CZ20004105A3 - Kmen mikroorganismu Nocardia sp. - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nového kmene mikroorganismu Nocardia L(+)-vinnou.

sp, produkujícího kyselinu

Dosavadní stav techniky

Kyselina vinná (kyselina 2,3-dihydroxybutandiová, C4H6O6, M_r=T 50,09) se v současnosti připravuje izolací z vinného kamene působením silných minerálních kyselin. Množství takto získané kyseliny vinné je však omezeno dodávkami základního materiálu, které jsou nestálé a omezené. Jiné chemické postupy umožňují připravit jen D,L-formu kyseliny vinné, která má však menší rozpustnost v porovnání s přírodní L-formou kyseliny vinné, což brání jejímu širšímu využití. Navíc, izolace L-formy z racemické směsi běžnými technikami je velmi nákladná.

Kyselina vinná se přirozeně nachází v různých druzích ovoce, hlavně v hroznech a je nejdůležitější kyselinou v moštech a ve víně. Z komerčního hlediska patří tato kyselina mezi atraktivní produkty, což dokazuje široké spektrum jejího použití v nejrozmanitějších průmyslových odvětvích, nejvíce však v potravinářském a farmaceutickém průmyslu. Přibližně Y

5^% z celkového množství se používá v potravinářském průmyslu jako okyselovadlo do nealkoholických nápojů a šumivých prášků, ochucovadlo v cukrovinkách, želatině, kandovaném ovoci a podobně. V pekařském průmyslu se při výrobě chleba a pečivá přidávají do těsta jako emulgátory směsné acylglyceroly s kyselinou diacetylvinnou, čímž se prodlužuje jejich trvanlivost. Svoje uplatnění má také v lékařství jako složka některých preparátů, například Etanbutol, Naproxen, Metaprolol, šumivé prášky na pročištění organismu apod. Technická kyselina vinná, směs opticky aktivních a inaktivních forem, se využívá hlavně ve fotografickém, keramickém, metalurgickém a textilním průmyslu. Kyselina vinná se vyskytuje ve čtyřech různých modifikacích. Kyseliny D- a L - vinné vykazují optickou aktivitu, racemická kyselina (D,L)-vinná a kyselina mezovinná jsou opticky inaktivní.

Chemicky je možno připravit kyselinu (D,L)-vinnou například oxidací kyseliny fumarové nebo maleinové za přítomnosti katalyzátoru, kterým může být například paladium, vanad nebo wolfram. (Petritsch, K., Korl, P.: Pat. peří 2555699, Lewis, D.F., Rodriguez, P.A.B.: Pat. GB 1442748).

Biotechnologické postupy odstraňují nedostatky chemické syntézy a umožňují přípravu přírodní L(+)-formy kyseliny vinné. V současnosti je známa mikrobiální příprava kyseliny L(+)-vinné prostřednictvím bakterií, přičemž jako substrát mohou být použity sacharidy, % palladiutn

-2kyselina 5-keto-D-glukanová nebo kyselina epoxyjantarová. V bakteriálních fermentacích se sacharidickými substráty dominují kmeny z rodu Acetobacter (Bhat Η. K., Qazi, G. N.: Research adn Industry 31, 1986, s. 148-152). Kyselina 5-keto-D-glukanová je vhodným substrátem pro přípravu kyseliny vinné pomocí bakterií Pseudomonas fluorescens (Miall, L.M.: Organic acids 2,

1. ed. London, Academie Press, 1978). Kontinuální fermentace, využívající tyto kmeny, nepřinesla očekávané výsledky, protože výsledné koncentrace kyseliny vinné byly nízké a kromě hlavního produktu vznikaly i produkty vedlejší, zejména kyselina glykolová, která má inhibiční účinek na růst bakterií.

Schopnost produkce L(+)-formy kyseliny vinné biokonverzí z kyseliny cis-epoxyjantarové byla popsána u některých kmenů zrodu Achromobacter, Alcaligenes, Acinetobacter, Rhizobium a Nocardia. Pat. JP 140683/75 a Pat. Ger'. 2517941 pojednávají o schopnosti bakterií patřících do rodů Achromobacter a Alcaligenes produkovat enzym, který konvertuje kyselinu cis-epoxyjantarovou na kyselinu L(+)-vinnou. Byly vyvinuty tři podobné postupy biochemické konverze kyseliny cis-epoxyjantarové, resp. jejích solí na kyselinu L(+)-vinnou, využitím bakteriálních kmenů zrodu Nocardia, Acinetobacter, Agrobacterium,

Rhizobium a Pseudomonas (Miura, I. a kol.: Pat. Ger. 2605921, Kamatani, Y. a kol.: Pat. Ger

TP

2600589, Kamatani, Y. a kol.: Pat. Ger 2619311). Dobré výtěžky kyseliny L(+)-vinné byly dosaženy především použitím bakterií zrodu Nocardia. Zjistilo se, že některé kmeny rodu Nocardia jsou schopny produkovat enzym cis-epoxyjantaranhydrolázu, který dokáže konvertovat kyselinu cis-epoxyjantarovou na kyselinu vinnou, přičemž má tento enzym vyšší katalytickou aktivitu při štěpení a hydrolýze epoxidového kruhu v porovnání s izolovanými hydrolázami rodu Alcaligenes a Achromobacter. Dobré produkční schopnosti byly popsány u kmene Nocardia tartaricans ATCC 31191, jejichž výsledkem byla biokoverze takřka bez vzniku vedlejších produktů za použití volných, vysušených nebo imobilizovaných buněk, bezbuňkových extraktů z těchto buněk, případně použitím purifikované cis-epoxyjantaranhydrolázy. U inaktivních buněk byl popsán pozitivní účinek povrchově aktivních látek na rychlost biokonverze cis-epoxyjantaran - vinan (Miura, Y. a kol₇Pat.US 4017362).

Kyselina cis-epoxyjantarová se lehce připraví chemickou syntézou například epoxidací maleinanhydridu, kyseliny maleinové, resp. jejích derivátů účinkem peroxidu vodíku a za přítomnosti wolframu nebo molybdenanu jako katalyzátoru (Olupide J.O. a kol.: J. Chem. Tech. Biotechnol. 55, 1992, strany 103 až 109). Na indukci cis-epoxyjantaranhydrolázy v buňkách se přidávají do kultivačního média soli cis-epoxyjantaranu v koncentraci 0,1 až 5 hmotn.%, max. 10 hmotn.%. Vyšší koncentrace způsobují inhibici růstu bakterií, ale je možné je použít

-3v případě, že buňky budou přeneseny do nerůstových podmínek, kde probíhá konverze cis-epoxyjantaranu na kyselinu L(+)-vinnou.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je nový kmen mikroorganizmu Nocardia sp. NT 24, produkující kyselinu L(+)-vinnou, uložený v České sbírce mikroorganismů v Brně, ČR pod označením CCM 4837/A.

Uvedený nový kmen byl připraven z rodičovského kmene Nocardia tartaricans ATCC 31191 nejprve chemickou mutací vegetativních buněk pomocí N-nitro-N-nitrozoguanidinu a následně pak pasážovaním takto získaných mutantů v tekutých a na tuhých kultivačních médiích s vyšší koncentrací kyseliny cis-poxyjantarové. Tento cyklus pasážování na tuhých a tekutých médiích byl u producenta s nejvyšší specifickou aktivitou cis-poxyjantaranhydrolázy vícenásobně opakován, až byl získán producent se standaptíumi produkčními schopnostmi, označený jako Nocardia sp. NT 24 (producent). Tento kmen je uložen v České sbírce mikroorganismů v Brně, ČR pod označením CCM 4837/A.

Hlavní výhodou nového kmene je překvapivá vysoká rychlost produkce kyseliny L(+)-vinné, která je způsobena alespoň dvojnásobnou a vyšší specifickou aktivitou cis-epoxyjantaranhydrolázy v buňkách Nocardia sp. NT 24 ve srovnání se specifickou aktivitou téhož enzymu v buňkách rodičovského kmene Nocardia tartaricans ATCC 31191 za analogických reakčních podmínek. Další výhodou je získání maximální objemové výtěžnosti nosiče při imobilizaci producenta na nosič, což umožňuje snížit fermentační objemy potřebné pro přípravu biomasy bakterií při použití volných buněk a podobně. Další výhodou je vícenásobné použití buněk Nocardia sp. NT 24 v opakovaných konverzích, při šetrné permeabilizaci buněk, což náklady na přípravu producenta ještě snižuje.

Nový kmen Nocardia sp. NT 24 roste dobře na běžných tuhých kultivačních médiích, jako jsou MPA, GTKA. Na YG agaru (R. Atlas: Handbook of microbial media. 2. vydám CRC Press, 1997) tvoří po 48 hodinách kultivace (28 °C) kolonie s nepravidelným zoubkovitým okrajem. Kolonie je zbarvená oranžově, neprůsvitná s jemně granulovaným povrchem, starší kolonie jsou zabarveny intenzivněji. Mladé buňky tvoří tyčinky (2 až 10 pm), netvoří vzdušné mycelium, u starších buněk jsou tyčinky kratší až kokoidního tvaru. Buňky netvoří spory a jsou gram-pozitivní.

V průběhu přípravy buněk se využívají míchané reaktory umožňující aeraci media. Kultivace se provádí 20 až 48 hodin a po fermentaci se buňky odseparují pro vlastní biokonverzi. K biokonverzi se použije médium s obsahem 5 až 40 hmotn.% kyseliny cis-epoxyjantarové

-4anebo jejích solí. Produktem bíokonverze je pak kyselina L(+)-vinná ve formě odpovídajících solí. Po skončení bíokonverze se produkt izoluje z reakční směsi například odstraněním buněk odstředěním a zahuštěním filtrátu. Kyselinu L(+)-vinnou je možné například vysrážet po přídavku vápenatých iontů ve formě vínanu vápenatého a následně připravit kyselinu L(+)-vinnou po přídavku minerálních kyselin standardními postupy. Základní charakteristiky kyseliny L(+)-vinné je možné například ověřit Rf papírovou chromatografií, měřením IČ spektra, NMR-spektra, stupně otáčivosti a elementární analýzou.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Připraví se 50 ml kultivačního média v 500£ml kultivační baňce (sterilizace 20 minut při 121 °C). Kultivační médium obsahuje v 1 litru destilované vody masový extrakt 3g, pepton 5g, NaCl 3g, KH₂PO₄ 3g, MgSO₄.7 H₂O 2g, FeSO₄.7H₂O 0,01g, CaCl₂.2H₂O 0,03g, MnSO₄.4H₂O 0,03g (pH 7,0). Takto připravené médium se zaočkuje kulturou bakterií Nocardia tartaricans ATCC 31191, která byla připravena 48-hodinovou kultivací na pevném kultivačním médiu při 28 °C (YG agar: kvasničný extrakt 5 g/1, glukóza 10 g/1, pepton 5 g/1, agar 20 g/1, pH 7,0). Po 24 hodinové kultivaci na závěsné rotační třepačce při teplotě 30 °C se biomasa bakterií oddělí od kultivačního média odstředěním (6000 ot/min., 10 min.), promyje se jedenkrát fyziologickým roztokem (0,85% NaCl) a tímto roztokem se naředí na koncentraci buněk 10⁵ buněk/cm³. K buňkám se přidá l-metyl-3-nitro-l-nitrozoguanidín (NTG) na výslednou koncentraci 1 mg/cm³. Inkubace probíhá 5, 10, 20 a 30 minut při laboratorní teplotě. Po inkubaci se buňky scentrifugují (5600 g, 10 min) a promyjí se sterilním fyziologickým roztokem. Promyté buňky se naočkují na tuhou agarovou půdu (kvasničný extrakt 5 g/dm, pepton 5 g/dm, glukóza 10 g/dm³, cis-epoxyjantaran sodný 10 g/dm³, agar 20 g/dm³) a. inkubují se 4 dny při teplotě 30 °C.

Vyrostlé kolonie se očkují na YG agar s přídavkem 5 g/1 cis-epoxyjantaranu sodného a kultivují se při 30 °C po dobu 48 hod. Takto vyrostlá kultura se naočkuje do 50 ml kultivačního média v 50(/|ml kultivační baňce (médium obsahuje v 1 litru destilované vody masový extrakt 5 g, pepton 5 g, cis-epoxyjantaran sodný 10 g, NaCl 3 g, KH₂PO₄ 3 g, MgSO₄.7H₂O 2 g, FeSO₄.7H₂O 0,01 g, CaCl₂.2H₂O 0,03 g, MnSO₄.4H₂O 0,03 g, pH 7,0) a kultivuje se na závěsné rotační třepačce 24 hod. při 30 °C. Aktivita cis-epoxyjantaranhydrolázy se u mutantních kmenů stanovila následujícím postupem:

Buňky se scentrifugují (5600 g, 10 min) a promyjí sterilním fyziologickým roztokem. Enzymová aktivita cis-epoxyjantaranhydrolázy v buňkách se stanoví za následujících experimentálních podmínek: 1M cis-epoxyjantaran sodný s obsahem deoxycholátu sodného

-50,02 hmotn.%, pH 7,8, teplota 35 °C. 1 unit (IU) se definuje jako množství cis-epoxyjantaranhydrolázy, která vytvoří 1 pmol kyseliny vinné za 1 hodinu v experimentálních podmínkách. Specifická aktivita cis-epoxyjantaranhydrolázy v buňkách se vztahuje na 1 mg suchých buněk. Množství kyseliny cis-epoxyjantarové, resp. kyseliny vinné, je možno stanovit například izotachoforetickou metodou s použitím systému β-alanin - HC1, pH 3,0 a kyseliny octové jako koncového iontu podle postupu Polonský J. a kol. (J.Chromatogr. 320, 1985, strany 11 až 118). Na stanovém těchto organických kyselin je však možno použít i jiné standardní postupy, například HPLC a podobně.

Buňky s nejvyšší specifickou aktivitou cis-epoxyjantaranhydrolázy se kultivují střídavě na tekutém a tuhém kultivačním médiu (složení a podmínky kultivace byly uvedeny výše) s rostoucí koncentrací kyseliny cis-epoxyjantarové (5 až 15 g/dm³). Tento cyklus pasážování na tuhých a tekutých médiích se u producenta s nejvyšší specifickou aktivitou cis-epoxyjantaranhydrolázy vícenásobně opakuje, až se získá producent se standardními produkčními schopnostmi, označený jako Nocardia sp. NT 24. Při konverzi 1M cis-epoxyjantaranu sodného s přídavkem deoxycholátu sodného (0,02 hmotn.%), pH 7,8 a teplotě 35 °C vyprodukoval 1 gram buněk Nocardia sp. NT 24 za 10 hodin biokonverze 102 g kyseliny L(+)-vinné, což odpovídá specifické aktivitě buněk 67,9 U/mg. 1 gram původního rodičovského kmenu vyprodukoval v analogických podmínkách za 10 hodin 45 g kyseliny L(+)-vinné, což odpovídá specifické aktivitě buněk 29,9 U/mg.

Příklad 2

Připraví se 50 ml kultivačního média v 50Qjml kultivační baňce (sterilizace 20 min při 121 °C). Kultivační médium obsahuje v 1 1 destilované vody masový extrakt 3 g, pepton 5 g, NaCl 3 g, KH2PO4 3 g, MgSO₄.7H₂O 2 g, FeSO₄.7H₂O 0,01 g, CaCl₂.2H₂O 0,03 g, MnSO₄.4H₂O 0,03 g (pH 7,0) s přídavkem cis-epoxyjantaranu sodného na výslednou koncentraci 0,6 hmotn.%. Médium se zaočkuje kulturou bakterií Nocardia sp. NT 24, která byla připravena 48-hodinovou kultivací na tuhém kultivačním médiu při 28 °C (YG agar) a kultivuje se 24 hodin na závěsné rotační třepačce při teplotě 30 °C. Takto připravené vegetativní inokulum se použije na zaočkovám 4 1 kultivačního média ve fermentoru v množství 2 obj.%. Složení média bylo analogické. Po 24 hodinách kultivace za analogických podmínek se biomasa bakterií ze 4 litrů média odseparuje odstředěním (6000 ot/min, 10 min) a buňky (6,0 g vztaženo na sušinu) se rozsuspendují v 1000 ml 1M roztoku cis-epoxyjantaranu sodného s přídavkem deoxycl^plátu sodného na výslednou koncentraci 0,02 hmotn.%. V průběhu biokonverze, která probíhá při teplotě 35 °C a pH 7,8, se do reakční směsi postupně přidává 1M roztok

-6cis-epoxyjantaranu sodného (pH 7,8) do výsledného objemu 20 1. Po 68 hodinách biokonverze bylo připraveno 2,97 kg kyseliny L(+)-vinné, což je 98,9 % teoretického výtěžku. Biomasa se následně odseparuje odstředěním (6000 ot/min, 10 min) a znovu se použije na konverzi 20 litrů ÍM roztoku cis-epoxyjantaranu sodného (pH 7,8) při teplotě 35°C. Po 80 hodinách biokonverze bylo připraveno 2,94 kg kyseliny L(+)-vinné, což je 98,0 % teoretického výtěžku.

Nový kmen podle vynálezu je využitelný při výrobě kyseliny L(+)-vinné nebo jejích solí, které mají široké použití v potravinářství, farmacii, chemickém průmyslu a dalších oblastech.

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Kmen mikroorganismu Nocardia sp. NT 24, CCM 4837/A, produkující kyselinu L(+) vinnou.