CN105861455A - DoxA蛋白突变体及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了DoxA蛋白突变体及其编码基因与应用。本发明公开一种蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。本发明公开的表阿霉素高产菌可高效表达表阿霉素,其发酵液的表阿霉素效价达到102.0μg/ml。本发明在生物工程制药技术领域具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程制药技术领域,具体涉及DoxA蛋白突变体及其编码基因与应用。
背景技术
蒽环类抗肿瘤药物可广泛用于治疗白血病、乳腺癌、胃癌、肠癌等恶性肿瘤疾病,是临床上的大品种药物。其中表阿霉素由于活性高、毒性小,因此得到了更广泛的临床应用。
目前表阿霉素是通过半合成方法生产的。然而化学合成过程复杂,成本高,反应条件要求严格;同时生产过程中大量使用化学溶剂,容易对环境造成污染。因此寻求微生物发酵这种绿色生产工艺来生产表阿霉素受到广泛关注。美国威斯康辛大学的研究人员在1998年报道应用组合生物学的方法,将阿霉素产生菌ATCC29050的酮基还原酶基因dnmV替换成avrE后,成功构建了产表柔红霉素和表阿霉素(图1)的基因工程菌株,但是只有微量的表阿霉素,代谢产物主要是其前体表柔红霉素。专利US20100255543A1用evaE替换dnmV后,表柔红霉素效价相比avrE的替换菌株效价提高了近2倍,达到173μg/ml,但是没有表阿霉素产生。上海医药工业研究院的朱宝泉在2006年对天蓝淡红链霉菌进行了相应的基因工程改造,发酵可以得到少量表柔红霉素。专利US20100143977A1披露了一种基因工程改造方法,可以通过链霉菌发酵得到700μg/ml表柔红霉素。
综上所述,目前可以通过菌株的遗传改造得到表柔红霉素的高产菌株,但是却只有微量的表阿霉素产生。表柔红霉素经过DoxA催化后得到表阿霉素,因此筛选高活性的doxA突变体成为解决这一问题的关键。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是制备表阿霉素并提高表阿霉素产量。
为了解决以上技术问题,本发明提供一种蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID No.16所示;
所述蛋白为DoxA蛋白突变体,可人工合成,也可先合成其编码基因,再进行生物表达得到。
为了解决以上技术问题,本发明还提供与所述蛋白相关的生物材料,为如下B1)或B2):
B1)编码所述蛋白的核酸分子;
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
其中,B1)所述核酸分子可以是DNA,如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可以是RNA,如mRNA或hnRNA等;
B2)所述的含有编码所述蛋白的核酸分子的表达盒,是指能够在宿主细胞中表达所述蛋白的DNA,该DNA不但可包括启动编码所述蛋白的基因转录的启动子,还可包括终止编码所述蛋白的基因转录的终止子;进一步,所述表达盒还可包括增强子序列;
所述重组微生物具体可为细菌、藻和真菌,其中,细菌可为链霉菌。
上述生物材料中,B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因:
1)SEQ ID No.15所示的DNA分子;
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子;
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。
上生物材料中,所述严格条件可为如下:50℃,在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNa3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交,在50℃,2×SSC,0.1%SDS中漂洗;还可为:50℃,在7%SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交,在50℃,1×SSC,0.1%SDS中漂洗;还可为:50℃,在7%SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交,在50℃,0.5×SSC,0.1%SDS中漂洗;还可为:50℃,在7%SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交,在50℃,0.1×SSC,0.1%SDS中漂洗;还可为:50℃,在7%SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交,在65℃,0.1×SSC,0.1%SDS中漂洗;也可为:在6×SSC,0.5%SDS的溶液中,在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次;
所述90%以上的同一性,可为91%、92%、93%、94%或95%以上的同一性。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法,例如定向进化和点突变的方法,对本发明的编码所述蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的,具有与本发明的编码所述蛋白的核苷酸序列有一定同一性的核苷酸,只要编码所述蛋白且具有所述蛋白的功能,均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件,两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(%)表示,其可以用来评价相关序列之间的同一性。
为了解决以上技术问题,本发明还提供一种表达表阿霉素的链霉菌的构建方法,包括如下步骤:将出发链霉菌的dnmV基因原位替换为avrE基因,并将其doxA基因突变为编码SEQ ID No.16所示蛋白的基因序列。
上述方法中,所述出发链霉菌的保藏编号为CGMCC No.4827。
上述任一所述的方法中,所述dnmV基因的序列如SEQ ID No.9所示;
所述avrE基因的序列如SEQ ID No.10所示;
所述编码SEQ ID No.16所示蛋白的基因序列如SEQ ID No.15所示。
上述任一所述的方法中,所述将出发链霉菌的dnmV基因原位替换为avrE基因的方法如下:
(1)分别构建得到dnmV基因敲除载体pZH11和用于avrE基因原位替换dnmV基因的载体pZH12;
(2)将所述pZH11和所述pZH12分别转化大肠杆菌,得到含有pZH11的重组大肠杆菌和含有pZH12的重组大肠杆菌;
(3)将所述含有pZH11的重组大肠杆菌接合转移到链霉菌(CGMCC No.4827),得到dnmV基因敲除菌ZH11;
(4)将所述含有pZH12的重组大肠杆菌接合转移到所述ZH11,得到dnmV基因原位替换为avrE基因的表阿霉素产生菌ZH12。
上述任一所述的方法中,所述编码SEQ ID No.16所示的蛋白的基因序列如SEQ IDNo.15所示。
上述任一所述的方法中,所述将doxA基因突变为编码SEQ ID No.16所示蛋白的基因序列的方法如下:将含有SEQ ID No.15的DNA分子替换pZH5的SacI和BglII酶切位点间序列,得到重组质粒pZH99;将所述pZH99的XbaI和BglII酶切位点间含有ermE*+SEQ ID No.15所示的DNA分子的片段替换pSET152的XbaI和BamHI酶切位点间序列,得到pZH100;再将所述pZH100转入大肠杆菌,得到含有pZH100的重组大肠杆菌;将所述含有pZH100的重组大肠杆菌接合转移到所述ZH12,得到所述表达表阿霉素的链霉菌;
所述pZH5的序列如SEQ ID No.2所示;
所述ermE*基因序列为SEQ ID No.2的第46位至第325位;
所述pSET152在文献“Bierman M,Logan R,O'Brien K,Seno ET,Rao RN,SchonerBE.Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichiacoli to Streptomyces spp.Gene.1992,116(1):43-9.”中公开过,公众可从浙江海正药业股份有限公司获得。
上述任一所述的方法中,所述步骤(1)中所述pZH11的构建方法如下:将dnmV基因上游DNA片段替换pHY642的HindIII和XbaI酶切位点间序列,得到pZH9;用dnmV基因下游DNA片段替换pZH9的EcoRI和XbaI酶切位点间序列,得到pZH10;将pIJ773的阿伯拉抗性基因片段插入pZH10的XbaI酶切位点,得到pZH11;
所述dnmV基因上游DNA片段和所述dnmV基因下游DNA片段的构建方法具体如下:以链霉菌(CGMCC No.4827)的基因组DNA为模板,分别用DnmVLF/DnmVLR引物对以及DnmVRF/DnmVRR引物对扩增得到所述dnmV基因上游DNA片段以及所述dnmV基因下游DNA片段;
所述DnmVLF的序列如SEQ ID No.3所示;
所述DnmVLR的序列如SEQ ID No.4所示;
所述DnmVRF的序列如SEQ ID No.5所示;
所述DnmVRR的序列如SEQ ID No.6所示;
所述pHY642的序列如SEQ ID No.1所示;
所述pIJ773在文献“Gust Bl,Challis GL,Fowler K,Kieser T,Chater KF.PCR-targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain needed forbiosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin.Proc Natl Acad SciUSA.2003Feb 18;100(4):1541-6.Epub 2003Jan 31.”中公开过,公众可从浙江海正药业股份有限公司获得。
上述任一所述的方法中,所述步骤(1)中所述pZH12的构建方法如下:将avrE基因片段插入所述pZH10的XbaI位点,得到pZH12;
所述avrE基因片段的构建方法具体如下:以除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)的基因组DNA为模板,用avrEF/avrER为引物对扩增得到所述avrE基因片段;
所述avrEF的序列如SEQ ID No.7所示;
所述avrER的序列如SEQ ID No.8所示;
所述除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)在文献“Ikeda H,Ishikawa J,Hanamoto A,Shinose M,Kikuchi H,Shiba T,Sakaki Y,Hattori M,Omura S.Completegenome sequence and comparative analysis of the industrial microorganismStreptomyces avermitilis.Nat Biotechnol.2003May;21(5):526-31.”中公开过,公众可从浙江海正药业股份有限公司获得。
上述任一所述的方法中,所述大肠杆菌为大肠杆菌ET12567(pUZ8002);
所述含有pZH11的重组大肠杆菌为重组大肠杆菌ET12567(pUZ8002,pZH11);
所述含有pZH12的重组大肠杆菌为重组大肠杆菌ET12567(pUZ8002,pZH12)。
上述任一所述的方法中,所述含有pZH100的重组大肠杆菌为重组大肠杆菌ET12567(pUZ8002,pZH100)。
为了解决以上技术问题,本发明还提供由上述任一所述的方法构建得到的链霉菌;
所述链霉菌为doxA突变体菌株,与链霉菌(CGMCC No.4827)菌相比,该菌表达的DoxA蛋白发生了A133T,A339D和C398S的突变;
链霉菌(CGMCC No.4827)的doxA基因序列如SEQ ID No.17所示,其编码的DoxA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.18所示。
为了解决以上技术问题,本发明还提供一种制备表阿霉素的方法,包括将所述链霉菌进行发酵培养。
上述方法中,所述发酵培养的培养基配方(g/L)如下:玉米淀粉80.0,酵母粉30.0,CaCO33.0,NaCl 3.0,余量为水,pH 6.80。
为了解决以上技术问题,本发明还提供如下(1)-(3)所示的至少一种在制备表阿霉素中的应用:
(1)上述蛋白;
(2)上述任一所述的生物材料;
(3)上述链霉菌和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物。
为了解决以上技术问题,本发明还提供如下(1)-(3)所示的至少一种在制备抗癌药物中的应用:
(1)上述蛋白;
(2)上述任一所述的生物材料;
(3)上述链霉菌和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物。
上述应用中,所述抗癌药物为抗白血病、乳腺癌、胃癌和/或肠癌的药物。
本发明将链霉菌(CGMCC No.4827)的dnmV基因原位替换为avrE基因后,进一步通过易错PCR对doxA基因进行定向进化,筛选得到对表柔红霉素到表阿霉素具有更高催化活性的doxA突变体菌株,在本发明的发酵条件下,其发酵液的表阿霉素效价达到102.0μg/ml,提高了表阿霉素产量。本发明在生物工程制药技术领域具有很好的应用前景。
附图说明
图1为表阿霉素的化学结构。
图2为质粒pHY642示意图,其序列如SEQ ID No.1所示。
图3为质粒pZH5示意图,其序列如SEQ ID No.2所示。
图4为表阿霉素标准品的HPLC检测图谱。
图5为表阿霉素标准品的质谱图。
图6为ZH98发酵液的HPLC检测图谱。
图7为ZH100发酵液的HPLC检测图谱。
图8为ZH100发酵液中的表阿霉素的质谱图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
以下结合具体实施例,对本发明作进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
链霉菌(CGMCC No.4827)购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
蔗糖-Tris缓冲液:溶质为蔗糖,溶剂为10mM Tris-HCl,蔗糖在蔗糖-Tris缓冲液中的质量百分含量为10.3%,该缓冲液的pH为8.0。
溶菌酶溶液为生工生物工程(上海)股份有限公司产品,产品目录号为A610308。
饱和酚溶液(pH8.0)为生工生物工程(上海)股份有限公司产品,产品目录号为A504193。
TSB培养基(Bacto TM Tryptic Soy Broth)为BD公司产品,货号为211825。
pIJ773在文献“Gust B1,Challis GL,Fowler K,Kieser T,Chater KF.PCR-targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain needed forbiosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin.Proc Natl Acad SciUSA.2003Feb 18;100(4):1541-6.Epub 2003Jan 31.”中公开过,公众可从浙江海正药业股份有限公司获得。
除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)在文献“Ikeda H,Ishikawa J,Hanamoto A,Shinose M,Kikuchi H,Shiba T,Sakaki Y,Hattori M,Omura S.Completegenome sequence and comparative analysis of the industrial microorganismStreptomyces avermitilis.Nat Biotechnol.2003May;21(5):526-31.”中公开过,公众可从浙江海正药业股份有限公司获得。
大肠杆菌ET12567(pUZ8002)在文献“Bierman M,Logan R,Obrien K,Seno ET,RaoRN,Schoner BE:Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA fromEscherichia coli to Streptomyces spp.Gene.1992,116(1):43-49.10.1016/0378-1119(92)90627-2.”中公开过,公众可从浙江海正药业股份有限公司获得。
表阿霉素标准品为上海岚克医药科技发展有限公司产品,产品目录号为10309。
pSET152在文献“Bierman M,Logan R,O'Brien K,Seno ET,Rao RN,SchonerBE.Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichiacoli to Streptomyces spp.Gene.1992,116(1):43-9.”中公开过,公众可从浙江海正药业股份有限公司获得。
实施例1、dnmV基因敲除质粒pZH11的构建
一、链霉菌(CGMCC No.4827)基因组DNA的提取
取链霉菌(CGMCC No.4827)细胞悬液50μl接种于30ml TSB培养基中,28℃,220rpm培养48hr后,于50ml离心管中,4000rpm离心10min,去上清,沉淀用30ml蔗糖-Tris缓冲液洗涤2遍后,以5ml蔗糖-Tris缓冲液悬浮。加入100mg/ml溶菌酶溶液20μl,37℃水浴2hr。加入10%SDS溶液500μl,温和颠倒直至基本澄清。加饱和酚溶液(pH8.0)5ml,温和颠倒数次后,4000rpm离心10min。取上层溶液4ml,加酚-氯仿-异戊醇(pH8.0)溶液4ml,温和颠倒数次后4000rpm离心10min。取上层3ml,加入3M HAc/NaAc缓冲液(pH5.3)300μl,异丙醇3ml,温和颠倒数次后,将结团的沉淀用吸头挑到1.5ml离心管。沉淀用体积百分含量为70%的乙醇水溶液洗涤2遍后,室温干燥。加入500μl Tris-HCl(pH8.0)溶解,得到链霉菌(CGMCC No.4827)的基因组DNA。
二、以步骤一得到的链霉菌(CGMCC No.4827)的基因组DNA为模板,分别用DnmVLF/DnmVLR引物对以及DnmVRF/DnmVRR引物对扩增得到dnmV基因上游DNA片段以及dnmV基因下游DNA片段。
引物序列如下:
DnmVLF:5’-CCCAAGCTTCCACTCTGCCCGTCCACCTCTT-3’;(SEQ ID No.3)
(下划线所示序列为限制性内切酶HindIII酶切识别位点)
DnmVLR:5’-TGCTCTAGACTCACCCGTCTCCGCGTG-3’;(SEQ ID No.4)
(下划线所示序列为限制性内切酶XbaI酶切识别位点)
DnmVRF:5’-TGCTCTAGACGGGCTGGTCGTCAACATCG-3’;(SEQ ID No.5)
(下划线所示序列为限制性内切酶XbaI酶切识别位点)
DnmVRR:5’-CCGGAATTCGCTCCTTCCTGGGCTTCCTG-3’。(SEQ ID No.6)
(下划线所示序列为限制性内切酶EcoRI酶切识别位点)
根据PrimeSTAR试剂盒(TaKaRa公司产品,产品目录号为R044A)说明书,按以下配比配制PCR扩增体系:
按照引物对的不同分装成2管进行PCR反应,PCR程序为:95℃,5min;(95℃,30sec;55℃,30sec;72℃,3min)×30循环,72℃,5min;16℃,1min。
三、HindIII和XbaI双酶切PCR扩增得到的dnmV基因上游DNA片段,得到上游片段1;HindIII和XbaI双酶切载体pHY642(图2),得到载体片段1;将上游片段1与载体片段1连接,得到重组质粒,将其命名为pZH9。将pZH9送测序,结果与预期一致。
EcoRI和XbaI双酶切PCR扩增得到的dnmV基因下游DNA片段,得到下游片段2;EcoRI和XbaI双酶切pZH9,得到载体片段2;将下游片段2与载体片段2连接,得到重组质粒,将其命名为pZH10。将pZH10送测序,结果与预期一致。
XbaI酶切pIJ773,得到阿伯拉抗性基因片段;XbaI酶切pZH10,得到载体片段3;将阿伯拉抗性基因片段与载体片段3连接,得到重组质粒,将其命名为pZH11。将pZH11送测序,结果与预期序列一致。
pZH11即为最终构建得到的dnmV基因敲除载体。
实施例2、用于avrE基因原位替换dnmV基因的质粒pZH12的构建
一、以除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)的基因组DNA为模板,用引物对avrEF/avrER扩增得到avrE基因片段。
除模板和引物不同外,PCR扩增体系和程序同实施例1。
引物序列如下:
avrEF:
5’-ACGCGGAGACGGGTGAGGCGGACATGGGGCGGTTTTCGGTGTGC-3’;(SEQ ID No.7)
avrER:
5’-GTCGTCGGAAGCCTGTGAGCTACACGTAAGCCGCCACCATG-3’。(SEQ ID No.8)
二、XbaI酶切步骤一得到的avrE基因片段,得到avrE片段3;将XbaI酶切pZH10,得到载体片段3;将avrE片段3与载体片段3连接,得到重组质粒,将其命名为pZH12。将pZH12送测序,结果与预期序列一致。
pZH12用于avrE基因原位替换dnmV基因。
实施例3、表阿霉素产生菌的构建
一、重组大肠杆菌ET12567(pUZ8002,pZH11)和ET12567(pUZ8002,pZH12)的构建
pZH11、pZH12分别转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002),具体如下:
取1μl实施例1制备的质粒pZH11、实施例2制备的质粒pZH12分别加入到100μl大肠杆菌ET12567(pUZ8002)感受态细胞中,冰上放置30min后,42℃热击90sec,再迅速放到冰上冷却1min,加入900μl液体LB培养基,37℃水浴50min。分别取100μl涂布于含25μg/ml氯霉素(Cm)、50μg/ml卡那霉素(Km)、50μg/ml氨苄青霉素(Amp)的固体LB培养基上,37℃培养过夜,分别长出转化子,即为重组大肠杆菌ET12567(pUZ8002,pZH11)和ET12567(pUZ8002,pZH12)。
二、重组大肠杆菌ET12567(pUZ8002,pZH11)和ET12567(pUZ8002,pZH12)的培养
分别将重组大肠杆菌ET12567(pUZ8002,pZH11)和ET12567(pUZ8002,pZH12)单菌落接种到3ml含25μg/ml Cm、50μg/ml Km和50μg/ml Amp的液体LB培养基中,37℃,250rpm培养过夜后,分别取300μl接种于30ml含25μg/ml Cm、50μg/ml Km和50μg/ml Amp的液体LB培养基中,37℃,250rpm培养4-6h,至OD600为0.4-0.6之间。离心后,分别收集菌体,以液体LB培养基洗涤2遍,最后分别加入500μl液体LB培养基悬浮菌体备用。
三、接合转移并筛选dnmV基因敲除菌ZH11
(一)接合转移
将链霉菌(CGMCC No.4827)细胞悬液50μl接种于30ml TSB培养基中,28℃,220rpm培养48hr后,取500μl菌液加入到500μl步骤二培养得到的ET12567(pUZ8002,pZH11)菌液中,离心去掉800μl上清。以剩余的上清悬浮菌体,并涂布于MS固体培养基平板,28℃培养16-20h后,用含有500μg阿伯拉霉素(Am)和500μg萘啶酮酸(Nal)的1ml无菌水覆盖培养基表面,28℃培养4-8d,长出接合子。
(二)筛选
挑一个步骤(一)得到的接合子,在含有25μg/ml Nal的MS固体培养基(琼脂20.0g,甘露醇20.0g,黄豆饼粉20.0g,自来水定容到1000ml)上划线,28℃培养4-6d。将生长的单菌落每一颗同时转接到以下两种固体培养基上:分别含25μg/ml硫链丝菌素(Tsr)和25μg/ml阿伯拉霉素(Am)的MS固体培养基上,28℃培养5d后,观察生长情况。其中在阿伯拉霉素(Am)的MS固体培养基上生长,同时在含硫链丝菌素的MS固体培养基上不生长的菌落就是dnmV基因敲除菌,将其命名为ZH11。
四、表阿霉素产生菌的构建
(一)接合转移
将步骤三得到的ZH11细胞的悬液50μl接种于30ml TSB培养基,28℃,220rpm培养48hr后,取500μl菌液加入到500μl步骤二培养得到的ET12567(pUZ8002,pZH12)菌液中,离心去掉800μl上清。以剩余的上清悬浮菌体,并涂布于MS固体培养基平板,28℃培养16-20h后,用含有500μgTsr和500μg Nal的1ml无菌水覆盖培养基表面,28℃培养4-8d,长出接合子。
(二)筛选
挑一个步骤(一)得到的接合子,在含有25μg/ml Nal的MS固体培养基上划线,28℃培养4-6d。将生长的单菌落每一颗同时转接到分别含25μg/ml Am和不含Am、Tsr的两种MS固体培养基上,28℃培养5d后,观察生长情况。选取只在不含Am、Tsr的MS培养基上生长、在含Am的MS培养基上不生长(即表明dnmV替换为avrE)的菌落,该菌株为表阿霉素产生菌,将其命名为ZH12。
dnmV基因序列如SEQ ID No.9所示。
avrE基因序列如SEQ ID No.10所示。
实施例4、表阿霉素的发酵检测
一、表阿霉素的发酵
接入一环实施例3制备的ZH12的菌丝体到固体斜面培养基上,28℃培养10d后,从斜面挖一块约1×1cm大小的菌块接入种子培养基,28℃,250rpm培养45hr,得到种子培养液。然后取2.5ml的种子培养液接入发酵培养基中,28℃,250rpm培养7天,得到发酵液。
上述各培养基的配方如下:
固体斜面培养基配方(g/L):酵母抽提物4.0,麦芽抽提物10.0,葡萄糖4.0,琼脂20.0,余量为水,调节pH为6.80,灭菌后斜放冷却。
种子培养基配方(g/L):可溶性淀粉30.0,葡萄糖10.0,黄豆饼粉20.0,CaCO3 2.0,NaCl 3.0,余量为水,调节pH为6.8。
发酵培养基配方(g/L):玉米淀粉80.0,酵母粉30.0,CaCO3 3.0,NaCl 3.0,余量为水,调节pH为6.80。
以上培养基的灭菌方法均为:121℃灭菌20分钟。
二、HPLC检测
发酵结束后,将发酵液用HCl调节pH到1.5,加入3倍体积的乙醇,放置1hr后,4000rpm离心,取上清样品进行HPLC检测,同时以表阿霉素标准品为对照。以样品与标准品的目的峰面积比乘标准品的浓度的方法计算发酵液的表阿霉素效价。
HPLC检测方法如下:
色谱柱:C18柱,5μm,4.6×250mm;
缓冲液:取十二烷基硫酸钠1.44g和磷酸0.68ml溶于500ml超纯水中制备而成;
流动相:缓冲液∶乙腈∶甲醇的体积比为500∶500∶60;
流速:1.35ml/min;
检测波长:254nm;
进样量:10μl。
表阿霉素标准品的HPLC检测图谱如图4所示,其中表阿霉素的保留时间为10.316min。
表阿霉素标准品的质谱图如图5所示。
结果表明,ZH12发酵液的表阿霉素效价为0.65μg/ml。
实施例5、doxA基因的突变及克隆
一、以链霉菌(CGMCC No.4827)的基因组DNA为模板,以DoxAF/DoxAR为引物对,并加入终浓度为0.5μM的MnCl2进行易错PCR扩增得到doxA突变基因片段,以对doxA基因进行随机突变。
引物序列如下:
DoxAF:5’-ACAGAGCTCGTGGCCGTCGACCCGTTC-3’(SEQ ID No.11)
(下划线所示序列为限制性内切酶SacI酶切识别位点)
DoxAR:5’-GGAAGATCTTCAGCGCAGCCAGACGGG-3’(SEQ ID No.12)
(下划线所示序列为限制性内切酶BglII酶切识别位点)
根据Taq Polymerase试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司产品,产品目录号为B500010)说明书,按以下配比配制PCR扩增体系:
分装成4管进行PCR反应,PCR程序为:94℃,5min;(94℃,30sec;55℃,30sec;72℃,2min)×30循环,72℃,5min;16℃,1min。
二、SacI和BglII双酶切步骤一得到的doxA突变基因片段,得到doxA突变片段4;SacI和BglII双酶切载体pZH5(图3)得到载体片段4;将doxA突变片段4与载体片段4连接,得到重组质粒,将其命名为pZH99。该过程中doxA突变基因被克隆到启动子ermE*下游。
三、XbaI和BglII双酶切pZH99,得到ermE*+doxA突变基因片段,XbaI和BamHI双酶切载体pSET152,得到载体片段5;将ermE*+doxA突变基因片段和载体片段5连接,得到重组质粒,将其命名为pZH100。
ermE*基因序列为SEQ ID No.2的第46位至第325位。
pZH100为DoxA蛋白突变体表达质粒。
四、以链霉菌(CGMCC No.4827)的基因组DNA为模板,以DoxAF/DoxAR为引物对,扩增得到doxA基因。
除引物不同外,PCR扩增体系和程序同实施例1。
利用扩增得到doxA基因,按照步骤二至三的方法,得到重组质粒pZH98。将pZH98送测序,结果与预期一致。
pZH98为DoxA蛋白表达质粒,作为pZH100的对照。
实施例6、doxA突变体的筛选
一、重组大肠杆菌ET12567(pUZ8002,pZH98)和ET12567(pUZ8002,pZH100)的构建
pZH98和pZH100分别转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002),具体如下:
分别取1μl实施例5制备的质粒pZH98、pZH100加入到100μl大肠杆菌ET12567(pUZ8002)感受态细胞中,冰上放置30min后,42℃热击90sec,再迅速放到冰上冷却1min,加入900μl液体LB培养基,37℃水浴50min。分别取100μl涂布于含25μg/ml氯霉素(Cm)、50μg/ml卡那霉素(Km)、50μg/ml阿伯拉霉素(Am)的固体LB培养基上,37℃培养过夜,分别长出转化子,即为重组大肠杆菌ET12567(pUZ8002,pZH98)和ET12567(pUZ8002,pZH100)。
二、接合转移
(一)挑选一个步骤一得到的ET12567(pUZ8002,pZH98)转化子单菌落接种于3ml含25μg/ml Cm、50μg/ml Km和50μg/ml Am的液体LB培养基中,37℃,250rpm培养过夜后,取300μl接种于30ml液体LB培养基。
(二)将步骤一得到的ET12567(pUZ8002,pZH100)的所有转化子用1ml液体LB培养基洗下后全部接种到30ml含25μg/ml Cm、50μg/ml Km和25μg/ml Am的液体LB培养基中。37℃,250rpm培养4-6h,至OD600为0.4-0.6之间。离心后,收集菌体,以液体LB培养基洗涤2遍,最后加入500μl液体LB培养基悬浮菌体备用。
(三)取实施例3制备的ZH12的细胞悬液50μl接种于30ml TSB培养基中,28℃,220rpm培养48hr后,分别取500μl菌液加入到500μl步骤(一)得到的ET12567(pUZ8002,pZH98)和步骤(二)得到的ET12567(pUZ8002,pZH100)菌液中,离心去掉800μl上清。以剩余的上清悬浮菌体,并涂布于MS固体培养基平板,28℃培养16-20h后,用含有500μg阿伯拉霉素(Am)和500μg萘啶酮酸(Nal)的1ml无菌水覆盖培养基表面,28℃培养4-8d后长出接合子,分别将其命名为ZH98和ZH100。将接合子ZH98和ZH100点种到实施例4中的固体斜面培养基上。
三、发酵检测
按照实施例4的方法进行ZH98和ZH100的表阿霉素的发酵和HPLC检测。
ZH98发酵液的HPLC检测图谱如图6所示。
ZH100发酵液的HPLC检测图谱如图7所示,其中表阿霉素的保留时间为10.316min。
ZH100发酵液中的表阿霉素的质谱图如图8所示。
以ZH98的发酵结果作为对照,筛选doxA突变体ZH100的表阿霉素高产菌株,其中筛选到一株菌的表阿霉素效价大幅提高,其发酵液的表阿霉素效价达到102.0μg/ml,而对照ZH98为0.72μg/ml。
四、doxA突变位点检测
按照实施例1步骤一的方法提取步骤三得到的ZH100的表阿霉素高产菌株的基因组DNA,并以ermEF/DoxAR为引物对,进行PCR反应,得到PCR扩增产物。
引物序列如下:
ermEF:5’-AGCCCGACCCGAGCACGC-3’(SEQ ID No.13)
DoxAR:5’-GGAAGATCTTCAGCGCAGCCAGACGGG-3’(SEQ ID No.14)
将PCR扩增产物送测序。
测序结果表明,该菌株doxA基因突变后的序列如SEQ ID No.15所示。
doxA基因突变后编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。
链霉菌(CGMCC No.4827)doxA基因序列如SEQ ID No.17所示。
链霉菌(CGMCC No.4827)doxA基因编码的DoxA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.18所示。
测序发现,该菌株中doxA基因发生的碱基突变为397G>A、399C>T、1016C>A、1193G>C,氨基酸密码子变化为第397-399位的5’-GCC-3’变为5’-ACT-3’,第1015-1017位的5’-GCC-3’变为5’-GAC-3’,第1192-1194位的5’-TGC-3’变为5’-TCC-3’。相对应的DoxA蛋白三个位点发生氨基酸改变,分别为DoxA蛋白第133位的丙氨酸突变为苏氨酸(A133T)、第339位丙氨酸突变为天冬氨酸(A339D)、第398位的半胱氨酸突变为丝氨酸(C398S)。
SEQ ID No.1:
5’-agcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcatcgatgatatcagatcaaggcgaatacttcatatgcggggatcgaccgcgcgggtcccggacggggaagagcggggagctttgccagagagcgacgacttccccttgcgttggtgattgccggtcagggcagccatccgccatcgtcgcgtagggtgtcacaccccaggaatcgcgtcactgaacacagcagccggtaggacgaccatgactgagttggacaccatcgcaaatccgtccgatcccgcggtgcagcggatcatcgatgtcaccaagccgtcgcgatccaacataaagacaacgttgatcgaggacgtcgagcccctcatgcacagcatcgcggccggggtggagttcatcgaggtctacggcagcgacagcagtccttttccatctgagttgctggatctgtgcgggcggcagaacataccggtccgcctcatcgactcctcgatcgtcaaccagttgttcaagggggagcggaaggccaagacattcggcatcgcccgcgtccctcgcccggccaggttcggcgatatcgcgagccggcgtggggacgtcgtcgttctcgacggggtgaagatcgtcgggaacatcggcgcgatagtacgcacgtcgctcgcgctcggagcgtcggggatcatcctggtcgacagtgacatcaccagcatcgcggaccggcgtctccaaagggccagccgaggttacgtcttctcccttcccgtcgttctctccggtcgcgaggaggccatcgccttcattcgggacagcggtatgcagctgatgacgctcaaggcggatggcgacatttccgtgaaggaactcggggacaatccggatcggctggccttgctgttcggcagcgaaaagggtgggccttccgacctgttcgaggaggcgtcttccgcctcggtttccatccccatgatgagccagaccgagtctctcaacgtttccgtttccctcggaatcgcgctgcacgagaggatcgacaggaatctcgcggccaaccgataagcgcctctgttcctcggacgctcggttcctcgacctcgattcgtcagtgatgatctgccggtctccctatagtgagtcgtattaatttcgataagccaggttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatctgacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtcagcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctgcaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaacacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatggacatattgtcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaactcgacctgcaggtccccggggatcggtcttgccttgctcgtcggtgatgtacttcaccagctccgcgaagtcgctcttcttgatggagcgcatggggacgtgcttggcaatcacgcgcaccccccggccgttttagcggctaaaaaagtcatggctctgccctcgggcggaccacgcccatcatgaccttgccaagctcgtcctgcttctcttcgatcttcgccagcagggcgaggatcgtggcatcaccgaaccgcgccgtgcgcgggtcgtcggtgagccagagtttcagcaggccgcccaggcggcccaggtcgccattgatgcgggccagctcgcggacgtgctcatagtccacgacgcccgtgattttgtagccctggccgacggccagcaggtaggccgacaggctcatgccggccgccgccgccttttcctcaatcgctcttcgttcgtctggaaggcagtacaccttgataggtgggctgcccttcctggttggcttggtttcatcagccatccgcttgccctcatctgttacgccggcggtagccggccagcctcgcagagcaggattcccgttgagcaccgccaggtgcgaataagggacagtgaagaaggaacacccgctcgcgggtgggcctacttcacctatcctgcccggctgacgccgttggatacaccaaggaaagtctacacgaaccctttggcaaaatcctgtatatcgtgcgaaaaaggatggatataccgaaaaaatcgctataatgaccccgaagcagggttatgcagcggaaaagatccgtcgagcagctga-3’
SEQ ID No.2:
5’-gaactcgagcagctgaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaagcccgacccgagcacgcgccggcacgcctggtcgatgtcggaccggagttcgaggtacgcggcttgcaggtccaggaaggggacgtccatgcgagtgtccgttcgagtggcggcttgcgcccgatgctagtcgcggttgatcggcgatcgcaggtgcacgcggtcgatcttgacggctggcgagaggtgcggggaggatctgaccgacgcggtccacacgtggcaccgcgatgctgttgtgggctggacaatcgtgccggttggtaggatccagcggtgagcgagctcgaattcatcgatgatatcagatctgccggtctccctatagtgagtcgtattaatttcgataagccaggttaacctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatggacatattgtcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactata-3’
SEQ ID No.9:
5’-atgcgggtcgtggttctgggggcgacgggcagcgtcggtcggcaggtgtgtgcggcgtaccaggcgcacgggtgggacgtgcacggggtggcccgccgcccggcgccgcacctgagcgggtgcgggttcacggagctggacctcgcggccgccgcgcctgggcggatcgccacggtgctgggtgatcttccggcggacgtcgtggtcaacgcggcgggcggctggggcgacaccgaggaggagatgacgtactcgcatctgcgactggtgcgacgcctggtggaggcgctcgcgctgctcccgttccggccccggctggtccatctggggtcggtgcacgagtacggtcccgtgccggccggcacgctgctgcacgaggacctgctgccggagccggtcacgccgtacgcgcgcgtcaaactggagacctcgtcggccgtcctgaccgcagcgcgggccggtgtcctggacgcggtggtgctgcgcgcggcgaacatgtcgggcccgcatccgccgcaggagagtttcctggccgccctgatggcgcgtatcagcacggcattcgcgcacggtgggcggctggagttgagcgtcgcggacgcacggcgggacttcatcgacgtgcgggacgtcgcacaggcggtggtgcgtgccgggcgggctccggcggtcggcgggctggtcgtcaacatcgggcgcggggacgccgtgccgatcggtgatctggtcggctggctgctggaggccgccgccttcccggaggaccgggtcgaccgccgggaggcgccggtgcggagcaagggcggcgactggacccggctggacatcgggcgggcccggcggttgctgtcctgggcgccgcgcatcggcctgcgggactccgtccacagcatgtggcggaccgcgcacggcgccccggcctag-3’
SEQ ID No.10:
5’-atggggcggttttcggtgtgcccgccccggccgaccggaatactgaagagcatgctgacgactgggatgtgcgaccgaccgctggtcgtcgtactcggagcctccggctatatcgggtcggccgtcgcggcggaactcgcccggtggccggtcctgttgcggctggtggcccggcgaccgggcgtcgttccgccgggcggcgccgcggagaccgagacgcgtacggccgacctgacggcggcgagcgaggtcgccctcgccgtgacggacgccgacgtggtgatccacctggtcgcgcgcctcacccagggagcggcatggcgggcggcggagagcgatccggtggccgagcgggtgaacgtcggggtgatgcacgacgtcgtcgcggccctgcggtccgggcgccgcgccgggccgcccccggtggtggtgttcgccgggtcggtctaccaggtgggccgcccgggtcgggtcgacggcagtgagccggacgagcccgtgacggcctatgcccgtcagaaactcgacgccgaacggacgttgaagtccgccacggtcgagggtgtcctgcgggggatctcgctgcggctgcccaccgtctacggcgcggggccgggcccgcagggcaacggcgtcgtgcaggcgatggtgctccgggcgctcgccgacgaggccctcaccgtgtggaacggaagcgtggtggagcgtgacctggtgcatgtggaggatgtcgcgcaggccttcgtgagctgcctggcgcacgcggatgcgctcgccgggcggcactggctgctcggcagcggtcgtcctgtgaccgtcccgcacctcttcggtgccatcgccgccggcgtgtccgcccgcaccgggcgccccgcggtgcccgtgaccgcggtggaccctccggcgatggcgacggcggcggacttccacgggaccgtcgtcgactcctcggcgttccgcgcggtcaccgggtggcggccgcggctgtcgcttcaggagggcctggaccacatggtggcggcttacgtgtag-3’
SEQ ID No.15:
5’-gtggccgtcgacccgttcgcgtgtcccatgatgaccatgcagcgcaagcccgaggtgcacgacgccttccgggaggcgggcccggtcgtcgaggtgaacgcccccgcgggcggacccgcctgggtcatcaccgatgacgccctcgcccgcgaggtgctggccgatccccggttcgtgaaggaccccgacctcgcccccgccgcctggcggggggtggacgacggtctcgacatccccgttccggagctgcgtccgttcacgctcatcgccgtggacggcgaggcccaccggcgcctgcgccgcatccacgcacctgcgttcaacccgcgccggctggccgagcggacggatcgcatcgccgcgatcgccggccggctgctcaccgaactcgccgacacttccggccggtcgggcaaaccggccgagctgatcggcggcttcgcgtaccacttcccgctgttggtcatctgcgagctgctcggtgtgccggtcaccgatccggcgatggcccgcgaggccgtcagcgttctcaaggcactcggcctcggcggcccgcagagcggcgggggtgacggcacggaccctgccgggggcgtgccggacacctcggccctggagagcctgctcctcgaagccgtgcactcagcccggcggaacgacaccccgaccatgacccgcgtgctgtacgagcgcgcgcaggccgagttcggctcggtctccgacgaccagctcgtctacatgatcaccgggctcatcttcgccggccacgacaccaccggctccttcctgggcttcctgctcgcggaggtcctggcgggccgcctcgcggcggatgccgacgaggacgccgtctcccggttcgtggaggaggcgctgcgctaccacccgccggtgccctacacgttgtggaggttcgctgccacggaggtgaccatcggcggcgtccggctgccccgcggagcgccggtgctggtggacatcgagggcaccaacaccgacggccgccatcacgacgacccgcacgccttccacccggaccgtccctcgtggcggcggctcaccttcggcgacgggccgcactactgcatcggggagcagctcgcccagctggagtcgcgcacgatgatcggcgtactgcgcagcaggttccccgaggcccgactggccgtgccgtacgacgagttgcggtggtcccggaagggggcccagacggcgcggctcaccgaactgcccgtctggctgcgctga-3’
SEQ ID No.16:
VAVDPFACPMMTMQRKPEVHDAFREAGPVVEVNAPAGGPAWVITDDALAREVLADPRFVKDPDLAPAAWRGVDDGLDIPVPELRPFTLIAVDGEAHRRLRRIHAPAFNPRRLAERTDRIAAIAGRLLTELADTSGRSGKPAELIGGFAYHFPLLVICELLGVPVTDPAMAREAVSVLKALGLGGPQSGGGDGTDPAGGVPDTSALESLLLEAVHSARRNDTPTMTRVLYERAQAEFGSVSDDQLVYMITGLIFAGHDTTGSFLGFLLAEVLAGRLAADADEDAVSRFVEEALRYHPPVPYTLWRFAATEVTIGGVRLPRGAPVLVDIEGTNTDGRHHDDPHAFHPDRPSWRRLTFGDGPHYCIGEQLAQLESRTMIGVLRSRFPEARLAVPYDELRWSRKGAQTARLTELPVWLR
SEQ ID No.17:
5’-gtggccgtcgacccgttcgcgtgtcccatgatgaccatgcagcgcaagcccgaggtgcacgacgccttccgggaggcgggcccggtcgtcgaggtgaacgcccccgcgggcggacccgcctgggtcatcaccgatgacgccctcgcccgcgaggtgctggccgatccccggttcgtgaaggaccccgacctcgcccccgccgcctggcggggggtggacgacggtctcgacatccccgttccggagctgcgtccgttcacgctcatcgccgtggacggcgaggcccaccggcgcctgcgccgcatccacgcacctgcgttcaacccgcgccggctggccgagcggacggatcgcatcgccgcgatcgccggccggctgctcaccgaactcgccgacgcctccggccggtcgggcaaaccggccgagctgatcggcggcttcgcgtaccacttcccgctgttggtcatctgcgagctgctcggtgtgccggtcaccgatccggcgatggcccgcgaggccgtcagcgttctcaaggcactcggcctcggcggcccgcagagcggcgggggtgacggcacggaccctgccgggggcgtgccggacacctcggccctggagagcctgctcctcgaagccgtgcactcagcccggcggaacgacaccccgaccatgacccgcgtgctgtacgagcgcgcgcaggccgagttcggctcggtctccgacgaccagctcgtctacatgatcaccgggctcatcttcgccggccacgacaccaccggctccttcctgggcttcctgctcgcggaggtcctggcgggccgcctcgcggcggatgccgacgaggacgccgtctcccggttcgtggaggaggcgctgcgctaccacccgccggtgccctacacgttgtggaggttcgctgccacggaggtgaccatcggcggcgtccggctgccccgcggagcgccggtgctggtggacatcgagggcaccaacaccgacggccgccatcacgacgccccgcacgccttccacccggaccgtccctcgtggcggcggctcaccttcggcgacgggccgcactactgcatcggggagcagctcgcccagctggagtcgcgcacgatgatcggcgtactgcgcagcaggttccccgaggcccgactggccgtgccgtacgacgagttgcggtggtgccggaagggggcccagacggcgcggctcaccgaactgcccgtctggctgcgctga-3’
SEQ ID No.18:
VAVDPFACPMMTMQRKPEVHDAFREAGPVVEVNAPAGGPAWVITDDALAREVLADPRFVKDPDLAPAAWRGVDDGLDIPVPELRPFTLIAVDGEAHRRLRRIHAPAFNPRRLAERTDRIAAIAGRLLTELADASGRSGKPAELIGGFAYHFPLLVICELLGVPVTDPAMAREAVSVLKALGLGGPQSGGGDGTDPAGGVPDTSALESLLLEAVHSARRNDTPTMTRVLYERAQAEFGSVSDDQLVYMITGLIFAGHDTTGSFLGFLLAEVLAGRLAADADEDAVSRFVEEALRYHPPVPYTLWRFAATEVTIGGVRLPRGAPVLVDIEGTNTDGRHHDAPHAFHPDRPSWRRLTFGDGPHYCIGEQLAQLESRTMIGVLRSRFPEARLAVPYDELRWCRKGAQTARLTELPVWLR
Claims (10)
1.一种蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。
2.与权利要求1所述的蛋白相关的生物材料,为如下B1)或B2):
B1)编码权利要求1所述蛋白的核酸分子;
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
3.根据权利要求2所述的生物材料,其特征在于:B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因:
1)SEQ ID No.15所示的DNA分子;
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子;
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
4.一种表达表阿霉素的链霉菌的构建方法,包括如下步骤:将出发链霉菌的dnmV基因原位替换为avrE基因,并将其doxA基因突变为编码SEQ ID No.16所示蛋白的基因序列。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:所述出发链霉菌的保藏编号为CGMCCNo.4827。
6.根据权利要求4或5所述的方法,其特征在于:所述dnmV基因的序列如SEQ ID No.9所示;所述avrE基因的序列如SEQ ID No.10所示;所述编码SEQ ID No.16所示蛋白的基因序列如SEQ ID No.15所示。
7.由权利要求4-6任一所述的方法构建得到的链霉菌。
8.一种制备表阿霉素的方法,包括将权利要求7所述的链霉菌进行发酵培养。
9.如下(1)-(3)所示的至少一种在制备表阿霉素中的应用:
(1)权利要求1所述的蛋白;
(2)权利要求2或3所述的生物材料;
(3)权利要求7所述的链霉菌和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物。
10.如下(1)-(3)所示的至少一种在制备抗癌药物中的应用:
(1)权利要求1所述的蛋白;
(2)权利要求2或3所述的生物材料;
(3)权利要求7所述的链霉菌和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物。
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