BRPI0214366B1 - célula de candida e, métodos para produzir um ou mais de isocitrato, alfa-cetoglutarato, lactato, succinato, malato, fumarato, oxaloacetato, citrato e acrilato, e para produzir uma célula - Google Patents

Abstract

"construção de ácido nucleico recombinante, célula e, métodos para produzir ácido láctico, e para reduzir a atividade de piruvato descarboxilase em uma célula". a presente invenção refere-se a biocatalisadores que são células, otimamente do fenótipo negativo para macieira silvestre, compreendendo vetores de expressão codificando genes heterólogos à célula que permitem aumentada produção de produtos orgânicos. mais especificamente, a invenção refere-se a célula de candida geneticamente modificadas, métodos para fazer as células de candida, e seu uso na produção de produtos orgânicos, particularmente ácido láctico.

Description

“CÉLULA DE CANDIDA E, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM OU MAIS DE ISOCITRATO, ALFA-CETOGLUTARATO, LACTATO, SUCCINATO, MALATO, FUMARATO, OXALOACETATO, CITRATO E ACR1LATO, E PARA PRODUZIR UMA CÉLULA” Este pedido é uma continuação-em-parte do Pedido de Patente US com número de série 09/992,430, depositado em 23 de novembro de 2001, que reivindica prioridade relativamente ao Pedido Provisório US 60/252,541, depositado em 22 de novembro 2000* FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO O uso de microorganismos para sintetiza/compreendendo de produtos orgânicos industrialmente importantes é bem conhecido. Abordagens biossintéticas para a produção de produtos orgânicos podem ser extremamente eficientes quando comparadas com a síntese química em grande escala. Vantagens que uma abordagem biossintética pode possuir relativamente a uma abordagem química sintética para a manufatura de um produto orgânico incluem rendimento mais rápido e mais eficiente de produto, pureza isomérica, e custo reduzido (ver Thomas et al., 2002, Trends BiotechnoL 20: 238-42). Ácido lãctico possui uma ampla aplicabilidade industrial, incluindo usos no processamento e na síntese química, na produção de cosméticos, farmacêuticos, plásticos, e produção de alimentos. Ácido láctico é uma molécula orgânica relativamente simples, e pode ser produzido por meio de síntese química ou por meio de fermentação em microorganismos (biossíntese). À medida que a manipulação genética de microorganismos se tomou mais avançada, processos de fermentação para produção de ácido láctico tornaram-se comercial mente preferidos em detrimento da síntese química. Uma razão para esta preferência é que a utilização de microorganismos geneticamente modificados permite a produção de produto opticamcntc puro (i.e., isômero L(+) ou D(-)). Referidos métodos eliminam a necessidade de separar misturas racêmicas de produto, reduzindo assim o custo.

No entanto, o uso de microorganismos para produzir produtos orgânicos apresenta determinadas limitações. Por exemplo, bactérias podem produzir grandes quantidades de produtos orgânicos em condições de fermentação, porém o acúmulo de produtos orgânicos dentro das próprias bactérias e no meio de crescimento pode inibir a proliferação das bactérias, ou causar morte da célula. Mesmo quando organismos mais robustos são manipulados e usados para produção, como o SaccharomyceS. cerevisiae acidofílico da levedura, produtos orgânicos podem levar a morte celular, à supressão do crescimento celular, reduzindo o rendimento global do produto orgânico. Assim, permanece na arte a necessidade de microorganismos robustos que sejam passíveis de manipulação genética, para uso em biorreatores e com outros métodos sintéticos para produzir produtos orgânicos industrialmente importantes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção proporciona métodos e reagentes, particularmente células e células recombinantes, para produzir produtos orgânicos por meio de biossíntese. A invenção proporciona especificamente construções de ácido nucleico recombinante que codificam pelo menos uma proteína útil para a síntese de um produto orgânico, células compreendendo referidas construções, particularmente células negativas para Crabtree, métodos de preparação de referidas células, métodos de cultivar referidas células, e métodos e reagentes para sintetizar numerosos produtos orgânicos in vivo.

Em um aspecto, a invenção proporciona construções de ácido nucleico recombinante compreendendo uma seqüência que codifica pelo menos uma proteína útil para a síntese de um produto orgânico. Em um concretização preferida, a construção de ácido nucléico recombinante codifica lactato desidrogenase. Em uma concretização deste aspecto, a construção de ácido nucléico recombinante compreende um promotor ligado operacionalmente ao ácido nucléico que codifica uma proteína útil para síntese de um produto orgânico, sendo que o promotor é um promotor de uma espécie de Candida, de preferência a espécie de Candida que compreende a construção de ácido nucléico recombinante.

Em outro aspecto, a invenção proporciona uma célula negativa para Crabtree transformada do gênero Candida, compreendendo a construção de ácido nucléico recombinante que codifica pelo menos uma proteína útil para a síntese de um produto orgânico. Em uma concretização preferida, a construção de ácido nucléico recombinante codifica lactato desidrogenase. Em uma concretização deste aspecto, a construção de ácido nucléico recombinante compreende um promotor ligado operacionalmente ao ácido nucléico que codifica uma proteína útil para a síntese de um produto orgânico, sendo que o promotor é um promotor de uma espécie de Candida, de preferência a espécie de Candida que compreende a construção de ácido nucléico recombinante. Em outro aspecto, a invenção proporciona uma célula de uma espécie de Candida geneticamente modificada de tal forma que apresenta reduzida eficiência em metabolizar piruvato a etanol. Em concretizações preferidas deste aspecto da invenção, a célula compreende adicionalmente uma construção de ácido nucléico recombinante da invenção codificando pelo menos um proteína útil para a síntese de um produto orgânico. Em uma concretização preferida, a construção de ácido nucléico recombinante codifica lactato desidrogenase. Em uma concretização deste aspecto, a construção de ácido nucléico recombinante compreende um promotor ligado operacionalmente ao ácido nucléico que codifica uma proteína útil para a síntese de um produto orgânico, sendo que o promotor é um promotor de uma espécie de Candida, de preferência a espécie de Candida que compreende a construção de ácido nucléico recombinante.

Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos para produzir produtos orgânicos compreendendo fermentar uma célula negativa para Crabtree do gênero Candida compreendendo a construção de ácido nucléico recombinante da invenção em condições que permitem a biossíntese de referidos produtos orgânicos. Em concretizações preferidas deste aspecto da invenção, o produto orgânico é ácido láctico. Em uma concretização preferida, a construção de ácido nucléico recombinante codifica lactato desidrogenase. Em uma concretização deste aspecto, a construção de ácido nucléico recombinante compreende um promotor ligado operacionalmente ao ácido nucléico que codifica uma proteína útil para a síntese de um produto orgânico, sendo que o promotor é um promotor de uma espécie de Candida, de preferência a espécie de Candida que compreende a construção de ácido nucléico recombinante.

Constitui uma vantagem desta invenção que as células transformadas aqui proporcionadas apresentem o fenótipo "negativo para Crabtree [Crabtree negaíive]". Organismos negativos para Crabtree são caracterizados epal capacidade de serem induzidos a um estado fermentativo incrementado. Tanto organismos naturalmente ocorrentes e organismos geneticamente modificados podem ser caracterizados como negativos para Crabtree. O efeito Crabtree é definido como inibição de consumo de oxigênio em um microorganismo quando o microorganismo é cultivado em condições aeróbicas na presença de uma alta concentração de glucose (p. ex. >5 mM de glucose). Organismos positivos para Crabtree continuam a fermentar (ao invés de respirar) irrespectivamente da disponibilidade de oxigênio na presença de glucose, embora organismos negativos para Crabtree não apresentem inibição do consumo de oxigênio mediada por glucose. Esta característica é útil para a síntese de produto orgânico, porque permite que células sejam desenvolvidas em altas concentrações de substrato, sem conservar os efeitos energéticos benéficos da fosforilação oxidativa. Muitas leveduras e fungos têm um fenótipo negativo para Crabtree incluindo os exemplos não-limitantes de gêneros Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Torulopsis, Yamadazyma, e Candida.

Espécies de Candida, que são caracterizadas de maneira variada na arte como leveduras e fungos dimórficos, podem apresentar o fenótipo negativo para Crabtree (Franzblau & Sinclair, 1983, Mycopathologia 82: 185-190). Determinadas espécies podem fermentar glucose, e também fontes de carbono alternativas, podem crescer a temperaturas elevadas (i.e., superiores a 37°C), e podem tolerar estresse de pH baixo. Espécies de Candida apresentam diversas das características desejáveis para se utilizar um organismo em métodos biossintéticos da fabricação de produtos orgânicos: suscetibilidade de manipulação genética, capacidade de processar uma variedade de fontes de carbono, fenótipo negativo para Crabtree, e capacidade de proliferar sob diversos estresses ambientais.

Concretizações específicas preferidas da presente invenção tomar-se-ão evidentes a seguir, a partir da descrição mais detalhada, de determinadas concretizações preferidas e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS FIG. 1 é um diagrama esquemático do vetor aescriio como pMI260, compreendendo o gene codificador de resistência a G418 impelido pelo promotor PGK (S. cerevisiae) e ligado ao terminador GAL10 (S. cerevisiaè). FIG. 2 é um diagrama esquemático do vetor descrito como pMI268, compreendendo o gene codificador de resistência G418 impelido pelo promotor PGK (C. sonorensis) e ligado ao terminador GAL10 (S. cerevisiae). FIG. 3 é um diagrama esquemático do vetor descrito como pMI269, compreendendo o gene codificador de resistência G418 impelido pelo promotor TDH (C. sonorensis) e ligado ao terminador GAL10 (S. cerevisiae) terminador. FIG. 4 é um diagrama esquemático do vetor descrito como pMI270, compreendendo o gene codificador de resistência à higromicina impelido pelo promotor PGK (C. sonorensis) e ligado ao terminador GAL10 (S. cerevisiae). FIG. 5 é um diagrama esquemático do vetor descrito como pMI234, compreendendo o gene MEL5 (S. cerevisiae) impelido pelo promotor PGK (C. sonorensis). FIG. 6 é um diagrama esquemático do vetor descrito como pMI238, compreendendo o gene MEL5 (S. cerevisiae) impelido pelo promotor TDH (C. sonorensis). FIG. 7 é um diagrama esquemático do vetor descrito como pMI271, compreendendo o gene codificador de resistência à higromicina impelido pelo promotor TDH (C. sonorensis) e ligado ao terminador GAL10 (S. cerevisiae). FIG. 8 é um diagrama esquemático do vetor descrito como pMI246, compreendendo os genes (S. cerevisiae) e LDH (L. helveticus), cada um impelido pelo promotor PGK (C. sonorensis). O gene LDH é ligado ao terminador CYC1, que se encontra a montante de uma região ae γκινα S26 (C. sonorensis). FIG. 9 é um diagrama esquemático do vetor descrito como pMI247, compreendendo o gene MEL5 (S. cerevisiae) impelido pelo promotor TDH (C. sonorensis) e o gene LDH (L. helveticus) impelido pelo promotor PGK (C. sonorensis). O gene LDH encontra-se ligado ao terminador CYC1, que se encontra a montante de uma região de rRNA S26 (C. sonorensis). FIG. 10 é um diagrama esquemático do vetor descrito como pMI257, compreendendo o gene MEL5 (S. cerevisiae) impelido pelo promotor PGK (C. sonorensis) e o gene LDH (L. helveticus) impelido pelo promotor PGK (C. sonorensis). O gene LDH é ligado ao terminador CYC1.

Toda esta cassete de expressão é inserida entre o promotor PDC1 e terminador (C. sonorensis). FIG. 11 é um diagrama esquemático do vetor descrito como pMI265, compreendendo o gene MEL5 (S. cerevisiae) impelido pelo promotor PGK (C. sonorensis) e o gene LDH (B. megaterium; do vetor pVR24) impelido pelo promotor PGK (C. sonorensis). O gene LDH é ligado ao terminador PDC1 (C. sonorensis). Toda esta cassete de expressão é inserida entre o promotor PDC1 e terminador (C. sonorensis). FIG. 12 é um diagrama esquemático do vetor descrito como pMI266, compreendendo o gene MEL5 (S. cerevisiae) impelido pelo promotor PGK (C. sonorensis) e o gene LDH (R. oryzae; do vetor pVR27) impelido pelo promotor PGK (C. sonorensis). O gene LDH é ligado ao terminador PDC1 (C. sonorensis). Toda esta cassete de expressão é inserida entre o promotor PDC1 e terminador (C. sonorensis). FIG. 13 é um diagrama esquemático do vetor descrito como pMI267, compreendendo o gene MEL5 (S. cerevisiae) impelido pelo promotor PGK (C. sonorensis). Esta cassete de expressão é inserida entre o promotor PDC1 e terminador (C. sonorensis). FIG. 14 é um diagrama esquemático do vetor descrito como pMI278, compreendendo o gene codificador de resistência G418 impelido pelo promotor TDH (C. sonorensis), ligado operacionalmente ao terminador MEL5, e o gene LDH (B. megaterium) impelido pelo promotor PGK (C. sonorensis). O gene LDH é ligado ao terminador GAL10 (S. cerevisiae). FIG. 15 é um diagrama esquemático do vetor descrito como pMI286, compreendendo o gene codificador de resistência G418 impelido pelo promotor TDH (C. sonorensis), ligado operacionalmente ao terminador MEL5 (S. cerevisiae), e o gene LDH (B. megaterium) impelido pelo promotor PGK (C. sonorensis). O gene LDH é ligado ao terminador GAL10 (S. cerevisiae). Toda esta cassete de expressão é inserida entre o promotor PDC2 e terminador (C. sonorensis). FIG.16 é um diagrama esquemático do vetor descrito como pMI287, compreendendo o gene codificador de resistência G418 impelido pelo promotor TDH (C. sonorensis), ligado operacionalmente ao terminador MEL5 (S. cerevisiae). Esta cassete de expressão é inserida entre o promotor PDC2 e terminador (C. sonorensis). FIG. 17 é um diagrama esquemático do vetor descrito como pMI288, compreendendo o gene codificador de resistência G418 impelido pelo promotor TDH (C. sonorensis), ligado operacionalmente ao terminador MEL5 (S. cerevisiae), e o gene LDH (Z. helveticus) impelido pelo promotor PGK (C. sonorensis). O gene LDH é ligado ao terminador CYC1. Toda esta cassete de expressão é inserida entre o promotor PDC2 e terminador (C. sonorensis). FIG. 18 é um diagrama esquemático do vetor descrito como pMI256, compreendendo o gene MEL5 (S. cerevisiae) impelido pelo promotor PGK (C. sonorensis) e o gene LDH (L. helveticus) impelido pelo promotor PGK (C. sonorensis). O gene LDH é ligado ao terminador CYC1. Toda esta cassete de expressão é inserida a montante do terminador ΐ'υυι sonorensis). FIG. 19 é um diagrama esquemático do vetor descrito como pMI277, compreendendo o promotor PDC2 (C. sonorensis). FIG. 20 é um diagrama esquemático do vetor descrito como pMI279, compreendendo o gene codificador de resistência G418 impelido pelo promotor TDH (C. sonorensis), ligado operacionalmente ao terminador MEL5 (S. cerevisiae), e o gene LDH (B. megaterium) impelido pelo promotor PGK (C. sonorensis). O gene LDH é ligado ao terminador GAL10 (S. cerevisiae). Toda esta cassete de expressão é inserida a jusante do promotor PDC2 (C. sonorensis). FIG. 21 é um diagrama esquemático do vetor descrito como pVR24. FIG. 22 é um diagrama esquemático do vetor descrito como pVR27. FIG. 23 A-C são diagramas esquemáticos dos vetores incluindo pMI214, pMI203, pMI205, pMI227, pMI233, e pMI234.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Como usado aqui, "produto orgânico" é qualquer composto contendo um átomo de carbono. Exemplos não-limitantes de produtos orgânicos incluem carboxilatos (p. ex. lactato, acrilato, citrato, isocitrato, alfa-cetoglutarato, succinato, fumarato, malato, oxaloacetato), carboidratos (p. ex. D-xilose), alditóis (p. ex. xilitol, arabitol, ribitol), aminoácidos (p. ex. glicina, triptofano, glutamato), lipídeos, ésteres, vitaminas (p. ex., L-ascorbato), polióis (p. ex. glicerol, 1,3-propanodiol, eritritol), aldeídos, alquenos, alquinos, e lactonas. Assim, um produto orgânico pode contém um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, ou mais átomos de carbono. Adicionalmente, produtos orgânicos podem ter um peso molecular que é menor do que cerca de 1.000 (p. ex. menor do que cerca de 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, ou 100) daltons. Por exemplo, D-xilose (G5H10Ü5) é um produto orgânico que tem um peso molecular de 150 daltons. Adicionalmente, produtos orgânicos podem ser produtos de fermentação. O termo "produto de fermentação" como usado aqui refere-se a qualquer composto orgânico que é produzido por meio de um processo de fermentação. Geralmente, um processo de fermentação pode envolver a conversão enzimática anaeróbica de compostos orgânicos (p. ex. carboidratos) a compostos, como álcool de etila, que produzem energia na forma de ATP. Fermentação celular difere da respiração celular pelo fato de que se utiliza produtos orgânicos ao invés de oxigênio molecular como receptores de elétron.

Exemplos não-limitantes de produtos de fermentação são acetato, etanol, butirato, e lactato.

Os produtos orgânicos também podem ser derivados de piruvato. Um "produto derivado de piruvato" como usado aqui, refere-se a qualquer composto que é sintetizado de piruvato em, no máximo, quinze etapas enzimáticas. Considera-se que uma etapa enzimática é qualquer reação química ou série de reações catalisadas por um polipeptídeo apresentando atividade enzimática. Referidos polipeptídeos são qualquer polipeptídeo que catalisa uma reação de outras substâncias sem que ela mesma seja destruída ou alterada após o completamento da reação ou reações. Estes polipeptídeos podem apresentar qualquer tipo de atividade enzimática incluindo os exemplos não-limitantes de atividades associadas com aconitase, isocitrato desidrogenase, cetoglutarato desidrogenase, succinato tioquinase, succinato desidrogenase, fumarase, malato desidrogenase, citrato sintase, 2,5-dioxovalerato desidrogenase, 5-desidro-4-desóxi-D-glucarato desidrogenase, glucarato desidratase, aldesido desidrogenase, glucuronolactona redutase, L-gulonolactona oxidase, 2-desidro-3-desóxi-D-pentanoato aldolase, xilonato desidratase, xilonolactonase, D-xilose desidrogenase, lactato desidrogenase, CoA-transferase, lacil-CoA desidratase, ou acniil-UoA moratase.

Os produtos de carboxilato da invenção podem encontrar-se na forma de sal ou de ácido livre, e podem ser referidas intercambiavelmente (p. ex. "ácido láctico" ou "lactato"). O uso de qualquer um dos termos é utilizado de modo a incluir o outro, a não ser que indicado especificamente de outra forma. Em concretizações preferidas, a invenção proporciona os carboxilatos na forma de ácido livre. O termo "seqüência de ácido nucleico" ou "molécula de ácido nucleico" refere-se a uma molécula de DNA ou RNA. O termo abrange moléculas formadas de qualquer um dos análogos de base de DNA e RNA conhecidos, como, embora sem limitação 4-acetilcitosina, 8-hidróxi-N6-metiladenosina, aziridinil-citosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxiidroxilmetil) uracila, 5-fluorouracila, 5-bromouracila, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracila, 5-carbóxi-metilaminometiluracila, diidrouracila, inosina, N6-iso-penteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracila, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetil-guanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracila, 5-metoxiamino-metil-2-tiouracila, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonil-metiluracila, 5-metoxiuracila, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, metil éster do ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracila, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-metiluracila, metil éster do ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracila, queosina, 2-tiocitosina, e 2,6-diaminopurina. O termo "vetor" é usado para referir a qualquer molécula (p. ex., ácido nucleico, plasmídeo, ou vírus) usada para transferir informação codificante de proteína para uma célula hospedeira. O termo "vetor de expressão" refere-se a um vetor que é adequado para transformação de uma célula hospedeira e contém seqüências de ácido nucleico que direcionam e/ou controlam a expressão de seqüências de ácido nucleico heterólogas inseridas. Expressão inclui, embora sem limitação, processes, como transcrição, tradução, e recomposição de RNA, caso íntrons estejam presentes. O termo "ligado operacionalmente" é usado aqui para referir a uma disposição de seqüências em que as seqüências são conjugadas entre si e configuradas ou montadas de modo a realizar sua função usual. Assim, uma seqüência ligada operacionalmente a uma seqüência que codifica uma proteína pode flanquear a seqüência codificante e ser capaz de efetuar replicação e/ou transcrição da seqüência codificante. Por exemplo, a seqüência codificante é ligada operacionalmente a um promotor quando o promotor é capaz de direcionar transcrição daquela seqüência codificante.

Uma seqüência flanqueadora não precisa ser contígua à seqüência codificante, desde que funcione corretamente. Assim, por exemplo, seqüências não-traduzidas intervenientes porém transcritas podem estar presentes entre uma seqüência promotora e a seqüência codificante, e ainda assim a seqüência promotora pode ser considerada como "ligada operacionalmente" à seqüência codificante. O termo "célula hospedeira" é usado para referir uma célula em que se introduziu ou transformou, ou que é capaz de ser transformada com uma seqüência de ácido nucleico e, depois, expressar um gene selecionado de interesse. O termo inclui a progênie da célula parental, quer ou não a progênie seja idêntica em morfologia ou em constituição genética ao parental original. O termo "endógeno" como usado aqui refere-se a material genômico que não é exógeno, ou seja, que não foi introduzido na célula. Referido material genômico endógeno desenvolve-se usualmente no interior de um organismo, tecido, ou célula e não é inserido ou modificado por meio de tecnologia recombinante. Material genômico endógeno abrange variantes naturalmente ocorrentes. O termo "exógeno" ou "heterológo" como usado aqui refere-se a material genômico que não é endógeno, ou seja, material que foi introduzido na célula. Tipicamente, referido material é inserido ou modificado por meio de tecnologia recombinante.

Como usado aqui, o termo "geneticamente modificado" refere-se a um organismo cujo genoma foi modificado por meio de métodos que incluem os exemplos não-limitantes de adição, substituição, ou deleção de material genético. Referidos métodos de manipulação genética são bem conhecidos na arte e incluem, embora sem limitação, mutagênese randômica, mutações pontuais, incluindo inserções, deleções, e substituições de um ou de um pluralidade de radicais de nucleotídeos individuais, tecnologia knock-out, e transformação de um organismo com uma seqüência de ácido nucleico utilizando tecnologia recombinante, incluindo transformantes estáveis e transientes.

Os termos "anaeróbico" e "condições anaeróbicas" são usados significando que a quantidade de oxigênio dissolvido numa solução, tipicamente um meio de cultura, não é detectável (i.e., cerca de 0 %), ou, altemativamente, a quantidade de oxigênio na atmosfera é de cerca de 0 % a 2 %.

Vetores e células hospedeiras Uma molécula de ácido nucleico que codifica a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo útil para a síntese de produtos orgânicos de interesse é inserida em um vetor de clonagem ou de expressão apropriado utilizando-se técnicas de ligação convencionais (ver, por exemplo, Sambrook et al, 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). O vetor é selecionado tipicamente para ser funcional na célula hospedeira particular empregada (i.e., o vetor é compatível com o maquinário da célula hospedeira de tal forma que possa ocorrer replicação, amplificação e/ou expressão do gene). Uma molécula de ácido nucleico que codifica a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo útil para a síntese of produtos orgânicos de interesse pode ser amplificada em qualquer célula apropriada e expressa em qualquer célula hospedeira, sendo o mais preferível uma célula hospedeira negativa para Crabtree. Células hospedeiras negativas para Crabtree preferidas incluem aquelas do gênero Candida, incluindo os exemplos não-limitantes de C. sonorensis, C. methanosorbosa, C. diddensiae, C. parapsilosis, C. naeodendra, C. krusei, C. blankii, e C. entomophila.

Seqüências flanqueadoras (incluindo promotores e terminadores) podem ser homólogas (i.e., da mesma espécie e/ou cepa que célula hospedeira), heterológas (i.e., de uma espécie diferente da espécie ou cepa da célula hospedeira), híbridas (i.e., uma combinação de seqüências flanqueadoras de mais de uma fonte), ou sintéticas, ou as seqüências flanqueadoras podem ser seqüências nativas que funcionam normalmente para regular expressão do gene de interesse. Desta forma, a fonte de uma seqüência flanqueadora pode ser qualquer organismo procariótico ou eucariótico, qualquer organismo vertebrado ou invertebrado, ou qualquer planta, desde que a seqüência flanqueadora seja funcional em, e possa ser ativada por, o maquinário da célula hospedeira.

Seqüências flanqueadoras úteis nos vetores desta invenção podem ser obtidas por meio de vários métodos bem conhecidos na arte. tipicamente, seqüências flanqueadoras úteis aqui terão sido previamente identificadas por meio de mapeamento e/ou por meio de digestão com endonuclease de restrição e, assim, podem ser isoladas de uma fonte biológica utilizando-se as endonucleases de restrição apropriadas. Em alguns casos, a seqüência completa de nucleotídeos de uma seqüência flanqueadora pode ser conhecida. Nesses casos, a seqüência flanqueadora pode ser sintetizada utilizando-se métodos bem conhecidos por aqueles versados na arte, e também descritos aqui, para a síntese e clonagem de ácido nucleico.

Onde se conhece toda ou apenas uma porção da seqüência flanqueadora, é possível obter a extensão total da seqüência flanqueadora funcional empregando-se uma técnica de amplificação in viíro, como reação em cadeia de polimerase (PCR) e/ou selecionando-se uma biblioteca genômica com um fragmento adequado de oligonucleotídeo e/ou seqüência flanqueadora da mesma ou de outra espécie. Onde a seqüência flanqueadora não é conhecida, um fragmento de DNA contendo uma seqüência flanqueadora pode ser isolado de um pedaço maior de DNA que pode conter, por exemplo, uma seqüência codificante ou mesmo outro gene ou genes. Isolamento pode ser realizado por meio de digestão com endonuclease de restrição para produzir o fragmento de DNA apropriado, seguido de isolamento empregando-se purificação com gel de agarose, cromatografia de coluna Qiagen® (Chatsworth, CA), ou outros métodos conhecidos pelo artesão habilitado. A seleção de enzimas adequadas para realizar este objetivo será facilmente perceptível por alguém com prática ordinária na arte.

Um elemento ou gene marcador selecionável codifica uma proteína necessária para a sobrevivência e o crescimento de uma célula hospedeira desenvolvida em um meio de cultura seletivo. Genes marcadores de seleção úteis codificam proteínas que (a) conferem resistência em células hospedeiras a antibióticos ou outras toxinas, p. ex., ampicilina, tetraciclina, ou canamicina; (b) complementam deficiências auxotróficas da célula hospedeira, como deficiência de Leu2; ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis de meios complexos. Marcadores selecionáveis preferidos incluem os exemplos não-limitantes do gene da resistência à zeocina, gene da resistência ao G418, e o gene da resistência à higromicina. r E possível utilizar outros genes de seleção para amplificar o gene que será expresso. Amplificação é o processo em que genes mais demandados para a produção de uma proteína crítica para o crescimento são reiterados em tandem dentro de cromossomos de gerações sucessivas de células recombinantes. Exemplos de marcadores selecionáveis adequados para células mamíferas incluem diidrofolato redutase (DHFR) e timidina quinase sem promotor. Os transformantes de célula mamífera são colocados sob pressão de seleção, sendo que apenas os transformantes são adaptados de maneira única para sobreviver em virtude do gene de seleção presente no vetor. Impõe-se pressão de seleção cultivando-se as células transformadas em condições em que a concentração de agente de seleção no meio é incrementada progressivamente, levando com isto à amplificação do gene de seleção e DNA que codifica um polipeptídeo útil para sintetizar um produto orgânico.

Vetores de expressão e clonagem da presente invenção conterão tipicamente um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e ligado operacionalmente à molécula que codifica o polipeptídeo útil para sintetizar um produto orgânico. Promotores são seqüências não-transcritas localizadas a montante (i.e., a 5') do códon de início de tradução de um gene estrutural (geralmente dentro de cerca de 100 a 1000 bp) e controlam a transcrição do gene estrutural. Promotores são agrupados convencionalmente em duas classes: promotores induzíveis e promotores constitutivos. Promotores induzíveis iniciam níveis incrementados de transcrição de DNA sob seu controle em resposta a alguma alteração nas condições de cultura, como a presença ou ausência de um nutriente ou uma alteração na temperatura. Promotores constitutivos, por outro lado, iniciam produção contínua de produto gênico; ou seja, há pouca ou nenhuma regulação da expressão gênica. Conhece-se na arte um grande número de promotores de ambos os tipos de promotor, reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais. Um promotor adequado é ligado operacionalmente a DNA que codifica um polipeptídeo útil para sintetizar um produto orgânico por meio de remoção do promotor da fonte de DNA por meio de digestão com enzima de restrição, ou produzir um fragmento de promotor por meio de amplificação in vitro e inserção da seqüência r promotora desejada no vetor. E possível utilizar seqüências promotoras nativas para direcionar a amplificação e/ou expressão de uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo útil para sintetizar um produto orgânico. Contudo, prefere-se um promotor heterólogo é preferido se o mesmo permitir maior transcrição e maiores rendimentos da proteína expressa em comparação com o promotor nativo, e se for compatível com o sistema de célula hospedeira que foi selecionado para uso.

Promotores adequados para uso com células hospedeiras de levedura também são bem conhecidos na arte, e incluem os exemplos não-limitantes de promotores de genes de levedura incluindo fosfoglicerato quinase (PGK), triose desidrogenase (TDH), piruvato descarboxilase (PDC), triose fosfato isomerase (TPI), e álcool desidrogenase (ADH). Promotores preferidos da invenção incluem promotores PGK e TDH. Acentuadores de levedura, seqüências que incrementam a expressão quando colocados em proximidade relativa de um promotor, são utilizados vantajosamente com promotores de levedura. Métodos de transformar células são bem conhecidos na arte, e podem incluir referidos exemplos não-limitantes como eletroporação e métodos de transformação baseados em cloreto de cálcio ou acetato de lítio. Vários dos vetores descritos nos Exemplos desta invenção foram construídos previamente e encontram-se descritos no pedido PCT/US01/44041. Em resumo, vetores pMI234, pMI238, pMI246, pMI247, e o PDC2 em lambda foram construídos como a seguir.

Isolamento de C. sonorensis (PDC2 em lambda): Isolou-se DNA genômico de C. sonorensis (número de acesso ATCC n° 32109) foi isolado de células desenvolvidas de um dia para o outro em YPD utilizando-se o Easy DNA kit (Invitrogen). DNA foi parcialmente digerido com Sau3A e fracionado por tamanho por meio de centrifugação com gradiente de sucrose (Sambrook et al. Id.). Fragmentos de DNA com cerca de 22 kb foram ligados a BamHl digeridos, braços de vetor DASH™ lambda tratados com fosfatase (Stratagene) e a mistura de ligação foi empacotada em partículas lambda utilizando-se Gigapack II Gold Packaging Extract (Stratagene). As partículas lambda foram usadas para infectar MRA P2 de E. coli.

Sondas para isolamento de genes de C. sonorensis da biblioteca foram preparadas por meio de amplificação com PCR utilizando-se a polimerase Dynazyme EXT (Finnzymes, Espoo, Finlândia), primers específicos para seqüência e DNA genômico de S. cerevisiae, C. albicans ou C. sonorensis como um padrão, como a seguir. • Utilizou-se oligonucleotídeos TGT CAT CAC TGC TCC ATC TT (SEQ ID No. 17) e TTA AGC CTT GGC AAC ATA TT (SEQ ID No. 18) correspondentes ao gene de S. cerevisiae TDH1 para amplificar um fragmento do gene TDH de DNA genômico de S. cerevisiae. • Oligonucleotídeos GCG ATC TCG AGG TCC TAG AAT ATG TAT ACT AAT TTG C (SEQ ID No. 19) e CGC GAA TTC CCA TGG TTA GTT TTT GTT GGA AAG AGC AAC (SEQ ID No. 20) correspondentes ao gene de C. albicans PGK1 foram usados para amplificar um fragmento do gene PGK1 de DNA genômico de C. albicans. • Utilizou-se oligonucleotídeos TGG ACT AGT AAA CCA ACA GGG ATT GCC TTA GT (SEQ ID No. 21) e CTA GTC TAG AGA TCA TTA CGC CAG CAT CCT AGG (SEQ ID No. 22) correspondentes ao rRNA de C. sonorensis 26S para amplificar um fragmento do gene de rDNA 26S de DNA genômico de C. sonorensis. • Oligonucleotídeos CCG GAA TTC GAT ATC TGG GCW GGK AAT GCC AAY GAR TTR AAT GC (SEQ ID No. 23) e CGC GGA TTC AGG CCT CAG TAN GAR AAW GAA CCN GTR TTR AAR TC (SEQ ID No. 24) foram projetados com base em porções de seqüência aminoácidos de piruvato descarboxilase WAGNANELNA (SEQ ID No. 25) e DFNTGSFSYS (SEQ ID No. 26), que são conservadas entre S. cerevisiae PDC1, Pichia stipiíis PDC1 e PDC2, e seqüências incompletas de Candida albicans PDC1 e PDC3. Estes primers foram usados para amplificar um fragmento do gene(s) PDC de DNA genômico de C. sonorensis. Reação PCR com estes primers produziu dois fragmentos de seqüência de nucleotídeos diferente denominados PDC1 e PDC2. • Oligonucleotídeos TCTGTTMCCTACRTAAGA (SEQ ID No. 27) e GTYGGTGGTCACGAAGGTGC (SEQ ID No. 28) foram projetados com base em regiões conservadas encontradas em seqüências fungicas de álcool desidrogenase. Estes primers foram usados para amplificar um fragmento do gene(s) ADH de DNA genômico de C. sonorensis. Reação PCR com estes primers produziu três fragmentos de seqüências diferentes de nucleotídeos denominados ADH1, ADH2, e ADH3. A biblioteca foi selecionada com fragmentos de PCR produzidos como descrito acima, e produtos foram marcados com P a-dCTP utilizando-se o Random Primed Labeling Kit (Boehringer Mannheim). Hibridação com as sondas radioativas foi realizada por meio de incubação de um dia para o outro a 42°C em uma solução contendo 50 % de formamida, 5x Denhardt, 5x SSPE, 0,1 % de SDS, 100 pg/ml de DNA de esperma de arenque, 1 μg/ml de DNA de polyA. No caso de sondas TDH1, PGK1, e PDC1, filtros foram lavados após hibridação à temperatura ambiente em uma solução de 2x SSC durante 5 min. e repetidos, seguido de duas lavagens de 30 min. em uma solução de lx SSC-0,1 % de SDS a 68°C. As lavagens após hibridação para sondas PDC2 e rDNA foram realizadas duas vezes durante 5 min. à temperatura ambiente em 2x SSC, seguido de duas lavagens de 30 min. em 0,lx SSC-0,1 % de SDS a 68°C.

Placas positivas foram isoladas e purificadas de acordo com as instruções dos fabricantes (Stratagene). Bacteriófagos foram purificados utilizando-se métodos convencionais (Sambrook et al., Id.), modificados eliminando-se tratamento com DNAsel e precipitando-se partículas de fagos liberadas de células hospedeiras lisadas empregando-se PEG6000. Referidas partículas de fagos foram então dissolvidas em tamponador SM e extraídas com clorofórmio, pelotizadas por meio de centrifugação a 25.000 rpm em um rotor Kontron TST41.14 durante 2 h., e novamente dissolvidas em tamponador SM. DNA lambda foi isolado digerindo-se as partículas de fagos com proteinase K seguido de extração e precipitação com etanol.

Insertos de DNA genômico de C. sonorensis foram parcialmente seqüenciados utilizando-se primers específicos para seqüência. As seqüências de nucleotídeos e as seqüências de aminoácidos deduzidas das mesmas foram comparadas com bancos de dados de seqüências com o objetivo de identificar genes codificados inteiramente ou em parte pelo inserto de fago, utilizando-se homologia com genes ou proteínas conhecidas. As seqüências obtidas apresentaram similaridade significativa com rDNA fungico, fosfoglicerato quinases, gliceraldesido-3-fosfato desidrogenases, ou pimvato descarboxilases dependendo da sonda usada para isolar cada clone. Os pontos de início e de fim das matrizes de leitura aberta codificando seqüências de C. sonorensis PGKI, PDC1 e TDH1 foram assim identificadas.

Vetores de "bloco construtivo". pMI203, DM1205 (vetores de resistência à zeocina para C. sonorensis), pVR24. e pVR27 Estes plasmídeos são usados na construção dos vetores descritos nos Exemplos, e são descritos na publicação PCT PCT/USO1/44041. Em resumo descreve-se a construção destes vetores. O plasmídeo pTEFl/Zeo (Invitrogen) contendo o marcador de resistência à zeocina sob o controle do promotor de S. cerevisiae TEF1 foi modificado adicionando-se um fragmento de rDNA de C. sonorensis para proporcionar um alvo para recombinante homóloga. Utilizou-se os seguintes primers de oligonucleotídeos: TGG ACT AGT AAA CCA ACA GGG ATT GCC TTA GT (SEQ ID No. 29) e CTA GTÇTAGAGA TCA TTA CGC CAG CAT CCT AGG (SEQ ID No. 30), que correspondem a rRNA 26S de C. sonorensis (número de acesso Genbank U70185), para amplificar DNA genômico de C. sonorensis para proporcionar um fragmento amplificado com PCR do gene de rDNA 26S. O fragmento de produto de PCR resultante foi digerido com enzimas de restrição Spel e Xbal e ligado com plasmídeo pTEF/Zseo digerido com Xbal. O plasmídeo resultante foi denominado pMI203 (FIG 23 B). O promotor TEF1 contido em pMI203 foi substituído por um promotor de um gene de outra espécie de Candida, o promotor PGKI de C. albicans. Os primers de oligonucleotídeos a seguir: GCG ATC TCG AGG TCC TAG AAT ATG TAT ACT AATTTGC (SEQ ID No. 31) e ACT TGG CCA TGG TGA TAG TTA TTC TTC TGC AATTGA (SEQ ID No. 32) foram projetados com base na seqüência disponível de C. albicans PGK1 (número de acesso Genbank U25180). Estes primers foram usados para amplificar um fragmento de 700 bp da região a montante da matriz de leitura aberta de PGK1 de C. albicans, utilizando-se DNA genômico de C. albicans como o padrão. Adicionou-se sítios de restrição Xbal e Spel (sublinhados acima) aos primers para facilitar a clonagem do fragmento. Após a amplificação, o fragmento foi isolado e digerido com enzimas de restrição Xhol e Ncol e depois ligado ao plasmídeo pMI203 digerido com Xhol e Ncol. O plasmídeo resultante foi denominado pMI205 (FIG. 23 B). PVR24 e pVR27: Plasmídeo pBFY004 (proprietário, NREL) foi digerido com enzima de restrição Notl (Invitrogen), resultando em um fragmento de 1235 bp (SEQ ID No: 33). O fragmento foi isolado e ligado a um pGEM5zF(+) (Promega North, Madison, WI) digerido com Notl. E. coli (top 10) (Invitrogen) foi transformado com a mistura de ligação utilizando-se protocolos de eletroporação convencional (Sambrook, Id.). O plasmídeo resultante foi denominado pNC002.

DNA de B. megaterium codificando o gene LDH foi isolado como a seguir. B. megaterium foi obtido da American Type Culture Collection (número de acesso ATCC #6458) e desenvolvido e condições convencionais. DNA genômico foi purificado destas células utilizando-se um kit Invitrogen "Easy-DNA" de acordo com o protocolo do fabricante. Primers foram pijetados com base na seqüência disponível no Genbank para o L-LDH de B. megaterium (número de acesso Genbank n° M22305). Realizou-se reações de amplificação de PCR com o emprego de técnicas convencionais, sendo que cada reação continha DNA genômico de B. megaterium (6 ng/μΐ), os 4 dNTPs (0,2 mM), e os primers de amplificação BM 1270 e BM 179 (1 μΜ em cada um). Os primers apresentavam as seqüências: BM1270 CCTGAGTCCACGTCATTATTC (SEQ ID No:34 e BM179 TGAAGCTATTTATTCTTGTTAC (SEQ ID No:35) Reações foram realizadas de acordo com as seguintes condições de termociclização: uma incubação inicial durante 10 min. a 95 °C, seguido de 35 ciclos consistindo de 30 s. a 95°C, 30 s. a 50°C, 60 s. a 72°C. Um fragmento de produto forte de 1100 pares de bases (bp) foi purificado utilizando-se procedimentos convencionais, clonados e seqüenciados. A seqüência resultante pôde ser traduzida num polipeptídeo que apresentou excelente homologia com genes conhecidos que codificam L-LDH. A seqüência codificante para o [lacuna] codificante de LDH de B. megaterium aqui indicada foi ligada operacionalmente a um promotor do gene PGK1 e um terminador transcricional do gene GAL10, ambos da levedura Saccharomyces cerevisiae. Dois primers de oligonucleotídeos, Bmeg5' e Bmeg3', foram projetados com base nesta seqüência para introduzir sítios de restrição nas pontas da seqüência codificante do gene: B.meg 5' GCTCTAGATGAAAACACAATTTACACC (SEQ ID No:36) e B.meg 3' ATGGATCCTTACACAAAAGCTCTGTCGC (SEQ ID No:37) Esta reação de amplificação foi realizadas utilizando-se concentrações de dNTP e primer descritas acima utilizando-se Pfu Turbo polimerase (Stratagene) em um tamponador fornecido pelo fabricante. A termociclização foi realizada incubando-se inicialmente a mistura de reação durante 3 min. a 95°C, depois com 20 ciclos de 30 s. a 95°C, 30 s. a 50°C, 60 s. a 72°C, seguido de uma incubação final durante 9 min. a 72°C. O produto foi digerido com enzimas de restrição Xbal e BamHI e depois ligado nos sítios Xbal e BamRl do plasmídeo pNC002. Esta ligação resultou em o promotor PGK e o terminador GAL10 tomarem-se ligados operacionalmente à seqüência codificante LDH de B. megaterium (pVR24; FIG. 21).

Construção de pVR27 (FIG. 22) foi realizada de forma a criar um vetor contendo LDF[ de R. oryzae para sua expressão sob o controle do promotor PGK1 de S. cerevisiae. LDH foi isolado de Rhizopus oryzae de DNA genômico purificado ("Easy-DNA" kit, Invitrogen) de células (número de acesso ATCC #9363) desenvolvidas em condições convencionais. Primers foram projetados com base na seqüência disponível no Genbank para o LDH de R. oryzae (número de acesso Genbank n° AF226154). Realizou-se reações de amplificação utilizando-se técnicas convencionais, cada reação contendo DNA genômico de R. oryzae (6 ng/μΐ), cada um dos 4 dNTPs (0,2 mM), e cada um dos primers de amplificação Ral-5' e Ral-3' (1 μΜ). Os primers de amplificação tinha a seqüência: Ral-5' CTTTATTTTTCTTTACAATATAATTC (SEQ ID

No:38) e Ral-3' ACTAGCAGTGCAAAACATG (SEQ ID No:39) Reações foram realizadas de acordo com as seguintes condições de ciclização: uma incubação inicial durante 10 min. a 95°C, seguido de 35 ciclos consistindo de 30 s. a 95°C, 30 s. a 41°C, 60 s. a 72°C. Um fragmento de produto forte com 1100 bp foi purificado com gel, clonado em vetor TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) e seqüenciado. A seqüência resultante pôde ser traduzida a um polipeptídeo que apresentou excelente homologia com seqüência conhecida do gene codificante de LDH de Rhizopus oryzae no Genbank (número de acesso AF226154). A seqüência codificante para o gene codificante de LDH de R. oryzae aqui descrito foi ligado operacionalmente a um promotor do gene PGK1 e um terminador transcricional do gene GAL10, ambos da levedura S. cervisiae. Na preparação desta construção, preparou-se os seguintes oligonucleotídeos que foram usados para amplificar a seqüência codificante do plasmídeo contendo o inserto de LDH de Rhizopus. Dois primers de oligonucleotídeo, Rapgk5 e Papgk3', foram projetados com base nesta seqüência para introduzir sítios de restrição nas pontas da seqüência codificante do gene.

Rapgk5 GCTCT AGAT GGT ATTAC ACTC AAAGGTCG (SEQ ID No:40) e Papgk3 GCTCTAGATCAACAGCTACTTTTAGAAAAG (SEQ ID No:41) Esta reação de amplificação foi realizada utilizando-se concentrações de dNTP e primer como descrito acima utilizando-se Pfu Turbo polimerase (Stratagene) em um tamponador fornecido pelo fabricante. Termociclização foi realizada incubando-se inicialmente a mistura de reação durante 3 min. a 95°C, depois com 20 ciclos de 30 s. a 95°C, 30 s. a 53°C, 60 s. a 72°C, seguido de um incubação final durante 9 min. a 72°C. O produto foi digerido com enzimas de restrição Xbal e depois ligado no sítio Xbal do plasmídeo pNC002.

Esta ligação resultou em o promotor PGK e o terminador GAL10 tomarem-se ligados operacionalmente à seqüência codificante de LDH de R. oryzae (pVR27; FIG. 22) pMI234 e pMI238: Visando desenvolver uma seleção positiva para transformantes de C. sonorensis, o gene MEL5 de S. cerevisiae (Naumov et al., 1990, MGG 224: 119-128; Turakainen et al., 1994, Yeast 10: 1559-1568; número de acesso Genbank Z37511) foi obtida como o fragmento EcoRJ-Spel com 2160 bp do plasmídeo pMEL5-39 e ligado a pBluescript II KS(-) (Stratagene) digerido com EcoRI e Spel. O sítio EcoRI no gene MEL5 localiza-se 510 bp a montante do iniciador ATG, e o sitio Spel localiza-se 250 bp a jusante do códon stop de MEL5. O plasmídeo resultante foi denominado pMI233 (FIG. 23 C). O promotor PGK1 com 1500 bp de C. sonorensis foi amplificado com primers apresentando a seqüência: GCG ATC TCG AGA AAG AAA CGA CCC ATC CAA GTG ATG (SEQ ID No. 5) e TGG ACT AGT ACA TGC ATG CGG TGA GAA AGT AGA AAG CAA ACA TTG TAT ATA GTC TTT TCT ATT ATT AG (SEQ ID No. 42) utilizando-se DNA do clone de PGK1 lambda isolado acima como padrão. O primer a 3' pode criar uma fusão entre o promotor PGK1 de C. sonorensis e MEL5 de S. cerevisiae, porque corresponde aos nucleotídeos presentes no promotor PGK1 imediatamente a montante da matriz de leitura aberta e nucleotídeos correspondentes à ponta 5' da matriz de leitura aberta de MEL5. O fragmento amplificado resultante foi digerido com enzimas de restrição Sphl e Xhol e ligado ao plasmídeo pMI233 (FIG. 23 C) digerido com Sphl e Xhol. A construção resultante no plasmídeo contém promotor PGK1 de C. sonorensis a montante de, e ligado operacionalmente à matriz de leitura aberta de MEL5, e é identificado como pMI234 na FIG. 5.

De uma maneira semelhante, um promotor TDH1 de C. sonorensis com 650 bp foi amplificado com primers apresentando a seqüência: GCG ATC TCG AGA AAA TGT TAT TAT AAC ACT ACA C (SEQ ID No. 3) e TGG ACT AGT ACA TGC ATG CGG TGA GAA AGT AGA AAG CAA ACA TTT TGT TTG ATT TGT TTG TTT TGT TTT TGT TTG (SEQ ID No. 43) utilizando-se DNA do clone de TDH1 lambda isolado acima como o padrão. O primer a 3' pode criar uma fusão entre o promotor TDH1 de C. sonorensis e MEL5 de S. cerevisiae, porque correspodne aos nucleotídeos presentes no promotor TDH1 imediatamente a montante da matriz de leitura aberta e nucleotídeos correspondentes à ponta 5' da matriz de leitura aberta de MEL5. O fragmento amplificado foi digerido com Sphl e Xhol e ligado ao plasmídeo pMI233 (FIG. 23 C) digerido com Sphl e Xhol. O plasmídeo resultante, identificado como pMI238 na FIG. 6, contém promotor TDH1 de C. sonorensis a montante de e ligado operacionalmente à matriz de leitura aberta de MEL5. pMI246 e DMI247: O plasmídeo pMI205 foi usado para produzir um plasmídeo contendo o gene MEL5 como um marcador selecionável e o gene LDH para permitir produção de ácido láctico em C. sonorensis. No plasmídeo resultante, o gene da resistência à zeocina no pMI205 foi substituído pelo gene LDH de L. helveticus.

Um fragmento NcoI-iLzmHI com 1329 bp de pVRl contendo o gene LDH e o terminador CYC1 foi ligado ao fragmento NcoI-iLwzHI com 3413 bp do pMI205 (FIG. 23 B) trazendo o gene LDH de L. helveticus sob o controle do promotor PGK1 de C. albicans; o plasmídeo resultante foi denominado pMI214. Em uma segunda etapa, o promotor PGK1 de C. albicans foi substituído pelo promotor PGK1 C. sonorensis. O promotor PGK 1 de C. sonorensis foi isolada por meio de amplificação de um clone lambada isolado como descrito acima utilizando-se primers apresentando a seqüência: GCG ATC TCG AGA AAG AAA CGA CCC ATC CAA GTG ATG (SEQ ID No. 5) e ACT TGG CCA TGG TAT ATA GTC TTT TCT ATT ATT AG (SEQ ID No. 44), e o produto de PCR foi digerido com Xhol e Ncol e ligado no pMI214 digerido com Xhol e Ncol. Este plasmídeo foi denominado pMI277 e é mostrado na FIG. 19. A cassete de expressão de LDH do pMI227 e a cassete de expressão do marcador de MEL5 do pMI234 foram combinadas no mesmo vetor ligando-se um fragmento Avrll-Nhel com 3377 bp do pMI227 (FIG. 23 A) com pMI234 digerido com Spel (FIG. 23 C). O plasmídeo resultante foi denominado pMI246 e é mostrado na FIG. 8. A cassete de expressão de LDH do pMI227 e a cassete de expressão do marcador de MEL5 do pMI238 foram combinadas no mesmo vetor ligando-se um fragmento Avrll-Nhel com 3377 bp do pMI227 com pMI238 digerido com Spel. O plasmídeo resultante foi denominado pMI247 e é mostrado na FIG. 9.

Em uma concretização, a invenção proporciona construções de ácido nucleico recombinante compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo útil para a biossíntese de um produto orgânico, que é ligado opeacionalmente a um promotor que é funcional no genero Candida.

Em concretizações relacionadas a seqüência de nucleotídeos codifica um gene de lactato desidrogenase. Em concretizações preferidas, o gene de lactato desidrogenase é heterológo para a célula de levedura de Candida em que é introduzido. Na maior parte das concretizações o gene de lactato desidrogenase é de um microorganismo, como por exemplo, uma bactéria ou fungo, e o produto orgânico produzido de acordo com os métodos da invenção é ácido láctico (ou lactato).

Tipicamente, os métodos da invenção para produzir ácido láctico podem proporcionar (baseado em gramas de ácido láctico produzido / grama de um substrato de carboidrato consumido) cerca de 60 % ou mais, de preferência cerca de 70 % ou mais, mais preferivelmente cerca de 80 % ou mais, e da forma mais preferível cerca de 90 % ou mais, quando o substrato de carboidrato é uma hexose, por exemplo, glucose.

Os métodos da invenção para produzir ácido láctico podem resultar em titulações de ácido láctico de cerca de 75 gramas/1 ou mais, de preferência cerca de 90 gramas/1 ou mais, e da forma mais preferível cerca de 100 gramas/1 ou mais. As células da invenção apresentam uma produtividade específica de produção de ácido láctico (em termos de gramas de ácido láctico produzido / grama de peso seco de células por hora) de cerca de 0,20 ou mais, de preferência cerca de 0,30 ou mais, e da forma mais preferível cerca de 0,50 ou mais, quando um substrato de carboidrato hexose, como glucose, é usado para produção.

Em uma concretização, as células negativas para Crabtree da invenção podem catabolizar amido, quer naturalmente ou em virtude de uma modificação genética. Em concretizações adicionais, as células são geneticamente modificadas para catabolizar celulósicos por meio da adição de referidas moléculas como celulases de base íungica.

Em concretizações relacionadas, as células da invenção podem metabolizar açúcares diferentes de glucose ou outras hexoses de monossacarídeos, em particular pentoses incluindo os exemplos não-limitantes de xilose e L-arabinose.

As células negativas para Crabtree da invenção são selecionadas, de preferência, das cepas de Candida[:] C. sonorensis, C. methanosorbosa, C. diddensiae, C. parapsilosis, C. naeodendra, C. krusei, C. blankii, e C. entomophila. Em concretizações preferidas as células de C. sonorensis e C. methanosorbosa. Métodos para isolar produtos orgânicos produzidos pelas células da invenção são poço conhecidos na arte. Em particular, métodos para separar ácido láctico de uma mistura de fermentação, incluindo misturas de fermentação com baixo pH, são divulgados por Eyal et al. (Pedido de Patente Internacional, Publicação n° WO 99/19290, publicado em 22 de abril de 1999). Referidos métodos para isolar ácido láctico incluem extração, adsorção, destilação/vaporização, separação via uma membrana, cristalização, e separação de fases, (ver também: Vickroy, 1985, Comprehensive Biotechnology. (Moo-Young, ed.), Volume 3, capítulo 38, Pergamon Press, Oxford; Datta et al., 1995, FEMS Microbiol. Rev. 16: 221-231; patente U.S. 4,771,001; patente U.S. 5,132,456; patente U.S. 5,510,526; e patente U.S. 5,420,304).

Condições de fermentação É possível utilizar diversos processos de fermentação com os diversos aspectos da presente invenção (ver, p. ex., Wolf, 1996, Nonconventional Yeasts in Biotechnology, Springer-Verlag Berlin, e Walker, 2000, Yeast Physiology e Biotechnology, John Wiley & Sons, Inglaterra). Aqueles com prática na arte perceberão que condições de fermentação podem ser variadas para se aperfeiçoar diversos aspectos da fermentação, incluindo rendimento do produto, produtividade da cultura, e saúde da cultura (entre outros), dependendo do organismo hospedeiro específico e do produto desejado. É particularmente vantajoso utilizar as características favoráveis de Candída para ajustar as condições de fermentação. Assim, o pH pode apresentar durante vários estágios de processamento uma faixa de cerca de 2,5 a cerca de 9,0. Níveis de oxigênio podem variar de cerca de 0 % a cerca de 100 % (relativamente ao teor de oxigênio encontrado no ar), conforme medido na atmosfera acima do meio ou dissolvida no meio. Níveis de oxigênio podem ser medidos ou calculados por meio de qualquer métodos usuais, incluindo pressão parcial, eletrodo de 02, volume/volume, ou taxa de fluxo de gás (WM). Faixas de temperatura podem abranger de cerca de a temperatura ambiente (23°C) a cerca de 40°C e acima (p. ex. até cerca de 45°C).

Condições de fermentação preferidas incluem a manutenção de uma faixa de pH de cerca de 4 até cerca de 5. É especialmente preferido manter um pH de cerca de 5 durante a produção de biomassa e durante a produção de ácido láctico. De preferência, o pH é mantido durante todo o processo de fermentação por meio da adição automatizada de uma base, por exemplo Ca(OH)2. A temperatura durante a produção de biomassa é mantida, de preferência, em cerca de 35°C. De preferência, a biomassa é produzida em condições aeróbicas, em que o meio de cultura é, de preferência, agitado e submetido a um fluxo de ar, até se atingir uma massa de células adequada para a produção de ácido láctico. Durante a produção de ácido láctico, a taxa de agitação e o fluxo de ar são preferivelmente diminuídos, relativamente a sua taxa durante a produção de biomassa.

Os dados a seguir foram gerados de três cultivos diferentes em fermentador sobre meio de glucose nas condições preferidas detalhadas acima.

Rendimento global e produtividade produtividade batelada cepa CDW pH* Base AL Glu Rendi- Tempo g/l/h g/g- (g/1) [ácido (final) mento (h.) célula/h láctico (%) 1 Φ 602 C40/28 5,1 5 Ca(OH)2 73 0 81 34 2,15 0,42 8-34 802 C40/28 5 5/4 Ca(OH)2 49 3 70 90 0,54 0,11 8-34 902 C40/28 4/4 Ca(OH)2 8-34 *pH durante produção de biomassa/pH durante produção de lactato Rendimento e produtividade em fase de produção de lactato produtividade Batelada Cepa CDW pH Glu Glu LA LA Tempo/ Rendi- g/l/h g/g- (g/Ί) (ini.) (final) (ini.) (final) h mento célula/h (%) 602 C40/288-34 5,1 5 63 0 12,5 73 21,5 96 2,81 0,55 802 C40/288-34 5 4 58 3 2 49 77 87 0,61 0,12 902 C40/288-34 4 Os exemplos a seguir servem para ilustrar determinadas concretizações da invenção e não para limitá-la em abrangência ou espírito. Exemplos Exemplo 1: Vetores de resistência a G418 e uso de G418 para seleção de transformantes de C. sonorensis Preparou-se como descrito a seguir vetores que conferem resistência a G418 sobre células de levedura transformadas, o que permite a seleção de transformantes de células de levedura compreendendo uma construção de ácido nucléico recombinante codificando uma proteína útil para a síntese de um produto orgânico. O marcador de resistência a G418 foi clonado sob o controle transcricional do promotor PGK1 de C. sonorensis ou promotor TDH1 e as construções foram denominadas pMI268 (FIG. 2) e pMI269 (FIG. 3), respectivamente. Em ambos os casos utilizou-se o terminador GAL10 de S. cerevisiae. O gene da resistência a G418 foi amplificado por meio de reação em cadeia de polimerase (PCR) utilizando-se a Dynazyme EXT Polimerase (Finnzymes, Espoo, Finlândia) utilizando-se um par de primers de oligonucleotídeo apresentando a seqüência: CTAGTCTAGA ACA ATG AGC CAT ATT CAA CGG GAA ACG (G418 5'; SEQ ID NO:l) e CGC GGATCC GAA TTC TTA GAA AAA CTC ATC GAG CAT CAA ATG (G418 3'; SEQ ID NO:2). O plasmídeo pPIC9K (obtido da Invitrogen) foi usado como padrão. PCR foi realizada incubando-se a mistura de reação durante 5 min. a 95°C, seguido de 29 ciclos de 45 s. a 95°C, 45 s. a 55°C, e 2 min. a 72°C, com uma incubação final durante 5 min. a 72°C. O produto de PCR foi digerido com enzimas de restrição BamRl e Xbal e isolou-se um fragmento com 800 bp. Este fragmento foi ligado ao fragmento 5amHI-XbaI com 4226 bp de pNClOl (obtida de Eric Jarvis na NREL). O plasmídeo pNC 101 foi construído a partir do promotor de fosfoglicerato quinase (pPGK) e das seqüências de terminador GAL10 de S. cerevisiae, utilizando-se técnicas de clonagem convencionais (ver, p. ex., Sambrook et al., Id.). Este plasmídeo também abriga um gene LDH de K. thermotolerans inserido entre sítios Xbal e EcoRI, que, juntamente com um sítio BamRl, estão contidos em uma região de poliligando encontrada entre seqüências promotora e terminadora de levedura. Este plasmídeo permite a expressão de vários genes ou marcadores selecionáveis, sob o controle do promotor e terminador de levedura. O plasmídeo resultante destas manipulações contém o gene da resistência a G418 entre o promotor PGK1 de S. cerevisiae e o terminador GAL10 de S. cerevisiae, e foi denominado pMI260. A estrutura deste plasmídeo é mostrada esquematicamente na FIG. 1. O promotor TDH1 com 600 bp de C. sonorensis foi amplificado por meio de PCR utilizando-se a Dynazyme EXT Polimerase com um par de primers de oligonucleotídeo apresentando a seqüência: GCG ATC TCG AGA AAA TGT TAT TAT AAC ACT ACA C (5441; SEQ ID NO:3) e CTAGTCTAGATT TGT TTG ATT TGT TTG TTT TGT TTT TGT TTG (Csl; SEQ ID NO:4) utilizando-se pMI238 como um padrão (ver acima "Vetores e células hospedeiras"; mostrado na FIG. 6). PCR foi realizada incubando-se inicialmente a mistura de reação durante 5 min. a 95°C, seguido de 29 ciclos de 45 s. a 95°C, 45 s. a 55 C, 2 min. a 72°C, com uma incubação final durante 5 min. a 72°C. O produto de PCR foi tomado rombudo com polimerase de Klenow e cada um dos 4 dNTPs e depois digerido com a enzima de restrição Xbal. O fragmento resultante com 600 bp foi ligado com o fragmento PstI com 4216 bp (tomado rombudo com T4 polimerase)-fragmento Xbal do pMI260. O plasmídeo resultante contém o gene da resistência a G418 ligado operacionalmente ao promotor TDH1 de C. sonorensis e ao terminador GAL10 de S. cerevisiae GAL10 terminador e foi denominado pMI269. A estrutura deste plasmídeo é mostradas esquematicamente na FIG. 3.

O promotor PGK1 com 1500 bp de C. sonorensis foi amplificado por meio de PCR utilizando-se a Dynazyme EXT Polimerase com um par de primers de oligonucleotídeo apresentando a seqüência: GCG ATC TCG AGA AAG AAA CGA CCC ATC CAA GTG ATG (5423; SEQ ID NO:5) e CTA GTC TAG ATG TAT ATA GTC TTT TCT ATT ATT AG (Cs2; SEQ ID N0:6) utilizando-se pMI234 como o padrão (ver acima "Vetores e células hospedeiras"; FIG. 5). PCR foi realizada incubando-se inicialmente a mistura de reação durante 5 min. a 95°C, seguido de 29 ciclos de 45 s. a 95°C, 45 s. a 55°C, 2 min. a 72°C, com uma incubação final durante 10 min. a 72°C. O fragmento de produto de PCR com 1500 bp foi tomado rombudo com polimerase de Klenow e cada um dos 4 dNTPs e depois digerido com a enzima de restrição Xbal. O fragmento de promotor PGK1 com 1500 bp foi ligado com o fragmento Pstl com 4216 bp (tomado rombudo com T4 polimerase)-ffagmento Xbal do pMI260. O plasmídeo resultante contém o gene da resistência a G418 ligado operacionalmente ao promotor PGK 1 de C. sonorensis e ao terminador GAL10 de S. cerevisiae, e foi denominado pMI268. A estrutura deste plasmídeo é mostrada esquematicamente na FIG. 2.

As duas construções pMI268 e pMI269 foram digeridos com enzimas de restrição Sall e Notl e transformadas em C. sonorensis utilizando-se o método químico de acordo com Gietz et al. (1992, Nucleic Acids Res. 20:1425). Esta técnica de transformação foi usada nestes Exemplos, e é descrita resumidamente a seguir. Células de uma cultura realizada de um dia para o outro de C. sonorensis desenvolvidas a uma OD60o de 0,8-1,5 foram recolhidas por meio de centrifugação, e foram lavadas primeiramente com um excesso de um solução de Tris-HCl 10 mM, 1 mM de EDTA (pH 7,5), seguido de lavagem com um excesso de uma solução de acetato de lítio 100 mM (LiAc), 10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA (pH 7,5), e depois ressuspensas em 2 ml de uma solução de 100 mM de LiAc, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA (pH 7,5). Células foram misturadas (cerca de 50 μΐ da suspensão de 2 ml) com cerca de 10 pg de DNA de transformação e 300 μΐ de uma solução de 40 % de PEG4000, 100 mM de LiAc, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA (pH 7,5). As células foram incubadas a 30°C durante 30 min. com agitação lenta.

Adicionou-se sulfóxido de dimetil (DMSO; 40 μΐ) e as células foram incubadas em um banho de água a 42°C durante 15 min. As células foram recolhidas por meio de centrifugação, lavadas com um excesso de uma solução de 10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA (pH 7,5), ressuspensas e incubadas a 30°C em meio YPD (compreendendo 10 g/1 de extrato de levedura, 20 g/1 de peptona e 20 g/1 de glucose) durante 3-7 h. Opcionalmente, a incubação em YPD pode ser continuada de um dia para o outro.

Antes de aplicar seleção as células foram incubadas em YPD líquido durante pelo menos 3 h. ou de um dia para o outro. Os transformantes foram desenvolvidos sobre placas de agar YPD (compreendendo 10 g/1 de extrato de levedura, 20 g/1 de peptona, 20 g/1 de glucose e 2 % de agar) suplementado com antibiótico G418 a uma concentração de 100 pg/ml ou 200 pg/rnl. As placas foram incubadas a 30°C durante 2-5 dias e os transformantes foram então reaplicados sobre placas de seleção frescas. Análise Southern de DNA total isolado das colônias resistentes a G418 mostraram que o gene da resistência a G418 foi integrado no genoma dos transformantes.

Estes resultados mostraram que o gene da resistência a G418 pode ser expresso das construções preparadas como descrito aqui e é uma seleção adequada para transformação de C. sonorensis.

Exemplo 2: Vetores de resistência à higromicina fhgh) e uso de higromicina B para seleção de transformantes de C. sonorensis Preparou-se como a seguir vetores que conferem resistência à higromicina sobre células de levedura transformadas, o que permite a seleção de transformantes de células de levedura compreendendo uma construção de ácido nucléico recombinante que codifica uma proteína útil para a síntese de um produto orgânico. O marcador de resistência à higromicina (E. coli hph) foi clonado sob o controle transcricional do promotor PGK1 e TDH1 de C. sonorensis e as construções foram denominadas pMI270 (FIG. 4) e pMI271, respectivamente. Em ambos os casos utilizou-se o terminador GAL10 de S. cerevisiae. O gene de hph de E. coli que confere resistência à higromicina B foi obtido do plasmídeo pRLMex30 (Mach et al. 1994, Curr. Genet. 25, 567-570). pRLMex30 foi linearizado com a enzima de restrição Nsil e tomado rombudo com T4 DNA polimerase e depois digerido com Xbal. O plasmídeo pMI268 preparado no Exemplo 1 foi digerido com EcoRI e foi tomado rombudo com polimerase de Klenow e cada um dos 4 dNTPs e depois digerido com Xbal. O fragmento resultante com 4900 bp foi ligado com o fragmento de hph com 1035 bp do pRLMex30. Esta ligação produziu um plasmídeo que contém o gene da resistência à higromicina ligado operacionalmente ao promotor PGK 1 de C. sonorensis e ao terminador GAL10 de S. cerevisiae GAL10, e foi denominado pMI270. A estrutura deste plasmídeo é mostrada esquematicamente na FIG. 4. O plasmídeo pMI269 preparado no Exemplo 1 foi digerido com EcoRI e foi tomado rombudo com polimerase de Klenow e cada um dos 4 dNTPs e depois digerido com Xbal. O fragmento resultante com 4000 bp foi ligado ao fragmento de hph com 1035 bp do pRLMex30. Isto produziu um plasmídeo que contém o gene da resistência à higromicina ligado operacionalmente ao promotor TDH1 de C. sonorensis e ao terminador GAL10 de S. cerevisiae, e foi denominado pMI271. A estrutura deste plasmídeo é mostrado esquematicamente na FIG. 7. Células de levedura foram transformadas utilizando-se o método químico de acordo com Gietz et al. (1992, Nucleic Acids Res. 20: 1425) como descrito no Exemplo 1 acima. As duas construções pMI270 e pMI271 foram digeridas com as enzimas de restrição Xhol e NotI. A mistura de transformação foi incubada em YPD a 30°C durante 3 h. antes de ser plaqueada sobre placas seletivas. Os transformantes foram desenvolvidos a 30°C durante 2-5 dias sobre placas de agar YPD suplementado com higromicina B (Calbiochem) a concentrações de 150-300 pg/ml. Transformantes foram reaplicados sobre placas de seleção frescas. A presença do DNA transformado no genoma dos transformantes resistentes à higromicina foi verificada por meio de PCR utilizando-se um par de primers de oligonucleotídeo apresentando a seqüência: CCGGACTA GTT GGT ACA GAG AAC TTG TAA ACA ATT CGG (ScerGal lOt; SEQ ID NO:7) e TAT AAA TAC TTA TCA TTT CCTCC (5436; SEQ ID NO:8). PCR foi realizada incubando-se inicialmente a mistura de reação durante 3 min. a 94°C, seguido de 29 ciclos de 45 s. a 94°C, 45 s. a 55°C, 2 min. a 72°C, com uma incubação final durante 10 min. a 72°C.

Estes resultados mostram que o gene de hph de E. coli pode ser expresso utilizando-se as construções aqui descritas, funciona em C. sonorensis e que a higromicina B pode ser usada para selecionar transformantes de C. sonorensis.

Exemplo 3: Vetores para expressão do LDH de L. helvelicus e para integração objetivada do DNA transformado no lócus de PDC1 Preparou-se como a seguir vetores compreendendo um gene LDH de L. helveticus para integração objetivada no lócus do gene de PDC1 de C. sonorensis. O vetor pMI246 contém a cassete de expressão de MEL5 e a cassete de expressão de LDH de L. helveticus, mostrado esquematicamente na FIG. 8 (ver acima "Vetores e células hospedeiras"). Com o objetivo de se construir um vetor que permita a integração objetivada no lócus de PDC1 de C. sonorensis e substituição da região codificante de proteína de PDC1, adicionou-se no pMI246 fragmentos de DNA correspondentes às seqüências imediatamente a montante e a jusante da região codificante de proteína de PDC1.

O terminador PDC1 foi amplificado por meio de PCR utilizando-se a Dynazyme EXT Polimerase (Finnzymes, Espoo, Finlândia) com primers de oligonucleotídeo apresentando a seqüência: GGG ACT AGT GGA TCC TTG AAG TGA GTC AGC CAT AAG GAC TTA AATTCACC (Cs7; SEQ ID NO:9) e AAGGCCT TGT CGA CGC GGC CGC TTG GTT AGA AAA GGT TGT GCC AAT TTA GCC (Cs8; SEQ ID NO: 10), utilizando-se DNA genômico de C. sonorensis como um padrão. PCR foi realizada incubando-se inicialmente a mistura de reação durante 5 min. a 95°C, seguido de 29 ciclos de 45 s. a 95°C, 45 s. a 55°C, 2 min. a 72°C, com um incubação final durante 10 min. a 72°C. O fragmento de produto de PCR com 920 bp foi digerido com enzimas de restrição BamHl e Notl e o fragmento com 920 bp foi purificado e ligado com o fragmento 5awHI-NotI com 8900 bp do pMI246. O plasmídeo resultante foi denominado pMI256, e é mostrado esquematicamente na FIG. 18. O promotor PDC1 foi amplificado de C. sonorensis com um par de primers de oligonucleotídeo apresentando a seqüência: GGG ACG GGC CCG CGG CCG CTA CAA GTG ATT CAT TCA TTC ACT (Cs5; SEQ ID NO:l 1) e CCC TGG GCC CCT CGA GGA TGA TTT AGC AAG AAT AAA TTA AAA TGG (Cs6; SEQ ID NO: 12) utilizando-se DNA genômico de C. sonorensis como um padrão. PCR foi realizada incubando-se inicialmente a mistura de reação durante 5 min. a 95 °C, seguido de 29 ciclos de 45 s. a 95°C, 45 s. a 55°C, 2 min. a 72°C, com uma incubação final durante 10 min. a 72°C. O fragmento de produto de PCR foi digerido com Apal e o fragmento com 800 bp foi purificado e ligado com o pMI246 linearizado com Apal de 9760 bp (ver acima "Vetores e células hospedeiras"; FIG. 18). O plasmídeo resultante foi denominado pMI257, e é mostrado esquematicamente na FIG. 10. pMI257 contém, nesta ordem, o promotor PGK1 de C. sonorensis, o promotor PGK1 de C. sonorensis ligado operacionalmente ao gene MEL5 de S. cerevisiae, o promotor PGK 1 de C. sonorensis ligado operacionalmente ao LDH de L. helveticus e o terminador CYC1 de S. cerevisiae seguido do terminador PDC1 de C. sonorensis. pMI257 foi digerida com Notl para excisar o fragmento com 7300 bp contendo as cassetes de expressão de MEL5 e LDH flanqueadas pelas regiões a 5' e 3' de PDC1. Este fragmento com 7300 bp foi usado para transformar C. sonorensis por meio do método descrito no Exemplo 1 acima, e os transformantes foram selecionados com base na expressão do marcador de MEL5. Os transformantes foram desenvolvidos sobre placas de agar YPD suplementado com o substrato cromogênico de α-galactosidase, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo (Χ-α-gal; ICN Biochemicals) a uma concentração de 40 pg/rnl. As placas foram incubadas a 30°C durante 1-3 dias e, depois, transferidas a 4°C. Na presença de Χ-α-gal, colônias de levedura transformadas com uma cassete de expressão de MEL5 funcional tomaram-se azuis, enquanto que as colônias não-transformadas estavam brancas. Colônias azuis foram purificadas reaplicando-se as mesmas sobre placas indicadoras frescas. Os transformantes que se originaram da transformação de C. sonorensis com pMI257 digerido com Notl foram denominados como 257-1 até 257-15, 257-41, 257-42, e 257-45.

Análise de manchamento Southern de DNA genômico isolado dos transformantes de pMI257 foi realizada com a sonda de PDC1 de C. sonorensis para identificar transformantes em que ocorreu a substituição antecipada da matriz de leitura aberta de PDC1 pelo DNA de pMI257 transformado. A ausência de uma banda de hibridação de PDC1 nos transformantes 257-3, 257-9, 257-12, 257-15, e 257-41 indicou que o gene PDC1 fora deletado. Outros transformantes de pMI257 e C. sonorensis deram um sinal positivo na hibridação de PDC1. Hibridação com a sonda de LDH de L. helveticus mostrou que o gene LDH estava presente em uma cópia nos deletantes de pdcl. Transformantes 257-6 257-7, e 257-8 continham duas cópias do LDH de L. helveticus integradas randomicamente no genoma. Outros transformantes de pMI257 possuíam uma cópia de LDH integrado randomicamente no genoma.

Estes resultados mostram que a integração objetivada de DNA de pMI257 transformado no lócus de PDC1 ocorreu por meio de recombinação homóloga entre seqüências promotora e terminadora de PDC1. Estes resultados também mostram que PDC1 é uma cópia única de gene em C. sonorensis. Adicionalmente, ocorreram eventos de integração fora do lócus de PDC1. Em alguns transformantes o gene LDH foi integrado em mais de uma cópia no genoma.

Exemplo 4: Vetores para expressão do LDH de B. mesaterium e para integração objetivada do DNA transformado no lócus de PDC1 Preparou-se como a seguir um gene LDE1 de B. megaterium para integração objetivada no locuso do gene PDC1. Nestes vetores, o LDH de L. helveticus no pMI257 foi substituído pelo LDH de B. megaterium. pMI257 foi linearizado com Ncol e os apêndices [overhangs] a 5' foram enchidos parcialmente com DNA polimerase I, fragmento de Klenow, e um mistura de dATP, dCTP, e dTTP, omitindo-se dGTP da reação. Isto foi seguido de remoção das extensões de filamento simples por meio de tratamento com nuclease de Vigna radiata [mung bean\ Em seguida, o DNA foi digerido com BamHl e o fragmento de 9200 bp foi isolado de um gel de agarose a 0,8 % após separação eletroforética. Vetor pVR24 contendo LDH de B. megaterium foi generado de DNA genômico de B. megaterium, e é mostrado na FIG. 21. O gene LDH foi clonado do DNA genômico por meio de PCR utilizando-se primers projetados a partir do número de acesso no. M22305, e ligado em um vetor comercialmente obtenível (ver acima "Vetores e células hospedeiras"). O fragmento com 976 bp contendo o LDH de B. megaterium foi excisado de pVR24 por meio de digestão com Xbal seguido de preenchimento dos apêndices a 5' por meio de DNA polimerase I, fragmento de Klenow e cada um dos 4 dNTPs, e digestão por meio de BamHl. O fragmento Ncol (rombudo)-5awHI com 9200 bp de pMI257 e o fragmento XbaI(rombudo)-itamHI com 976 bp de pVR24 foram ligados e o plasmídeo resultante foi denominado pMI265, mostrado na FIG. 11. pMI265 contém, nesta ordem, o promotor PDC1 de C. sonorensis, o promotor PGK 1 de C. sonorensis ligado operacionalmente ao gene MEL5 de S. cerevisiae, o promotor PGK1 de C. sonorensis ligado operacionalmente ao LDH de B. megaterium e o terminador PDClde C. sonorensis. pMI265 foi digerida com Notl para excisar o fragmento com 7300 bp que consistia das cassetes de expressão de MEL5 e LDH flanqueadas pelas regiões de PDC1 a 5' e 3'. Este fragmento com 7300 bp foi usado para transformar C. sonorensis como descrito no Exemplo 1 e os transformantes foram selecionados sobre placas de YPD suplementado com Χ-α-gal a uma concentração de 40 pg/ml. Os transformantes foram desenvolvidos sobre placas de agar YPD suplementado com X-a-gal (40 pg/ml). Os transformantes que se originam da transformação de C. sonorensis com pMI265 digerido com Notl foram denominados como 265-1 até 265-60.

Análise de manchamento Southern de DNA genômico isolado dos transformantes de pMI265 foi realizada com a sonda de PDC1 de C. sonorensis para identificar transformantes em que a ocorreu substituição antecipada da matriz de leitura aberta de DNA de pMI265 transformado. A ausência de uma banda de hibridação de PDC1 nos transformantes 265-5, 265-7, 265-15, 265-17, 265-33, 265-34, 265-35, 265-38, 265-39, 265-42, 265-43, 265-47, 265-48, 265-49, 265-51, e 265-60 indicou que o gene PDC1 foi deletado. Outros transformantes de pMI265 e C. sonorensis não transformados proporcionaram um sinal positivo para hibridação com PDC1. Hibridação com a sonda de LDH de B. megaterium mostrou que o gene LDH estava presente em uma cópia nos deletantes de pdcl. Transformantes que hibridam positivamente para PDC1 265-14, 265-22 e 265-23 continham duas cópias e 265-56 continha três cópias do gene LDH integradas randomicamente no genoma. Outros transformantes de pMI265 apresentavam uma cópia de LDHa integrado randomicamente no genoma.

Estes resultados mostraram que integração objetivada de DNA de pMI265 transformado no lócus de PDC1 ocorreu por meio de recombinação homóloga entre seqüências promotora e terminadora de PDC1. Estes resultados também confirmaram que PDC1 é um gene de cópia única em C. sonorensis. Os transformantes deletados de pdcl eram viáveis, indicando que PDC1 não é um gene essencial em C. sonorensis. Adicionalmente às integrações que deletam PDC1, eventos de integração fora do lócus de PDC1 ocorreram em determinados transformantes. Em alguns transformantes o gene LDH foi itnegrado em mais de uma cópia no genoma. Exemplo 5: Vetores para expressão de LDH de R. orvzae e para integração objetivada do DNA transformado no lócus de PDC1 Preparou-se como a seguir vetores compreendendo um gene LDH de R. oryzae para integração objetivada no lócus do gene de PDC1 de C. sonorensis. Nestes vetores, as seqüências codificantes de LDH de L. helveticus em pMI257 foram substituídas por LDH de R. oryzae. O plasmídeo pMI257 descrito no Exemplo 3 acima foi linearizado com Ncol e os apêndices a 5' foram enchidos parcialmente com DNA polimerase I, fragmento de Klenow, e a mistura de dATP, dCTP, e dTTP, omitindo dGTP da reação. Isto foi seguido de remoção das extensões de filamento simples por meio de tratamento com nuclease de Vigna radiata. Em seguida, o DNA foi digerido com BamHl e o fragmento com 9200 bp foi isolado de um gel de agarose a 0,8 % após separação eletroforética. A seqüência codificante de DNA codificando LDH de R. oryzae foi ligado operacionalmente ao promotor PGK 1 de C. sonorensis e ao terminador transcricional do gene de PDC1 de C. sonorensis. Vetor pVR 27 contendo LDH de R. oryzae foi genrado de DNA genômico de R. oryzae, e é mostrado na FIG. 22. O gene LDH foi clonado do DNA genômico por meio de PCR utilizando-se primers projetadas a partir do número de acesso AF226154, e ligado em um vetor comercialmente obtenível (ver acima "Vetores e células hospedeiras"). O fragmento com 978 bp contendo o LDH de R. oryzae foi excisado de pVR27 por meio de digestão com Xbal seguido de preenchimento dos apêndices a 5' por meio de DNA polimerase I, fragmento de Klenow e cada um dos 4 dNTPs e digestão por meio de BamRl. O fragmento Ncol (rombudo)-itamHI com 9200 bp de pMI257 e o XbaI(rombudo)-itaraHI com 978 bp de pVR27 foram ligados e o plasmídeo resultante contendo [lacuna] foi denominado pMI266, mostrado esquematicamente na FIG. 12. pMI266 contém, nesta ordem, o promotor PDC1 de C. sonorensis, o promotor PGK 1 de C. sonorensis ligado operacionalmente ao gene MEL5 de S. cerevisiae, o promotor PGK 1 de C. sonorensis ligado operacionalmente ao LDH de R. oryzae A e o terminador PDC1 de C. sonorensis. pMI266 foi digerido com Notl para excisar um fragmento com 7300 que consistia das cassetes de expressão de MEL5 e LDH flanqueadas pelas regiões de PDC1 a 5' e 3'. Este fragmento com 7300 bp foi usado para transformar C. sonorensis por meio do método descrito no Exemplo 1 acima, e os transformantes foram selecionados sobre placas de YPD suplementado com Χ-α-gal a uma concentração de 40 pg/ml. Os transformantes que se originam da transformação de C. sonorensis com pMI266 digerido com Notl foram denominados como 266-1 até 266-13.

Análise de manchamento Southern de DNA genômico isolado dos transformantes de pMI266 foi realizada com a sonda de PDC1 de C. sonorensis para identificar transformantes em que ocorreu a substituição antecipiada da matriz de leitura aberta de PDC1 pelo DNA de pMI266 transfformado. A ausência de uma banda de hibridação de PDC1 em transformantes 266-1, 266-3, 266-4, e 266-11 indicou que o gene PDC1 foi deletado. Em contraste, transformantes de pMI266 266-2, 266-7 e 266-8 e C. sonorensis não-transformada proporcionaram um sinal positivo na hibridação de PDC1. Hibridação com a sonda de LDH mostrou que o gene LDH de R. oryzae estava presente em uma cópia em todos os transformantes.

Estes resultados mostraram que integração objetivada do DNA

de pMI266 transformado no locjus de PDC1 ocorreu por meio de recombinação homóloga entre Seqüências promotora e terminadora de PDC1. Adicionalmente, ocorreram eventos de integração fora do lócus de PDC1. Exemplo 6: Vetor para substituição de PDC1 sem LDH

Preparou-se vetores para substituir PDC1 sem introduzir seqüências codificantes de LDH exógenas. O plasmídeo pMI257 descrito no Exemplo 3 acima foi digerido com Ncol e BamEl de forma a remover o gene LDH e o terminador CYC1 de S. cerevisiae CYC1 terminador. Os apêndices a 5' foram preenchidos com DNA polimerase I, fragmento de Klenow, e cada um dos 4 dNTPs. O fragmento de 9200 bp foi purificado após eletroforese em gel de agarose e recircularizado por meio de incubação a uma concentração de 40 ng/μΐ na presença de 400 U de T4 DNA ligase (New England Biolabs) e o tamponador apropriado recomendado pelo fabricante. O plasmídeo resultante foi denominado pMI267, e é mostrado esquematicamente na FIG. 13. pMI267 contém, nesta ordem, o promotor PDC1 de C. sonorensis, o promotor PGK1 de C. sonorensis ligado operacionalmente ao gene MEL5 de S. cerevisiae, e ao terminador PDC 1 de C. sonorensis. pMI267 foi digerido com Notl para excisar o fragmento com 6300 bp que consistia da cassete de MEL5 franqueada pelas regiões 5' e 3' de PDC1. Este fragmento com 6300 bp foi usado para transformar C. sonorensis pelo método descrito acima no Exemplo 1 e os transformantes foram selecionados em placas de YPD suplementado com Χ-α-gal a uma concentração de 40 pg/ml. Os transformantes que se originam da transformação de C. sonorensis com pMI267 digerido com Notl foram denominados como 267-1 até 267-10.

Análise de manchamento Southern de DNA genômico isolado dos transformantes de pMI267 foi realizadas com a sonda de PDC1 de C. sonorensis para identificar transformantes em que se deletou matriz de leitura aberta de PDC1. A ausência de uma banda de hibridação de PDC1 nos transformantes 267-1 e 267-10 indicou que o gene PDC1 foi deletado.

Estes resultados mostraram que a integração objetivada do DNA de pMI267 transformado no lócus de PDC1 ocorreu por meio de recombinação homóloga entre as seqüências promotora e terminadora de PDC1. Expressão de LDH não foi necessária para manter a viabilidade da cepa deletada de pdcl. Adicionalmente, ocorreram eventos de integração fora do lócus de PDCl.

Exemplo 7: Construção de um vetor de C. sonorensis contendo o gene LDH de B. mesaterium e o marcador G418 Preparou-se como a seguir um vetor compreendendo o gene da resistência a G418 e gene LDH de B. megaterium. Nestes vetores, a cassete de expressão de LDH de B. megaterium do plasmídeo pMI265 e a cassete de expressão do marcador de resistência a G418 do plasmídeo pMI269 foram combinadas no mesmo vetor. O plasmídeo pMI269 descrito no Exemplo 1 foi digerido com EcoRI e os apêndices a 5' foram preenchidos com DNA polimerase I, fragmento de Klenow, e cada um dos 4 dNTPs, seguido de digestão do DNA com BamHL. O fragmento EcoRI(rombudo)-i?amHI com 4800 bp do pMI269 foi ligado com fragmento MscI-itamHI com 2800 bp do plasmídeo pMI265 descrito no Exemplo 4. O plasmídeo resultante foi denominado pMI278 e contém, nesta ordem, o promotor TDH1 de C. sonorensis ligado operacionalmente ao gene da resistência a G418 e o terminador MEL5 seguido do promotor PGK1 de C. sonorensis ligado operacionalmente ao LDH de B. megaterium e ao terminador GAL10 de S. cerevisiae, e é mostrado esquematicamente na FIG. 14.

Exemplo 8: Construção de cepas de C. sonorensis expressando o LDH de R. oryzae e o LDH de B. mesaterium simultaneamente O transformante de C. sonorensis denominado 266-3, em que o LDH de R. oryzae é integrado no lócus de pdcl, foi selecionado como hospedeiro para uma segunda transformação com a construção de LDH de B. megaterium descrita no Exemplo 4 acima. O transformante 266-3 foi transformado adicionalmente com pMI287 digerido com Sall-Notl e os transformantes foram selecionados em placas de agar YPD suplementado com antibiótico G418 a uma concentração de 200 μg/ml. As placas foram incubadas a 30°C durante 2-5 dias para seleção; transformantes foram purificados por meio de reaplicação sobre placas de seleção frescas. Os transformantes resultantes foram denominadas 278-1 até 278-20. A presença do LDH de B. megaterium no genoma de 19 destes transformantes foi verificada por meio de análise de manchamento Southern de DNA de levedura digerido com HindIII utilizando-se o gene LDH de B. megaterium como a sonda. Alguns dos transformantes possuíam mais do que uma cópia do LDH de B. megaterium integrado no genoma. Análise de manchamento Southern foi repetida com o gene LDH de R. oryzae como uma sonda para verificar se o LDH de R. oryzae ainda estava presente.

Este experimento mostrou que C. sonorensis pôde ser transformado muitas vezes e independentemente com marcadores diferentes. Desta maneira demonstrou-se que é possível incrementar o número de cópias do gene de interesse (LDH) no genoma hospedeiro.

Exemplo 9: Vetores para expressão de LDH de B. mesaterium e para integração objetivada do DNA transformado no lócus de PDC2 Preparou-se como a seguir vetores compreendendo um gene LDH de B. megaterium para integração objetivada no lócus do gene PDC2 de C. sonorensis. Promotor PDC2 de C. sonorensis foi amplificado por meio de PCR utilizando-se a Dynazyme EXT polimerase e um par de primers de oligonucleotídeo apresentando a seqüência: GGG ACG GGC CCG CGG CCG CTT ACA GCA GCA AAC AAG TGATGCC (Cs26; SEQ ID NO: 13) e CCC TGG GCC CCT CGA GTT TGA TTT ATT TGC TTT GTA AAGAGAA (Cs27; SEQ ID NO: 14). A cópia genômica do PDC2 de C. sonorensis clonado em um vetor lambda foi usada como o padrão (ver acima). PCR foi realizada incubando-se inicialmente a mistura de reação durante 3 min. a 94°C, seguido de 29 ciclos de 45 s. a 94°C, 45 s. a 55°C, 2 min. a 72 C, com uma incubação final durante 10 min. a 72°C. O produto de PCR com 1000 bp foi clonado no vetor TOPO TA (Invitrogen) e o plasmídeo resultante foi denominado pMI277, mostrado esquematicamente na FIG. 19. O promotor PDC2 foi liberado por meio de digestão com EcoRI e tomado rombudo com a polimerase de Klenow e cada um dos 4 dNTPs. O plasmídeo pMI278 preparado como descrito no Exemplo 7 foi linearizado por meio de Sall e os apêndices a 5' foram preenchidos com polimerase de Klenow e cada um dos 4 dNTPs, depois ligados ao fragmento EcoRI com 1000 bp (rombudo) do plasmídeo pMI277. O plasmídeo contendo o inserto na orientação desejada foi denominado pMI279, mostrado esquematicamente na FIG. 20. O terminador PDC2 foi amplificado por meio de PCR utilizando-se a Dynazyme EXT polimerase com um par de primers de oligonucleotídeo apresentando a seqüência: TGGACTAGTTAGATAG CAA TTC TTA CTT GAA AAA TTA ATT GAA GCA TTACC (Cs29; SEQ ID NO: 15) e GGC CCG CGG CCG CTA AAT ATA ATT ATC GCT TAG TTA TTA AAA TGG (Cs30; SEQ ID NO: 16), utilizando-se a cópia genômica do gene PDC2 de C. sonorensis clonado em um vetor lambda como o padrão. O fragmento terminadorpdc2 inclui parte da matriz de leitura aberta correspondente aos 239 aminoácidos C-terminais. Introduziu-se códons de stop de tradução no oligonucleotídeo de PCR Cs29 em todas as três matrizes a montante dos nucleotídeos correspondentes aos últimos 239 aminoácidos C-terminais no fragmento terminador. PCR foi realizada incubando-se inicialmente a mistura de reação durante 3 min. a 94°C, seguido de 29 ciclos de 45 s. a 94°C, 45 s. a 55°C, 2 min. a 72°C, com uma incubação final durante 10 min. a 72°C. O produto de PCR foi tomado rombudo com a polimerase de Klenow e cada um dos 4 dNTPs, e purificado com uma coluna Qiaquick (Qiagen). O produto de PCR foi fosforilado com T4 polinucleotide quinase e rATP a uma concentração de 1 mM em condições convencionais (ver Sambrook et al., Id.). O fragmento terminador PDC2 com 800 bp foi purificado após eletroforese em gel de agarose e ligado com pMI279 digerido com Ncol (rombudo) que foi desfosforilado com fosfatase intestinal de bezerro. O plasmídeo resultante foi denominado pMI286 e contém, nesta ordem, o promotor PDC2 de C. sonorensis, o promotor TDH1 de C. sonorensis ligado operacionalmente ao gene da resistência a G418 e o terminador MEL5 de S. cerevisiae, o promotor PGK 1 de C. sonorensis ligado operacionalmente ao gene LDH de B. megaterium, o terminador GAL10 de S. cerevisiae seguido do terminador PDC2 de C. sonorensis. Esta construção é mostrada esquematicamente na FIG. 15. O plasmídeo pMI286 foi digerida com Notl para excisar o fragmento com 6400 bp que consistia das cassetes de expressão de resistência a G418 e de LDH flanqueadas pelas regiões a 5' e 3' de PDC2. Este fragmento com 6400 bp foi usado para transformar C. sonorensis por meio do método descrito no Exemplo 1 acima. Os transformantes foram desenvolvidos em placas de agar YPD suplementado com antibiótico G418 a uma concentração de 200 pg /ml. As placas foram incubadas a 30°C durante 2-5 dias e os transformantes foram então reaplicados sobre placas de seleção frescas. Os transformantes foram denominados como 286-1 até 286-40.

Análise de manchamento Southern de DNA genômico isolado dos transformantes de pMI286 foi realizada com a sonda de PDC2 de C. sonorensis (correspondendo aos nucleotídeos na área deletada) para identificar transformantes em que LDH de B. megaterium foi integrado no lócus de PDC2. A ausência de uma banda de hibridação de PDC2 nos transformantes 286-1, 286-2, 286-4, 286-19, e 286-30 indicou que o gene PDC2 foi deletado. Outros transformantes de pMI286 e C. sonorensis não transformadas proporcionaram um sinal positivo na hibridação de PDC2.

Hibridação com a sonda de LDH de B. megaterium mostrou que LDH estava presente em uma cópia nos deletantes de pdc2. A freqüência de integração objetivada no lócus de PDC2 foi de 15 %.

Estes resultados mostraram que a integração objetivada do DNA de pMI286 transformado no lócus de PDC2 ocorre por meio de recombinação homóloga entre sequências promotora de PDC2 e terminadora de PDC2. Estes resultados também mostram que o PDC2 é um gene de cópia única em C. sonorensis. Adicionalmente, ocorreram eventos de integração fora de PDC2. Em alguns transformantes o gene LDH foi integrado em mais de uma cópia do genoma.

Exemplo 10: Construção de cepas de C. sonorensis deletadas de pdcl e disrompidas em pdc2 e abrigo de duas cópias de LDH de B. megaterium integrado no genoma nos loci de vdcl e pdc2 O transformante de C. sonorensis 265-15 apresentando LDH de B. megaterium integrado no lócus de pdcl foi selecionado como hospedeiro para uma segunda transformação com LDH de B. megaterium. Transformante 265-15 foi transformado adicionalmente compMI286 digerido com Notl utilizando-se os métodos descritos no Exemplo 1 acima, e os transformantes foram selecionados em placas de agar YPD suplementado com antibiótico G418 a uma concentração de 200 pg/ml. As placas foram incubadas a 30°C durante 2-5 dias para seleção, e transformantes obtidos desta maneira foram purificados por meio de reaplicação dos mesmos sobre placas de seleção frescas. Os transformantes foram denominados como C44/286-1 até C44/286-40.

Disrupção do gene pdc2 foi verificada utilizando-se a sonda de PDC2 (correspondendo aos nucleotídeos na área deletada). A ausência de banda de hibridação de PDC2 em transformantes C44/286-10, C44/286-26, C44/286-27, C44/286-28, C44/286-29, C44/286-30, C44/286-31, C44/286-32, e C44/286-33 indicou que o gene PDC2 foi deletado. A presença de LDH de B. megaterium no genoma em duas cópias nos deletantes duplos pdcl, pdc2 foi verificada por meio de análise Southern de DNA de levedura digerido com HindIII utilizando-se o gene LDH de B. megaterium, como a sonda.

Estes resultados mostraram que integração objetivada do DNA de pMI286 transformado no lócus de PDC2 ocorreu por meio de recombinação homóloga entre seqüências promotora PDC2 e terminadora de PDC2. Estes resultados também confirmam que o PDC2 é um gene de cópia única em C. sonorensis, e que podem ocorrer eventos de integração fora do lócus de PDC2. Em alguns transformantes o gene LDH foi integrado em mais de uma cópia do genoma. Os transformantes deletados simultaneamente de pdcl e disrompidos empdc2 são viáveis.

Este Exemplo também confirmou que C. sonorensis pode ser transformado muitas vezes e independentemente quando se utiliza marcadores diferentes. Desta maneira também é possível incrementar o número de cópias do gene de interesse (LDH) no genoma hospedeiro.

Exemplo 11: Produção de etanol com as cepas de Odcl-Odc2 Analisou-se como a seguir a produção de etanol em cepas de Candida portando deleções ou disrupções nos genes PDC1 e/ou PDC2. Transformantes denominados C44/286-10, C44/286-26, e C44/286-33 e quatro outras cepas incluídas como controle foram desenvolvidas em 50 ml de YP + 5 % de glucose em frascos agitados de 250 ml com agitação a 250 rpm e a uma temperatura de 30°C. Amostras foram retiradas diariamente e células foram removidas por meio de centrifugação. Amostras de sobrenadante de cultura colhidas 56 h. após inoculação foram analisadas quando ao etanol por meio do método de UV de etanol de Boehringer Mannheim (Tabela 1). Estes resultados mostraram que a produção de etanol pelos transformantes deletados de ambos pdcl e pdc2 é reduzida em mais de dez vezes em comparação com as cepas contendo um gene PDC1 ou PDC2 intacto.

Estes resultados demonstraram que ambos, PDC1 e PDC2, codificam piruvato descarboxilases funcionais, porque uma redução drástica na produção de etanol só é observada quando ambos os genes são deletados simultaneamente. Os resultados também indicaram que disrupção de PDC2 removendo aproximadamente 60 % da matriz de leitura aberta de PDC2 aboliu a função de PDC2.

Tabela 1. Produção de etanol por meio de transformantes de C. sonorensis em YP + 5 % de glucose após 56 horas de cultivo.

Exemplo 12: Vetor para disrupção de PDC2 sem LDH

Preparou-se vetores para substituir PDC2 sem introduzir seqüências codificantes de LDH exógenas. O gene LDH de B. megaterium foi removido do plasmídeo pMI286 descrito no Exemplo 9 como um fragmento Spel-Xbal com 1276 bp. pMI286 foi digerido com Spel e a molécula linearizada parcialmente digerida com Xbal. O fragmento Spel-Xbal com 8100 bp foi isolado após eletroforese em gel e recircularizado. O plasmídeo resultante denominado pMI287 consiste, nesta ordem, do promotor PDC2 de C. sonorensis, promotor TDH1 de C. sonorensis ligado operacionalmente ao gene da resistência a G418 e o terminador MEL5 de S. cerevisiae, o promotor PGK 1 de C. sonorensis seguido do terminador PDC2 de C. sonorensis, e é mostrado esquematicamente na FIG. 16. pMI287 foi digerido com Notl para excisar o fragmento com 5100 bp que consistia da cassete de expressão de G418 flanqueada pelas regiões 5' e 3' de PDC2. Este fragmento com 5100 bp foi usado para transformar C. sonorensis por meio dos métodos descritos no Exemplo 1 acima. Transformantes foram desenvolvidos em placas de agar YPD suplementado com antibiótico G418 a uma concentração de 200 pg/ml. As placas foram incubadas a 30°C durante 2-5 dias e os transformantes foram então reaplicados sobre placas de seleção frescas.

Transformantes foram denominados como 287-1 até 287-57. Análise de manchamento Southern de DNA genômico isolado dos transformantes de pMI287 foi realizada utilizando-se uma sonda de PDC2 que correspondia aos nucleotídeos na região deletada, com o objetivo de identificar transformantes bem sucedidos. Não se observou banda de hibridação de PDC2 nos transformantes 287-6 e 287-16, indicando que o gene PDC2 foi deletado.

Exemplo 13: Vetores para expressão de LDH de L. helveticus e para integração objetivada do DNA transformado no lócus de PDC2 Visando substituir seqüências que codificam LDH de B. megaterium em pMI286 por DNA que codifica LDH de L. helveticus, o pMI286 descrito no Exemplo 9 foi digerido com a enzima de restrição Spel e tomado rombudo com DNA polimerase I, fragmento de Klenow, e cada um dos quatro dNTPs e então digerido com BspMl. Plasmídeo pMI247 mostrado na FIG. 9 foi digerido com BarnHl e tomado rombudo com DNA polimerase I, fragmento de Klenow, e cada um dos quatro dNTPs e então digerido com BspMl. O fragmento SpeI(rombudo)- BspMl com 6800 bp do pMI286 e o fragmento 5amHI(rombudo)- BspMl com 2700 bp do pMI247 foram ligados. O plasmídeo resultante denominado pMI288 consiste, nesta ordem, do promotor PDC2 de C. sonorensis, o promotor TDH1 de C. sonorensis ligado operacionalmente ao gene da resistência a G418 e o terminador MEL5 de S. cerevisiae, o promotor PGK 1 de C. sonorensis ligado operacionalmente ao gene LDH de L. helveticus e o terminador CYC1 de S. cerevisiae seguido do terminador PDC2 de C. sonorensis, e é mostrado esquematicamente na FIG. 17. pMI288 foi digerido com Notl para excisar o fragmento com 6400 bp que consistia das cassetes de expressão de resistência a G418 resistance e LDH flanqueadas pelas regiões 5' e 3' de PDC2. O transformante de C. sonorensis denominado 257-3 apresentando o LDH de L. helveticus integrado no lócus de pdcl foi selecionado como hospedeiro para uma segunda transformação com LDH de L. helveticus. Transformante 257-3 foi transformado adicionalmente com o fragmento Notl com 6400 bp do pMI288 por meio dos métodos descritos no Exemplo 1 acima. Transformantes foram selecionados em placas de agar YPD suplementado com antibiótico G418 a uma concentração de 200 pg/ml. As placas foram incubadas a 30°C durante 2-5 dias, e transformantes obtidos desta maneira foram purificados por meio de reaplicação dos mesmos sobre placas de seleção frescas. Estes transformantes foram denominados como C40/288-1 até C40/288-40.

Disrupção do gene pdc2 foi verificada utilizando-se uma sonda de PDC2 correspondente aos nucleotídeos na área deletada do lócus. A ausência de uma banda de hibridação de PDC2 em transformantes C40/288-2, C40/288-11, C40/288-29, C40/288-34, e C40/288-38, indicou que o gene PDC2 foi deletado. A presença de LDH de L. helveticus no genoma em duas cópias nos deletantes duplos pdcl, pdc2 foi verificada por meio de análise de manchamento Southern de DNA de levedura digerido com HindIII utilizando-se o gene LDH de L. helveticus como a sonda.

Estes resultados demonstraram que a integração objetivada de seqüências de LDH exógenas no lócus de PDC2 de C. sonorensis foi bem sucedida, e proporcionou células com lócus de PDC2 rompidos.

Exemplo 14: produção de ácido L-láctico em meio definido ou rico em glucose em culturas aeróbicas em tubo de ensaio por meio de C. sonorensis abrigando L. helveticus ou gene LDH de B. mesaterium integrado no genoma. Células de C. sonorensis e os transformardes divulgados nos Exemplos acima (nominalmente, 246-27, 247-11, 265-03, 265-05, 265-06, 265-07, 265-11, 265-12, 265-14, 265-15, 265-17, 265-18, 265-22, 265-23, 265-29, 265-33, 265-34, 265-35, 265-38, 265-39, 265-42, 265-43, 265-44, 265-45, 265-46, 265-47, 265-48, 265-49, 265-51, 265-52, 265-55, 265-56, 265-57, e 265-60) foram cultivados em meio YPD (YP suplementado com 5 % de glucose e 0,5 M de MES pH 5,5) ou meio YD (base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos suplementada com 2 % de glucose e 0,5 M de MES pH 5,5). Duas colônias independentes de cada transformante foram inoculadas em um tubo plástico descartável de 14 ml contendo 5 ml de meio YPD ou YD e cultivadas com agitação a 250 rpm a 30°C. Retirou-se amostras durante o cultivo, medindo-se a OD60o, e células foram removidas por meio de centrifugação e o sobrenadante de cultura foi analisado por meio de HPLC quanto a ácido láctico, glucose e etanol. Realizou-se análises de HPLC com bomba Waters 510 HPLC, auto-coletador de amostras Waters 717+ autosampler, e complexo de cromatografia líquida Water System Interfase Module com detector de índice reffativo (refratômetro diferencial Waters 410) e detector de UV (detector de UV Waters 2487 dual λ UV detector). Utilizou-se uma coluna de exclusão de íon Aminex HPX-87H Ion Exclusion Column (300 mm x 7,8 mm, Bio-Rad) e foi equilibrada com 5 mM de H2SO4 em água a 35°C, e amostras foram eluídas com 5 mM de H2SO4 em água a uma taxa de fluxo de 0,6 ml/min. Aquisição de dados e o controle foram realizados empregando programa [software] Waters Millennium. Valores são apresentados como médias de duas amostras independentes. Estes resultados são mostrados nas Tabelas 2 e 3.

Após 13 horas de cultivo em meio definido, transformantes 246-27 e 247-11 abrigando o gene LDH de L. helveticus produzirams 0,1-0,4 g/1 de ácido láctico; 1,8-3,9 g/1 de ácido láctico foram produzidos após 19 horas.

Após 13 horas de cultivo em meio definido, transformantes 265-03, 265-06, 265-11, 265-12, 265-18, 265-29, 265-44, 265-45, 265-46, 265-52, 265-55 e 265-57 abrigando o gene LDH de B. megaterium integrado em um sítio desconhecido no genoma em uma cópia produziu 0,5-1,9 g/1 de ácido láctico; 4,0-6,3 g/1 de ácido láctico foram produzidos após 19 horas.

Após 13 horas de cultivo em meio definido, transformantes 265-14, 265-22 e 265-23 abrigando duas cópias do gene LDH de B. megaterium integrado em um sítio desconhecido no genoma produziram 0,5-1,2 g/1 de ácido láctico; 3,8-6,1 g/1 de ácido láctico foram produzidos após 19 horas.

Após 13 horas de cultivo em meio definido, transformante 265-56 abrigando três cópias do gene LDH de B. megaterium produziu 0,7 g/1 de ácido láctico; 5,2 g/1 de ácido láctico foram produzidos após 19 horas.

Após 13 horas de cultivo em meio definido, transformantes 265-05, 265-07, 265-15, 265-17, 265-33, 265-34, 265-35, 265-38, 265-39, 265-42, 265-43, 265-47, 265-48, 265-49, 265-51 e 265-60 abrigando o gene LDH de B. megaterium integrado no locuso do gene pdcl (genótipo pdcl-) produziram 0,4-2,7 g/1 de ácido láctico; 3,4-7,5 g/1 de ácido láctico foram produzidos após 19 horas.

Após 12 horas de cultivo em meio rico, transformantes 246-27 e 247-11 abrigando o gene LDH de L. helveticus produziram 0,5-1,7 g/1 de ácido láctico, e produziram 3,7-6,1 g/1 de ácido láctico após 17 horas. Em comparação, a cepa hospedeira produziu 0,1 g/1 de ácido láctico após 17 horas de cultivo.

Após 12 horas de cultivo em meio rico, os transformantes 265-03, 265-06, 265-11, 265-12, 265-18, 265-29, 265-44, 265-45, 265-46, 265-52, 265-55 e 265-57 abrigando o gene LDH de B. megaterium produziram 1,4-4,3 g/1 de ácido láctico, e produziram 7,2-9,8 g/1 de ácido láctico após 17 horas.

Após 12 horas de cultivo em meio rico, transformantes 265-14, 265-22 e 265-23 abrigando duas cópias do gene LDH de B. megaterium produziram 2,1-1,9 g/1 de ácido láctico, e produziram 6,3-6,8 g/1 de ácido láctico após 17 horas.

Após 12 horas de cultivo em meio rico, transformante 265-56 abrigando três cópias do gene LDH de B. megaterium produziram 2,6 g/1 de ácido láctico, e produziram 7,5 g/1 de ácido láctico após 17 horas.

Após 12 horas de cultivo em meio rico, os transformantes 265-05, 265-07, 265-15, 265-17, 265-33, 265-34, 265-35, 265-38, 265-39, 265-42, 265-43, 265-47, 265-48, 265-49, 265-51 e 265-60 abrigando o gene LDH de B. megaterium integrado no lócus do gene pdcl (genótipo pdcl-) produziram 2,0-4,7 g/1 de ácido láctico, e produziram 7,1-10,7 g/1 de ácido láctico após 17 horas.

Estes resultados mostram que os transformantes de LDH produziram ácido láctico quando a cepa hospedeira não produziu. Mostrou-se que LDHs de B. megaterium e L. helveticus são ativos em C. sonorensis. Assim, estes LDHs heterológos LDHs podem competir efetivamente pelo piruvato na presença de PDC. A deleção de pdcl não pareceu exercer um efeito sobre o rendimento global e a produção de lactato. Glucose residual foi maior e a concentração de etanol foi menor em transformantes contendo duas (265-14, 265-22, 265-23) ou três (265-56) cópias. Um número maior de cópias de LDH ttde LDH também resultou em maior rendimento de ácido láctico de glucose, menor produção de etanol, e uma maior relação de ácido láctico para etanol. A biomassa (OD60o) aumentou menos em cepas contendo mais de uma cópia de LDH de B. megaterium.

Tabela 2. OD^no glucose residual, ácido láctico e produção de etanol de transformantes de C. sonorensis e LDH em meio definido.

Concentrações de glucose, ácido láctico, e etanol em g/1 Tabela 3. OD^nn glucose residual, ácido láctico e produção de etanol de transformardes de C. snnnrp.nsis e LDH em meio rico.

Concentrações de glucose, ácido láctico, e etanol em g/1.

Exemplo 15: Produção de ácido L-láctico em meio de glucose definido ou rico em culturas aeróbicas em tubos de ensaio por meio de C. sonorensis abrigando L. helveticus, gene LDH de B. mezaterium ou R. oryzae integrado no genoma. Células de C. sonorensis e os transformantes divulgados acima (nominalmente, 246-27, 247-11, 265-39, 265-5, 265-15, 265-44, 266-1, 266-2, 266-4, 266-6, 266-7, 266-8, 266-11, 278-2, 278-3, 278-4, 278-6, 278-7, 278-8, 278-9, 278-11, 278-12, 278-13, 278-14, 278-15, 278-17, 278-18, 278-19, 278-20, 257-3, 257-5, 257-6, 257-8, 257-8, 257-9, 257-10, 257-11, e 257-12) foram cultivadas em meio YPD (YP suplementado com 5 % de glucose e 0,5 M de MES pH 5,5) ou meio YD (base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos suplementada com 2 % de glucose e 0,5 M de MES pH 5,5). Uma colônia de cada transformante foi inoculada em um tubo plástico descartável contendo 5 ml de meio YPD ou YD e cultivada com agitação a 250 rpm a 30°C. Amostras foram retiradas durante o cultivo nos momentos de 12 e 17 horas, mediu-se a OD60o, e células foram coletadas por meio de centrifugação e o sobrenadante de cultura foi analisado por meio de HPLC como descrito acima quanto a ácido láctico, glucose e etanol. Realizou-se análises de HPLC como detalhado acima no Exemplo 14. Estes resultados são mostrados nas Tabelas 4 e 5.

Após 12 horas de cultivo em meio definido, transformantes abrigando o gene de L. helveticus produziram 0,1-0,7 g/1 de ácido láctico. Em meio rico estas células produziram 0,9-2,7 g/1 de ácido láctico.

Após 12 horas de cultivo em meio definido, transformantes abrigando o gene LDH de B. megaterium produziram 0,1-0,5 g/1 de ácido láctico. Em meio rico estas células produziram 1,9-3,2 g/1 de ácido láctico.

Após 12 horas de cultivo em meio definido, transformantes abrigando o gene LDH de R. oryzae produziram 0,2-0,6 g/1 de ácido láctico. Em meio rico estas células produziram 0,9-2,7 g/1 de ácido láctico.

Após 12 horas de cultivo em meio definido, transformantes abrigando ambos, o gene LDH de R. oryzae integrado no lócus do gene pdcl e o gene LDH de B. megaterium, produziram 0,1-0,9 g/1 de ácido láctico. Em meio rico estas células produziram 1,0-3,3 g/1 de ácido láctico.

Após 17 horas de cultivo em meio definido, transformantes abrigando o gene LDH de L. helveticus produziram 0,9-2,1 g/1 de ácido láctico. Em meio rico estas células produziram 6,6-9,9 g/1 de ácido láctico.

Após 17 horas de cultivo em meio definido, transformantes abrigando o gene LDH de B. megaterium produziram 0,8-1,7 g/1 de ácido láctico. Em meio rico estas células produziram 8,7-11,0 g/1 de ácido láctico.

Após 17 horas de cultivo em meio definido, transformantes abrigando o gene LDH de R. oryzae produziram 0,7-1,3 g/1 de ácido láctico. Em meio rico estas células produziram 7,3-9,5 g/1 de ácido láctico.

Após 17 horas de cultivo em meio definido, transformantes abrigando ambos, o gene LDH de R. oryzae integrado no lócus do gene pdcl e o gene LDH de B. megaterium produziram 0,7-3,0 g/1 de ácido láctico. Em meio rico estas células produziram 5,0-10,7 g/1 de ácido láctico.

Estes resultados mostraram que todos os três LDHs heterólogos eram ativos em C. sonorensis e poderíam ser usados para produzir ácido láctico. Estes LDHs podem competir efetivamente pelo piruvato na presença de PDC. Expressão de qualquer destes genes LDH reduziu a utilização, o crescimento e a produção de etanol, particularmente em meio rico. A redução na taxa de utilização de glucose e no crescimento foi a maior em cepas contendo LDH de L. helveticus, e a menor em cepas contendo LDH de R. oryzae, enquanto que transformantes de LDH de B. megaterium apresentaram comportamento intermediário. Os efeitos foram mascarados pela presença do LDH de B. megaterium nos transformantes contendo LDHs de duas origens.

Tabela 4. OD^nn glucose residual, ácido láctico e produção de etanol de transformantes de C. sonorensis e LDH em meio definido. _________________ Concentrações de glucose, ácido láctico e etanol em g/1.

Tabela 5. ODmn elucose residual, produção de ácido láctico e etanol de transformantes de C. sonorensis e LDH em meio rico.

Glucose, ácido láctico e etanol concentrações in g/1.

Exemplo 16: Produção de ácido L-láctico em meio de glucose definido com ou sem tamponamento em culturas microaeróbicas em frascos agitados por C. sonorensis abrigando B. mesaterium ou gene LDH de R. oryzae integrado no genoma.

Os transformantes de C. sonorensis abrigando o gene LDH de B. megaterium (nominalmente 265-23 e 265-55) ou o gene LDH de R. oryzae (266-8) foram cultivados em meio de glucose definido. Desenvolveu-se pré-culturas em meio YD (base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos suplementado com 5 % de glucose e 0,5 M de MES pH 5,5), células foram coletadas por meio de centrifugação e ressuspensas em 50 ml de meio YD (base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos suplementado com 10 % de glucose) apresentando uma OD60o de 15 para os experimentos de cultivo. Leveduras foram cultivadas em frascos de Erlenmeyer de 250 ml com ou sem 4 g de CaC03 com agitação a 100 rpm a 30°C. Amostras foram coletadas durante o cultivo, a OD60o foi medida das culturas sem CaC03, e células coletadas por meio de centrifugação e o sobrenadante de cultura foi analisado quanto a ácido L-láctico (por meio do método do ácido L-láctico UV de Boehringer Mannheim, Roche) e glucose (por meio do método de glucose/GOD-Perid de Boehringer Mannheim, Roche). Estes resultados são mostrados na Tabela 6.

Após 24 horas de cultivo, transformante 265-55 abrigando gene LDH de B. megaterium produziu 35,7 g/1 de ácido láctico com tamponamento de CaC03 e 6,16 g/1 de ácido láctico sem tamponamento quando o pH caiu para 2,75.

Transformante 265-23 abrigando duas cópias de gene LDH de B. megaterium produziu 38,2 g/1 de ácido láctico com tamponamento de CaC03 e 6,81 g/1 de ácido láctico sem tamponamento quando o pH caiu para 2,68 (24 horas de cultivo). Transformante 266-8 abrigando gene LDH de R. oryzae produziu 35,4 g/1 de ácido láctico com tamponamento de CaC03 e 3,05 g/1 de ácido láctico sem tamponamento quando o pH caiu para 2,83 (24 horas de cultivo).

Estes resultados demonstraram que, na presença de CaC03 a pH 6,5, a produção de ácido láctico e a utilização de glucose foram maiores do que em condições não-tamponadas abaixo de pH 3. Titulações mais elevadas de ácido láctico foram obtidas na presença de CaC03.

Tabela 6. OD^m glucose residual (g/lL e produção de ácido láctico (g/D de transformantes de LDH em meio definido. "C" indica a presença de CaC03 no cultivo.

Exemplo 17: Ácido láctico intracelular em cultivo não-tamponado e tamponado com CaCCh Pellets de células de transformantes de C. sonorensis abrigando o gene LDH de B. megaterium (nominalmente 265-23 e 265-55) ou o gene LDH de R. oryzae (266-8) cultivados em meio de glucose definido, como descrito acima no Exemplo 16, foram analisados para se determinar a concentração de ácido láctico intracelular. Coletou-se amostras (2 ml) durante o cultivo a 8 h. e 24 h., mediu-se a OD60o e células foram coletadas por meio de centrifugação. O sobrenadante foi descartado e cada um dos pellets foi lavado com 1 ml de 10 mM de K2HPO4/KH2PO4 gelado, pH 7,5, suplementado com 2 mM de EDTA. Pellets de células lavados foram suspensos em 0,5 ml do mesmo tamponador e armazenados a -70°C. Amostras foram orvalhadas e lavadas (1 ml) uma vez em 1 M de Tris-HCl, pH 9,0, e centrifugadas a 13.000 rpm durante 1 min. O pellet foi suspenso a 1 ml de ácido tricloroacético (TCA) 5 % gelado e foi submetido a agitação com vórtice durante 1 min. Após agitação com vórtice, a amostra foi mantida sobre gelo durante cerca de 30 min. Após incubação sobre gelo, a amostra foi submetida a agitação com vórtice durante 1 min. e centrifugado a 13.000 rpm durante 30 min. a 4°C. Mediu-se níveis de ácido láctico no sobrenadante coletado. Analisou-se a concentração de ácido láctico da amostra com um método enzimático (método do ácido L-láctico UV, Boehringer Mannheim, Roche) ou por meio de HPLC (como no Exemplo 14). A concentração intracelular de ácido láctico foi calculada como a seguir: 1. Volume intracelular das células (na amostra): Peso seco da cultura (g/1) * volume da amostra (1) * 2 ml/g célula = volume da célula (ml).

Volume da célula é convertido em litros multiplicando-se o mesmo por 0,001. Um grama de célula (peso seco) corresponde a 2 ml de volume da célula (Gancedo & Serrano, 1989, "Energy Yielding Metabolism," em The veasts. (Rose & Harrison, eds.), Vol 3, Academic Press: London). 2. As quantidades de ácido láctico nas células: Concentração medida de ácido láctico (g/1) * volume usado de TCA a 5 % (1) = quantidade de ácido láctico (g) na amostra. Para calcular a quantidade de ácido láctico na célula: dividir a quantidade de ácido láctico na amostra (g) pelo volume da célula (1).

Após 24 horas de cultivo transformante 265-55 abrigando o gene LDH de B. megaterium apresentou uma concentração intracelular de 28,2 g/1 de ácido láctico com tamponamento de CaC03 e 7,2 g/1 de ácido láctico sem tamponamento. Transformante 265-23 abrigando duas cópias do gene LDH de B. megaterium apresentou uma concentração intracelular de 46,1 g/1 de ácido láctico com tamponamento de CaCC>3 e 8,2 g/1 de ácido láctico sem tamponamento, após 24 horas de cultivo. Transformante 266-8 abrigando gene LDH de R. oryzae apresentou uma concentração intracelular de 45,4 g/1 de ácido láctico com tamponamento de CaC03 e 4,9 g/1 de ácido láctico sem tamponamento (24 horas de cultivo). Estes resultados são mostrados na Tabela 7.

Estes resultados mostraram que após 8 h. de cultivo intracelular os níveis de ácido láctico eram duas vezes tão altos quanto níveis extracelular em transformantes 265-55 e 265-23 quando desenvolvidos em cultura não tamponada. A 8 h. de cultivo para os outros transformantes, a diferença entre níveis intra- e extracelular foi pequena, de cerca de 10 %. Quando CaC03 foi incluído nas culturas, os níveis de ácido láctico intracelular e extracelular em todas as cepas foram maiores do que em culturas sem CaC03. As concentrações de ácido láctico intra- e extracelular em todas as cepas aumentaram de 8 para 24 h. na mesma cultura tamponada com CaC03. As concentrações de ácido láctico intracelular nas culturas tamponadas são semelhantes a 8 h. e a 24 h. Os níveis de ácido láctico intracelular da cepa 266-8 são menores do que os níveis das outras cepas.

Tabela 7. Concentração de ácido láctico intracelular (g/Γ). "C" indica a presença de CaC03 no cultivo._______________________________ Exemplo 18: Atividades enzimáticas de lactato desidrogenase e piruvato descarboxilase em C. sonorensis abrigando L. helveticus ou gene LDH de B. mesaterium integrado no genoma.

Os transformantes de C. sonorensis (nominalmente, 246-27, 247-11, 257-3, 257-12, 257-6, 247-9, 246-27, 247-11, 265-39, 265-15, 265-44, 265-55, 265-23, 265-22, 265-56, 278-14, 278-17, 286-4, 286-30, e 286-1) foram cultivados em 50 ml de meio YD (base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos suplementado com 5 % de glucose e 0,5 M de MES pH 5,5), em frascos de Erlenmeyer de 250 ml com agitação a 250 rpm a uma OD60o de 10 a 30°C. Células foram coletadas por meio de centrifugação e o sobrenadante de cultura foi analisado por meio de HPLC. Amostras de células a serem usadas para medições de atividade enzimática (2 ml) foram coletadas por meio de centrifugação e lavadas com 1 ml de K2HPO4/ KH2P04 10 mM gelado, pH 7,5 suplementado com 2 mM de EDTA. Pellets de células lavados foram ressuspensos em 0,5 ml do mesmo tamponador e armazenados a -70°C. Amostras foram orvalhadas à temperatura ambiente e lavadas (1 ml) uma vez em tamponador de sonificação (10 0 mM de KH2P04 / K2HP04, pH 7,5 suplementado com 2 mM MgCl2 e 10 mM de DTT). Amostras lavadas foram ressuspensas em 0,5 ml de tamponador de sonificação e homogeneizadas com 0,5 ml de pérolas de vidro com um homogeneizador Bead Beater durante 1 minuto. Em seguida amostras de homogeneização foram centrifugadas a 14.000 rpm durante 30 min. a 4°C. Coletou-se amostras de sobrenadante e determinou-se a atividade de lactato desidrogenase por meio de espectrofotometria (A340) com analisador automatizado Cobas MIRA a 30°C em tamponador de acetato de sódio (50 mM de acetato de Na, pH 5,2) (LDH de Lactobacillus helveticus) ou em tamponador de imidazol (40 mM de imidazol-HCl, pH 6,5) (LDH de Bacillus megaterium) contendo 0,4 mM de NADH, 5 mM de frutose-l,6-difosfato, 1 mM de ácido glioxílico e 2 mM de piruvato. As concentrações de proteína foram determinadas pelo método de Lowry (Lowry et al., 1951, J. Biol. Chem. 193: 265-275). Utilizou-se albumina de soro bovino (Sigma) como um padrão de proteína. Determinou-se a atividade de piruvato descarboxilase por via espectrofotométrica (A340) com analisador automatizado Cobas MIRA a 30°C em tamponador de imidazol (40 mM de imidazol-HCl pH 6,5) contendo 0,2 mM de NADH, 50 mM de MgCl2, 0,2 mM de pirofosfato de tiamina (cocarboxilase), 90 unidades de ADH e 50 mM de piruvato. 1 U de atividade de enzima foi definido como a quantidade de atividade que converte 1 pmol de NADH a NAD+ por minuto. Estes resultados são mostrados na Tabela 8.

Este Exemplo demonstrou que atividade de LDH intracelular se correlaciona com o número de cópias dos genes LDH no genoma. A atividade de LDH calculada em cepas que abrigam uma cópia do LDH de L. helveticus foi de 8 U/mg de proteína celular total, e a atividade em cepas que abrigam duas cópias foi de 15 ou 35 U/mg de proteína celular total. Titulações de ácido láctico e rendimentos de glucose foram maiores nas cepas contendo múltiplas cópias do gene LDH, no entanto as titulações de etanol foram menores do que em cepas contendo apenas uma cópia do gene LDH. Atividade de LDH caculada em cepas que abrigam uma cópia do LDH de B. megaterium foi de 2-3 U/mg de proteína celular total, a atividade em cepas que abrigam 2 cópias foi de 10 U/mg, e a atividade em cepas que abrigam 3 cópias foi de 40 U/mg.

Atividade de piruvato descarboxilase foi tipicamente de 2-4 U/mg de proteína celular total em cepas contendo um gene PDC2 intacto. Quanto pdc2 foi rompido, atividade de PDC caiu abaixo de 0,4 U/ mg de proteína celular total. Se ambos, pdcl e PDC2, fossem deletados ou disrompidos (cepa C44/286-10) a atividade de PDC diminuiría a 0,07 U/mg de proteína celular total.

Tabela 8. Atividades enzimáticas de LDH e PDC: concentrações de glucose, ácido láctico. e etanol: rendimento de ácido láctico no sobrenadante de cultura foi medido de culturas desenvolvidas em meio YD. n.d.: não determinado, lx, 2x. e 3x indicam o número de cópis do gene LDH.

Exemplo 19: Produção de ácido L-láctico em meio de glucose definido por C. sonorensis abrigando o gene codificante LDH de L. helveticus, B. megaterium ou de R. orvzae LDH. ou ambos os genes LDH de B. mesaterium e R. oryzae integrados no genoma. Células de C. sonorensis e os transformantes (nominalmente 266-7, 266-8, 246-27, 247-11, 257-3, 257-12, 257-6, 247-9, 265-39, 265-15, 265-44, 265-55, 265-23, 265-22, 265-56, 266-3, 278-14, 278-17, 286-4, 286-30, 286-1) foram cultivadas em meio YD (base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, pH 5,5, suplementado com 5 % de glucose e 0,5 M de MES), e coletadas por meio de centrifugação. As células foram ressuspensas em 50 ml de YD (base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos suplementada com 10 % de glucose) a uma OD600 de 15 para os experimentos de cultivo. As células foram cultivadas em frascos de Erlenmeyer de 250 ml contendo 4 g de CaC03 com agitação a 100 rpm a 30°C. Retirou-se amostras durante o cultivo, as células foram coletadas por meio de centrifugação, e o meio de crescimento foi analisado quanto a ácido láctico, glucose, e etanol, por meio de HPLC como descrito acima (Exemplo 14). Estes resultados são mostrados nas Tabelas 9-13.

As titulações máximas de ácido láctico nos sobrenadantes de cultura foram atingidas tipicamente a 72 h. ou mais tarde no cultivo, após toda a glucose ter sido consumida. As titulações máximas e os rendimentos atingidos de ácido láctico conforme classificados com base nos diferentes fundos genéticos, foram os seguintes: - 1 cópia de LDH de R. oryzae (cepa 266-7): 81 g/1 e 79 % de rendimento a 96 h. - 1 cópia de LDH de B. megaterium (cepa 265-55): 85 g/1 e 82 % de rendimento a 96 h. - 1 cópia de LDH de L. helveticus (cepa 257-3): 85 g/1 e 84 % de rendimento a 96 h. - 2 cópias de LDH de B. megaíerium (cepa 265-22): 87 g/1 e 84 % de rendimento a 72 h. - 3 cópias de LDH de B. megaíerium (cepa 265-56): 83 g/1 e 80 % de rendimento a 72 h. - 2 cópias de LDH L. helveticus (cepa 247-9): 90 g/1 e 89 % de rendimento a 72 h. - 1 cópia de LDH de R. oryzae e 1 cópia de LDH de B. megaíerium (cepa 278-17): 79 g/1 e 76 % de rendimento a 72 h. - 1 cópia de LDH de R. oryzae e 2 cópias de LDH de B. megaíerium (cepa 278-14): 89 g/1 e 86 % de rendimento a 96 h.

Após toda a glucose ter sido consumida formou-se um precipitado de lactato de cálcio nas seguintes culturas: cepas 246-27, 247-11, 265-39, 265-15, 265-44, 265-23, 265-22, 278-14, 278-17, 286-4, 286-30, e 286-1. A formação de precipitado também indicou que se obteve titulações muito altas de ácido láctico.

Estes resultados demonstraram que C. sonorensis superexpressando LDH de L. helveticus, R. oryzae ou de B. megaíerium atingiu altas titulações (>80 g/1) e rendimentos (>80 %) finais de ácido láctico a partir de glucose em meio definido tamponado com CaC03 a pH 6,5. Transformantes de LDH de L. helveticus e de B. megaíerium realizaram essencialmente bem e de forma equiparada, e melhor do que transformantes de LDH de R. oryzae que proporcionaram titulações e rendimentos ligeiramente menores de ácido láctico. O número de cópias de LDH afetou particularmente a formação de subproduto: um número maior de cópias de LDH e uma atividade [maior] de LDH resultou em menor produção de etanol e acetato. Ambos os transformantes de LDH, de L. helveticus e de B. megaíerium, produziram menos etanol e acetato do que transformantes de LDH de R. oryzae. Outros subprodutos medidos, incluindo glicerol e piruvato, estiveram presentes em quantidades desprezíveis, e não diferem significativamente entre os genótipos de PDC+,pdcl- ou pdc2-.

Tabela 9. Titulações e rendimentos máximos de ácido láctico e produção de etanol e acetato por transformantes de LDH de C. sonorensis em cultivo tamponado com CaCCb em meio definido, lx 2x e 3x indicam o número de cópias do gene LDH.

Tabela 10. Glucose g/1 em diferentes momentos. n.d.= não determinado: * -precipitado de lactato de cálcio.____________________________ Tabela 11. Ácido láctico g/1: n.d. = não determinado: * = precipitado de lactato de cálcio.

Tabela 12. Etanol g/1. Valores abaixo do limite de detecção (0.02 g/1) não são mostrados, n.d. = não determinado. __ r Tabela 13. Acido láctico (g/ g glucose consumida), n.d. = não determinado; * = precipitado de lactato de cálcio.

Exemplo 20: Produção de ácido L-láctico em meio de glucose definido em tubos inundados com nitrogênio por C. sonorensis abrigando L. helveticus ou gene codificante LDH de R. oryzae integrado no genoma.

Produção de ácido L-láctico em células de C. sonorensis transformadas foi demonstrada como a seguir. Células de C. sonorensis e os transformantes que abrigando o gene LDH L. helveticus (nominalmente, 246-14, 246-14, 246-18, 246-23, 246-27, 247-7, 247-8, 247-11, e 257-3) ou o gene LDH de R. oryzae (266-3 e 266-4) foram cultivadas em meio YD (base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos suplementada com 12 % de glucose e 0,4 M de MES pH 5,5). Pré-culturas foram desenvolvidas em 50 ml de meio YD (base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos suplementada com 6,5 % de glucose e 0,4 M MES, pH 5,5) em frascos de Erlenmeyer de 250 ml com agitação a 250 rpm a 30°C. Células foram recolhidas por meio de centrifugação e lavadas uma vez com 0,9 % de NaCl, depois ressuspensas em 50 ml de meio YD a uma OD60o de 11 para os experimentos de cultivo. Leveduras foram cultivadas em tubos plásticos descartáveis de 50 ml inundados com nitrogênio e com agitação a 250 rpm a 30°C (condições (quase) anaeróbicas). Coletou-se amostras durante o cultivo e, após isto, os tubos foram inundados com nitrogênio. Mediu-se a OD60o, e células foram coletadas por meio de centrifugação e o sobrenadante de cultura analisado por meio de HPLC como descrito acima para ácido láctico, glucose e etanol. Estes resultados são mostrados nas Tabelas 14-20.

Após 94 horas de cultivo os transformantes abrigando gene LDH de L. helveticus produziram 6,9-7,2 g/1 de ácido láctico (equivalente a um rendimento de 66-84 %) e 1-1,4 g/1 de etanol, enquanto que a cepa hospedeira produziu 0,1 g/1 de ácido láctico e 40 g/1 de etanol. Os transformantes abrigando gene LDH de R. oryzae produziram 7,2-8,8 g/1 de ácido láctico (equivalente a um rendimento de 13-18 %) e 17-28 g/1 de etanol após 94 horas de cultivo. O consumo de glucose e a produção de etanol pelos transformantes de LDH de R. oryzae foram mais rápidos do que aqueles dos transformantes de L. helveticus.

Estes resultados mostraram que C. sonorensis transformado com LDH de L. helveticus ou LDH de R. oryzae produziram ácido láctico de glucose em culturas em tubos inundados com nitrogênio.

Tabela 14. Ácido láctico g/g de glucose consumida Exemplo 21: Produção de ácido L-láctico em meio rico em glucose sem tamponamento em culturas microaeróbicas em frascos agitados por C. sonorensis abrigando gene LDH de L. helveticus ou de B. mesaterium integrado no genoma.

Produção de ácido L-láctico em células transformadas de C. sonorensis foi demonstrada como a seguir. Os transformantes de C. sonorensis abrigando o gene LDH de B. megaterium (nominalmente, 265-23 e 286-1) e gene LDH de L. helveticus (246-27 e 247-11) divulgados acima foram cultivados em 50 ml de meio YD (base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos suplementada com 5 % de glucose e 0,5 M de MES, pH 5,5) em frascos de Erlenmeyer de 250 ml com agitação a 250 rpm a 30°C. Células foram recolhidas por meio de centrifugação e depois ressuspensos in 50 ml de YP suplementado com 5 % de glucose a uma OD60o de 15 para os experimentos de cultivo. Células foram cultivadas em frascos de Erlenmeyer de 250 ml com agitação a 100 rpm a 30°C. Coletou-se amostras durante o cultivo, mediu-se a OD60o, e células foram coletadas por meio de centrifugação. O sobrenadante de cultura foi analisado quanto a ácido L-láctico (pelo método de ácido L-láctico UV de Boehringer Mannheim, Roche), quanto à glucose (pelo método de glucose/ GOD-Perid de Boehringer Mannheim, Roche), quanto a acetato (pelo método de ácido acético UV de Boehringer Mannheim, Roche), e quanto a etanol (pelo método de etanol UV de Boehringer Mannheim, Roche). Estes resultados são mostrados nas Tabelas 15-20.

Transformantes 246-27 e 247-11 abrigando gene LDH L. helveticus integrado randomicamente no genoma de levedura (PDC+ genótipo) produziram 7,8-9,0 g/1 de ácido láctico (equivalente a um rendimento de 24-29 %) após 24 horas de cultivo. O transformante 286-1 abrigando gene LDH de B. megaterium integrado no lócus do gene pdc2 (genótipo pdc2-) produziram 8,9 g/1 de ácido láctico (equivalente a um rendimento de 31 %) após 24 horas de cultivo. Transformante 265-23 abrigando duas cópias de gene LDH de B. megaterium integrado randomicamente no genoma (genótipo PDC+) produziu 9,1 g/1 de ácido láctico (equivalente a um rendimento de 30 %) após 24 horas de cultivo. Após 24 horas de cultivo os transformantes abrigando gene LDH de B. megaterium produziram 8,9-9,1 g/1 de ácido láctico, equivalente a um rendimento de 30-31 % de glucose. Transformantes abrigando o gene LDH de L. helveticus produziram 7,8-9,0 g/1 de ácido láctico, que é equivalente a um rendimento de 24-29 % de glucose. Embora alguma glucose tenha sido consumida a 24 h, toda a glucose foi eventualmente consumida (a 120 h). Contudo, não ocorreu qualquer aumento da concentração de ácido láctico após 24 h. O consumo de glucose por todas as cepas foi muito semelhante. O pH do meio de cultura foi entre 3,4-3,8 durante este experimento. O transformante 265-23 contendo duas cópias de LDH de B. megaterium produziu menos etanol e acetato no início do cultivo, enquanto que o transformante de pdc2 286-1 produziu menos etanol e acetato mais próximo do fim do cultivo do que as outras cepas.

Estes resultados demonstraram que C. sonorensis transformada com LDH de L. helveticus ou LDH de B. megaterium foi capaz de produzir ácido láctico a partir de glucose em condições microaeróbicas a pH baixo até 9 g/1.

Tabela 15. Absorbância OD^nn Exemplo 22: Produção de ácido L-láctico em um biorreator em meio rico em glucose por C. sonorensis abrigando gene LDH de B. mesaterium integrado no genoma.

Transformantes de C. sonorensis denominados 265-55, 286-30 e 265-15, descritos acima, foram cultivados em biorreatores aeróbicos. Realizou-se cultivo em bateladas a 35°C em um biorreator de laboratório (Biostat CT-DCU3, Braun, Alemanha) com um volume de trabalho de 2 1. Durante a fase de produção o pH foi mantido em 5,0 ± 0,1 ou aumentado para 6.0 ±0,1 após 48 horas de cultivo através da adição automatizada de 5 M de hidróxido de potássio (KOH). Biomassa foi produzida com meio YP suplementado com 150 g/1 de glucose. A fase de produção de biomassa foi inoculada com 20 ml de cultura armazenados em 23 % (peso/volume) de glicerol a -80°C a uma OD60o inicial de 0,7-1. O biorreator foi enxaguado com 100 % de ar a uma taxa de fluxo de 1,0 1/min e agitado a 800 rpm durante esta fase. Após 23,5 horas de cultivo, produziu-se 10-21 g/1 de massa de células (peso seco) (equivalente a um rendimento de 0,2-0,3 g de peso seco por grama usado de glucose). Após a produção de 24 horas de biomassa, o biorreator foi esvaziado e células foram recolhidas por meio de centrifugação (4000 rpm, 20°C, 10 min). O meio para produção de lactato (YP suplementado com 100 g/1 de glucose) foi bombeado para o biorreator e foi inoculado com as células recolhidas de uma fase de produção de biomassa, a uma densidade correspondente a 5 g/1 de peso seco. O biorreator foi enxaguado com 10 % de air-90 % de gás de nitrogênio a uma taxa de fluxo de 1.01 min'1 e agitado a 500 rpm.

Coletou-se amostras durante o cultivo. Para cada amostra, determinou-se o peso seco das células, mediu-se a OD60o, e as células foram coletadas por meio de centrifugação. Sobrenadantes de cultura foram analisados por meio de HPLC como descrito acima quanto a ácido láctico, glucose, etanol, e acetato. Estes resultados são mostrados nas Tabelas 21 e 22. O transformante abrigando o gene LDH de B. megaterium integrado randomicamente no genoma (265-55, genótipo PDC+) produziu 28 g/1 de ácido láctico (equivalente a um rendimento de 67 %) a pH 5,0, após 52 horas de cultivo na fase de produção de lactato. O mesmo transformantes produziu 28 g/1 de ácido láctico (equivalente a um rendimento de 60 %) a pH 6,0 após 72 horas de cultivo na fase de produção. O transformante abrigando o gene LDH de B. megaterium integrado no lócus do genepdcl (265-15, genótipo pdcl -) produziu 23 g/1 de ácido láctico (equivalente a um rendimento de 66 %) a pH 5,0 após 51 horas de cultivo na fase de produção de lactato. O transformante abrigando o gene LDH de B. megaterium integrado no lócus do gene pdc2 (286-30, genótipo pdcl -) produziu 27 g/1 de ácido láctico (equivalente a um rendimento de 54 %) a pH 5,0 após 46 horas de cultivo na fase de produção de lactato.

Após de 46 a 52 horas de produção de fase de ácido láctico, os transformantes produziram 23-28 g/1 de ácido láctico (equivalente a um rendimento de a 54-67 %).

Estes resultados demonstraram que C. sonorensis superexpressando um gene que codifica lactato desidrogenase heterológa produziu ácido láctico a partir de glucose em fermentação em batelada sob condições microaeróbias (p. ex. de 0 %-2 % de O2 na atmosfera).

Tabela 21: Produção de biomassa em cultivos de biorreator em meio YPD com 150 g/1 de glucose Tabela 22: Produção de lactato com C. sonorensis em cultivos de biorreator em meio YPD com 100 g/1 de glucose. Consumo de glucose, concentração de lactato. e rendimento de lactato no momento em que se atingiu o pico da concentração de lactato. * = pH foi aumentou para 6,0 a 48 h.

Tabela 23: Produção de subproduto com C. sonorensis em cultivos de biorreator em meio YPD com 100 g/1 de glucose. Concentrações de subproduto no momento em que se atingiu o pico da concentração de lactato. *= pH foi incrementado para 6,0 a 48 h. Ácido láctico e piruvato intracelulares Determinou-se as concentrações intracelulares de ácido láctico e piruvato como descrito acima no Exemplo 17, exceto que o volume da amostra foi de 1 ml e o pellet de células foi lavado (1 ml) em 1 M de Tris-HC1, pH 9,0, centrifugado a 13.000 rpm durante 1 min., e armazenado a -70°C. Após orvalhamento, o pellet foi suspenso diretamente em 1 ml de TC A a 5 % gelado. Analisou-se enzimaticamente a concentração intracelular de piruvato da amostra (kit de piruvato, Sigma Diagnostics). Estes resultados são mostrados nas Tabelas 24-27. O transformante abrigando o gene LDH de B. megateríum integrado randomicamente no genoma (265-55, genótipo PDC+) produziu 60,9 g/1 de ácido láctico nas a 52 horas de cultivo na fase de produção de lactato, a pH 5,0. O mesmo transformante produziu 38,7 g/1 de ácido láctico, a ρΗ 6,0, a 72 horas de cultivo na fase de produção de lactato. O transformante abrigando o gene LDH de B. megaterium integrado no lócus de pdcl (265-15, genótipo pdcl-) produziu 13,4 g/1 de ácido láctico nas células a 51 horas de cultivo na fase de produção de lactato. O transformante abrigando o gene LDH de B. megaterium integrado no lócus de pdc2 (286-30, genótipo pdc2-) produziu 14,3 g/1 de ácido láctico a 49 horas de cultivo na fase de produção de lactato. O transformante abrigando o gene LDH de B. megaterium integrado randomicamente no genoma (265-55, genótipo PDC+) produziu 0,1 g/1 de piruvato nas células durante o cultivo a pH 5,0 e a pH 6,0. O transformante abrigando o gene LDH de B. megaterium integrado no lócus de pdcl (265-15, genótipo pdcl-) ou no lócus de pdc2 (286-30, genótipo pdc2~) produziu 0,3 g/1 de piruvato nas células durante os cultivos.

Estes resultados mostraram que deleção de pdcl e disrupção de pdc2 causaram um aumento nos níveis intracelulares de piruvato. Na cepa PDC+ níveis intracelulares de ácido láctico cresceram próximos do fim dos cultivos, embora esta tendência não se apresentasse clara nas cepas pdcl- e pdc2~.

Tabela 24. Concentração intracelular de lactato e piruvato (g/1) na cepa 265-55 (PDC+. pH 5.0) Tabela 25. Concentração intracelular de lactato e piruvato fg/D na cepa 265-55 (TOC+. pH 6.0)) _____________________________________________ Tabela 26. Concentração intracelular de lactato e piruvato fg/Γ) na cepa 286-30 (vdc2- pH 5.0) Tabela 27. Concentração intracelular de lactato e piruvato fg/Γ) na cepa 265-15 (vdcl-, pH 5.0)________________ Atividades de lactato desidrogenase e piruvato descarboxilase Atividades de lactato desidrogenase e piruvato descarboxilase foram determinadas como a seguir. Coletou-se amostras para medições de atividade enzimática (2 ml) por meio de centrifugação e os pellets de células foram lavados com 1 ml de K2HPO4/KH2PO4 10 mM gelado, pH 7,5, suplementado com 2 mM de EDTA. Pellets lavados foram ressuspensos em 0,5 ml do mesmo tamponador e armazenados a -70°C. Amostras foram orvalhadas à temperatura ambiente e lavadas (1 ml) uma vez em tamponador de homogeneização (100 mM de KH2P04,/ K2HP04, pH 7,5, suplementado com 2 mM de MgCl2 e 10 mM de DTT). Amostras lavadas foram ressuspensas em 0,5 ml de tamponador de homogeneização e homogeneizadas com 0,5 ml de pérolas de vidro com um homogeneizador Bead Beater durante 1 minuto. Em seguida, amostras de homogeneização foram centrifugadas a 14.000 rpm durante 30 min. a 4°C. Coletou-se amostras de sobrenadante e determinou-se as atividades de lactato desidrogenase e piruvato descarboxilase por via espectrofotométrica (A340) como descrito acima no exemplo 18, exceto por não se ter usado ácido glioxílico. Estes resultados são mostrados nas Tabelas 28-31. O transformante abrigando gene LDH de B. megaíerium integrado randomicamente no genoma (265-55, genótipo PDC+) produziu atividade de lactato desidrogenase de 1,4 U/mg de proteína celular total e atividade de piruvato descarboxilase de 0,8 U/mg de proteína celular total a 52 horas de cultivo na fase de produção de lactato a pH 5,0. O mesmo transformante produziu atividade de lactato desidrogenase de 1,2 U/mg de proteína celular total e atividade de piruvato descarboxilase de 0,4 U/mg de proteína celular total, a pH 6,0, a 72 horas de cultivo na fase de produção de lactato. O transformante abrigando o gene LDH de B. megaíerium integrado no lócus de pdcl (265-15, genótipo pdcT) produziu atividade de lactato desidrogenase de 1,5 U/mg de proteína celular total e atividade de piruvato descarboxilase de 0,5 U/mg de proteína celular total a 51 horas de cultivo na fase de produção de lactato. O transformante abrigando o gene LDH de B. megaíerium integrado no lócus de pdc2 (286-30,genótipo pdc2-) produziu atividade de lactato desidrogenase de 0,7 U/mg de proteína celular total e atividade de piruvato descarboxilase de 0,1 U/mg de proteína celular total, a 49 horas de cultivo na fase de produção de lactato.

Estes resultados demonstraram que atividade de LDH é similar em todas as cepas que contêm uma cópia do LDH de B. megaíerium integrado no genoma. Atividade de LDH foi maior do que a atividade de PDC (U/mg de proteína celular total) e, assim, LDH podería competir eficientemente com PDC pelo piruvato. A cepa de pdc2- 286-30 reduziu claramente a atividade de PDC em comparação com o tipo selvagem. O efeito observado da deleção de pdcl sobre a atividade de PDC na cepa de pdcl- 265-15 foi um decréscimo mais gradual na atividade ao longo do tempo.

Tabela 28. Atividades de lactato desidrogenase e piruvato descarboxilase Γ265-55 (TDC+. nH 5.0V) Tabela 29. Atividades de lactato desidrogenase e piruvato descarboxilase (265-55 (PDC+ pH 6.0)1 Tabela 30. Atividades de lactato desidrogenase e piruvato descarboxilase (265-15 (pdcl- pH 5,0)1____________________________________________________ laoeia óí. Anviaaaes ae lactato aesiorogenase e piruvato aescareoxiiase ínsfr?- nH S OY>

Exemplo 23: Produção anaeróbica de ácido L-láctico em um biorreator em meio rico em glucose por C. sonorensis abrigando o gene LDH de B. mesaíerium integrado no genoma. O transformante de C. sonorensis denominado 265-55 descrito acima foi cultivado em um biorreator. Realizou-se cultivo em bateladas a 35°C em um biorreator de laboratório (Biostat CT-DCU3, Braun, Alemanha) com um volume de trabalho de 2 1. Biomassa foi produzida aerobicamente em meio YP suplementado com 150 g/1 de glucose. A fase de produção de biomassa foi inoculada com 20 ml de cultura armazenada em 23 % (peso/volume) glicerol a -80°C. O biorreator foi enxaguado com 100 % de ar a uma taxa de fluxo de 1,0 1/min, e agitado a 800 rpm. A concentração de oxigênio dissolvido foi monitorada continuamente com um eletrodo de oxigênio (Mettler Toledo). Após 22,5 horas de produção de biomassa o biorreator foi esvaziado e recolheu-se células por meio de centrifugação (4000 rpm, 20°C, 10 min). Meio para produção de ácido láctico (YP suplementado com 100 g/1 de glucose) foi bombeado no biorreator, e foi inoculado com a biomassa centrifugada a uma densidade equivalente de 4,5 g/1 de peso seco de células. O biorreator foi enxaguado com 100 % de nitrogen a uma taxa de fluxo de 1,0 1/min e agitado a 500 rpm. O pH foi mantido em 5,0 ± 0,1 com adição automatizada de 5 M de hidróxido de potássio (KOH).

Coletou-se amostras durante o cultivo. Determinou-se o peso seco das células, mediu-se a OD60o, e células foram coletadas por meio de centrifugação. Os sobrenadantes de cultura foram analisados quanto a ácido L-láctico (por meio do método de ácido L-láctico UV de Boehringer Mannheim) e ao teor de glucose (por meio do método de glucose/ GOD-Perid de Boehringer Mannheim). Estes resultados são mostrados nas Tabelas 32 e 33.

Após 120 h. de cultivo produziu-se 4,7 g/1 de ácido láctico a partir de glucose (equivalente a um rendimento de 52 %).

Este exemplo demonstrou que C. sonorensis superexpressando uma lactato desidrogenase heteróloga foi capaz de produzir ácido láctico a partir de glucose em condições de fermentação anaeróbica em bateladas. Tabela 32: Produção aeróbica de biomassa em um cultivo em biorreator em meio YPD com 150 g/1 de glucose.

Tabela 33: Produção de ácido láctico com C. sonorensis superexpressando LDH de B. mesaterium em cultivo anaeróbico em biorreator em meio YPD com 100 g/1 de glucose: consumo de glucose, concentração de ácido láctico e rendimento de ácido láctico.

Exemplo 24: Produção de ácido L-láctico em um biorreator em meio rico em glucose tamponado com CafOHb por C. sonorensis abrigando gene LDH de B. mesaterium integrado no genoma. O transformante de C. sonorensis denominado 265-55 descrito acima foi cultivado por meio de cultivo em batelada em um biorreator (Biostat CT-DCU3, Braun, Alemanha) a 35°C como descrito no Exemplo 23. Após 18,5 horas de produção de biomassa o biorreator foi esvaziado e células foram recolhidas por meio de centrifugação (4000 rpm, 20°C, 10 min). O meio para produção de ácido láctico (YP suplementado com 100 g/1 de glucose) foi bombeado no biorreator e inoculado com a biomassa centrifugada a uma densidade equivalente de 6,7 g/1 de peso seco de células. O biorreator foi enxaguado com 90 % de nitrogênio e 10 % de ar a uma taxa de fluxo de 1,0 1/min e agitado a 500 rpm. O pH foi mantido em 5,0 ± 0,1 por meio de adição automatizada de 2,5 M de hidróxido de cálcio (Ca(OH)2).

Coletou-se amostras durante o cultivo. Determinou-se o peso seco das células, mediu-se a OD60o e células foram coletadas por meio de centrifugação. Os sobrenadantes de cultura foram analisados quanto a ácido L-láctico (por meio do método de ácido L-láctico UV, Boehringer Mannheim) e teor de glucose (por meio do método de glucose/GOD-Perid, Boehringer Mannheim). Estes resultados são mostrados nas Tabelas 34 e 35.

Após 53 horas de cultivo, produziu-se 26 g/1 de ácido láctico a partir de glucose (equivalente a um rendimento de 67 %).

Estes resultados demonstraram que C. sonorensis superexpressando lactato desidrogenase de B. megaterium foi capaz de produzir ácido láctico a partir de glucose em uma fermentação microaeróbica em batelada, (2 % de 02) com tamponamento de hidróxido de cálcio.

Tabela 34: Produção aeróbica de biomassa em um cultivo realizado em Hinrrpatnr pm mpin VPD mm 1 SO σ/l rlp alnmsp Tabela 35: Produção de ácido láctico com C. sonorensis superexpressando LDH de B. mesaterium em um biorreator cultivo em meio YPD com 100 g/1 de glucose: consumo de glucose, concentração de ácido láctico e rendimento de ácido láctico.

Exemplo 25: Produção de ácido L-láctico em um biorreator em meio rico em glucose por C. sonorensis abrigando gene LDH de L. helveticus integrado no genoma.

Os transformantes de C. sonorensis denominados 247-5 e 247-11 descritos acima foram cultivados por meio de cultivo em batelada em um biorreator de laboratório (Biostat CT-DCU3, Braun, Alemanha) a 30°C (cepa 247-11) ou a 35°C (cepa 247-5) com um volume de trabalho de 2 1. O meio de cultivo consistiu de YP suplementado com 40 g/1 de glucose. Desenvolveou-se pré-culturas em meio YPD a uma OD60o de 11-16, recolheu-se células por meio de centrifugação e o biorreator foi inoculado a uma OD60o de 1. O cultivo continuou até que toda a glucose fosse consumida. O pH foi mantido em 5,0 ± 0,1 por meio de adição automatizada de 5 M de hidróxido de potássio (KOH). O biorreator foi enxaguado com 5 % de ar e 95 % de gás de nitrogênio a uma taxa de fluxo de 0,5 1/min e agitado a 500 rpm. A concentração de oxigênio dissolvido foi monitorada continuamente com um eletrodo de oxigênio (Mettler Toledo).

Coletou-se amostras durante o cultivo. Determinou-se o peso seco das células, mediu-se a OD60o, e as células foram coletadas por meio de centifugação. Os sobrenadantes de cultura foram analisados por meio de HPLC como descrito acima quanto a ácido láctico, glucose, etanol e acetato. Estes resultados são mostrados nas Tabelas 36 e 37.

Após de 52 a 69 horas de cultivo, os transformantes produzem 26-29 g/1 de ácido láctico (equivalente a um rendimento de 67-72 %) a partir de glucose.

Estes resultados demonstraram que C. sonorensis superexpressando o gene de lactato desidrogenase de L. helveticus foi capaz de produzir ácido láctico a partir de glucose em uma fermentação microaeróbica em batelada.

Tabela 36: Produção de lactato com C. sonorensis superexpressando LDH de L. helveticus em dois cultivos em biorreator em meio YPD com 40 g/1 de consumo de glucose, concentração de lactato e rendimento de lactato ao final da fermentação (toda a glucose utilizada).

Tabela 37: Produção de lactato com C. sonorensis superexnressando LDH de L. helveticus em dois cultivos em biorreator em meio YPD com 40 g/1 de glucose: concentrações de subproduto.

Exemplo 26: Produção de ácido L-láctico em meio de xilose definido por células de C. sonorensis abrigando gene LDH de L. helveticus integrado no genoma Células de C. sonorensis e os transformantes divulgados above (especificamente 246-1, 246-10, 247-2, e 247-5) foram cultivadas em meio YX (base de nitrogênio de levedura sem sulfato de amônio e aminoácidos suplementado com 0,3 % de uréia e 5 % de xilose). Pré-culturas foram desenvolvidas em meio YPD, células foram recolhidas por meio de centrifugação, lavadas uma vez com meio YX e depois ressuspensas em 50 ml de meio YX a uma OD6oo de 14-22 para os experimentos de cultivo. Células de levedura foram cultivadas em frascos de Erlenmeyer de 100 ml com agitação a 100 rpm a 30°C. Quando o pH atingiu aproximadamente 3,5, adicionou-se 0,2 % de carbonato de cálcio sólido. Coletou-se amostras durante o cultivo, mediu-se a OD60o, células foram coletadas por meio de centrifugação, e o sobrenadante de cultura foi analisado por meio de HPLC, como descrito acima. Estes resultados são mostrados na Tabela 38.

Após 71 horas de cultivo, os transformantes abrigando LDH de L. helveticus produziram 3,6-5,0 g/1 de ácido láctico, equivalente a um rendimento de 18-34 % de xilose, enquanto que hospedeiro de C. sonorensis não produz ácido láctico detectável. A biomassa aumentou menos de 10 % durante o experimento de 167 horas. Os transformantes utilizaram 10-30 g/1 de xilose e produziram 4-9 g/1 de ácido láctico. Um terço da xilose utilizada foi convertido a ácido láctico pelos transformantes 246-10 e 247-5.

Estes resultados demonstraram que C. sonorensis superexpressando um gene de lactato desidrogenase heteróloga foi capaz de produzir ácido láctico de xilose.

Tabela 38. ODmn, xilose residual e produção de ácido láctico por C. sonorensis e os transformantes de LDH de L. helveticus em meio de xilose definido.

Exemplo 27: Produção de ácido L-láctico em meio de L-arabinose definido por C. sonorensis abrigando gene LDH de L. helveticus integrado no genoma. Células de C. sonorensis e os transformantes descritos acima (especificamente 246-1, 246-10, 247-2, e 247-5) foram cultivadas em meio YA (base de nitrogênio de levedura sem sulfato de amônio e aminoácidos suplementado com 0,3 % de uréia e 2 % de L-arabinose). Pré-culturas foram desenvolvidas em meio YPD, células foram recolhidas por meio de centrifugação, lavadas uma vez com meio YA e ressuspensas nos 50 ml de meio YA a uma OD6oo de 14-20 para os experimentos de cultivo. Células de levedura foram cultivadas em frascos de Erlenmeyer de 100 ml com agitação a 100 rpm (condições microaeróbicas) a 30°C. Quando o pH atingiu aproximadamente 3,5, adicionou-se 0,2 % de carbonato de cálcio sólido. Coletou-se amostras durante o cultivo, mediu-se a OD60o, as células foram coletadas por meio de centrifugação, e o sobrenadante de cultura analisado quanto a ácido láctico e xilose por meio de HPLC como descrito acima. Estes resultados são mostrados na Tabela 39.

Após 71 horas de cultivo os transformantes abrigando o gene LDH de L. helveticus produziram 2,3-3,2 g/1 de ácido láctico equivalente a um rendimento de 14-34 % de arabinose, enquanto que a cepa de controle não produz ácido láctico detectável. A biomassa aumentou 20-60 % durante o experimento de 167 h. Os transformantes utilizaram quase todos os 20 g/1 de arabinose proporcionados inicialmente e produziram 3,3-4,5 g/1 de ácido láctico. Cerca de 20 % da arabinose foram convertidos a ácido láctico pelos transformantes 246-10 e 247-5.

Este exemplo mostrou que C. sonorensis expressando um gene LDH heterólogo produziu ácido láctico de arabinose.

Tabela 39. OD^on, xilose residual e produção de ácido láctico por C. sonorensis e os transformantes de LDH de L. helveticus em meio de arabinose definido (OD^nn).

Exemplo 28: Transformação de C. methanosorbosa e produção de ácido láctico por cepas abrigando LDH de B. mesaterium integrado no genoma C. methanosorbosa foi transformada com o vetor de C. sonorensis pMI278 descrito acima para produção de ácido láctico. pMI278 foi digerido com Sall e NotI. Transformação de acetato de lítio de acordo com uma modificação do método de Gietz et al. (1992, Nucleic Acids Res. 20: 1425) descrito acima no Exemplo 1. Células de uma cultura realizada de um dia para o outro de C. methanosorbosa desenvolvidas a OD60o = 0,9-1,1 foram recolhidas por meio de centrifugação, lavadas primeiramente com um excesso de uma solução de 10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA (pH 7,5), e depois com um excesso de uma solução 100 mM de LiAc/10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA (pH 7,5), e ressuspensas em 2 ml de LiAc 100 mM / Tris-HCl 10 mM, 1 mM de EDTA (pH 7,5). 50 μΐ de células foram misturados com 10 pg de DNA de transformação e 50 pg de DNA de esperma de arenque desnaturado com calor. Adicionou-se às células 300 pl de uma solução de 40 % de PEG-4000 em 100 mM de LiAc / 10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA (pH 7,5) e as células foram então incubadas a 30°C durante 30 min. com agitação lenta. Adicionou-se então DMSO (40 pl) e as células foram incubadas em um banho de água a 42°C durante 15 min. Células foram recolhidas por meio de centrifugação, lavadas com um excesso de uma solução 10 mM de Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7,5), ressuspensas em YPD e incubadas a 30°C de um dia para o outro. Células foram espalhadas sobre meio YPD sólido contendo 200 pg/ml de placas de G418 e incubadas a 30°C durante de três a cinco dias. Transformantes foram aplicados sobre placas de seleção frescas duas vezes. Os transformantes foram denominados como Cm/278-1 até Cm/278-74.

Transformantes foram testados quanto a sua capacidade de produzir ácido L-láctico como a seguir. 5 ml de YPD em um tubo de plástico de 10 ml foram inoculados com uma colônia desenvolvida sobre placas de G418 e incubadas com agitação a 250 rpm a 30°C de um dia para o outro. As células foram removidas por meio de centrifugação e o sobrenadante foi analisadas quanto a ácido L-láctico utilizando-se o método do ácido L-láctico UV de Boehringer Mannheim. Acido L-láctico foi produzido a 2,3-4,3 g/1. A presença de uma cópia única do gene LDH de B. megaterium no genoma foi verificada por meio de análise de manchamento Southern de DNA de levedura digerido com HindIII utilizando-se o gene LDH de B. megaterium. como a sonda.

Estes resultados mostraram que LDH de B. megaterium foi capaz de funciona em C. methanosorbosa e produziu ácido láctico de glucose. O LDH de B. megaterium é ligado operacionalmente ao promotor PGK 1 de C. sonorensis que é capaz de impelir a expressão de um gene heterólogo em C. methanosorbosa. Além disso, o promotor TDH1 de C. sonorensis que é ligado operacionalmente ao gene da resistência a G418 também é capaz de funcionar em C. methanosorbosa.

Exemplo 29: Produção de ácido L-láctico em meio rico em glucose sem tamponamento por C, methanosorbosa abrigando o gene LDH de B. megaterium integrado no genoma.

Um dos transformantes de C. methanosorbosa divulgado acima (Cm/278-1) foi cultivado em meio YD (base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos suplementado com 5 % de glucose e 0,5 M de MES pH 5,5). Células foram então coletadas por meio de centrifugação e ressuspensas em 50 ml de YP suplementado com 5 % de glucose a uma OD60o de 16. Células de levedura foram cultivadas em frascos de Erlenmeyer de 250 ml com agitação a 100 rpm a 30°C. Coletou-se amostras durante o cultivo, mediu-se a OD60o, as células foram coletadas por meio de centrifugação, e o sobrenadante de cultura foi analisado quanto a ácido L-láctico (por meio do método de ácido L-láctico UV de Boehringer Mannheim, Roche), glucose (por meio do método de glucose/ GOD-Perid de Boehringer Mannheim, Roche), quanto a acetato (por meio do método de ácido acético UV de Boehringer Mannheim, Roche), e etanol (por meio do método de etanol UV de Boehringer Mannheim, Roche). Estes resultados são mostrados na Tabela 40.

Após 24 horas de cultivo o transformante produziu 8,1 g/1 de ácido láctico (equivalente a um rendimento de 19 %) a partir de glucose e o pH caiu para 3,5.

Estes resultados demonstraram que C. methanosorbosa superexpressando um LDH heterólogo produziu ácido láctico a partir de glucose em meio rico, a um pH baixo.

Tabela 40. OD^nn. glucose residual, produção de ácido láctico. etanol e acetato, e nH do sobrenadante de cultura da cena Cm/278-1.

Glucose, ácido láctico, etanol, e acetato, todos em g/1.

Exemplo 30: Produção de ácido L-láctico em meio de glucose definido tamponado com CaCO^ por C. methanosorbosa abrigando o gene LDH de B. mesaterium integrado no genoma.

As células transformadas de C. methanosorbosa divulgadas acima (especificamente, transformantes denominados Cm/278-1 e Cm/278-14) e a célula hospedeira não-transformada (Cm) foram cultivadas em meio YD (base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos suplementada com 5 % de glucose e 0,5 M de MES, pH 5,5). As células foram então coletadas por meio de centrifugação e ressuspensas em 50 ml de meio YD (base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos suplementada com 10 % glucose) a uma OD6oo de 15 para os experimentos de cultivo. Células de levedura foram cultivadas em frascos de Erlenmeyer de 250 ml contendo 4 g de CaC03 com agitação a 100 rpm a 30°C. O pH do meio de cultura em todo o cultivo foi de 6,5. Coletou-se amostras durante o cultivo, células foram coletadas por meio de centrifugação e o sobrenadante de cultura analisado por meio de HPLC quanto a ácido láctico, glucose e etanol, como descrito acima. Estes resultados são mostrados nas Tabelas 41-44.

Os transformantes consumiram a glucose a 96 horas de cultivo e produziram 63-65 g/1 de ácido láctico (equivalente a um rendimento de 63-64 %) e 6,5-6,9 g/1 de etanol. A cepa hospedeira (Cm) havia utilizado toda a glucose às 120 horas de cultivo e produzido 23 g/1 de etanol e nenhum ácido láctico.

Estes resultados demonstraram que células de C. methanosorbosa superexpressando um gene LDH heterólogo produziu ácido láctico a partir de glucose em meio definido a pH neutro. Obteve-se altas titulações de ácido láctico, de 63-65 g/1, e rendimentos de 63-64 %.

Tabela 41. Glucose g/1 Tabela 42. Acido láctico g/1 Tabela 43. Etanol g/1 Tabela 44. Ácido láctico g/g glucose usada Exemplo 31: Atividades enzimáticas de lactato desidrogenase e piruvato descarboxilase e produção de ácido L-láctico em meio de glucose definido por C, methanosorbosa abrigando o gene LDH de B. megaterium integrado no genoma.

Os transformantes de C. methanosorbosa divulgados acima (Cm/278-1 e Cm/278-14) foram cultivados em 50 ml de meio YD (base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos suplementada com 5 % de glucose e 0,5 M de MES, pH 5,5). Células de levedura foram cultivadas em frascos de Erlenmeyer de 250 ml com agitação a 250 rpm a uma OD6oo de 10 a 30°C. Coletou-se amostras (2 ml) e células foram coletadas por meio de centrifugação. O sobrenadante de cultura foi analisado por meio de HPLC.

Para medições de atividade enzimática, o pellet de células foi lavado com 1 ml de K2HPO4/KH2PO4 10 mM gelado, 2 mM de EDTA (pH 7,5). Pellets lavados foram ressuspensos com 0,5 ml do mesmo tamponador e armazenados a -70°C. Amostras foram orvalhadas à temperatura ambiente e lavadas uma vez com 1 ml de tamponador de sonificação (100 mM de KH2PO4/K2HPO4, 2 mM de MgCl2, 10 mM de DTT, pH 7,5). Amostras lavadas foram ressuspensas com 0,5 ml de tamponador de sonifícação e homogeneizadas com 0,5 ml de pérolas de vidro em um homogeneizador Bead Beater durante 1 min. Após homogeneização, as amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm durante 30 min. a 4°C. Coletou-se amostras de sobrenadante e determinou-se as atividades de lactato desidrogenase e piruvato descarboxilase por via espectrofotométrica (A340) como descrito acima no exemplo 18. Estes resultados são mostrados na Tabela 45. A 20 h. de cultivo, transformantes 278-1 e 278-14 produziram 0,69 e 0,33 g/1 de ácido láctico (equivalente a um rendimento de 7 e 4 % de glucose), respectivamente. Naquele ponto, a atividade de lactato desidrogenase foi de 0,05 e 0,16 U/mg de proteína celular total, e a atividade de piruvato descarboxilase foi de 0,71 e 0,53 U/mg de proteína celular total nos transformantes 278-1 e 278-14, respectivamente.

Estes resultados demonstraram que atividade de lactato desidrogenase é detectada em células de C. methanosorbosa superexpressando um gene LDH heterólogo que confirmou que as células foram capazes de produzir ácido láctico a partir de glucose. A menor atividade podería ser atribuída a uma menor OD60o inicial e a uma maior aeração (250 rpm), resultando predominantemente em crescimento celular e pequena quantidade de produção de lactato.

Tabela 45. Atividades enzimáticas de LDH e PDC intracelulares ÍU/mg de proteína celular total) e glucose residual, ácido láctico e etanol (g/1) no sobrenadante de cultura de C. methanosorbosa expressando o LDH de B. megaterium.

Exemplo 32. Produção de ácido láctico em meio de xilose definido por C. sonorensis abrigando o gene codifícante de LDH de L. helveticus ou de B. mesaterium e por C. methanosorbosa abrigando o gene codificante de LDH de B. mesaterium integrado no genoma. Ácido láctico foi produzido de xilose em culturas de C. sonorensis e C. methanosorbosa tamponadas com CaC03 cultivadas em meio definido. A biomassa de células foi gerada sobre glucose ou sobre xilose em dois estágios antes da transferência para o meio de produção contendo xilose. Aj Geração de biomassa com base em glucose e produção de lactato com base em xilose 5 ml de meio YP + 5 % de glucose foram inoculados com uma colônia de levedura (cepa C40/288-34) desenvolvida sobre placas de YPD. A cultura foi incubada de um dia para o outro com agitação a 250 rpm a 30°C. 50 ml de meio YD (base de nitrogênio de levedura, sem suplemento de aminoácidos, 5 % de glucose, e 0,5 M de MES, pH 5,5) em frascos de Erlenmeyer de 250 ml foram inoculados a uma OD60o inicial de 0,1 e incubados com agitação a 250 rpm de um dia para o outro a 30°C até se atingir uma OD60o de 10. As células foram ressuspensas em 50 ml de meio YX (base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos suplementada com 5 % de xilose) a uma OD60o de 11-13. As células foram cultivadas em frascos de Erlenmeyer de 250 ml contendo 2 g de CaC03 com agitação a 100 rpm a 30°C. Coletou-se amostras durante o cultivo. As células foram removidas por meio de centrifugação, e o sobrenadante de cultura foi analisado quanto a ácido láctico e xilose por meio de HPLC como descrito acima (Exemplo 14). Realizou-se dois experimentos independentes e os resultados são mostrados na Tabela 46. O transformante de C. sonorensis C40/288-34 consumiu 50 g/1 de xilose em 7-8 dias e produziu 13-16 g/1 de ácido láctico, correspondendo a um rendimento de 28-32 % de ácido láctico a partir de xilose.

Tabela 46. Produção de ácido láctico a partir de xilose em cultivo tamponado com CaCCb em meio definido por células desenvolvidas com glucose. Os rendimentos foram calculados a uma concentração de pico de lactato (168 ou 198 h.f Os dados são de dois exüerimentos indeoendentes. B) Geração de biomassa com base em xilose e produção de lactato com base em xilose Utilizou-se os transformantes 265-55 e 265-44 (C. sonorensis) abrigando o LDH de B. megaterium, transformantes C40/288-34, C40/288-36, 257-3, e 246-27 (C. sonorensis) abrigando o LDH de L. helveticus, e transformantes Cm/278-1 e Cm/278-42 (C. methanosorbosa) abrigando o LDH de B. megaterium. 50 ml de meio YP + 5 % de xilose em um frasco agitado de 250 ml foram inoculados com uma colônia de levedura desenvolvida sobre placas de YP + 2 % de xilose. A cultura foi incubada de um dia para o outro com agitação a 250 rpm a 30°C até se atingir uma OD60o de 10, depois 50 ml de meio YX (base de nitrogênio de levedura, sem suplementos de aminoácidos, 5 % de xilose, e 0,5 M de MES, pH 5,5) e frascos de Erlenmeyer de 250 ml inoculados a uma OD60o inicial de 0,2. As células foram incubadas com agitação a 250 rpm de um dia para o outro a 30°C até se atingir uma OD60o de 7-10. As células foram ressuspensas em 50 ml de meio YX (base de nitrogênio de levedura, sem suplementos de aminoácidos, e 5 % de xilose) a uma OD60o de 11-12. As células foram cultivadas em frascos de Erlenmeyer de 250 ml contendo 2 g de CaC03 com agitação a 100 rpm a 30°C. Coletou-se amostras durante o cultivo. As células foram removidas por meio de centrifugação, e o sobrenadante de cultura foi analisado quanto a ácido láctico e xilose por meio de HPLC como descrito acima (Exemplo 14). Os resultados são mostrados na Tabela 47.

Transformantes de LDH de C. sonorensis consumiram 50 g/1 de xilose, tipicamente em 5-6 dias. Titulações máximas de ácido láctico foram medidas 4-5 dias após a transferência para meio de xilose tamponado com CaC03, quando pelo menos 95 % de xilose haviam sido consumidos. A quantidade de ácido láctico produzido foi de 30-37 g/1, correspondendo a um rendimento de 63-76 % de ácido láctico a partir de xilose.

Transformantes de LDH de C. methanosorbosa consumiram 50 g/1 de xilose, tipicamente em 5-6 dias. Titulações máximas de ácido láctico foram medidas 4-5 dias após transferência para meio de xilose tamponado com CaC03, quando pelo menos 95 % da xilose haviam sido consumidos. Transformantes produziram 8-14 g/1 de ácido láctico, correspondendo a um rendimento de 16-28 % ácido láctico a partir de xilose.

Tabela 47. Produção de ácido láctico de xilose em meio definido tamponado com CaCCh por células desenvolvidas sobre xilose. Os rendimentos foram calculados à concentração de pico de ácido láctico.

Este Exemplo demonstrou que as condições de cultura e a história do inóculo exercem um efeito importante sobre a produção de ácido láctico a partir de xilose. Quando a biomassa foi gerada com base em glucose, o transformante de LDH de C. sonorensis C40/288-34 converteu xilose a ácido láctico, após transferência para meio contendo xilose, com um rendimento de aproximadamente 30 %. Em comparação, quando a biomassa foi gerada com base em xilose, o mesmo transformante converteu xilose a ácido láctico com um rendimento muito mais elevado (63-76 %), após transferência para meio contendo xilose. A biomassa desenvolvida sobre xilose também consumiu xilose mais rapidamente do que biomassa desenvolvida sobre glucose em condições de produção de ácido láctico. Os dados sugerem que é possível obter rendimentos incrementados de ácido láctico quando as células são "adaptadas" a açúcares diferentes de glucose, por exemplo xilose, por meio de crescimento sobre meio contendo xilose, antes de sua transformação para o meio de produção de ácido láctico contendo xilose.

Exemplo 33. Produção de ácido L-láctico em meio de glucose definido por C. sonorensis compreendendo um gene pdcl deletado e um gene pdc2 disrompido e abrigando o gene codificante de LDH de L. helveticus integrado no genoma.

Os transformantes de C. sonorensis denominados 257-3, C40/288-2, C40/288-34 e C40/288-11 (descritos acima no Exemplo 13) foram cultivados e analisados como descrito no Exemplo 19, com a exceção de que as células foram suspensas a uma OD6oo =18 para a fase de produção de lactato. O sobrenadante de cultura foi analisado quanto a ácido láctico, glucose, e etanol como descrito acima. Estes resultados são mostrados na Tabela 48. A cepa de pdcl- 257-3 (em que pdcl é deletado) produziu 89 g/1 de ácido láctico em 48 h, correspondendo a um rendimento de 93 % a partir de glucose (g/g). As cepas de pdcl-(deletado) pdc2- (em que pdc2 é disrompido) C40/288-2, C40/288-34 e C40/288-11 produziram 86-87 g/1 de ácido láctico em 72 h, correspondendo a um rendimento de 89-90 % a partir de glucose (g/g). Não se detectou etanol nestes momentos.

Tabela 48. Titulações e rendimentos de ácido láctico obtidos em meio definido tamponado com CaCO? contendo glucose, após o consumo de toda a glucose (micialmente 96 g/F).

Deve-se compreender que, embora a invenção tenha sido descrita conjugando a descrição detalhada e os exemplos precedentes, estes destinam-se a ilustrar e não a limitar a abrangência ou o espírito da invenção, que é definida pelas reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens e modificações encontram-se dentro do escopo das reivindicações.

Claims (10)

1. Célula de Candida, caracterizada pelo fato de ser um organismo negativo para Crabtree geneticamente modificado para conter gene pdcJ ou pdcl não funcional ou deletado e pelo menos uma sequência exógena que codifica um polipeptídeo para sintetizar um ou mais de isocitrato, alfa-cetoglutarato, lactato, succinato, mal ato, fumarato, oxaloacetato, citrato e acrilato.

2. Célula de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que ambos os genes pdcl e pdc2 são não funcionais ou deletados.

3. Célula de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caraterizada pelo fato de que o polipeptídeo é um ou mais de aeonitase, isocitrato desidrogenase, lactato desidrogenase, cetoglutarato desidrogenase, fu mar ase, succinato desidrogenase, ma lato desidrogenase, citrato sintase, e acrilil-CoA hidratase,

4. Método para produzir um ou mais de isocitrato, alfa-cetoglutarato, lactato, succinato, malato, fumarato, oxaloacetato, citrato e acrilato, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) cultivar uma célula como definida na reivindicação 1, 2 ou 3, sob condições que permitem que a célula prolifere; e b) fermentar a cultura de células de (a) em um meio nutriente compreendendo um açúcar.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o pH final do meio de cultura após a produção de isocitrato, alface toglutarato, lactato, succinato, malato, fumarato, oxaloacetato, citrato e acrilato é de cerca de pH 2,6 a cerca de pH 5.

6. Método de acordo com a reivindicação 4 ou 6, caracterizado pelo fato de que o açúcar no meio nutriente é uma ou uma pluralidade de pentoses, ou uma combinação de uma de uma pluralidade de pentoses e uma ou uma pluralidade de hexoses.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o açúcar no meio nutriente é uma combinação de glucose, xilose e L-arabinose.

8. Método para produzir uma célula como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender transformar a célula com uma construção de ácido nucleico recombinante, em que a construção de ácido nucleico compreende um, gene selecionável flanqueado por sequências de flanco 5' e 3' de, pelo menos, um gene de piruvato descarboxilase nativo para o gênero Candida.

9, Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um gene de piruvato descarboxilase é selecionado dentre o grupo consistindo de piruvato descarboxilase 1 (pdcl), piruvato descarboxilase 2 (pdc2), ou ambos pdcl epdc2.

10,Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as sequências de flanco são um promotor e um terminador para, pelo menos, um gene de piruvato descarboxilase nativo para o gênero Candida,