CZ20004105A3 - Kmen mikroorganismu Nocardia sp. - Google Patents
Kmen mikroorganismu Nocardia sp. Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20004105A3 CZ20004105A3 CZ20004105A CZ20004105A CZ20004105A3 CZ 20004105 A3 CZ20004105 A3 CZ 20004105A3 CZ 20004105 A CZ20004105 A CZ 20004105A CZ 20004105 A CZ20004105 A CZ 20004105A CZ 20004105 A3 CZ20004105 A3 CZ 20004105A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- tartaric acid
- cis
- nocardia
- acid
- cells
- Prior art date
Links
- 241000187681 Nocardia sp. Species 0.000 title claims abstract description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 7
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 37
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 claims abstract description 34
- 239000001358 L(+)-tartaric acid Substances 0.000 claims abstract description 18
- 235000011002 L(+)-tartaric acid Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- FEWJPZIEWOKRBE-LWMBPPNESA-N L-(+)-Tartaric acid Natural products OC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-LWMBPPNESA-N 0.000 claims abstract description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 15
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 13
- DCEMCPAKSGRHCN-UHFFFAOYSA-N oxirane-2,3-dicarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1OC1C(O)=O DCEMCPAKSGRHCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 10
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 10
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 9
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 9
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- CYUUZGXOQDCCGH-UHFFFAOYSA-N dodecyl dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOC(=O)CCCCCCCCCCC CYUUZGXOQDCCGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 241000116581 Nocardia tartaricans Species 0.000 description 4
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000590020 Achromobacter Species 0.000 description 3
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 3
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 239000007911 effervescent powder Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 2
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- DNISEZBAYYIQFB-PHDIDXHHSA-N (2r,3r)-2,3-diacetyloxybutanedioic acid Chemical compound CC(=O)O[C@@H](C(O)=O)[C@H](C(O)=O)OC(C)=O DNISEZBAYYIQFB-PHDIDXHHSA-N 0.000 description 1
- MNDGPLSORKUYSJ-UHFFFAOYSA-J 1,6,8,13-tetraoxa-7-stannaspiro[6.6]tridecane-2,5,9,12-tetrone Chemical compound O1C(=O)CCC(=O)O[Sn]21OC(=O)CCC(=O)O2 MNDGPLSORKUYSJ-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- PDLNHDSYGLTYDS-UHFFFAOYSA-N 3-aminopropanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.NCCC(O)=O PDLNHDSYGLTYDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QISOBCMNUJQOJU-UHFFFAOYSA-N 4-bromo-1h-pyrazole-5-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C=1NN=CC=1Br QISOBCMNUJQOJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589220 Acetobacter Species 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Natural products OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CMWTZPSULFXXJA-UHFFFAOYSA-N Naproxen Natural products C1=C(C(C)C(O)=O)C=CC2=CC(OC)=CC=C21 CMWTZPSULFXXJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 1
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 description 1
- 239000002535 acidifier Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- GUPPESBEIQALOS-UHFFFAOYSA-L calcium tartrate Chemical compound [Ca+2].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O GUPPESBEIQALOS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001427 calcium tartrate Substances 0.000 description 1
- 235000011035 calcium tartrate Nutrition 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000006735 epoxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical group 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000002218 isotachophoresis Methods 0.000 description 1
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- MEFBJEMVZONFCJ-UHFFFAOYSA-N molybdate Chemical compound [O-][Mo]([O-])(=O)=O MEFBJEMVZONFCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- CMWTZPSULFXXJA-VIFPVBQESA-N naproxen Chemical compound C1=C([C@H](C)C(O)=O)C=CC2=CC(OC)=CC=C21 CMWTZPSULFXXJA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960002009 naproxen Drugs 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002924 oxiranes Chemical group 0.000 description 1
- 238000004816 paper chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000014594 pastries Nutrition 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003385 ring cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 235000014214 soft drink Nutrition 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 150000003890 succinate salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- LEONUFNNVUYDNQ-UHFFFAOYSA-N vanadium atom Chemical compound [V] LEONUFNNVUYDNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Oblast techniky
Vynález se týká nového kmene mikroorganismu Nocardia L(+)-vinnou.
sp, produkujícího kyselinu
Dosavadní stav techniky
Kyselina vinná (kyselina 2,3-dihydroxybutandiová, C4H6O6, Mr=T 50,09) se v současnosti připravuje izolací z vinného kamene působením silných minerálních kyselin. Množství takto získané kyseliny vinné je však omezeno dodávkami základního materiálu, které jsou nestálé a omezené. Jiné chemické postupy umožňují připravit jen D,L-formu kyseliny vinné, která má však menší rozpustnost v porovnání s přírodní L-formou kyseliny vinné, což brání jejímu širšímu využití. Navíc, izolace L-formy z racemické směsi běžnými technikami je velmi nákladná.
Kyselina vinná se přirozeně nachází v různých druzích ovoce, hlavně v hroznech a je nejdůležitější kyselinou v moštech a ve víně. Z komerčního hlediska patří tato kyselina mezi atraktivní produkty, což dokazuje široké spektrum jejího použití v nejrozmanitějších průmyslových odvětvích, nejvíce však v potravinářském a farmaceutickém průmyslu. Přibližně Y
5^% z celkového množství se používá v potravinářském průmyslu jako okyselovadlo do nealkoholických nápojů a šumivých prášků, ochucovadlo v cukrovinkách, želatině, kandovaném ovoci a podobně. V pekařském průmyslu se při výrobě chleba a pečivá přidávají do těsta jako emulgátory směsné acylglyceroly s kyselinou diacetylvinnou, čímž se prodlužuje jejich trvanlivost. Svoje uplatnění má také v lékařství jako složka některých preparátů, například Etanbutol, Naproxen, Metaprolol, šumivé prášky na pročištění organismu apod. Technická kyselina vinná, směs opticky aktivních a inaktivních forem, se využívá hlavně ve fotografickém, keramickém, metalurgickém a textilním průmyslu. Kyselina vinná se vyskytuje ve čtyřech různých modifikacích. Kyseliny D- a L - vinné vykazují optickou aktivitu, racemická kyselina (D,L)-vinná a kyselina mezovinná jsou opticky inaktivní.
Chemicky je možno připravit kyselinu (D,L)-vinnou například oxidací kyseliny fumarové nebo maleinové za přítomnosti katalyzátoru, kterým může být například paladium, vanad nebo wolfram. (Petritsch, K., Korl, P.: Pat. peří 2555699, Lewis, D.F., Rodriguez, P.A.B.: Pat. GB 1442748).
Biotechnologické postupy odstraňují nedostatky chemické syntézy a umožňují přípravu přírodní L(+)-formy kyseliny vinné. V současnosti je známa mikrobiální příprava kyseliny L(+)-vinné prostřednictvím bakterií, přičemž jako substrát mohou být použity sacharidy, % palladiutn
-2kyselina 5-keto-D-glukanová nebo kyselina epoxyjantarová. V bakteriálních fermentacích se sacharidickými substráty dominují kmeny z rodu Acetobacter (Bhat Η. K., Qazi, G. N.: Research adn Industry 31, 1986, s. 148-152). Kyselina 5-keto-D-glukanová je vhodným substrátem pro přípravu kyseliny vinné pomocí bakterií Pseudomonas fluorescens (Miall, L.M.: Organic acids 2,
1. ed. London, Academie Press, 1978). Kontinuální fermentace, využívající tyto kmeny, nepřinesla očekávané výsledky, protože výsledné koncentrace kyseliny vinné byly nízké a kromě hlavního produktu vznikaly i produkty vedlejší, zejména kyselina glykolová, která má inhibiční účinek na růst bakterií.
Schopnost produkce L(+)-formy kyseliny vinné biokonverzí z kyseliny cis-epoxyjantarové byla popsána u některých kmenů zrodu Achromobacter, Alcaligenes, Acinetobacter, Rhizobium a Nocardia. Pat. JP 140683/75 a Pat. Ger'. 2517941 pojednávají o schopnosti bakterií patřících do rodů Achromobacter a Alcaligenes produkovat enzym, který konvertuje kyselinu cis-epoxyjantarovou na kyselinu L(+)-vinnou. Byly vyvinuty tři podobné postupy biochemické konverze kyseliny cis-epoxyjantarové, resp. jejích solí na kyselinu L(+)-vinnou, využitím bakteriálních kmenů zrodu Nocardia, Acinetobacter, Agrobacterium,
Rhizobium a Pseudomonas (Miura, I. a kol.: Pat. Ger. 2605921, Kamatani, Y. a kol.: Pat. Ger
TP
2600589, Kamatani, Y. a kol.: Pat. Ger 2619311). Dobré výtěžky kyseliny L(+)-vinné byly dosaženy především použitím bakterií zrodu Nocardia. Zjistilo se, že některé kmeny rodu Nocardia jsou schopny produkovat enzym cis-epoxyjantaranhydrolázu, který dokáže konvertovat kyselinu cis-epoxyjantarovou na kyselinu vinnou, přičemž má tento enzym vyšší katalytickou aktivitu při štěpení a hydrolýze epoxidového kruhu v porovnání s izolovanými hydrolázami rodu Alcaligenes a Achromobacter. Dobré produkční schopnosti byly popsány u kmene Nocardia tartaricans ATCC 31191, jejichž výsledkem byla biokoverze takřka bez vzniku vedlejších produktů za použití volných, vysušených nebo imobilizovaných buněk, bezbuňkových extraktů z těchto buněk, případně použitím purifikované cis-epoxyjantaranhydrolázy. U inaktivních buněk byl popsán pozitivní účinek povrchově aktivních látek na rychlost biokonverze cis-epoxyjantaran - vinan (Miura, Y. a kol7Pat.US 4017362).
Kyselina cis-epoxyjantarová se lehce připraví chemickou syntézou například epoxidací maleinanhydridu, kyseliny maleinové, resp. jejích derivátů účinkem peroxidu vodíku a za přítomnosti wolframu nebo molybdenanu jako katalyzátoru (Olupide J.O. a kol.: J. Chem. Tech. Biotechnol. 55, 1992, strany 103 až 109). Na indukci cis-epoxyjantaranhydrolázy v buňkách se přidávají do kultivačního média soli cis-epoxyjantaranu v koncentraci 0,1 až 5 hmotn.%, max. 10 hmotn.%. Vyšší koncentrace způsobují inhibici růstu bakterií, ale je možné je použít
-3v případě, že buňky budou přeneseny do nerůstových podmínek, kde probíhá konverze cis-epoxyjantaranu na kyselinu L(+)-vinnou.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je nový kmen mikroorganizmu Nocardia sp. NT 24, produkující kyselinu L(+)-vinnou, uložený v České sbírce mikroorganismů v Brně, ČR pod označením CCM 4837/A.
Uvedený nový kmen byl připraven z rodičovského kmene Nocardia tartaricans ATCC 31191 nejprve chemickou mutací vegetativních buněk pomocí N-nitro-N-nitrozoguanidinu a následně pak pasážovaním takto získaných mutantů v tekutých a na tuhých kultivačních médiích s vyšší koncentrací kyseliny cis-poxyjantarové. Tento cyklus pasážování na tuhých a tekutých médiích byl u producenta s nejvyšší specifickou aktivitou cis-poxyjantaranhydrolázy vícenásobně opakován, až byl získán producent se standaptíumi produkčními schopnostmi, označený jako Nocardia sp. NT 24 (producent). Tento kmen je uložen v České sbírce mikroorganismů v Brně, ČR pod označením CCM 4837/A.
Hlavní výhodou nového kmene je překvapivá vysoká rychlost produkce kyseliny L(+)-vinné, která je způsobena alespoň dvojnásobnou a vyšší specifickou aktivitou cis-epoxyjantaranhydrolázy v buňkách Nocardia sp. NT 24 ve srovnání se specifickou aktivitou téhož enzymu v buňkách rodičovského kmene Nocardia tartaricans ATCC 31191 za analogických reakčních podmínek. Další výhodou je získání maximální objemové výtěžnosti nosiče při imobilizaci producenta na nosič, což umožňuje snížit fermentační objemy potřebné pro přípravu biomasy bakterií při použití volných buněk a podobně. Další výhodou je vícenásobné použití buněk Nocardia sp. NT 24 v opakovaných konverzích, při šetrné permeabilizaci buněk, což náklady na přípravu producenta ještě snižuje.
Nový kmen Nocardia sp. NT 24 roste dobře na běžných tuhých kultivačních médiích, jako jsou MPA, GTKA. Na YG agaru (R. Atlas: Handbook of microbial media. 2. vydám CRC Press, 1997) tvoří po 48 hodinách kultivace (28 °C) kolonie s nepravidelným zoubkovitým okrajem. Kolonie je zbarvená oranžově, neprůsvitná s jemně granulovaným povrchem, starší kolonie jsou zabarveny intenzivněji. Mladé buňky tvoří tyčinky (2 až 10 pm), netvoří vzdušné mycelium, u starších buněk jsou tyčinky kratší až kokoidního tvaru. Buňky netvoří spory a jsou gram-pozitivní.
V průběhu přípravy buněk se využívají míchané reaktory umožňující aeraci media. Kultivace se provádí 20 až 48 hodin a po fermentaci se buňky odseparují pro vlastní biokonverzi. K biokonverzi se použije médium s obsahem 5 až 40 hmotn.% kyseliny cis-epoxyjantarové
-4anebo jejích solí. Produktem bíokonverze je pak kyselina L(+)-vinná ve formě odpovídajících solí. Po skončení bíokonverze se produkt izoluje z reakční směsi například odstraněním buněk odstředěním a zahuštěním filtrátu. Kyselinu L(+)-vinnou je možné například vysrážet po přídavku vápenatých iontů ve formě vínanu vápenatého a následně připravit kyselinu L(+)-vinnou po přídavku minerálních kyselin standardními postupy. Základní charakteristiky kyseliny L(+)-vinné je možné například ověřit Rf papírovou chromatografií, měřením IČ spektra, NMR-spektra, stupně otáčivosti a elementární analýzou.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Připraví se 50 ml kultivačního média v 500£ml kultivační baňce (sterilizace 20 minut při 121 °C). Kultivační médium obsahuje v 1 litru destilované vody masový extrakt 3g, pepton 5g, NaCl 3g, KH2PO4 3g, MgSO4.7 H2O 2g, FeSO4.7H2O 0,01g, CaCl2.2H2O 0,03g, MnSO4.4H2O 0,03g (pH 7,0). Takto připravené médium se zaočkuje kulturou bakterií Nocardia tartaricans ATCC 31191, která byla připravena 48-hodinovou kultivací na pevném kultivačním médiu při 28 °C (YG agar: kvasničný extrakt 5 g/1, glukóza 10 g/1, pepton 5 g/1, agar 20 g/1, pH 7,0). Po 24 hodinové kultivaci na závěsné rotační třepačce při teplotě 30 °C se biomasa bakterií oddělí od kultivačního média odstředěním (6000 ot/min., 10 min.), promyje se jedenkrát fyziologickým roztokem (0,85% NaCl) a tímto roztokem se naředí na koncentraci buněk 105 buněk/cm3. K buňkám se přidá l-metyl-3-nitro-l-nitrozoguanidín (NTG) na výslednou koncentraci 1 mg/cm3. Inkubace probíhá 5, 10, 20 a 30 minut při laboratorní teplotě. Po inkubaci se buňky scentrifugují (5600 g, 10 min) a promyjí se sterilním fyziologickým roztokem. Promyté buňky se naočkují na tuhou agarovou půdu (kvasničný extrakt 5 g/dm, pepton 5 g/dm, glukóza 10 g/dm3, cis-epoxyjantaran sodný 10 g/dm3, agar 20 g/dm3) a. inkubují se 4 dny při teplotě 30 °C.
Vyrostlé kolonie se očkují na YG agar s přídavkem 5 g/1 cis-epoxyjantaranu sodného a kultivují se při 30 °C po dobu 48 hod. Takto vyrostlá kultura se naočkuje do 50 ml kultivačního média v 50(/|ml kultivační baňce (médium obsahuje v 1 litru destilované vody masový extrakt 5 g, pepton 5 g, cis-epoxyjantaran sodný 10 g, NaCl 3 g, KH2PO4 3 g, MgSO4.7H2O 2 g, FeSO4.7H2O 0,01 g, CaCl2.2H2O 0,03 g, MnSO4.4H2O 0,03 g, pH 7,0) a kultivuje se na závěsné rotační třepačce 24 hod. při 30 °C. Aktivita cis-epoxyjantaranhydrolázy se u mutantních kmenů stanovila následujícím postupem:
Buňky se scentrifugují (5600 g, 10 min) a promyjí sterilním fyziologickým roztokem. Enzymová aktivita cis-epoxyjantaranhydrolázy v buňkách se stanoví za následujících experimentálních podmínek: 1M cis-epoxyjantaran sodný s obsahem deoxycholátu sodného
-50,02 hmotn.%, pH 7,8, teplota 35 °C. 1 unit (IU) se definuje jako množství cis-epoxyjantaranhydrolázy, která vytvoří 1 pmol kyseliny vinné za 1 hodinu v experimentálních podmínkách. Specifická aktivita cis-epoxyjantaranhydrolázy v buňkách se vztahuje na 1 mg suchých buněk. Množství kyseliny cis-epoxyjantarové, resp. kyseliny vinné, je možno stanovit například izotachoforetickou metodou s použitím systému β-alanin - HC1, pH 3,0 a kyseliny octové jako koncového iontu podle postupu Polonský J. a kol. (J.Chromatogr. 320, 1985, strany 11 až 118). Na stanovém těchto organických kyselin je však možno použít i jiné standardní postupy, například HPLC a podobně.
Buňky s nejvyšší specifickou aktivitou cis-epoxyjantaranhydrolázy se kultivují střídavě na tekutém a tuhém kultivačním médiu (složení a podmínky kultivace byly uvedeny výše) s rostoucí koncentrací kyseliny cis-epoxyjantarové (5 až 15 g/dm3). Tento cyklus pasážování na tuhých a tekutých médiích se u producenta s nejvyšší specifickou aktivitou cis-epoxyjantaranhydrolázy vícenásobně opakuje, až se získá producent se standardními produkčními schopnostmi, označený jako Nocardia sp. NT 24. Při konverzi 1M cis-epoxyjantaranu sodného s přídavkem deoxycholátu sodného (0,02 hmotn.%), pH 7,8 a teplotě 35 °C vyprodukoval 1 gram buněk Nocardia sp. NT 24 za 10 hodin biokonverze 102 g kyseliny L(+)-vinné, což odpovídá specifické aktivitě buněk 67,9 U/mg. 1 gram původního rodičovského kmenu vyprodukoval v analogických podmínkách za 10 hodin 45 g kyseliny L(+)-vinné, což odpovídá specifické aktivitě buněk 29,9 U/mg.
Příklad 2
Připraví se 50 ml kultivačního média v 50Qjml kultivační baňce (sterilizace 20 min při 121 °C). Kultivační médium obsahuje v 1 1 destilované vody masový extrakt 3 g, pepton 5 g, NaCl 3 g, KH2PO4 3 g, MgSO4.7H2O 2 g, FeSO4.7H2O 0,01 g, CaCl2.2H2O 0,03 g, MnSO4.4H2O 0,03 g (pH 7,0) s přídavkem cis-epoxyjantaranu sodného na výslednou koncentraci 0,6 hmotn.%. Médium se zaočkuje kulturou bakterií Nocardia sp. NT 24, která byla připravena 48-hodinovou kultivací na tuhém kultivačním médiu při 28 °C (YG agar) a kultivuje se 24 hodin na závěsné rotační třepačce při teplotě 30 °C. Takto připravené vegetativní inokulum se použije na zaočkovám 4 1 kultivačního média ve fermentoru v množství 2 obj.%. Složení média bylo analogické. Po 24 hodinách kultivace za analogických podmínek se biomasa bakterií ze 4 litrů média odseparuje odstředěním (6000 ot/min, 10 min) a buňky (6,0 g vztaženo na sušinu) se rozsuspendují v 1000 ml 1M roztoku cis-epoxyjantaranu sodného s přídavkem deoxycl^plátu sodného na výslednou koncentraci 0,02 hmotn.%. V průběhu biokonverze, která probíhá při teplotě 35 °C a pH 7,8, se do reakční směsi postupně přidává 1M roztok
-6cis-epoxyjantaranu sodného (pH 7,8) do výsledného objemu 20 1. Po 68 hodinách biokonverze bylo připraveno 2,97 kg kyseliny L(+)-vinné, což je 98,9 % teoretického výtěžku. Biomasa se následně odseparuje odstředěním (6000 ot/min, 10 min) a znovu se použije na konverzi 20 litrů ÍM roztoku cis-epoxyjantaranu sodného (pH 7,8) při teplotě 35°C. Po 80 hodinách biokonverze bylo připraveno 2,94 kg kyseliny L(+)-vinné, což je 98,0 % teoretického výtěžku.
Nový kmen podle vynálezu je využitelný při výrobě kyseliny L(+)-vinné nebo jejích solí, které mají široké použití v potravinářství, farmacii, chemickém průmyslu a dalších oblastech.
Claims (1)
- PATENTOVÉ NÁROKYKmen mikroorganismu Nocardia sp. NT 24, CCM 4837/A, produkující kyselinu L(+) vinnou.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20004105A CZ289404B6 (cs) | 2000-11-06 | 2000-11-06 | Kmen mikroorganismu Nocardia sp. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20004105A CZ289404B6 (cs) | 2000-11-06 | 2000-11-06 | Kmen mikroorganismu Nocardia sp. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20004105A3 true CZ20004105A3 (cs) | 2002-01-16 |
| CZ289404B6 CZ289404B6 (cs) | 2002-01-16 |
Family
ID=5472442
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20004105A CZ289404B6 (cs) | 2000-11-06 | 2000-11-06 | Kmen mikroorganismu Nocardia sp. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ289404B6 (cs) |
-
2000
- 2000-11-06 CZ CZ20004105A patent/CZ289404B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ289404B6 (cs) | 2002-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5246841A (en) | Microbial process for production of eicosapentaenoic acid | |
| CN1052512C (zh) | 生产2-酮基-l-古洛糖酸或其盐的方法 | |
| JPH067157A (ja) | シュードグルコノバクター属酸化菌 | |
| Lanzilotta et al. | Microbial reduction of ketopantoyl lactone to pantoyl lactone | |
| EP1803820B1 (en) | A process for the preparation of vitamin K2 | |
| US5128261A (en) | Natural delta-lactones and process of the production thereof | |
| US4248967A (en) | Enzymic complexes adapted to convert racemic hydantoins into optically active aminoacids, and their applications | |
| DK172133B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af L-sorbose | |
| WO2008092950A1 (en) | Fermentation process for preparing pravastatin | |
| CZ20004105A3 (cs) | Kmen mikroorganismu Nocardia sp. | |
| DK171744B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af pyrodruesyre | |
| JPH06153924A (ja) | 置換メトキシフエノールの製造法及びこの目的に適した微生物 | |
| KR100186758B1 (ko) | 프라바스타틴(pravastatin)전구체의제조방법 | |
| US3850750A (en) | Preparation of d-({31 ) pantoic acid and/or d-({31 ) pantoyl lactone | |
| RU2213777C2 (ru) | Способ микробиологического окисления 2-метилхиноксалина (варианты) | |
| US6025170A (en) | Process for the biotechnological production of δ-decalactone and δ-dodecalactone | |
| WO1992018637A1 (en) | Method for the production of d-gluconic acid | |
| SU539538A3 (ru) | Способ получени метаболита "а 27 106 | |
| CN113337433B (zh) | 一种产吡咯喹啉醌的假单胞菌及其应用 | |
| JP4261304B2 (ja) | 微生物によるα−ホモノジリマイシンの製造方法 | |
| JP3030306B2 (ja) | ３−ケトー７β−ヒドロキシコラン酸の製造方法 | |
| JP3082973B2 (ja) | ３α，７α−ジヒドロキシ−１２−ケト−５β−コラン酸の製造方法 | |
| JPH0378106B2 (cs) | ||
| JPH0751054A (ja) | Ｌ−ソルボースの生産菌 | |
| JPH0665313B2 (ja) | トランス−４−シアノシクロヘキサン−１−カルボン酸を製造する方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20171106 |