CN116004502A - 一种表达鼠李糖糖基转移酶的重组大肠杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达鼠李糖糖基转移酶的重组大肠杆菌及其应用，属于基因工程技术与生物医药领域。将氨基酸序列如SEQ ID NO.6‑SEQ ID NO.10任一所示的鼠李糖糖基转移酶、文献报道具有C‑28位葡萄糖糖基转移酶UGT73AH1以及葡萄糖糖基转移酶UGT73C7或UGT73C8于大肠杆菌宿主BL21(DE3)△pgi中共表达。发酵结果表明，本发明筛选的5个鼠李糖糖基转移酶均能发挥作用，并且在0.596min出现唯一新峰，且与积雪草苷标准品特征离子流一致。本发明突破现有技术的壁垒，提供了全新的积雪草苷生物合成的方法，使得积雪草苷生物合成产业化成为可能。

Description

一种表达鼠李糖糖基转移酶的重组大肠杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种表达鼠李糖糖基转移酶的重组大肠杆菌及其应用，属于基因工程技术与生物医药领域。

背景技术

积雪草为伞形科植物的干燥全草，其化学成分包括三萜皂苷、三萜酸、多炔烯类和挥发油等。同时，积雪草富含多种生物活性物质，其主要成分为三萜及其皂苷类化合物，积雪草苷B、羟基积雪草苷和积雪草苷。

三萜类化合物广泛存在于真菌、蕨类植物、单子叶植物、双子叶植物和动物中，尤其是双子叶植物中。积雪草叶提取物的主要生物活性是这些皂苷,其中积雪草苷具有广泛的生物活性，如抗癌、抗炎和伤口愈合、抗糖尿病、抗氧化和护肝、抗丙型肝炎病毒(HCV)和神经保护等。然而，积雪草苷作为一组重要的植物次生代谢物，其结构复杂，在植物中含量相对较低。另外，这些化合物中的大多数能够与具有相似结构的化合物混合。因此，很难通过植物提取或化学合成获得大量的三萜类单体，从而限制了其在食品、医药、化妆品等多个领域的应用。随着测序技术的快速发展，越来越多的萜类合成途径中的酶得到挖掘和鉴定，萜类合成途径得以解析；此外，合成生物学的迅速发展，使得构建微生物细胞工厂生产萜类等具有重大医药价值的化合物成为了研究热点。

在过去几十年中，参与三萜类化合物生物合成的UGT基因的功能表征进展相对较少，这可能与植物基因组有编码大量UGT同源物有关。目前，积雪草苷的合成途径尚未完全解析，研究认为从积雪草酸到积雪草苷需要三步糖基化。Costa等人报道称，UGT73AD1在积雪草中起连接葡萄糖的羧基的作用并且体外表达确定UGT73AD1能够特异性糖基化积雪草酸和羟基积雪草酸。Kim等从积雪草Centella asiatica(L.)Urban中鉴定出糖基转移酶UGT73AH1，该酶能够糖基化积雪草酸的C28-COOH生成相应的单糖苷，但对其他位置C-2α、C-3β、C23-OH是否有催化作用尚不明确。在之前的研究中，已经明确从积雪草酸单糖苷到积雪草酸二糖苷的葡萄糖糖基化的酶，但最后一步的催化积雪草酸二糖苷到积雪草苷的酶仍然未知。

发明内容

本发明通过对积雪草植物进行二代转录组测序，利用BLAST比对、蛋白建模、分子对接、进化树分析等生物信息学手段，挖掘潜在的具有功能的鼠李糖糖基转移酶，在大肠杆菌中进行表达验证，通过外源添加底物积雪草酸的形式，构建一株可以合成积雪草苷的重组大肠杆菌。

本发明的第一个目的是提供一种重组大肠杆菌，是以大肠杆菌为宿主，过表达鼠李糖糖基转移酶，过表达葡萄糖糖基转移酶和糖基转移酶UGT73AH1。

在本发明的一种实施方式中，所述鼠李糖糖基转移酶如下(a)或(b)：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.10任一所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有葡萄糖糖基转移酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

在本发明的一种实施方式中，编码所述鼠李糖糖基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.5任一所示。

在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12所示。

在本发明的一种实施方式中，所述糖基转移酶UGT73AH1来源于积雪草Centellaasiatica(L.)Urban。

在本发明的一种实施方式中，所述糖基转移酶UGT73AH1的氨基酸序列如SEQ IDNO.13所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还敲除基因组上葡萄糖磷酸异构酶蛋白编码基因pgi。

在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖磷酸异构酶蛋白编码基因pgi的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pRSFDuet-1载体表达鼠李糖糖基转移酶，利用pETDuet-1共表达葡萄糖糖基转移酶和糖基转移酶UGT73AH1。。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。

本发明的第二个目的是提供一种合成积雪草苷的方法，所述方法为以上述重组大肠杆菌为出发菌株，以积雪草酸为底物发酵生产积雪草苷。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将上述重组大肠杆菌的种子液接种于发酵培养基中，35～38℃，200～240rpm振荡培养至OD₆₀₀值为0.6-0.8，加入异丙基硫代半乳糖苷至终浓度为0.4～0.6μmol/L，4～8h后加入终浓度150～250mg/L积雪草酸，以28～32℃，200～240rpm继续振荡培养40～60h。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基包括葡萄糖15～25g/L，甘油4～6g/L，K₂HPO₄·3H₂O 14～18g/L，KH₂PO₄ 1～3g/L，酵母粉20～30g/L，蛋白胨10～15g/L。

本发明的第三个目的是提供上述重组大肠杆菌在合成积雪草苷或含有积雪草苷的产品中的应用。

本发明的第四个目的是提供鼠李糖糖基转移酶在合成积雪草苷或含有积雪草苷的产品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述鼠李糖糖基转移酶如下(a)或(b)：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.10任一所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有葡萄糖糖基转移酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明的有益效果：

(1)本发明通过将积雪草转录组筛选出的鼠李糖糖基转移酶的编码基因分别连接至大肠杆菌表达载体pRSFDuet-1上，在大肠杆菌宿主BL21(DE3)△pgi进行诱导表达。以0.5μmol/LIPTG 20℃诱导20h，收集细胞，超声破碎，SDS-PAGE结果表明，筛选到的5个鼠李糖糖基转移酶均可以正常表达。

(2)本发明将积雪草转录组筛选出的5个鼠李糖糖基转移酶的编码基因以及来源于葡萄(Vitis vinifera)的鼠李糖异构酶VvRHM分别连接至大肠杆菌表达载体pRSFDuet-1上，将文献报道具有C-28位葡萄糖糖基转移酶UGT73AH1以及具有催化积雪草酸单糖苷为积雪草酸二糖苷功能的葡萄糖糖基转移酶UGT73(UGT73C7或UGT73C8)连接至大肠杆菌表达载体pETDuet-1上，转入大肠杆菌宿主BL21(DE3)△pgi中构建得到重组大肠杆菌。将重组大肠杆菌接入含有20g/L葡萄糖的TB培养基，底物积雪草酸添加终浓度为200mg/L，诱导表达24h取样检测。由质谱图可以看出，转录组筛选出来的5个鼠李糖糖基转移酶均能发挥作用，在0.596min出现唯一新峰，且与积雪草苷标准品特征离子流一致。本发明突破了现有技术的壁垒，提供了全新的积雪草苷生物合成的方法，使得积雪草苷生物合成产业化成为可能。

附图说明

图1：RRT重组大肠杆菌表达SDS-PAGE电泳结果。

图2：RRT以及VvRHM重组大肠杆菌摇瓶发酵液相结果。

图3：RRT以及VvRHM重组大肠杆菌摇瓶发酵质谱结果。

具体实施方式

(一)培养基

种子培养基(LB)：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L；固体培养基添加2％(质量分数)的琼脂粉。

摇瓶发酵培养基：葡萄糖20g/L，5g/L甘油，K₂HPO₄·3H₂O 16.4g/L，KH₂PO₄ 2.31g/L，酵母粉24g/L，蛋白胨12g/L。其中20g/L葡萄糖单独分开灭菌，在接种前混匀。

(二)PCR反应体系和扩增条件

反应体系：正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 20ng，2×PhantaMax Master Mix 25μL，双蒸水加至50μL。

扩增条件：95℃预变形3min；随后30个循环(95℃15s，55℃15s，72℃15s)，72℃继续延伸10min。

(三)大肠杆菌感受态的制备

使用CRISPR/Cas9系统对大肠杆菌BL21进行基因编辑构建大肠杆菌BL21(DE3)△pgi。敲除用的pTarget质粒均通过PCR介导的点突变技术构建，模板pTarget质粒来源于实验室保存。引物P21pgi-F和P21pgi-R用于构建pTarget-pgi质粒，PPGI-UPARM-F/R和PPGI-downARM-F/R用于构建敲除所用同源臂，具体的操作方法参考文献：Li Q,Sun B,Chen J,etal.Amodified pCas/pTargetF system for CRISPR-Cas9-assisted genome editing inEscherichia coli[J].生物化学与生物物理学报：英文版,2021,53(5):8.

P21pgi-F：

AGTTGCTGGCGCTGATTGGCATCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG CT；

P21pgi-R：

AAACGATGCCAATCAGCGCCAGCACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAG；

21-PGI-UPARM-F：cctcgtgtcaggggatccattttc；

21-PGI-UPARM-R：tgatccggcaaacaaaccaccgctggtagccacggcgcggttttcagtgc；

21-PGI-DOWNARM-F：gctaccagcggtggtttgtttgccggatcattgagcaggaatatcgtgatcagg；

21-PGIDOWNARM-R：tttacccaaaaacatttcgggcg；

以菌株BL21(DE3)△pgi为出发菌株，甘油管划线于相应的LB平板上，37℃过夜培养(12h左右)。12h后挑取扁平、圆润、长势大的菌接种于含5mL LB培养基的50mL摇瓶中，以37℃220rpm下培养约8h-10h；以体积比1％接种量转接至含50mL LB的250mL锥形瓶中；37℃，220rpm培养约2h至OD₆₀₀＝0.6～0.8；将菌液转移至50mL离心管中，冰上放置约10-15min；4000rpm，4℃离心5min去上清；加入5mL solution A重悬；4000rpm，4℃离心5min去上清；加入5mL solution B重悬菌体，以100μL/份分装，于-80℃保存。

(四)大肠杆菌的转化

于冰上解冻大肠杆菌感受态细胞；取10μL重组产物加入到100μL感受态细胞中，在冰上静置30min；于42℃水浴锅中热激45s，在冰上静置2min；加入1mL LB培养基，在37℃，220rpm下孵育60min；4000rpm离心2min，去900μL上清，用剩余培养基重悬菌体，涂布于相应抗性的平板上。

(五)积雪草苷的萃取：发酵结束后，取2ml发酵液加入同体积的甲醇，剧烈振荡混匀后，14000r/min离心10min，取上清液后用0.22μm有机相滤膜过滤后使用岛津UPLC-IT-TOF/MS进行产物检测。

(六)积雪草苷的HPLC测定：采用Thermo Fisher C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)进行色谱分离；柱温箱温度设置为40℃；进样量为10μL；流动相分别为：A相为超纯水(加入0.1％三氟乙酸)，B相为乙腈(加入0.1％三氟乙酸)；总流速为1mL/min，洗脱方式为等度洗脱，A相与B相的比例为70:30，检测器波长：210nm。

实施例1具有潜在功能的鼠李糖糖基转移酶的筛选

将积雪草转录组数据与文献中已知功能的50个不同来源的鼠李糖糖基转移酶进行BLAST比对，结果表明，有5个同工酶与文献中已知功能鼠李糖糖基转移酶基因基本同源，E值为0，同时，积雪草转录组中KEGG富集分析能够被注释为鼠李糖糖基转移酶的有5个。

表1相似度较高的鼠李糖糖基转移酶

实施例2糖基转移酶基因扩增及重组表达鼠李糖糖基转移酶大肠杆菌构建

设计用于扩增实施例1筛选出来的鼠李糖糖基转移酶序列的引物对(表2)，以积雪草反转录的cDNA为模板分别进行PCR扩增，选择Primer Star MasterMix(Takara公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，60℃，15s，72℃，1min进行；延伸72℃，5min。将PCR产物进行产物纯化得目的片段RRT1～RRT5，同时将载体pRSFDuet-1利用引物对VvRHM-F以及VvRHM-R进行PCR扩增以及产物纯化，通过Gibson组装的方法将纯化的片段RRT1～RRT5分别和载体pRSFDuet-1骨架重组得到重组载体，并转化大肠杆菌JM109。得到的载体送上海生工测序，得到测序正确的重组质粒pRSFDuet-1–RRT1～pRSFDuet-1–RRT5，分别转化大肠杆菌BL21(DE3)△pgi中获得重组大肠杆菌BL21(DE3)△pgi/pRSFDuet-1–RRT1～BL21(DE3)△pgi/pRSFDuet-1–RRT5。

设计用于扩增来源于葡萄(Vitis vinifera)的鼠李糖异构酶VvRHM的引物对(表2)，以合成序列为模板，进行PCR扩增，选择Primer Star MasterMix(Takara公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，56℃，15s，72℃，1min进行；延伸72℃，5min。将PCR产物进行产物纯化，将载体pRSFDuet-1进行PCR扩增以及产物纯化，通过Gibson组装的方法将纯化的片段VvRHM和载体pRSFDuet-1骨架重组得到重组载体，并转化大肠杆菌JM109。得到的载体送上海生工测序，比对正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)△pgi中获得重组大肠杆菌BL21(DE3)△pgi/pRSFDuet-1–VvRHM。

表2构建葡萄糖糖基转移酶表达载体所用引物

实施例3鼠李糖糖基转移酶的诱导表达

以转化有空载体pRSFDuet-1的菌株BL21(DE3)△pgi/pRSFDuet-1作为对照，将实施例2中构建完成的一系列重组大肠杆菌分别于含有卡那霉素浓度为50μg/mL的LB平板划线，37℃培养12h。挑取单菌落转接入5mL含有卡那霉素浓度为50μg/mL的LB液体培养基，37℃ 220rpm振荡培养12h。按照体积比1％的接种量转接至25mL含有卡那霉素浓度为50μg/mL的TB液体培养基，37℃ 220rpm振荡培养至OD₆₀₀值为0.6-0.8，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5μmol/L，以16℃，220rpm继续振荡培养20h。

培养结束吸取1mL菌液测定最终OD₆₀₀值。取1mL菌液以5000×g离心1min收集菌体，并用1mL 0.1M pH 7.4的PBS缓冲液重悬菌体，5000×g离心1min，洗涤菌体除去残余培养基。以0.1M pH 7.4的PBS缓冲液重悬菌体，控制最终重悬菌液OD₆₀₀值为5。使用超声破碎仪对菌体进行破碎，破碎完成后，收集破碎液，以12000×g离心2min，收集上清，即为鼠李糖糖基转移酶的粗酶液，SDS-PAGE结果见图1。

实施例4诱导重组大肠杆菌发酵生产积雪草苷

(1)构建生成积雪草苷的重组大肠杆菌

将氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的葡萄糖糖基转移酶UGT73C7连接至载体pETDuet-1的XbaI和EcoRI酶切位点之间，将氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的葡萄糖糖基转移酶UGT73AH1连接至载体pETDuet-1的NdeI和XhoI酶切位点之间，构建得到重组载体，并转化大肠杆菌JM109。得到的载体送上海生工测序，得到测序正确的重组质粒pETDuet-1-UGT73AH1-UGT73C7。

将氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示的葡萄糖糖基转移酶UGT73C8连接至载体pETDuet-1的XbaI和EcoRI酶切位点之间，将氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的葡萄糖糖基转移酶UGT73AH1连接至载体pETDuet-1的NdeI和XhoI酶切位点之间，构建得到重组载体，并转化大肠杆菌JM109。得到的载体送上海生工测序，得到测序正确的重组质粒pETDuet-1-UGT73AH1-UGT73C8。

将重组质粒pETDuet-1-UGT73AH1-UGT73C7或pETDuet-1-UGT73AH1-UGT73C8转化至实施例2中构建的一系列重组大肠杆菌，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)△pgi/pRSFDuet-1–RRT1/pETDuet-1-UGT73AH1-UGT73C7～BL21 (DE3)△pgi/pRSFDuet-1–RRT5/pETDuet-1-UGT73AH1-UGT73C7 ， BL21 (DE3)△pgi/pRSFDuet-1–RRT1/pETDuet-1-UGT73AH1-UGT73C8～BL21 (DE3)△pgi/pRSFDuet-1–RRT5/pETDuet-1-UGT73AH1-UGT73C8 、 BL21 (DE3)△pgi/pRSFDuet-1-VvRHM-RRT/pETDuet-1-UGT73AH1-UGT73C7、BL21(DE3)△pgi/pRSFDuet-1-VvRHM-RRT/pETDuet-1-UGT73AH1-UGT73C8。

(2)摇瓶发酵生产积雪草苷

以转化有空载体pRSFDuet-1和pETDuet-1的BL21(DE3)△pgi/pRSFDuet-1/pETDuet-1作为对照菌株，将步骤(1)中构建完成的一系列重组大肠杆菌分别于含有卡那霉素浓度为50μg/mL、氨苄浓度为50μg/mL的LB平板划线，37℃培养12h。挑取单菌落转接入5mL含有卡那霉素浓度为50μg/mL、氨苄浓度为50μg/mL的LB液体培养基，37℃ 220rpm振荡培养12h。按照体积比1％的接种量转接至25mL含有卡那霉素浓度为50μg/mL、氨苄浓度为50μg/mL的TB液体培养基，37℃ 220rpm振荡培养至OD₆₀₀值为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.5μmol/L，6h后加入终浓度为200mg/L底物积雪草酸，以30℃，220rpm继续振荡培养48h，24h取样检测。

发酵结束后，取2ml发酵液加入同体积的甲醇，剧烈振荡混匀后，14000r/min离心10min，取上清液后用0.22μm有机相滤膜过滤后使用岛津UPLC-IT-TOF/MS进行产物检测。由质谱图2、3可以看出，UGT73AH1、葡萄糖糖基转移酶(UGT73C7或UGT73C8)分别与实施例1筛选到的5个鼠李糖糖基转移酶共表达均能发酵制备得到积雪草苷，在0.596min出现唯一新峰，且与积雪草苷标准品特征离子流一致，确定该物质为积雪草苷。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，过表达鼠李糖糖基转移酶，过表达葡萄糖糖基转移酶和糖基转移酶UGT73AH1；

所述鼠李糖糖基转移酶如下(a)或(b)：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.10任一所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有葡萄糖糖基转移酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述葡萄糖糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；所述糖基转移酶UGT73AH1来源于积雪草Centella asiatica(L.)Urban。

3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌还敲除基因组上葡萄糖磷酸异构酶蛋白编码基因pgi。

4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述葡萄糖磷酸异构酶蛋白编码基因pgi的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

5.根据权利要求1～4任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，利用pRSFDuet-1载体表达鼠李糖糖基转移酶，利用pETDuet-1载体共表达葡萄糖糖基转移酶和糖基转移酶UGT73AH1。

6.根据权利要求1～5任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。

7.一种合成积雪草苷的方法，其特征在于，所述方法为以权利要求1～6任一所述重组大肠杆菌为出发菌株，以积雪草酸为底物发酵生产积雪草苷。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1～6任一所述重组大肠杆菌的种子液接种于发酵培养基中，振荡培养至OD₆₀₀值为0.6-0.8，加入异丙基硫代半乳糖苷，4～8h后加入终浓度150～250mg/L积雪草酸，继续振荡培养40～60h。

9.权利要求1～6任一所述重组大肠杆菌在合成积雪草苷或含有积雪草苷的产品中的应用。

10.鼠李糖糖基转移酶在合成积雪草苷或含有积雪草苷的产品中的应用，其特征在于，所述鼠李糖糖基转移酶如下(a)或(b)：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.10任一所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有葡萄糖糖基转移酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

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