taatggcttt tattcgcctt 540

aggggagcgg agtttggaat tttaaatacg aatgatgtaa aagatattgt ttcaacaaac 600

tctagcgcct ttagattatg gtttgagggc aattatcagt gtggatatag agcaagttat 660

gcaaaggttc ttgatgctga aacgggggaa ataaaatga 699

Claims

1.一种产L-乳酸的重组菌株，其特征在于，该重组菌株由出发菌株经遗传改造获得，相比于出发菌株，所述重组菌株的D-乳酸脱氢酶的活性减弱或失活且L-乳酸脱氢酶的活性增强；

其中，所述重组菌株中的至少部分D-乳酸脱氢酶基因被敲除；

敲除的D-乳酸脱氢酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示；

所述重组菌株中含有编码氨基酸序列如SEQ ID NO：11和/或SEQ ID NO：13所示的L-乳酸脱氢酶的基因。

2.根据权利要求1所述的重组菌株，其中，所述出发菌株是保藏编号为CGMCC No.16834的鼠李糖乳杆菌。

3.根据权利要求1所述的重组菌株，其中，敲除的D-乳酸脱氢酶基因的序列如SEQ IDNO：16所示。

4.根据权利要求1所述的重组菌株，其中，所述重组菌株中含有基因序列如SEQ ID NO：12和/或SEQ ID NO：14所示的L-乳酸脱氢酶基因。

5.根据权利要求4所述的重组菌株，其中，所述重组菌株的保藏编号为CGMCCNo.19508。

6.一种构建重组菌株的方法，其特征在于，该方法包括：对出发菌株进行遗传改造以使出发菌株的D-乳酸脱氢酶的活性减弱或失活并使出发菌株的L-乳酸脱氢酶的活性增强；

其中，使出发菌株的D-乳酸脱氢酶的活性减弱或失活的方式为基因敲除；

使出发菌株的L-乳酸脱氢酶的活性增强的方式为外源引入编码氨基酸序列如SEQ IDNO：11和/或SEQ ID NO：13所示的L-乳酸脱氢酶的基因。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述出发菌株是保藏编号为CGMCC No.16834的鼠李糖乳杆菌。

8.根据权利要求6所述的方法，其中，敲除的D-乳酸脱氢酶基因的序列如SEQ ID NO：16所示。

9.根据权利要求6所述的方法，其中，使出发菌株的L-乳酸脱氢酶的活性增强的方式为外源引入基因序列如SEQ ID NO：12和/或SEQ ID NO：14所示的L-乳酸脱氢酶基因。

10.一种发酵产L-乳酸的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1-5中任意一项所述的重组菌株接种至产酸发酵培养基中进行发酵；

或者，按照权利要求6-9中任意一项所述的方法构建重组菌株，并将得到的重组菌株接种至产酸发酵培养基中进行发酵。

11.权利要求1-5中任意一项所述的重组菌株或权利要求6-9中任意一项所述的方法在制备L-乳酸或聚L-乳酸中的应用。