CN1332035C - 补料发酵生产l－乳酸的工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明为一种补料发酵生产L-乳酸的工艺，采用根霉菌属的菌种生成乳酸，其工艺包括以下步骤：A.对菌种进行斜面菌种的制备和孢子的增生培养；B.将步骤A获得的孢子置入种子培养基中进行种子培养；C.将步骤B获得的种子接种于发酵培养基中进行分批发酵培养，并在发酵培养过程中补加单糖料及中和剂，使发酵液残糖浓度提高1～3%，中和剂添加总量达到5-7%。本发明工艺在种子的制备过程中通过对培养基成分的控制可获得微小的菌球体，并在发酵中期进行分批补加碳源可获得L-乳酸的高产，并提高碳源的利用率，其产品L-乳酸广泛用于食品、医药、酿造、皮革、塑料等行业，是十分有用的化合物。

Description

补料发酵生产L-乳酸的工艺
技术领域
本发明涉及乳酸发酵领域，特别是涉及一种利用根霉菌种，通过利用葡萄糖或水解糖等发酵生产L-乳酸的生产工艺。
背景技术
乳酸是一种十分有用的化合物，在食品、医药、酿造、皮革、塑料等行业具有广泛的用途。特别是聚L-乳酸(PLA)是一种可完全生物降解的化工产品，在消除“白色污染”具有十分重大的意义。
乳酸分为D-型、DL-型和L型，其中L-乳酸具有完全的生物相容性和生物可降解性，而D-乳酸却不被绝大多数的生物所吸收利用，过量摄入D-乳酸会对人体造成一定的危害。
现有的发酵法生产L-乳酸的工艺，一般是以称之为乳酸菌类的细菌为生产菌种，如乳酸杆菌(Lactobacllillus)，乳球菌属(Lactococcus)等在厌氧或微好氧的条件下培养，培养过程中所用的培养基以玉米粉、米粉、淀粉、葡萄糖、水解糖、糖蜜等为主要碳源，并配合酵母提取物、蛋白胨、玉米浆等作为氮源及少量的无机盐进行发酵，发酵所得为DL-乳酸，若所需纯度高的L-乳酸则要经过分离消旋，从而使L-乳酸价格较高。
另一方面，利用根霉菌属类的丝状真菌，使用通气搅拌反应器、气泡塔型反应器、气升式反应器等，在通氧的条件下进行培养发酵产生L-乳酸。发酵培养基中的碳源物质的选择较广，可以为葡萄糖、玉米粉、米粉、淀粉等为主要的原料，少量(NH4)2SO4、NH4NO3等作为氮源，少量其它无机盐进行培养。例如：Hang(Hang和Yong D，U.S.Pat.No.4963486A C12P7/56)利用玉米粉为碳源，由R.oryzae NRRL 395(ATCC 9363)和R.oryzae NRRL394的孢子一步发酵生产L-乳酸，产酸量达到350g/Kg玉米粉(相当于52.5g/L)，糖的转化率大于44％。高年发(高年发，樊晓翔和杨枫，中国酿造，1997(2)19-25)利用经α-淀粉酶对玉米粉液化并去渣，由米根霉(Rh.oryzae L-A6)进行分批发酵，L-乳酸产量可达100g/L，对葡萄糖的转化率达75.4％。虞东胜，周晓燕(虞东胜，周晓燕等，工业微生物，Vol30，No3，2000，4-7)以诱变菌株Rs928在60吨的发酵罐上利用淀粉水解糖发酵L-乳酸，产酸量为140g/L，L-乳酸收率80.4％。以上工艺，前两个属一步发酵生产，尽管产生的乳酸产品纯度较高，分离纯化工艺简单，但L-乳酸产量和收率都较低，两步法发酵相对而言发酵产酸量和乳酸收率都有所提高，但上述研究课题所用的研究菌株为具有高产酸和高转化特性的诱变菌株，存在产酸率的稳定性问题。
由于在L-乳酸发酵过程中，根霉菌属的菌丝体可以形成粒状、块状或微球状，通过简单的沉降作用即可与发酵培养液分离。利用菌丝体易沉降的特点，冈部满康等(冈部满康，JP9-173090A，C12P7/56)设计制造了一种“气泡塔型反应器”，利用R.oryzae NRRL 395发酵生产L-乳酸，在发酵培养终点时，通过静置，菌丝体与培养基分离并沉降于反应器的锥形底部，分离上清液后反应器中重新加入发酵培养基进行培养。此课题研究通过上述方式实现L-乳酸生产的连续和半连续的分批发酵，在一定意义上提高发酵生产中乳酸的收率和终产物乳酸的浓度。单批发酵产酸量达82～86g/L，产酸收率为68％以上。友村友宏等(友村友宏，JP6-253871A，C12P7/56)在研究中使用与冈部满康等相似的生物反应器，利用R.oryzaeAHU6537发酵，实现半连续分批培养，发酵产酸达72g/L，乳酸收率70％左右。这两项发明都利用了菌丝体易沉降的特性，形成半连续或连续发酵培养，能有效的利用生物反应器，但单批发酵L-乳酸产量低，乳酸收率较低，同时工艺的实施需要特定的生物反应器作为技术基础。
另外，在以发酵法生产L-乳酸时，为解除L-乳酸对产物的抑制现象，必需使用中合剂中和L-乳酸。常用的中和剂是CaCO3，也有使用Ca(OH)2、NaOH、氨水等的研究。冈部满康(冈部满康，JP2000-37196A，C12P7/56，CN1254016A，C12P7/56)利用耐氨性L-乳酸产生菌Rhizopus sp.MK96-1156发酵生产，用连续流加氨水的方式中和L-乳酸，分批发酵产酸率可达81g/L，乳酸收率77.4％，以回收菌丝体实现连续分批发酵，乳酸产量最高可达89g/L，乳酸收率最高为81.6％。此项发明此能有效提高发酵过程L-乳酸的收率，但需要特定的耐氨性生产菌株和特定的发酵设备作为工艺的基础，此项发明难于规模化生产。
综上所述，现国内外关于L-乳酸的生产研究技术主要集中在三个方面，一是研究根霉发酵过程中的代谢特性；二是通过定向育种获得高产酸、高转化率的特性菌株来提高发酵培养中的L-乳酸产量和收率；三是通过发酵培养设备的创新来实现半连续或连续化生产工艺，提高L-乳酸的收率。但对于用一般菌株和常规设备进行L-乳酸生产，综合解决在其生产过程中菌丝形态与产率关系，综合能使其产酸量和收率提高都存在较大的问题。
发明内容
本发明目的：是针对上述现有的发酵生产L-乳酸的问题，提供一种以一般根霉菌属菌发酵生产L-乳酸的生产工艺，解决发酵生产过程中乳酸的产量和收率的问题。
本发明提供的补料发酵生产L-乳酸工艺，可解决生产过程中菌丝体形态与产酸的关系，并由于是以一般的稳定生产菌株和在常规的发酵设备进行L-乳酸生产，可解决发酵生产过程中乳酸的产量和收率的问题，提高乳酸的产量和收率。
本发明提供的补料发酵生产L-乳酸工艺是一种以一般根霉菌属菌发酵生产L-乳酸时种子的培养方法。
另外，本发明提供一种根霉菌属菌在好氧条件下通过补料工艺生产L-乳酸的方法。
本发明具体的操作步骤如下：
A.对菌种进行斜面菌种的制备和孢子的增生培养；
采用此方法可大量的扩增根霉孢子，而且在制备孢子时易于孢子的分散处理，孢子量达到106个/mL。
B.将步骤A获得的孢子置入种子培养基中进行种子培养；
本发明通过此种培养方法可获得均匀的最适于发酵的菌丝体形态，利于发酵产酸。
C、将步骤B获得的种子接种于发酵培养基中进行分批发酵培养，并在发酵培养过程中补加单糖料及中和剂，使发酵液残糖浓度提高1％～4％，中和剂添加总量达到5-7％。
本发明通过补料工艺提高L-乳酸的单批发酵产量及收率。
通过补料工艺，可有效提高发酵产量15％以上，和L-乳酸的收率9％以上，从而有效的利用生产原料，获得高产。
本发明中，只要属于根霉菌属的，能够产生L-乳酸的丝状真菌就可以使用。属于根霉菌属的，具有L-乳酸发酵能力的菌有米根霉(Rhizopusoryzae)、无根根霉(Rhizopus arrhizus)、爪哇根霉(Rhizopus javanic)、变黑色根霉(Rhizopus nigricans)、德列马根霉(Rhizopus delemar)等，其中以米根霉(Rhizopus oryzae)和无根根霉(Rhizopus arrhizus)产L-乳酸能力较高。以东京根霉(Rhizopus torinensis NO 3.851)根霉菌属菌为丝状真菌，能产生孢子，在培养过程中会呈现颗粒状、块状、丝状和小球状。以上涉及到的菌种均可通过中国微生物菌种管理委员会普通微生物菌种保藏中心购置。
本发明中，对菌种的斜面培养培养基无特殊的要求，只要能使菌种良好的生长，并产生孢子即可，如马铃薯琼脂培养基(PDA)，以铂丝或竹签接种于斜面培养基上，在25～35℃内培养，直至产生大量孢子。
本发明中，对菌种的孢子增生采用固曲培养法。固曲原料可以是麸皮、面包渣等易于真菌生长并产生孢子的原料。在本发明中优选麸皮为原料。因为，麸皮松散，吸水性较好，在培养过程中可以为菌丝体的生长提供丰富的营养，并且菌丝生长较短，加无菌水、灭菌的生理盐水或灭菌的培养基制备孢子悬浮液时孢子能很好的分散，在孢子量需求较大时可将整个麸皮培养基分散后加入种子培养基中。
本发明中，对孢子采用种子培养基培养后再加入发酵培养基中。种子培养基由碳源、氮源和无机盐组成。碳源通常可以是葡萄糖、玉米粉、玉米淀粉、淀粉、米粉、糖蜜、乳糖等，即可单独使用，也可混合使用。在本发明中优选玉米粉水解物作碳源、和硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠，碳酸钙组成种子培养基。因为，玉米粉的α-淀粉酶水解物不但可以为孢子的生长提供良好的营养，而且培养的种子形成均一细小的菌丝球，不易结团或成块，有利于发酵产酸，从而解决菌丝体形态对发酵产酸量和原料利用率的影响作用。同时，接种以玉米粉水解物为培养基的种子培养液也有利于发酵反应器内菌种的进一步生长。
另外、利用本发明的种子培养基的培养属好氧培养，培养温度以所使用的菌种的最适生长温度为宜。培养方式可以是振荡培养、搅拌培养、通气培养等，在本发明中优选振荡培养和搅拌培养并选择通气搅拌型反应器。因为搅拌型反应器更利于细小菌丝球的形成、物料和氧均一分布。
本发明中，根霉菌属菌的发酵培养使用液体培养，分批发酵。液体培养方式选用振荡培养、搅拌培养、通气培养中的任何一种。在本发明中优选振荡培养、深部通气搅拌培养。选用搅拌型反应器是因为使用此种生物反应器的机械搅动方式虽会影响菌的生长速度和有菌丝的缠绕现象，但在这种搅拌方式下菌丝体的增生会受到一定的限制，从而使更多的原料用以合成L-乳酸。对于反应器对菌丝体生长速度的影响作用可以加大接种量的方法解决。深部通气培养中通入的气体可以是空气或氧气，通气量的大小以分批发酵最适通气量为好。
另外，本发明对发酵培养基的选择与种子培养基相同，在本发明中优选葡萄糖、水解糖等以单糖为主的生产原料，在发酵培养中，当发酵液酸积累量达到85～95g/L，残糖量低于2％时进行补料，向生物反应器内单独添加单糖，使发酵液中残糖量提高1％～4％。促进发酵培养的进行，使分批发酵产酸量提高，并提高糖向L-乳酸的转化率。
根霉发酵生产L-乳酸的培养过程分为两个阶段，第一阶段以菌丝体的生长为主，第二阶段以菌体代谢产酸为主。发酵培养的中后期，菌体将糖和杂酸转化为L-乳酸的代谢能力最高，此时补加葡萄糖不但可以为菌丝体代谢提供能量促进L-乳酸的生成，而且此时菌丝体可以将糖高效转化，首先转化为中间酸，然后再转化为L-乳酸，从而提高糖的利用率和分批发酵的产酸量。此项是利用菌本身的代谢特性，也就是本发明的出发点和理论依据，本发明在研究过程中发现，在培养过程中出现的这一特性阶段，即中间酸的大量合成阶段，在此阶段中菌体可有效的将糖转化为中间酸，从而在以后的培养过程中进一步转化为L-乳酸；另外，在发酵后期提高发酵液中的葡萄糖量能促进行菌丝体的进一步代谢，促使L-乳酸生成。这也是本工艺路线为什么能提高发酵产量和糖转化率的原因。
本发明采用补料工艺发酵生产L-乳酸，补加糖是一次性的加入。
另外，培养基的pH控制可以用添加碳酸钙、或通过pH传感器和pH控制器添加氢氧化钠、氢氧化钙、氨水、碳酸钠等物质自动维持pH稳定于所培养菌种的最适发酵产酸范围内。、补料的方式是间歇式的补加，补加糖是一次性的加入。
本发明采用分批发酵，在分批发酵中，优选中性碳酸盐类为pH中和剂，分三次加入，第一次在发酵培养初始时加入1-3％的中性碳酸盐类，调节培养基的pH至5.5～6.0，第二次在第一次加入的中性碳酸盐类用尽后补加，最后一次在补加单糖时加入。
有益效果
通过本发明的工艺设计，在使用常规生产菌株和发酵设备的情况下可有效的提高分批发酵培养的L-乳酸产率15％以上，同时提高原料中糖的利用率9％以上，从而有效的降低了L-乳酸的生产成本，促进L-乳酸的生产应用。
为了更清楚地理解本发明的实质，现参照下列附图和实施例对其进行解释。附图和实施例是为了说明本发明，而不以任何方式限制本发明。
附图说明：
图1：为根霉生产L-乳酸的生产工艺流程图
图2：为用根霉生产L-乳酸的操作流程图
图号说明：
1-种子培养缸    2-发酵培养缸      3-补料缸
4-碳酸钙贮缸    5-种子缸进气管路  6-接种管路
7-发酵培养缸进气管路              8-补料管路
9-碳酸钙添加管路                  10-排料管路
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明的实质，现参照下列实施例对其进行解释。实施例是为了说明本发明，而不以任何方式限制本发明。
实施例1：L-乳酸发酵生产(三角烧瓶振荡培养)
培养所用的根霉菌属菌东京根霉(Rhinous tokinensis NO 3.851)，购自菌种管理委员会普通微生物菌种保藏中心，经分离纯化选育。在表1所示的PDA斜面琼脂培养基上培养。接种斜面孢子于装有表2所示的孢子增生培养基2.5g的100mL三角烧瓶上，34℃恒温培养，至孢子大量生成为止。无菌水50mL加入长满孢子的100mL三角烧瓶中，振荡，使孢子悬浮，孢浓度大于104个/mL。取4mL孢子悬浮液加入装有表3所示的种子培养基30mL的100mL三角烧瓶中，置于恒温振荡器上恒温振荡培养，34℃，180rpm，14h。
然后，将培养好的种子培养基全部接种于装有100mL如表4所示的发酵培养基的500mL三角烧瓶中，并置于恒温振荡器上恒温振荡培养，34℃，300rpm。培养24h，发酵液澄清，此时添加2％的灭过菌的CaCO3继续培养。培养36h时，补加葡萄糖2g和1％的CaCO3，继续培养直至72h时发酵到达终点。发酵过程如表5所示。
从接种培养的12h后糖的消耗速度加快，24h后，L-乳酸的生长成较快。在36h补加糖和CaCO3后发酵培养继续进行，菌丝体首选吸收利用葡萄糖然后再生成L-乳酸，最终L-乳酸发酵产量为120g/L，以发酵培养时培养基中的含糖量为基准，L-乳酸的收率达79％。
表1马铃薯琼脂培养基
名称     用量
马铃薯     200g
蔗糖     20g
琼脂     20g
蒸馏水     1000mL
高压灭菌，1kg/cm2，15min。
表2孢子增生培养基
    名称     用量
    麸皮     1.5g
    1％(NH4)2SO4溶液     2.5mL
    高压灭菌，1kg/cm2，15min。
表3种子培养基
  名称     用量
  NH4NO3     4g
  Na2HPO4     0.3g
  MgSO4     0.25g
  ZnSO4     0.05g
  CaCO3     1g
  玉米粉水解液     100mL
  1、玉米粉水解液为35％的经α-淀粉酶处理的液体。2、高压灭菌，1kg/cm2，15min。3、CaCO3分开灭菌，在接种时加入。
表4发酵培养基
  名称     用量
  葡萄糖     24.g
  NH4NO3     2g
  Na2HPO4     0.3g
  MgSO4     0.25g
  ZnSO4     0.05g
  CaCO3     2g
  水     100mL
  1、高压灭菌，1kg/cm2，15min。2、CaCO3分开灭菌，在接种时加入。
表5发酵培养过程
    时间(h)     葡萄糖浓度(％)     L-乳酸产量(g/L)
    0     15.3     0
    12     11.8     29
    24     7.7     56
    36     1.5/2.8     94
    48     0.6     107
    60     0.4     112
    72     0.2     120
比较例1：
使用根霉NO 3.85 1，在与实施例1相同的条件下进行发酵培养，只是在发酵过程中不补加糖，CaCO3的添加不变。其结果如表6所示。
从表6可以看出，根霉发酵生产L-乳酸在不补加糖的情况下，发酵产酸率为103g/L，乳酸收率为70％。由此可以看出，发酵的中后期补加葡萄糖不但可以提高分批发酵产酸量，而且能提高糖的利用率。
表6
    时间(h)     葡萄糖浓度(％)     L-乳酸产量(g/L)
    0     15.5     0
    12     12.8     16
    24     7.1     56
    36     0.8     92
    48     0.1     101
    60     0.1     103
实施例2：L-乳酸发酵生产(三角烧瓶振荡培养)
本实验中，所用的三角烧瓶改为具有挡板结构的500mL三角烧瓶。由于使用了这种三角烧瓶使振荡培养过程氧的供给条件得到了较大的改善，但发酵时间有所延长。
本实验中，从斜面菌种到种子培养和发酵培养的具体操作与实施例1相同。其结果如表7所示。
实施例2与实施例1相比在发酵培养过程中菌丝体量明显的减少，发酵时间延长，培养过程产酸速度显著下降。在培养30h时第一次添加CaCO3，60h和补糖一起再次添加CaCO3。发酵终点时L-乳酸产量达136g/L，乳酸的发酵收率达到86％。
实施例3：L-乳酸发酵生产(搅拌型反应器培养)
本实施例中斜面菌种、孢子增生培养与实施例1中相同，在种子培养时以500mL三角瓶装150mL如表3所示的种子培养基，恒温振荡培养。按表8所示的发酵培养基配制发酵培养基3.5L，于7L搅拌型反应器中，其中加水时3.1L，灭菌后加入200mL培养好的种子培养液，200mL30％(W/V)的CaCO3悬浊液，使发酵培养液总体积达到3.5L。
发酵培养条件：培养温度34℃，通气量0.6vvm，最初搅拌速度200rpm；36h时发酵液澄清，此时补加30％(W/V)CaCO3悬浊液200mL，提高搅拌速度至300rpm；60h时菌丝体处于高速产酸的中期，些时添加50％(W/V)葡萄糖液200mL，和15％(W/V)CaCO3悬浊液100mL。最终发酵L-乳酸产酸量为154g/L，以加入的葡萄量计算L-乳酸收率为87％。发酵过程如表9所示。
从以上实施例和对比例可以看出，以本发明工艺进行L-乳酸的发酵生产时发酵类型基本属于次级代谢产物发酵，即培养前期主要是菌体的生长为主，中后期以产酸为主。在发酵培养中期出现酸的高速积累，但菌丝体代谢葡萄糖的量与产酸量并不成正比关系，经层析法定性检测发现，在发酵过程中有中间酸的积累现象，在发酵后期中间酸可转化为L-乳酸。
表7
    时间(h)     葡萄糖浓度(％)     L-乳酸产量(g/L)
    0     15     0
    12     12.5     13
    24     8.5     42
    36     4.7     65
    48     2.7     91
    60     1.9/3.1     105
    72     0.6     128
    84     0.2     136
表8
    名称     用量(％)
    葡萄糖     16
    NH4NO3     2
    Na2HPO4     0.3
    MgSO4     0.25
    ZnSO4     0.05
    水     补足100mL
    高压灭菌，1kg/cm2，15min。
表9
    时间(h)     葡萄糖浓度(％)     L-乳酸产量(g/L)
    0     16.2     -
    12     12.5     -
    24     10.6     41
    36     6.7     57
    48     4.7     75
    60     0.5/3.3     97
    72     2.9     128
    84     1.3     139
    96     0.2     154

Claims (4)

1、一种发酵生产L-乳酸的补料工艺，采用根霉菌属的菌种生成乳酸，其特征在于：其工艺包括以下步骤：
A.对菌种进行斜面菌种的制备和孢子的增生培养；
B.将步骤A获得的孢子置入种子培养基中进行种子培养；
C.将步骤B获得的种子接种于发酵培养基中进行分批发酵培养，并在发酵培养过程中一次性补加单糖料，使发酵液残糖浓度提高1％～4％，并分三次添加中和剂，使中和剂总量达到5-7％。
2、按照权利要求1所述的一种发酵生产L-乳酸的补料工艺，其特征在于：以固曲孢子扩增培养基对根霉的孢子进行增生培养；固曲原料选用麸皮或面包渣作为真菌生长并产生孢子的原料。
3、按照权利要求1所述的一种发酵生产L-乳酸的补料工艺，其特征在于：种子培养基的碳源采用玉米粉水解物。
4、按照权利要求1所述的一种发酵生产L-乳酸的补料工艺，其特征在于：
1)、在发酵培养中，当发酵液酸积累量达到85～95g/L，残糖量低于2％时进行补料，向生物反应器内添加单糖，使发酵液中残糖量提高1％～4％；
2)、补中和剂的方式是间歇式的补加，补加糖是一次性的加入；
3)、在分批发酵中，优选中性碳酸盐类为pH中和剂，分三次加入，第一次在发酵培养初始时加入1-3％的中性碳酸盐类，调节培养基的pH至5.5～6.0，第二次在第一次加入的中性碳酸盐类用尽后补加，最后一次在补加单糖时加入。
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固定化米根霉发酵制L－乳酸 李学梅 等，菌物系统，第17卷第4期 1998 *
根霉L－乳酸发酵条件的优化 王学东 等，山东轻工业学院学报，第16卷第3期 2002 *
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米根霉发酵生产L（＋）－乳酸研究进展 白冬梅 等，现代化工，第22卷第6期 2002 *

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