BR112014026720B1 - Cepa de lactobacillus sp. produtora de d-ácido lático, método de preparação da dita cepa e método para a produção de d-ácido lático - Google Patents
Cepa de lactobacillus sp. produtora de d-ácido lático, método de preparação da dita cepa e método para a produção de d-ácido lático Download PDFInfo
- Publication number
- BR112014026720B1 BR112014026720B1 BR112014026720-0A BR112014026720A BR112014026720B1 BR 112014026720 B1 BR112014026720 B1 BR 112014026720B1 BR 112014026720 A BR112014026720 A BR 112014026720A BR 112014026720 B1 BR112014026720 B1 BR 112014026720B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- lactic acid
- lactobacillus
- ldh
- seq
- polynucleotide encoding
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 241000186610 Lactobacillus sp. Species 0.000 title claims description 20
- 239000002253 acid Substances 0.000 title description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 4
- 229920000126 latex Polymers 0.000 title 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-N D-lactic acid Chemical compound C[C@@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-N 0.000 claims abstract description 104
- JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N L-lactic acid Chemical compound C[C@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 102
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 96
- 229930182843 D-Lactic acid Natural products 0.000 claims abstract description 86
- 229940022769 d- lactic acid Drugs 0.000 claims abstract description 83
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 claims abstract description 68
- 108010001539 D-lactate dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 102100023319 Dihydrolipoyl dehydrogenase, mitochondrial Human genes 0.000 claims abstract description 51
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 38
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 13
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 98
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 98
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 98
- 101150026107 ldh1 gene Proteins 0.000 claims description 36
- 241000186605 Lactobacillus paracasei Species 0.000 claims description 34
- 241000218588 Lactobacillus rhamnosus Species 0.000 claims description 23
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 claims description 18
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 claims description 18
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 claims description 18
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 claims description 18
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 claims description 18
- 241000186673 Lactobacillus delbrueckii Species 0.000 claims description 17
- 101150095787 ldh2 gene Proteins 0.000 claims description 14
- 101001090713 Homo sapiens L-lactate dehydrogenase A chain Proteins 0.000 claims description 12
- 101001130147 Homo sapiens Probable D-lactate dehydrogenase, mitochondrial Proteins 0.000 claims description 12
- 102100034671 L-lactate dehydrogenase A chain Human genes 0.000 claims description 12
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 claims description 12
- 102100031708 Probable D-lactate dehydrogenase, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 12
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 9
- 108010087599 lactate dehydrogenase 1 Proteins 0.000 claims description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- 101150100271 ldhb gene Proteins 0.000 claims description 3
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 abstract description 38
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 abstract description 37
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 15
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 10
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 9
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 8
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 8
- 101100398785 Streptococcus agalactiae serotype V (strain ATCC BAA-611 / 2603 V/R) ldhD gene Proteins 0.000 description 8
- 101100386830 Zymomonas mobilis subsp. mobilis (strain ATCC 31821 / ZM4 / CP4) ddh gene Proteins 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 8
- 101150109073 ldhD gene Proteins 0.000 description 8
- 101150041530 ldha gene Proteins 0.000 description 8
- 239000006872 mrs medium Substances 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 108090000841 L-Lactate Dehydrogenase (Cytochrome) Proteins 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101150104734 ldh gene Proteins 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- -1 linoleic acid, alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004526 pharmaceutical effect Effects 0.000 description 2
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241001495410 Enterococcus sp. Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101100454398 Lactiplantibacillus plantarum (strain ATCC BAA-793 / NCIMB 8826 / WCFS1) ldh1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100020699 Lactiplantibacillus plantarum (strain ATCC BAA-793 / NCIMB 8826 / WCFS1) ldh2 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 description 1
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 description 1
- 240000001929 Lactobacillus brevis Species 0.000 description 1
- 235000013957 Lactobacillus brevis Nutrition 0.000 description 1
- 241000186840 Lactobacillus fermentum Species 0.000 description 1
- 241001561398 Lactobacillus jensenii Species 0.000 description 1
- 241001468157 Lactobacillus johnsonii Species 0.000 description 1
- 241000866650 Lactobacillus paraplantarum Species 0.000 description 1
- 241000186684 Lactobacillus pentosus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241001627205 Leuconostoc sp. Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 241000952054 Rhizopus sp. Species 0.000 description 1
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000194022 Streptococcus sp. Species 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229920006125 amorphous polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 235000013332 fish product Nutrition 0.000 description 1
- FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N flavin mononucleotide Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M iron chloride Chemical compound [Cl-].[Fe] FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 description 1
- 229940012969 lactobacillus fermentum Drugs 0.000 description 1
- 229940035901 lactobacillus sp Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920001522 polyglycol ester Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/56—Lactic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01027—L-Lactate dehydrogenase (1.1.1.27)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01028—D-Lactate dehydrogenase (1.1.1.28)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
NOVA CEPA PRODUTORA DE ÁCIDO LÁTICO DE SEUS USOS. A presente invenção se refere a um método para a preparação de uma cepa produtora de ácido lático D modificada para inibir a atividade da L-lactato desidrogenase (L-LDH) e introduzir a atividade da D-lactato- desidrogenase (D-LOH) em uma cepa produtora de ácido lático L; a uma cepa produtora de ácido lático D mutante preparada pelo método acima indicado; e a um método para a produção de ácido lático D, incluindo as etapas de cultivar a cepa e recuperar o ácido lático D do meio de cultura.
Description
[001] A presente invenção se refere a uma nova cepa produtora de D-ácido lático e a seus usos. Especificamente, a presente invenção se refere a um método para a preparação de uma cepa produtora de D-ácido lático incluindo as etapas de inibição da atividade da L-lactato desidrogenase (L-LDH) e introdução da atividade da D-lactato-desidrogenase (D-LDH) em uma cepa produtora de L-ácido lático, a uma cepa produtora de D-ácido lático modificada preparada pelo método indicado acima, e a um método para a produção de D-ácido lático, incluindo as etapas de cultivar a cepa e recuperar o D-ácido lático do caldo de cultura.
[002] O ácido lático possui uma ampla variedade de aplicações industriais em alimentos, medicamentos, cosméticos, etc. Nos últimos anos, o ácido lático tem sido utilizado como um monômero para o ácido polilático e, portanto, tem havido um aumento notável na demanda por ácido lático.
[003] O ácido lático pode ser produzido por um processo de síntese química ou de fermentação biológica usando carboidratos como substrato. O último método é o preferido do ponto de vista comercial porque a síntese química de ácido lático cria um problema de aumento de custo causado pelo aumento do preço do gás ou pela contaminação ambiental. Além disso, também há problemas de produção de L-ácido lático na forma de uma mistura racêmica consistindo de uma quantidade igual de D- ácido lático e L-ácido lático. Infelizmente, a proporção da composição de D-ácido lático e L-ácido lático não pode ser controlada. Quando o ácido lático na forma de uma mistura racêmica é utilizado para a preparação de ácido polilático, é produzido um polímero amorfo com um ponto de fusão baixo, limitando desta forma a aplicação deste. Por outro lado, o processo de fermentação biológica usando microorganismos torna possível a produção seletiva de D-ácido lático ou L-ácido lático, dependendo da cepa utilizada. Por exemplo, microrganismos tal como Lactobacillus sp., Bacillus sp., Rhizopus sp., Streptococcus sp., ou Enterococcus sp. geralmente produzem L- ácido lático. Microrganismos tal como Leuconostoc sp. e Lactobacillus vulgaricus geralmente produzem D-ácido lático. Em particular, devido ao D-ácido lático não ser metabolizado no corpo, o D-ácido lático pode ser usado como um biomaterial no campo médico e também pode ser usado como um herbicida oticamente ativo através de esterificação e cloração. É sabido que um herbicida oticamente ativo pode melhorar consideravelmente o seu efeito farmacêutico e também que tem o mesmo efeito farmacêutico com uma quantidade menor. Por esta razão, a demanda por D- ácido lático tem aumentado. Além disso, o ácido polilático-sc (estereocomplexo-PLA) tem um ponto de fusão e uma temperatura de degradação térmica significativamente mais elevados do que os ácidos poliláticos conhecidos. Portanto, ele pode ser utilizado como um material plástico de alta resistência ao calor, resultando de uma mistura de ácido L-polilático puro e ácido D-polilático puro. Consequentemente, é necessário um monômero de D-ácido lático, e sua demanda tem crescido gradualmente.
[004] Na produção de tal D-ácido lático oticamente puro, é preferido o processo de fermentação biológica utilizando especificidade de substrato enanciosseletivo de uma enzima microbiana. No entanto, os microorganismos do tipo selvagem, produtores de D-ácido lático geralmente encontrados na natureza, ainda não são adequados para uso industrial em relação à pureza ótica, ou à produtividade. Exemplos de microorganismos produtores de D-ácido lático são Lb. plantarum, Lb. pentosus, Lb. fermentum, Lb delbrueckii, ou semelhantes. No entanto, existem as desvantagens, já que eles não são capazes de produzir ácido lático com produtividade e rendimento elevados, e 20 ~ 40% do ácido lático é o L-ácido lático como impureza óptica. Para superar estas desvantagens foram feitas tentativas para desenvolver uma variante que produza concentrações elevadas de ácido lático em um meio de cultura com glicose elevada através da indução de mutações em bactérias produtoras de ácido lático por tratamento com EMS (etilmetanossulfonato) (J. Industrial Microbiol, 11:23 -28, 1992). Como resultado, foi selecionada a cepa que apresenta uma produtividade cerca de 4,8 vezes maior do que a produtividade de um grupo de controle, mas a sua atividade foi reduzida durante o armazenamento de longo prazo. Entretanto, no caso de desenvolvimento de uma cepa utilizando uma variante, uma cepa com rendimento melhorado tende a apresentar uma produtividade reduzida, ao passo que uma cepa com a produtividade melhorada tende a apresentar um rendimento reduzido.
[005] Com base na ideia de que as cepas para a fermentação industrial do ácido lático geralmente são microrganismos produtores de L-ácido lático, e que esses microrganismos têm, na maioria das vezes, produtividade e rendimento superiores em comparação com microorganismos produtores de D-ácido lático, os presentes inventores descobriram que o D-ácido lático pode ser produzido, com rendimento elevado, por inativação de um gene que codifica uma L-lactato desidrogenase (L- LDH) em um microorganismo com elevada produção de L-ácido lático e, em seguida, introduzindo neste um gene heterógeno que codifica uma D-lactato desidrogenase (D-LDH), completando assim a presente invenção
[006] Uma configuração da presente invenção proporciona um método para a preparação de uma cepa produtora de D-ácido lático modificada, incluindo as etapas de atenuação ou inativação da atividade da L-lactato desidrogenase de introdução ou aumento da atividade da D-lactato desidrogenase em uma cepa produtora de L- ácido lático.
[007] Outra configuração da presente invenção proporciona uma cepa produtora de D-ácido lático modificada que é preparada pelo método descrito acima.
[008] Outra configuração da presente invenção proporciona um método para a produção de D-ácido lático usando a cepa produtora de D-ácido lático modificada.
[009] A Figura 1 mostra um gráfico que representa os resultados da análise da proporção de D-ácido lático e L-ácido lático produzidos por 10 tipos diferentes de microorganismos do tipo selvagem produtores de ácido lático.
[0010] Uma configuração da presente invenção proporciona um método para a preparação de uma cepa produtora de D-ácido lático modificada por meio da atenuação ou inativação da atividade da L-lactato desidrogenase (L-LDH) e introdução ou aumento da atividade da D-lactato desidrogenase (D-LDH) lático D em uma cepa produtora de L-ácido lático.
[0011] Em detalhe, o método para a preparação da cepa produtora de D-ácido lático modificada da presente invenção inclui (a) atenuar ou inativar a atividade da L- lactato desidrogenase (L-LDH) em uma cepa produtora de L-ácido lático para se obter uma cepa produtora de ácido lático modificada; e (b) introduzir ou aumentar a atividade da D-lactato-desidrogenase (D-LDH) na cepa produtora de ácido lático modificada.
[0012] Com relação a isso, a cepa produtora de L-ácido lático pode ser uma cepa que expressa apenas um polinucleotídeo que codifica a L-LDH para a produção de L-ácido lático ou uma cepa que expressa um polinucleotídeo que codifica uma L- LDH e um polinucleotídeo que codifica uma D-LDH ao mesmo tempo para a produção tanto de L-ácido lático como de D-ácido lático. O método para atenuar ou inativar a atividade da L-LDH pode ser realizado por substituição, deleção, inserção ou adição de um ou vários nucleotídeos em uma ou mais posições do polinucleotídeo que codifica a L-LDH. O método para introduzir ou aumentar a atividade da D-LDH pode ser realizado pela introdução do polinucleotídeo que codifica a D-LDH no cromossomo da cepa produtora de ácido lático modificada, pela introdução de um polinucleotídeo que codifica uma variante da D-LDH tendo atividade melhorada no cromossomo da cepa produtora de ácido lático modificada, pela introdução de um promotor forte a montante no polinucleotídeo que codifica a D-LDH no cromossomo da cepa produtora de ácido lático mutante, pela introdução de um promotor forte e o polinucleotídeo que codifica a D-LDH operativamente ligado ao promotor no cromossomo da cepa produtora de ácido lático modificada, pela introdução de um promotor forte e o polinucleotídeo que codifica a variante da D-LDH com atividade melhorada, que é operativamente ligado ao promotor, no cromossomo da cepa produtora de ácido lático modificada, pela introdução de um vetor de expressão incluindo o polinucleotídeo que codifica a D-LDH na cepa produtora de ácido lático modificada, pela introdução de um vetor de expressão incluindo o polinucleotídeo que codifica a variante da D-LDH tendo atividade melhorada na cepa produtora de ácido lático modificada, pela introdução de um vetor de expressão incluindo um promotor forte e o polinucleotídeo que codifica a D-LDH operativamente ligado ao promotor na cepa produtora de ácido lático modificada, pela introdução de um vetor de expressão incluindo um promotor forte e o polinucleotídeo que codifica a variante da D-LDH tendo atividade melhorada, que é operativamente ligado ao promotor, na cepa produtora de ácido lático modificada, ou semelhante.
[0013] Conforme utilizado aqui, o termo "lactato desidrogenase (LDH)" se refere a uma enzima que catalisa a produção de piruvato a partir de lactato por remoção de hidrogênio ou a produção de lactato a partir de piruvato por redução usando NADH. A LDH tem um peso molecular de cerca de 140 kDa e pode ser classificada em L- LDH (EC 1.1.1.27.) produtora de L-ácido lático, D-LDH (EC 1.1.1.28.) produtora de D-ácido lático, e L-LDH (citocromo b2, EC 1.1.2.3) contendo FMN e heme.
[0014] Conforme utilizado aqui, o termo "cepa produtora de L-ácido lático" se refere a uma cepa que expressa um polinucleotídeo que codifica a L-LDH e produz L-ácido lático utilizando a L-LDH expressa. Além disso, a cepa também inclui uma cepa que produz tanto o L-ácido lático como o D-ácido lático pela expressão do polinucleotídeo que codifica a L-LDH e do polinucleotídeo que codifica a D-LDH ao mesmo tempo, como uma cepa que produz L-ácido lático pela expressão apenas do polinucleotídeo que codifica a L-LDH. A cepa produtora de L-ácido lático não está particularmente limitada, desde que esta possa produzir L-ácido lático. Por exemplo, podem ser usados Lactobacillus brevis, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus johnsonii, e Lactobacillus casei, especificamente, podem ser usados Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei, e Lactobacillus casei, e mais especificamente podem ser usados Lactobacillus paracasei.
[0015] O método para atenuação ou inativação da atividade da L-LDH na cepa produtora de L-ácido lático pode ser realizado utilizando um método conhecido no estado da técnica. Por exemplo, um método para inibir a expressão do polinucleotídeo que codifica a L-LDH ou para produzir uma L-LDH inativada pode ser um método para a substituição, deleção, inserção ou adição de um ou vários nucleotídeos, mais especificamente de 2 a 20 nucleotídeos, mais especificamente, de 2 a 10 nucleotídeos, e ainda mais especificamente de 2 a 5 nucleotídeos do polinucleotídeo que codifica a L-LDH inerente à cepa produtora de L-ácido lático. Além disso, qualquer método pode ser utilizado sem limitação particular, desde que seja utilizado para atenuar ou inativar a atividade da L-LDH na cepa produtora de L- ácido lático.
[0016] Na presente invenção, a L-LDH a ser atenuada ou inativada pode ser inerente à cepa produtora de L-ácido lático. A sequência de aminoácidos da L-LDH ou a sequência de polinucleotídeo que codifica a mesma não é particularmente limitada. A L-LDH pode ser representada por uma sequência de polinucleotídeo (SEQ ID NO: 25) que codifica a LDH e uma sequência de polinucleotídeo (SEQ ID NO: 26) que codifica a LDH1 de Lactobacillus paracasei, por uma sequência de polinucleotídeo (SEQ ID NO: 27) que codifica a LDH1 e uma sequência de polinucleotídeo (SEQ ID NO: 28) que codifica a LDH2 de Lactobacillus casei, uma sequência de polinucleotídeo (SEQ ID NO: 29) que codifica a LGG_02523 e uma sequência de polinucleotídeo (SEQ ID NO: 30) que codifica a LGG_00606 de Lactobacillus rhamnosus.
[0017] Conforme utilizado aqui, o termo "cepa produtora de ácido lático modificada" se refere a uma cepa produtora de L-ácido lático na qual a atividade da L-LDH é atenuada ou inativada. A cepa produtora de ácido lático pode ser modificada para atenuar ou inativar a atividade da L-LDH por indução de mutações artificiais na cepa produtora de L-ácido lático normal, ou por mutações de ocorrência natural sem a indução de mutações artificiais.
[0018] O método para introduzir ou aumentar a atividade da D-LDH na cepa produtora de ácido lático modificada pode ser, mas não está particularmente limitado a, um método para introdução do polinucleotídeo que codifica a D-LDH no cromossomo da cepa produtora de ácido lático modificada, um método para a introdução de um polinucleotídeo que codifica uma variante da D-LDH tendo atividade melhorada no cromossomo da cepa produtora de ácido lático modificada, um método para a introdução de um promotor forte a montante no polinucleotídeo que codifica a D-LDH no cromossomo da cepa produtora de ácido lático mutante, um método para a introdução de um promotor forte e o polinucleotídeo que codifica a D- LDH operativamente ligado ao promotor no cromossomo da cepa produtora de ácido lático modificada, um método para a introdução de um promotor forte e o polinucleotídeo que codifica a variante de D-LDH tendo atividade melhorada, que é operativamente ligado ao promotor, no cromossomo da cepa produtora de ácido lático modificada, um método para a introdução de um vetor de expressão incluindo o polinucleotídeo que codifica a D-LDH na cepa produtora de ácido lático modificada, um método para a introdução de um vetor de expressão incluindo o polinucleotídeo que codifica a variante da D-LDH tendo atividade melhorada na cepa produtora de ácido lático modificada, um método para a introdução de um vetor de expressão incluindo um promotor forte e o polinucleotídeo que codifica a D-LDH operativamente ligado ao promotor na cepa produtora de ácido lático modificada, um método para a introdução de um vetor de expressão incluindo um promotor forte e o polinucleotídeo que codifica a variante da D-LDH tendo atividade melhorada, que é operativamente ligado ao promotor, na cepa produtora de ácido lático modificada, ou semelhante.
[0019] Conforme utilizado aqui, o termo "vetor de expressão" se refere a um produto de DNA que compreende uma sequência de nucleotídeo de um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo, o qual está operativamente ligado a uma sequência reguladora adequada para expressar o polinucleotídeo que codifica a proteína alvo em um hospedeiro adequado. A sequência reguladora pode incluir um promotor capaz de iniciar a transcrição, uma sequência operadora arbitrária para regular a transcrição, uma sequência que codifica um sítio de ligação do ribossoma ao mRNA adequado, e sequências para a regulação da terminação da transcrição e tradução. Uma vez que o vetor é transformado em um hospedeiro adequado, o vetor pode se replicar e funcionar independentemente do genoma do hospedeiro, ou pode ser integrado ao próprio genoma.
[0020] Desde que seja replicável em hospedeiros, qualquer vetor conhecido no estado da técnica pode ser utilizado como o vetor de expressão na presente invenção, sem limitações particulares. Um exemplo do vetor de expressão tipicamente usado pode incluir um plasmídeo, cosmídeo, vírus e bacteriófago natural ou recombinante. Exemplos do vetor de fago ou do vetor cosmídeo podem incluir pWE15, M13, ÁMBL3, ÁMBL4, ÁIXII, ÁASHII, ÁAPII, Át10, Át11, Charon4A, e Charon21A. O vetor plasmídeo pode incluir o tipo pBR, o tipo pUC, o tipo pBluescriptII, o tipo pGEM, o tipo PTZ, o tipo pCL, o tipo pET, etc.
[0021] Em detalhe, o vetor utilizado em configurações da presente invenção é o pG+host6, que é um vetor usado em uma grande variedade de bactérias Gram- positivas. Este vetor é caracterizado por conter um gene de resistência à ampicilina e uma origem de replicação para utilização em E. coli, um gene de resistência à eritromicina e uma origem de replicação para uso em bactérias Gram-positivas. Em particular, a origem de replicação em bactérias Gram-positivas contém uma mutação sensível ao calor e, portanto, a replicação não ocorre a uma temperatura acima de 37°C. Portanto, isto permite a inserção do gene através de uma sequência homóloga em bactérias Gram-positivas (Publicação de Pedido de Patente US N° 20060025190).
[0022] Conforme utilizado aqui, o termo "transformação" significa uma série de operações de introdução de um vetor incluindo um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo em uma célula hospedeira, expressão do polinucleotídeo na célula hospedeira, e produção de um produto de expressão, mRNA ou proteína. O polinucleotídeo a ser introduzido na célula hospedeira pode ser de qualquer forma, desde que este possa ser introduzido na célula hospedeira e expresso nesta. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira na forma de um cassete de expressão que é uma estrutura que inclui todos os elementos (um promotor operativamente ligado ao polinucleotídeo, um sinal de terminação da transcrição, um sítio de ligação ao ribossoma, um sinal de terminação da tradução, etc.) necessários para a auto-expressão. O cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão auto-replicável. Além disso, o próprio polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira para ser operativamente ligado a uma sequência necessária para a expressão na célula hospedeira.
[0023] A D-LDH utilizada na presente invenção pode ser, mas não está particularmente limitada a, derivada de uma cepa produtora de D-ácido lático. Especificamente derivada de Lactobacillus plantarum ou Lactobacillus delbrueckii, e ainda mais especificamente, um polipeptídeo representado por uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 de Lactobacillus delbrueckii ou uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 de Lactobacillus plantarum. Na adição, substituição, deleção, inserção, adição ou inversão de um aminoácido ou de vários aminoácidos (dependendo das posições dos resíduos de aminoácidos na estrutura tridimensional da proteína ou dos tipos de resíduos de aminoácidos, podem ser incluídos especificamente de 2 a 20, mais especificamente de 2 a 10, ainda mais especificamente de 2 a 5 aminoácidos) a uma ou mais posições da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 ou 32. Contanto que a sequência possa manter ou aumentar a atividade da D-LDH, pode ser incluída uma sequência de aminoácidos possuindo 80% ou mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente 95% ou mais, ainda mais especificamente 97% ou mais de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 ou 32. Uma vez que a sequência de aminoácidos da enzima pode ser diferente, dependendo da espécie ou cepa de um microrganismo, a substituição, deleção, inserção, adição ou inversão do aminoácido também inclui uma sequência mutante de ocorrência natural ou uma sequência mutante artificial, mas não está particularmente limitada a estas.
[0024] Conforme utilizado aqui, o termo "homologia" se refere à identidade entre duas sequências de aminoácidos diferentes ou duas sequências de nucleotídeo diferentes, e pode ser determinada por um método bem conhecido dos especialistas na técnica. Por exemplo, podem ser utilizados os parâmetros de cálculo BLAST 2.0 tal como pontuação, identidade e semelhança, mas isso não está particularmente limitado aos mesmos.
[0025] De um modo geral, a cepa produtora de L-ácido lático produz ácido lático com um rendimento de produção maior do que a cepa produtora de D-ácido lático. Assim, os inventores da presente invenção pretenderam preparar uma cepa possuindo excelente produtibilidade de D-ácido lático pela modificação da cepa produtora de L-ácido lático em uma cepa produtora de D-ácido lático. Para este fim, foi comparada a proporção de fermentação dos ácidos lático D e lático L entre as cepas de Lactobacillus sp do tipo selvagem. Como resultado, foi verificado que cepas de Lactobacillus paracasei, Lactobacillus casei e Lactobacillus rhamnosus apresentaram excelente produtibilidade global de ácido lático, e as suas proporções de ácidos lático L foram extremamente excelentes. Por conseguinte, os inventores da presente invenção pretenderam preparar cepas modificadas das mesmas (fig. 1). Por exemplo, os genes ldh e ldh1 de L-LDHin de Lactobacillus paracasei foram deletados e, ao mesmo tempo, foram preparados δldh1-ldhA(Lb. db) e δldh-ldhD(Lb. pl) como os cassetes de inserção da D-LDH, e depois cada um deles foi introduzido no vetor sensível ao calor pG+host6 para preparar dois tipos de vetores, pG+host6- δldh1-ldhA(Lb. db) e pG+host6-δldh-ldhD(Lb. pl) (Exemplo 3). Subsequentemente, cada vetor foi introduzido no Lactobacillus paracasei com o gene da L-LDH deletado para preparar uma transformante modificada para atenuar ou inativar a atividade da L-LDH e para aumentar a atividade da D-LDH (Exemplo 4). Assim, as transformantes preparadas foram cultivadas, e o ácido lático produzido por estas foi analisado. Como resultado, o D-ácido lático foi produzido em uma concentração de 41,6 g/l, mas não houve produção de L-ácido lático. O rendimento de produção do D-ácido lático produzido na presente invenção foi maior do que o do D-ácido lático produzido pela cepa produtora de D-ácido lático conhecida (Exemplo 5).
[0026] Por conseguinte, quando a atividade da L-LDH é atenuada ou inativada e a atividade da D-LDH é introduzida ou aumentada na cepa produtora de L-ácido lático que possui alto rendimento de produção de ácido lático, o D-ácido lático pode ser produzido com rendimento mais elevado do que o das cepas produtoras de D- ácido lático conhecidas.
[0027] Uma configuração da presente invenção proporciona uma cepa produtora de D-ácido lático modificada para atenuar ou inativar a atividade da L-LDH e para introduzir ou aumentar a atividade da D-LDH na cepa produtora de L-ácido lático que apresenta atividade da L-LDH usando o método acima.
[0028] A cepa produtora de D-ácido lático modificada pode ser uma cepa em que o polinucleotídeo que codifica a D-LDH é substituído pelo polinucleotídeo que codifica a L-LDH no cromossomo da cepa produtora de L-ácido lático ou é superexpresso. A cepa produtora de lático D modificada, embora não seja particularmente limitada, pode ser uma cepa na qual um polinucleotídeo que codifica a LDH1 (SEQ ID NO: 27) e um polinucleotídeo que codifica a LDH2 (SEQ ID NO: 28) de Lactobacillus casei são substituídos com um polinucleotídeo que codifica a LDHA (SEQ ID NO: 31) de Lactobacillus delbrueckii e um polinucleotídeo que codifica a LDHD (SEQ ID NO: 32) de Lactobacillus plantarum, respectivamente; uma cepa na qual um polinucleotídeo que codifica a LDH(LGG_02523) (SEQ ID NO: 29) e um polinucleotídeo que codifica a LDH(LGG_00606) (SEQ ID NO: 30) de Lactobacillus rhamnosus são substituídos por um polinucleotídeo que codifica a LDHA (SEQ ID NO: 31) de Lactobacillus delbrueckii e um polinucleotídeo que codifica a LDHD (SEQ ID NO: 32) de Lactobacillus plantarum, respectivamente; uma cepa na qual um polinucleotídeo que codifica a LDH (SEQ ID NO: 25) e um polinucleotídeo que codifica a LDH1 (SEQ ID NO: 26) de Lactobacillus paracasei são substituídos por um polinucleotídeo que codifica a LDHA (SEQ ID NO: 31) de Lactobacillus delbrueckii e um polinucleotídeo que codifica a LDHD (SEQ ID NO: 32) de Lactobacillus plantarum, respectivamente. Especificamente, a cepa produtora de D-ácido lático modificada pode ser uma cepa na qual um polinucleotídeo que codifica a LDH (SEQ ID NO: 25) e um polinucleotídeo que codifica a LDH1 (SEQ ID NO: 26) de Lactobacillus paracasei são substituídos por um polinucleotídeo que codifica a LDHA (SEQ ID NO: 31) de Lactobacillus delbrueckii e um polinucleotídeo que codifica a LDHD (SEQ ID NO: 32) de Lactobacillus plantarum, respectivamente, e mais especificamente, Lactobaciluus paracasei CC02-0095 (KCCM11273P)
[0029] Os presentes inventores produziram D-ácido lático utilizando cada uma das transformantes que foram modificadas para deletar cada um dos polinucleotídeos que codificam a L-LDH em cepas de Lactobacillus paracasei, Lactobacillus casei e Lactobacillus rhamnosus e para introduzir o polinucleotídeo que codifica a LDHA (SEQ ID NO: 31 ) de Lactobacillus delbrueckii e o polinucleotídeo que codifica a LDHD (SEQ ID NO: 32) de Lactobacillus plantarum, respectivamente, nas mesmas. Os valores de rendimento, produtividade, quantidade de produção, etc., do D-ácido lático foram comparados. Como resultado, foi confirmado que a transformante derivada de Lactobacillus paracasei (Lb. paracasei ldh::ldhA ldh1::ldhD) foi a melhor em termos de rendimento, produtividade, e quantidade de produção de D-ácido lático.
[0030] Consequentemente, os presentes inventores designaram a transformante (Lb. paracasei ldh::ldhA ldh1::ldhD) como Lactobacillus paracasei CC02-0095, em que a transformante foi a melhor em termos de rendimento, produtividade, e quantidade de produção de D-ácido lático. A cepa CC02-095 foi uma cepa preparada pela substituição do polinucleotídeo que codifica a LDH (SEQ ID NO: 25) e do polinucleotídeo que codifica a LDH1 (SEQ ID NO: 26) de Lactobacillus paracasei pelo polinucleotídeo que codifica a LDHA (SEQ ID NO: 31) de Lactobacillus delbrueckii e pelo polinucleotídeo que codifica a LDHD (SEQ ID NO: 32) de Lactobacillus plantarum. A transformante foi depositada no Korean Culture Center of Microorganisms (Centro Coreano de Cultura de Microrganismos, doravante abreviado como "KCCM") de acordo com o Tratado de Budapeste, em 02 de abril de 2012, com o N° de Depósito KCCM11273P.
[0031] Outra configuração da presente invenção proporciona um método para a produção de D-ácido lático, incluindo as etapas de (a) cultivar a cepa produtora de D-ácido lático modificada para se obter um caldo de cultura; e (b) recuperar o D- ácido lático a partir do caldo de cultura.
[0032] A cepa produtora de D-ácido lático modificada da presente invenção é uma cepa preparada a partir de uma cepa produtora de L-ácido lático que possui excelente produtibilidade de ácido lático de modo a fazer com que a cepa produza D-ácido lático. Portanto, quando a cepa produtora de D-ácido lático modificada é cultivada, o D-ácido lático produzido pode ser acumulado dentro da cepa ou no meio de cultura. Consequentemente, o D-ácido lático pode ser obtido por recuperação do D-ácido lático que se acumula dentro da cepa cultivada ou no meio de cultura.
[0033] Conforme utilizado aqui, o termo "cultura" significa todas as ações para cultivar um microrganismo em condições ambientais artificiais moderadamente controladas. Na presente invenção, a cultura é realizada com a finalidade de produzir D-ácido lático a partir da cepa produtora de ácido lático-D modificada, e um método específico para a cultura não é particularmente limitado, desde que possa produzir D-ácido lático a partir da cepa produtora de D-ácido lático modificada. A cultura pode ser realizada usando qualquer método conhecido no estado da técnica. Especificamente, a cultura pode ser realizada em um processo em batelada, um processo descontínuo alimentado, ou em um processo contínuo.
[0034] Especificamente, o meio utilizado para a cultura pode ter que satisfazer os requisitos de uma cepa específica de forma apropriada, ao mesmo tempo em que é feito o controle da temperatura, pH, etc., em condições aeróbicas em um meio típico contendo uma fonte de carbono adequada, uma fonte de nitrogênio, aminoácidos, vitaminas, etc. Fontes de carbono possíveis podem incluir uma mistura de glicose e xilose como fonte principal de carbono, açúcares e carboidratos tal como sacarose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose, óleos e gorduras, tal como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino e gordura de coco, ácidos graxos tal como ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico, alcoóis, tal como glicerol e etanol, e ácidos orgânicos tal como ácido acético. Estas substâncias podem ser utilizadas isoladamente ou em combinação. Possíveis fontes de nitrogênio podem incluir fontes de nitrogênio inorgânicas, tal como amônia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, acetato de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio; aminoácidos tal como ácido glutâmico, metionina e glutamina; e fontes de nitrogênio orgânicas tal como peptona, NZ-amina, extrato de carne, extrato de levedura, extrato de malte, licor de maceração de milho, hidrolisados de caseína, peixe ou produtos de decomposição deste, e bolo de soja desengordurado ou produtos de decomposição deste. Estas fontes de nitrogênio podem ser usadas isoladamente ou em combinação. O meio pode incluir dihidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato dipotássico ou os sais contendo sódio correspondentes como fontes de fósforo. As possíveis fontes de fósforo podem incluir dihidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato dipotássico ou os sais contendo sódio correspondentes. Além disso, podem ser utilizados compostos inorgânicos tal como cloreto de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de ferro, sulfato de magnésio, sulfato de ferro, sulfato de manganês e carbonato de cálcio. Além das substâncias referidas acima, podem ser incluídas substâncias de crescimento essenciais, tal como aminoácidos e vitaminas. Precursores apropriados também podem ser adicionados ao meio de cultura. As substâncias mencionadas acima podem ser adequadamente adicionadas ao meio de cultura em modo em batelada, descontínuo alimentado ou modo contínuo durante o cultivo, mas não estão particularmente limitadas a estas. O pH da cultura pode ser ajustado adequadamente pela adição de compostos básicos tal como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio e amônia, ou compostos acídicos tal como ácido fosfórico e ácido sulfúrico.
[0035] Um agente anti-espuma, tal como ésteres de poliglicol de ácidos graxos podem ser utilizados para suprimir o desenvolvimento de espuma. Para manter a condição aeróbica, oxigênio ou gás contendo oxigênio (por exemplo, ar) é introduzido no caldo de cultura. A temperatura do caldo de cultura é normalmente de 27°C a 37°C, especificamente 30°C a 35°C. A cultura pode ser continuada até que a produção de D-ácido lático tenha atingido um nível desejado, e pode ser continuada normalmente durante 10 a 100 horas. D-ácido lático pode ser liberado para o meio de cultura ou estar incluído dentro das células.
[0036] Além disso, a recuperação do D-ácido lático a partir do caldo de cultura pode ser realizada por um método conhecido no estado da técnica. Especificamente, o método conhecido para a recuperação do D-ácido lático não está particularmente limitado, desde que o método possa recuperar D-ácido lático do caldo de cultura. Especificamente, podem ser usados centrifugação, filtração, extração, pulverização, secagem, evaporação, precipitação, cristalização, eletroforese, dissolução fraccionada (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio, etc.), ou cromatografia (por exemplo, cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade, cromatografia hidrofóbica, e cromatografia de exclusão por tamanho, etc.).
[0037] Daqui em diante, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos Exemplos. No entanto, estes Exemplos são apenas para fins ilustrativos, e a invenção não deve ser limitada por estes Exemplos.
[0038] Cada uma dos 10 tipos de cepas produtoras de ácido lático do tipo selvagem foi inoculada em 50 ml de meio de cultura GY (5% de dextrose, 1% de extrato de levedura, 0,05% de citrato de sódio, 3% de CaCO3, 0,02% de MgSO4, 0,001% de MnSO4, 0,001% de FeSO4 e 0,001% de NaCl) e, em seguida, cultivada em condições anaeróbicas a 37°C durante 40 horas, seguido por análise por HPLC para determinação da proporção de D-ácido lático e L-ácido lático no caldo de fermentação (Fig. 1). A Figura 1 mostra um gráfico que representa os resultados da análise da proporção de D-ácido lático e L-ácido lático que foram produzidos por 10 tipos de cepas produtoras de ácido lático do tipo selvagem.
[0039] Cepas de Lactobacillus paracasei, Lactobacillus casei e Lactobacillus rhamnosus apresentando alta produtividade de ácido lático e uma proporção muito maior de L-ácido lático foram selecionadas dentre os 10 tipos de cepas. As cepas selecionadas foram modificadas para produzir D-ácido lático.
[0040] Para deletar um gene de indução de excesso de produção de L-ácido lático em cada uma das cepas selecionadas no Exemplo 1, as homologias entre o gene que codifica a L-LDH das cepas selecionadas foram comparadas e analisadas através de busca/pesquisa no U.S. National Center for Biotechnology Information (NCBI) (www .ncbi.nlm.nih.gov // www.ncbi.nlm.nih.gov) (Tabela 1). Tabela 1: Comparação da homologia entre o gene da L-LDH de Lactobacillus paracasei e genes homólogos
[0041] Conforme mostrado na Tabela 1, os genes de codificação da L-LDH de 3 tipos de cepas produtoras de ácido lático têm sequências de nucleotídeo muito semelhantes umas com as outras e, em particular, o ldh1 de Lactobacillus casei é conhecido como um gene de produção de L-ácido lático importante (J. Ind. Microbiotechnol., 2008, 35:579-586). Entretanto, o ldh2 de Lactobacillus casei é outro gene produtor de L-ácido lático. Os genes ldh1 e ldh2 foram deletados para preparar uma cepa produtora de D-ácido lático oticamente puro. Em resumo, do total de três tipos de cepas-mãe, os genes ldh e ldh1 de Lactobacillus paracasei, os genes ldh1 e ldh2 de Lactobacillus casei, e dois tipos de genes ldh de Lactobacillus rhamnosus foram selecionados como os genes para a deleção.
[0042] Os vetores para a deleção dos genes de L-LDH de Lactobacillus paracasei, Lactobacillus casei e Lactobacillus rhamnosus, que foram selecionados no Exemplo 2, foram preparados. Para preparar um cassete de deleção de L-LDH e inserção de D-LDH ao mesmo tempo, as sequências adjacentes da ORF (fase de leitura aberta) dos genes ldh e ldh1 de Lactobacillus paracasei, ldh1 e ldh2 de Lactobacillus casei, e LGG02523 e LGG00606 de Lactobacillus rhamnosus foram usadas como sequência de nucleotídeo homólogo e foram preparados primers com as sequências de números SEQ ID NOs. 1 a 24, (Tabela 2). Tabela 2: Sequência de nucleotídeo do primer
[0043] A sequência de 700 pares de bases na região 5' (ldh.pc_UP_700) e a sequência de 700 pares de bases na região 3' (ldh.pc_DOWN_700) da ORF do gene ldh foram amplificadas usando o genoma do Lactobacillus paracasei como um modelo e os primers de SEQ ID NOS. 1 e 2, e primers de SEQ ID NOS: 5 e 6. A sequência de 700 pares de bases na região 5' (ldh1.pc_UP_700) e a sequência de 700 pares de bases na região 3' (ldh1.pc_DOWN_700) da ORF do gene ldh1 também foram amplificadas usando os primers de SEQ ID NOS. 7 e 8, e primers de SEQ ID NOS: 11 e 12.
[0044] Entretanto, para amplificar o gene D-LDH, fragmentos de DNA de ldhA(Lb. db) e ldhD(Lb. pl) foram preparados utilizando os genomas do Lactobacillus delbrueckii e Lactobacillus plantarum como modelo e os primers de SEQ ID NOS. 3 e 4, e primers de SEQ ID NOS: 9 e 10.
[0045] Subsequentemente, foi realizada uma PCR de sobreposição usando os fragmentos de DNA amplificados, ldh.pc_UP_700, ldh.pc_DOWN_700 e ldhA(Lb. db), e os primers de SEQ ID NOS. 1 e 6, de modo a preparar um cassete δldh.pc- ldhA(Lb. db). O cassete δldh.pc-ldhA(Lb. db) tem uma sequência nucleotídica homóloga às sequências adjacentes à região ORF do ldh e a D-lactato desidrogenase está localizada no meio do cassete. Além disso, o gene ldh1 foi submetido aos mesmos procedimentos para preparar um cassete δldh1.pc-ldhD(Lb. pl). A este respeito, cada cassete foi projetado para conter um sítio de enzima de restrição XhoI na extremidade 5', e um sítio de enzima de restrição Spel na extremidade 3'.
[0046] Como os genes ldh1 e ldh2 de Lactobacillus casei eram muito semelhantes aos genes de ldh e ldh1 de Lactobacillus paracasei, respectivamente, foram utilizados os mesmos primers. ldh1.ca_UP_700 e a sequência de 700 pares de bases na região 3' (ldh1.ca_DOWN_700) foram amplificadas usando o genoma do Lactobacillus casei como um modelo e os primers de SEQ ID NOS. 1 e 2, e primers de SEQ ID NOS: 5 e 6. Os 700 pares de bases na região 5' (ldh2.ca_UP_700) e a sequência de 700 pares de bases na região 3' (ldh2.ca_DOWN_700) da ORF do gene ldh2 também foram amplificadas usando os primers de SEQ ID NOS. 7 e 8, e primers de SEQ ID NOS: 11 e 12.
[0047] Subsequentemente, foi realizada uma PCR de sobreposição usando ldh1.ca_UP_700, ldh1.ca_DOWN_700, ldhA(Lb. db), e os primers de SEQ ID NOS. 1 e 6, de modo a preparar um cassete δldh1.ca-ldhA (Lb. db). O cassete δldh1.ca- ldhA(Lb. db) tem uma sequência nucleotídica homóloga às sequências adjacentes à região ORF do ldh1 e a D-lactato desidrogenase está localizada no meio do cassete. Além disso, o gene ldh2 foi submetido aos mesmos procedimentos para preparar um cassete δldh2.ca-ldhD(Lb. pl).
[0048] A sequência de 700 pares de bases na região 5' (LGG_02523_UP_700) e a sequência de 700 pares de bases na região 3' (LGG_02523_DOWN_700) da ORF do gene LGG_02523 foram amplificadas usando o genoma do Lactobacillus rhamnosus como um modelo e os primers de SEQ ID NOS. 13 e 14, e primers de SEQ ID NOS: 17 e 18. A sequência de 700 pares de bases na região 5' (LGG_00606_UP_700) e a sequência de 700 pares de bases na região 3' (LGG_00606_DOWN_700) da ORF do gene LGG_00606 também foram amplificadas usando os primers de SEQ ID NOS. 19 e 20, e primers de SEQ ID NOS: 23 e 24.
[0049] Entretanto, para amplificar o gene da D-LDH, fragmentos de DNA de ldhA(Lb. db) e ldhD(Lb. pl) foram preparados utilizando os genomas do Lactobacillus delbrueckii e Lactobacillus plantarum como modelo e os primers de SEQ ID NOS. 15 e 16, e primers de SEQ ID NOS: 21 e 22.
[0050] Subsequentemente, foi realizada uma PCR de sobreposição usando os fragmentos de DNA amplificados, LGG_02523_UP_700, LGG_02523 _DOWN_700, ldhA(Lb. db) e os primers de SEQ ID NOS. 13 e 18, de modo a preparar um cassete δLGG_02523-ldhA(Lb. db). O cassete δLGG_02523-ldhA(Lb. db) tem uma sequência nucleotídica homóloga às sequências adjacentes à região ORF do LGG_02523 e a D-lactato desidrogenase está localizada no meio do cassete. Além disso, o gene LGG_00606 foi submetido aos mesmos procedimentos para preparar um cassete δLGG_00606-ldhD(Lb. pl). A este respeito, cada cassete foi projetado para conter um sítio de enzima de restrição XhoI na extremidade 5', e um sítio de enzima de restrição Spel na extremidade 3'.
[0051] Subsequentemente, cada um dos seis tipos de cassetes foi clonado utilizando os sítios de enzima de restrição Xhol e Spel em um vetor sensível ao calor, pG+host6, que é caracterizado pelo fato de conter genes de resistência à ampicilina e à eritromicina e, portanto, é usado como um vetor do tipo ponte de bactérias E. choli de ácido lático, e não é amplificado em Lactobacillus a 42°C. Portanto, foram preparados 6 tipos de vetores, pG+host6-δldh.pc-ldhA(Lb. db) e pG+host6-δldh1.pc- ldhD(Lb. pl), pG+host6-δldh1.ca-ldhA(Lb. db) e pG+host6-δldh2.ca-ldhD(Lb. pl), e pG+host6-δLGG_02523-ldhA(Lb. db) e pG+host6-δLGG_00606-ldhD(Lb. pl).
[0052] Cepas de Lactobacillus paracasei, Lactobacillus casei ou Lactobacillus rhamnosus cultivadas em meio MRS sólido durante um dia foram inoculadas em 10 ml de meio de cultura MRS, seguido por cultura estacionária a 37°C durante um dia. 50 ml de MRS foram colocados em um tubo de 50 ml, e 500 μl de cada uma das cepas cultivadas durante um dia foram inoculados neste, seguido por cultura estacionária a 37°C durante 3 horas e 30 minutos. Quando a OD600 atingiu 0,8, os caldos de cultura foram colocados em um banho de gelo durante 5 minutos. Em seguida, os meios foram removidos dos caldos de cultura por centrifugação para a obtenção apenas das cepas. As cepas foram lavadas com um tampão de lavagem (5 mM de fosfato de sódio, 1 mM de MgCl2, pH 7,4) duas vezes. Subsequentemente, 25 μl de solução de sacarose 0,5 M foram adicionados às cepas , seguido por suspensão. Cada 50 μl desta foi dispensado. Cada 200 ng dos vetores preparados nos Exemplos 3 foram adicionados às cepas, seguido por eletroporação nas condições de 1800 v, 25 F e 200 Q. Depois disso, as cepas foram cultivadas em 500 μl de MRS a 37°C durante 2 horas e, em seguida, espalhadas sobre meio MRS sólido (MRSE) contendo 10 μg/ml de eritromicina, e cultivadas a 30°C durante 3 dias para a obtenção de colônias.
[0053] Uma porção das colônias obtidas a partir da transformante derivada de Lactobacillus paracasei (cepa de Lactobacillus com um plasmídeo pG+host6-δldh1- ldhA inserido contendo ldhA derivado de Lactobacillus delbrueckii) dentre as colônias obtidas no Exemplo 4 foi inoculada em 1 ml de meio MRS líquido contendo 10 μg/ml de eritromicina, seguido por cultura estacionária a 42°C durante um dia para indução do crossover primário. 100 μl do caldo de cultura foram espalhados em meio sólido MRSE, e incubados durante 7 dias para a obtenção de colônias. Cada colônia isolada foi subcultivada em meio de cultura MRSE sólido a 42°C durante 2 dias. Cada uma das cepas obtidas foi inoculada em um tubo de 1,5 ml contendo 1 ml de MRS, seguido por cultura estacionária a 37°C durante um dia para indução do crossover secundário. Uma porção das cepas cultivadas a 37°C foi submetida à PCR da colônia para examinar a inserção do gene ldhA(Lb. db) na região do ldh1, e as colônias individuais foram selecionadas em meio MRS sólido. Colônias individuais foram submetidas a PCR para examinar a deleção do gene ldh e a inserção da D-lactato desidrogenase e, finalmente, foi preparada uma cepa ldh1::ldhA(Lb. db). Esta cepa foi utilizada como cepa-mãe, e a deleção do ldh e inserção do ldhD(Lb pl.) foram realizadas da mesma maneira, para preparar uma cepa final produtora de D-ácido lático, em que foram deletados dois tipos de L-lactato desidrogenase.
[0054] Ao mesmo tempo, Lactobacillus casei e Lactobacillus rhamnosus foram submetidos aos mesmos procedimentos para preparar cepas produtoras de D-ácido lático, em que foram deletados dois tipos de L-lactato desidrogenase.
[0055] Resultados da fermentação entre o novo Lactobacillus do tipo D modificado que foi preparado na presente invenção e os dois tipos de cepas produtoras de D-ácido lático recombinantes conhecidas com base em Lb. plantarum. Com relação a isso, a cepa produtora de D-ácido lático recombinante conhecida com base em Lb. plantarum é uma cepa em que qualquer um ou ambos os dois tipos de sua própria L-lactato desidrogenase foi/foram deletados, e foi preparada por um método semelhante ao do trabalho publicado por Okano et al. (Appl. Environ. Microbiol. (2009) 462~467). Estas cepas têm a deleção dos gene ldhL1 ou ldhL2 , e produzem D-ácido lático com pureza ótica de 99% ou superior.
[0056] Em uma experiência comparativa específica, dois tipos de cepas produtoras de D-ácido lático a base de Lactobacillus plantarum e três novos tipos de cepas de Lactobacillus recombinantes foram cultivados em meio MRS sólido por um dia, e cada uma das colônias de células obtida foi inoculada em MRS líquido, seguido por cultura a 37°C durante um dia. Um total de 5 tipos de cepas de Lactobacillus recombinantes foram inoculadas em um balão de 250 ml com saliências/reentrâncias contendo 25 ml de meio de cultura GY líquido com densidade ótica de células inicial de 0,1 a 600 nm. A experiência foi realizada em uma incubadora a uma temperatura de 37°C com agitação a 100 rpm. O tempo total de cultura foi de 42 horas. As amostras do caldo de cultura foram colhidas no instante inicial da inoculação e no instante final de fermentação, e uma quantidade adequada destas foi centrifugada para obtenção do sobrenadante, seguida por HPLC. Como resultado, a concentração inicial de glicose foi de 53 g/l. Os dados analisados foram a média dos resultados das experiências repetidas duas vezes. Os resultados são apresentados na Tabela 3 a seguir. A quantificação enzimática mostrou que o ácido lático produzido em todas as amostras foi o ácido láctico D oticamente puro (ácido lático, R-Biopharm, Germany). Tabela 3: Comparação da produtividade de ácido lático entre as cepas
[0057] Conforme mostrado na Tabela 3, foi descoberto que três tipos de novas cepas recombinantes de Lactobacillus preparadas na presente invenção tinham rendimento, produtividade e quantidade de produção de D-ácido lático maiores do que as cepas conhecidas (Lb. plantarum ΔldhL1 e Lb. plantarum ΔldhL1 ΔldhL2) em que qualquer um ou ambos os dois tipos de sua própria L-lactato desidrogenase foi/foram eliminados. Em particular, foi descoberto que a transformante derivada de Lactobacillus paracasei (Lb. paracasei ldh::ldhA ldh1::ldhD) foi a de maior rendimento, produtividade, e quantidade de produção de D-ácido lático.
[0058] Consequentemente, os presentes inventores designaram a transformante (Lb. paracasei ldh::ldhA ldh1::ldhD) como Lactobacillus paracasei CC02-0095. A transformante que foi modificada pela substituição do polinucleotídeo que codifica a LDH (SEQ ID NO: 25) e do polinucleotídeo que codifica a LDH1 (SEQ ID NO: 26) de Lactobacillus paracasei pelo polinucleotídeo que codifica a LDHA (SEQ ID NO: 31) de Lactobacillus delbrueckii e pelo polinucleotídeo que codifica a LDHD (SEQ ID NO: 32) de Lactobacillus plantarum, apresentou os melhores valores em termos de rendimento, produtividade e quantidade de produção de D-ácido lático. A transformante foi depositada no Korean Culture Center of Microorganisms (Centro Coreano de Cultura de Microrganismos, doravante abreviado como "KCCM", de acordo com o Tratado de Budapeste) em 02 de abril de 2012, com o N° de Depósito KCCM11273P.
[0059] Será evidente para os especialistas na técnica que várias modificações e alterações podem ser feitas sem sair do escopo e do espírito da invenção. Portanto, deve ser entendido que a configuração acima não é limitativa, mas ilustrativa em todos os aspectos. O escopo da invenção inclui não só as reivindicações anexas mas também todas as alterações e modificações dos limites das reivindicações, ou equivalentes.
[0060] A cepa produtora de D-ácido lático modificada da presente invenção é uma cepa preparada a partir de uma cepa produtora de L-ácido lático que possui excelente produtividade de ácido lático e, portanto, tem uma produtividade de D- ácido lático excelente. Portanto, a cepa pode ser amplamente usada para melhorar a produtividade de vários produtos que são fabricados utilizando D-ácido lático como matéria-prima.
Claims (11)
1. Cepa de Lactobacillus sp. produtora de D-ácido lático, caracterizada por ser modificada para atenuar ou inativar a atividade da L- lactato desidrogenase (L-LDH) por inativação do polinucleotídeo codificador de L-LDH e para aumentar a atividade da D-lactato-desidrogenase (D-LDH) pela introdução de polinucleotídeo que codifica D-LDH em uma cepa de Lactobacillus sp. produtora de L-ácido lático em maior quantidade do que D-ácido lático, em que o polinucleotídeo que codifica a L-LDH é selecionado do grupo que consiste em ldh (SEQ ID NO: 25) e ldh1 (SEQ ID NO: 26) de Lactobacillus paracasei, ldh1 (SEQ ID NO: 27) e ldh2 (SEQ ID NO: 28) de Lactobacillus paracasei, e ldh (LGG_02523) (SEQ ID NO: 29) e ldh (LGG_00606) (SEQ ID NO: 30) de Lactobacillus rhamnosus, e em que o polinucleotídeo que codifica a D-LDH é um polinucleotideo codificador de LDHA (SEQ ID NO: 31) de Lactobacillus delbrueckii ou um polinucleotideo codificador de LDHD (SEQ ID NO: 32) de Lactobacillus plantarum.
2. Cepa de Lactobacillus sp. produtora de D-ácido lático, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por um ou mais polinucleotídeos heterogênes que codificam a D-LDH serem substituídos pelo polinucleotídeo que codifica a L-LDH no cromossomo e serem superexpressas.
3. Cepa de Lactobacillus sp. produtora de D-ácido lático, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por um polinucleotídeo que codifica a LDH1 (SEQ ID NO: 27) e um polinucleotídeo que codifica a LDH2 (SEQ ID NO: 28) de Lactobacillus casei serem substituídos por um polinucleotídeo que codifica a LDHA (SEQ ID NO: 31) de Lactobacillus delbrueckii e um polinucleotídeo que codifica a LDHD (SEQ ID NO: 32) de Lactobacillus plantarum, respectivamente.
4. Cepa de Lactobacillus sp. produtora de D-ácido lático, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por um polinucleotídeo que codifica a LDH (SEQ ID NO: 25) e um polinucleotídeo que codifica a LDH1 (SEQ ID NO: 26) de Lactobacillus paracasei serem substituídos por um polinucleotídeo que codifica a LDHA (SEQ ID NO: 31) de Lactobacillus delbrueckii e um polinucleotídeo que codifica a LDHD (SEQ ID NO: 32) de Lactobacillus plantarum, respectivamente.
5. Cepa de Lactobacillus sp. produtora de D-ácido lático, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por um polinucleotídeo que codifica a LDH (LGG_02523) (SEQ ID NO: 29) e um polinucleotídeo que codifica a LDH (LGG_00606) (SEQ ID NO: 30) de Lactobacillus rhamnosus serem substituídos por um polinucleotídeo que codifica a LDHA (SEQ ID NO: 31) de Lactobacillus delbrueckii e um polinucleotídeo que codifica a LDHD (SEQ ID NO: 32) de Lactobacillus plantarum, respectivamente.
6. Cepa de Lactobacillus sp. produtora de D-ácido lático, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por o Lactobacillus paracasei CC02-0095 estar depositada com o N° de Depósito KCCM11273P.
7. Método de preparação de uma cepa de Lactobacillus sp. produtora de D-ácido lático modificada de uma cepa de Lactobacillus sp. produtora de L- ácido lático em maior quantidade do que D-ácido lático, caracterizado por compreender: (a) atenuar ou inativar a atividade da L-lactato desidrogenase (L-LDH) por inativação do polinucleotídeo codificador de L-LDH na cepa de Lactobacillus sp. produtora de L-ácido lático em maior quantidade do que D-ácido lático para obter uma cepa de Lactobacillus sp. produtora de ácido lático modificada; e (b) introduzir ou aumentar a atividade da D-lactato desidrogenase (D- LDH) pela introdução de polinucleotídeo que codifica D-LDH na cepa de Lactobacillus sp. produtora de ácido lático modificada, em que o polinucleotídeo que codifica a L-LDH é selecionado do grupo que consiste em ldh (SEQ ID NO: 25) e ldh1 (SEQ ID NO: 26) de Lactobacillus paracasei, ldh1 (SEQ ID NO: 27) e ldh2 (SEQ ID NO: 28) de Lactobacillus paracasei, e ldh (LGG_02523) (SEQ ID NO: 29) e ldh (LGG_00606) (SEQ ID NO: 30) de Lactobacillus rhamnosus, e em que o polinucleotídeo que codifica a D-LDH é um polinucleotideo codificador de LDHA (SEQ ID NO: 31) de Lactobacillus delbrueckii ou um polinucleotideo codificador de LDHD (SEQ ID NO: 32) de Lactobacillus plantarum.
8. Método de preparação de uma cepa de Lactobacillus sp. produtora de D-ácido lático modificada de uma cepa de Lactobacillus sp. produtora de L- ácido lático em maior quantidade do que D-ácido lático, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a cepa de Lactobacillus sp. produtora de L- ácido lático em maior quantidade do que D-ácido lático ser selecionada do grupo compreendendo Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei, e Lactobacillus casei.
9. Método para a produção de D-ácido lático, caracterizado por compreender: (a) cultivar a cepa de Lactobacillus sp. produtora de D-ácido láctico modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 para obter um meio de cultura; e (b) recuperar o D-ácido lático do meio de cultura.
10. Método para a produção de D-ácido lático, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a cepa de Lactobacillus sp. produtora de D- ácido láctico modificada ser Lactobacillus paracasei CC02-0095 depositada com o N° de Depósito KCCM11273P.
11. Método para a produção de D-ácido lático, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a recuperação do D-ácido lático ser por um método selecionado do grupo consistindo de centrifugação, filtração, extração, pulverização, secagem, evaporação, precipitação, cristalização, eletroforese, dissolução fracionada, cromatografia e combinações dos mesmos.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20120042894A KR101438882B1 (ko) | 2012-04-24 | 2012-04-24 | 신규한 ｄ형 젖산 생산균주 |
| KR10-2012-0042894 | 2012-04-24 | ||
| PCT/KR2013/003501 WO2013162274A1 (ko) | 2012-04-24 | 2013-04-24 | 신규한 ｄ형 젖산 생산균주 및 그의 용도 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR112014026720A2 BR112014026720A2 (pt) | 2017-06-27 |
| BR112014026720B1 true BR112014026720B1 (pt) | 2023-02-23 |
Family
ID=49483496
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BR112014026720-0A BR112014026720B1 (pt) | 2012-04-24 | 2013-04-24 | Cepa de lactobacillus sp. produtora de d-ácido lático, método de preparação da dita cepa e método para a produção de d-ácido lático |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10138500B2 (pt) |
| EP (1) | EP2843039B1 (pt) |
| JP (2) | JP6085023B2 (pt) |
| KR (1) | KR101438882B1 (pt) |
| CN (1) | CN104395456A (pt) |
| AU (1) | AU2013253153B2 (pt) |
| BR (1) | BR112014026720B1 (pt) |
| MY (1) | MY182333A (pt) |
| PL (1) | PL2843039T3 (pt) |
| RU (1) | RU2639507C2 (pt) |
| SG (2) | SG10201803888UA (pt) |
| UA (1) | UA116444C2 (pt) |
| WO (1) | WO2013162274A1 (pt) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101438882B1 (ko) * | 2012-04-24 | 2014-09-05 | 씨제이제일제당 (주) | 신규한 ｄ형 젖산 생산균주 |
| KR102214835B1 (ko) * | 2014-09-19 | 2021-02-10 | 삼성전자주식회사 | 락테이트 데히드로게나제 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포, 및 이를 이용한 락테이트의 생산 방법 |
| KR102144997B1 (ko) * | 2014-02-14 | 2020-08-14 | 삼성전자주식회사 | 락테이트 데히드로게나제 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포, 상기 변이체의 제조 방법 및 이를 이용한 락테이트의 생산 방법 |
| KR101577134B1 (ko) * | 2014-05-09 | 2015-12-14 | 씨제이제일제당 (주) | 젖산 생산이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 젖산을 생산하는 방법 |
| JP6637026B2 (ja) * | 2014-07-23 | 2020-01-29 | ピュラック バイオケム ビー． ブイ． | 遺伝子改変された（ｒ）−乳酸産生好熱性細菌 |
| KR101719035B1 (ko) * | 2014-09-19 | 2017-03-23 | 포항공과대학교 산학협력단 | 신규 효소를 사용한 d형 젖산의 제조 |
| KR102581464B1 (ko) * | 2015-05-28 | 2023-09-21 | 삼성전자주식회사 | 락테이트 데히드로게나제 변이체를 스크리닝하는 방법, 락테이트 데히드로게나제 변이체, 상기 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 벡터, 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 락테이트를 생산하는 방법 |
| US10155967B2 (en) | 2015-06-12 | 2018-12-18 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism having enhanced productivity of lactic acid and a process for producing lactic acid using the same |
| MY182357A (en) * | 2015-10-16 | 2021-01-20 | Iner Aec Executive Yuan | Highly optically pure l-lactic acid-producing strain with tolerance to lignocellulosic hydrolysate |
| CN107267476B (zh) * | 2016-04-08 | 2019-08-30 | 中国科学院微生物研究所 | 一种乳酸脱氢酶及其在制备乳酸中应用 |
| CN109385389A (zh) * | 2017-08-08 | 2019-02-26 | 光明乳业股份有限公司 | 一种缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ及其制备方法 |
| KR101915463B1 (ko) | 2018-05-02 | 2018-11-06 | (주)잇츠한불 | 신규한 락토바실러스 펜토서스 균주 및 이를 포함하는 프로바이오틱스 제제 또는 조성물 |
| CN109504630B (zh) * | 2018-12-17 | 2022-03-11 | 吉林中粮生化有限公司 | 一种重组d-乳酸生产植物乳杆菌菌株及利用该菌株生产d-乳酸的方法 |
| JP2021007309A (ja) * | 2019-06-28 | 2021-01-28 | 裕希 土肥 | 形質転換体およびそれを用いたｄ−乳酸の生産方法 |
| CN111500517B (zh) * | 2020-05-27 | 2020-12-11 | 吉林中粮生化有限公司 | 产l-乳酸的重组菌株及其构建方法和发酵产l-乳酸的方法及应用 |
| CN111849852A (zh) * | 2020-06-01 | 2020-10-30 | 华东理工大学 | 一种高光学纯l-乳酸工程菌的构建方法 |
| CN111378698B (zh) * | 2020-06-01 | 2020-12-25 | 中粮营养健康研究院有限公司 | 发酵制备d-乳酸的方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2931939B2 (ja) | 1992-07-10 | 1999-08-09 | 明治乳業株式会社 | Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ 種染色体への遺伝子組込み方法及び遺伝子組込み体 |
| PH31093A (en) * | 1993-08-06 | 1998-02-05 | Nestec Ltd | Lactobacillus bulgaricus having decreased acid production and/or improved aroma and flavor production and food composition comprising said lactobacillus. |
| ATE365805T1 (de) * | 1997-05-03 | 2007-07-15 | Nestle Sa | Herstellung von l(+)-lactat |
| US7232664B2 (en) * | 2002-05-30 | 2007-06-19 | Natureworks Llc | Fermentation process using specific oxygen uptake rates as a process control |
| CN1245515C (zh) * | 2004-03-03 | 2006-03-15 | 南开大学 | L－乳酸脱氢酶基因、包括该基因的重组载体及其宿主细胞 |
| US20060025190A1 (en) | 2004-07-28 | 2006-02-02 | Kraft David W | System and method of gaming involving continued distribution of components until certain criteria are met |
| DE102007047206B4 (de) * | 2007-10-02 | 2016-08-11 | Insilico Biotechnology Ag | Biotechnologische Fixierung von Kohlenstoffdioxid |
| CN101993850B (zh) * | 2010-08-08 | 2012-11-14 | 天津大学 | 一种生产d-乳酸基因工程菌及构建方法和应用 |
| KR101438882B1 (ko) | 2012-04-24 | 2014-09-05 | 씨제이제일제당 (주) | 신규한 ｄ형 젖산 생산균주 |
-
2012
- 2012-04-24 KR KR20120042894A patent/KR101438882B1/ko active IP Right Grant
-
2013
- 2013-04-24 WO PCT/KR2013/003501 patent/WO2013162274A1/ko active Application Filing
- 2013-04-24 PL PL13780610T patent/PL2843039T3/pl unknown
- 2013-04-24 RU RU2014144647A patent/RU2639507C2/ru active
- 2013-04-24 JP JP2015508862A patent/JP6085023B2/ja active Active
- 2013-04-24 EP EP13780610.5A patent/EP2843039B1/en active Active
- 2013-04-24 SG SG10201803888UA patent/SG10201803888UA/en unknown
- 2013-04-24 MY MYPI2014003012A patent/MY182333A/en unknown
- 2013-04-24 US US14/397,117 patent/US10138500B2/en active Active
- 2013-04-24 BR BR112014026720-0A patent/BR112014026720B1/pt active IP Right Grant
- 2013-04-24 UA UAA201411896A patent/UA116444C2/uk unknown
- 2013-04-24 AU AU2013253153A patent/AU2013253153B2/en active Active
- 2013-04-24 CN CN201380033424.1A patent/CN104395456A/zh active Pending
- 2013-04-24 SG SG11201406876VA patent/SG11201406876VA/en unknown
-
2016
- 2016-11-07 JP JP2016216887A patent/JP2017070288A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2843039B1 (en) | 2020-11-04 |
| EP2843039A1 (en) | 2015-03-04 |
| JP2015514434A (ja) | 2015-05-21 |
| JP6085023B2 (ja) | 2017-02-22 |
| US10138500B2 (en) | 2018-11-27 |
| KR20130126809A (ko) | 2013-11-21 |
| PL2843039T3 (pl) | 2021-07-05 |
| US20150118724A1 (en) | 2015-04-30 |
| AU2013253153A1 (en) | 2014-11-20 |
| BR112014026720A2 (pt) | 2017-06-27 |
| UA116444C2 (uk) | 2018-03-26 |
| WO2013162274A1 (ko) | 2013-10-31 |
| EP2843039A4 (en) | 2016-01-06 |
| MY182333A (en) | 2021-01-19 |
| SG10201803888UA (en) | 2018-06-28 |
| AU2013253153B2 (en) | 2017-06-08 |
| SG11201406876VA (en) | 2015-01-29 |
| CN104395456A (zh) | 2015-03-04 |
| RU2014144647A (ru) | 2016-06-10 |
| JP2017070288A (ja) | 2017-04-13 |
| RU2639507C2 (ru) | 2017-12-21 |
| KR101438882B1 (ko) | 2014-09-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BR112014026720B1 (pt) | Cepa de lactobacillus sp. produtora de d-ácido lático, método de preparação da dita cepa e método para a produção de d-ácido lático | |
| ES2654809T3 (es) | Microorganismos de Corynebacterium que pueden utilizar xilosa y procedimiento de producción de L-lisina utilizando los mismos | |
| JP2023071883A (ja) | Ｌ－グルタミン酸生産能が向上した変異菌株、およびそれを用いたｌ－グルタミン酸の製造方法 | |
| BR112015020274B1 (pt) | Cepa produtora de l-valina transformada para melhorar a expressão do óperon da lvalina, método para a produção da l-valina e variante da região reguladora do óperon da l-valina | |
| BR112014015215B1 (pt) | Microrganismo produtor de lisina e método para a produção de l-lisina | |
| BRPI0214366B1 (pt) | célula de candida e, métodos para produzir um ou mais de isocitrato, alfa-cetoglutarato, lactato, succinato, malato, fumarato, oxaloacetato, citrato e acrilato, e para produzir uma célula | |
| BRPI0604949B1 (pt) | Micro-organismo do gênero corynebacterium e método de produção de l-lisina | |
| CN106029879B (zh) | 具有提高的l-苏氨酸生产能力的微生物以及使用其生产l-苏氨酸的方法 | |
| BR112020003467B1 (pt) | Método para preparar uma composição fermentada, e, composição fermentada | |
| BR112019014101B1 (pt) | Variante de proteína que tem uma atividade de exportação de inosina-5'-monofosfato, polinucleotídeo, vetor, micro-organismo do gênero corynebacterium que produz inosina-5'- monofosfato, método para preparar inosina-5'-monofosfato e uso da variante de proteína | |
| BR112020004575A2 (pt) | polinucleotídeo, vetor, microrganismo do gênero corynebacterium, métodos para produção de substância-alvo e para preparar uma composição fermentada, e, composição fermentada. | |
| BR112016030467B1 (pt) | Microrganismo do gênero escherichia produtor de l-triptofano e método para produzir l-triptofano usando o mesmo | |
| US20210324427A1 (en) | Genetically modified bacterium for producing lactate from co2 | |
| BR112016023337B1 (pt) | Microrganismo tendo capacidade de produção de l-lisina e método de produção de l-lisina utilizando o mesmo | |
| US9605280B2 (en) | Escherichia coli containing mutated lpdA gene and application thereof | |
| RU2668176C1 (ru) | Микроорганизм с улучшенной способностью продуцировать L-лизин и способ получения L-лизина с использованием этого микроорганизма | |
| JP4312608B2 (ja) | 酢酸菌のスクアレン−ホペンサイクラーゼ遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法 | |
| KR101622460B1 (ko) | Ｌ-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물 및 이를 이용한 ｌ-오르니틴의 제조방법 | |
| KR101526047B1 (ko) | 아미노트랜스퍼라제 활성 강화를 통하여 ｌ-오르니틴 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-오르니틴의 제조방법 | |
| KR20230175159A (ko) | L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법 | |
| TWI659101B (zh) | 具有增進乳酸生產力之微生物及使用該微生物生產乳酸之方法 | |
| KR20240086753A (ko) | 신규한 프로피온알데하이드 디하이드로게나제 활성을 갖는 변이체 폴리펩티드 및 이의 용도 | |
| KR20240013960A (ko) | L-아르기닌 또는 l-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 또는 l-시트룰린의 생산 방법 | |
| KR20230084993A (ko) | L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법 | |
| BR112016026286B1 (pt) | Micro-organismo com produtividade aumentada de ácido láctico e processo para produzir ácido láctico utilizando o mesmo |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B06U | Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette] | ||
| B06G | Technical and formal requirements: other requirements [chapter 6.7 patent gazette] | ||
| B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 24/04/2013, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS |