CN112458065A - 水飞蓟来源黄酮3-羟化酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了水飞蓟来源黄酮3‑羟化酶及其应用，属于基因和代谢工程领域。本发明扩增了潜在的水飞蓟来源的SmF3H，通过催化反应，证明了SmF3H具有黄酮3‑羟化酶功能，且催化效果较常用的SlF3H催化产黄杉素能力高20.9％。随后利用不同强度的启动子，对SmF3H的表达水平进行优化，使得圣草酚产量进一步提升，将所获得菌株在250mL摇瓶水平进行黄杉素的生产，黄杉素产量较已报道的最高产量提高了106.6％。将菌株在5L发酵罐中进一步优化黄杉素发酵条件，最终得到3.54g·L^‑1的产量，是目前可见报道的最高产量，是之前已报道最高产量的10.5倍。

Description

水飞蓟来源黄酮3-羟化酶及其应用

技术领域

本发明涉及水飞蓟来源黄酮3-羟化酶及其应用，属于基因和代谢工程领域。

背景技术

在植物中，黄杉素是以圣草酚为前体经过黄酮3-羟化酶(F3H)的催化获得的。微生物法合成黄杉素的产量依然较低，如在酿酒酵母和解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica)中从头合成黄杉素的产量分别达到336.8mg·L^-1(Yang,J.et al.,Green production ofsilybin and isosilybin by merging metabolic engineering approaches andenzymatic catalysis.2020,Metab Eng 59,44-52)和110.5mg·L^-1(Lv,Y.et al.,Optimizing oleaginous yeast cell factories for flavonoids and hydroxylatedflavonoids biosynthesis.2019,ACS Synth Biol 8(11),2514–2523)。如果直接添加黄杉素作为前体，可以催化生成水飞蓟宾的产量高达2.58g·L^-1(Lv,Y.et al.,Engineeringenzymatic cascades for the efficient biotransformation of eugenol andtaxifolin to silybin and isosilybin.2019,Green Chem 21(7),1660–1667)。可见，在微生物中，黄杉素的产量较低，严重限制下游高附加值植物天然产物的合成。

发明内容

黄杉素价格较高，一般在微生物中合成黄杉素是从柚皮素出发，经过黄酮3β-羟化酶(F3′H)及其还原酶(CPR)催化生成圣草酚，再经过黄酮3-羟化酶催化获得黄杉素。但是还没有催化效率很好的黄酮3-羟化酶(F3H)，这限制了柚皮素在生产黄杉素中的应用。

本发明提供了一种黄酮3-羟化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了编码所述的黄酮3-羟化酶的核苷酸序列，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明提供了携带所述核苷酸序列的表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体以pY26-TEF-GPD为出发载体。

在本发明的一种实施方式中，利用启动子PGK1、TPI1、GAL7、ACS2或LEU2启动黄酮3-羟化酶的表达。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子为PGK1、TPI1或GAL7。

本发明提供了表达所述的黄酮3-羟化酶，或携带所述表达载体的微生物细胞。

本发明提供了一种微生物细胞，在所述表达所述的黄酮3-羟化酶，或携带所述表达载体微生物细胞中表达黄酮3β-羟化酶和黄酮3β-羟化酶的辅酶。

在本发明的一种实施方式中，所述黄酮3β-羟化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

在本发明的一种实施方式中，所述黄酮3β-羟化酶的的辅酶的核苷酸序列如SEQID NO.12所示。

在本发明的一种实施方式中，以酿酒酵母为宿主。

在本发明的一种实施方式中，以酿酒酵母C800为宿主，酿酒酵母C800记载于文献Gao,S.,et al.,Promoter-library-based pathway optimization for efficient(2S)-naringenin production from p-coumaric acid in Saccharomyces cerevisiae.JAgric Food Chem,2020.68(25):p.6884-6891中。

本发明提供了一种生产黄杉素的方法，其特征在于，以圣草酚为底物，以所述的黄酮3-羟化酶为催化剂，或加入表达所述的黄酮3-羟化酶、或携带所述表达载体的微生物细胞。

本发明提供了一种全细胞生产黄杉素的方法，其特征在于，以柚皮素为底物，将所述表达黄酮3β-羟化酶和黄酮3β-羟化酶的辅酶的微生物细胞加入反应体系中，转化生产黄杉素。

在本发明的一种实施方式中，将微生物细胞在25-35℃，200-250rpm培养16-18h，获得种子培养基以1-3mL/100mL的量加入反应体系中。

在本发明的一种实施方式中，在反应过程中流加培养基A和培养基B；培养基A中含有葡萄糖、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、K₂SO₄、Na₂SO₄、金属盐、维生素、氨基酸；培养基B中含有柚皮素。

在本发明的一种实施方式中，培养基A的流加速度为1.3-3.1mL·h^-1，培养基B的流加速度为2.5-6.3mL·h^-1。

在本发明的一种实施方式中，反应体系中含有碳酸钙。

在本发明的一种实施方式中，碳酸钙浓度为5-10g·L^-1。

本发明提供了所述黄酮3-羟化酶，或所述微生物细胞在生产黄杉素中的应用。

本发明的有益效果：从水飞蓟中鉴定得到一个具有黄酮3-羟化酶功能且催化性能较好的SmF3H，较常用的SlF3H，在相同培养条件下可使圣草酚产量增加20.9％。再经过启动子优化获得的最佳启动子组合可以进一步有效提高SmF3H的催化能力，显著提高了黄杉素的产量，在205mL摇瓶中达到695.9mg/L，较已报道的最高产量336.8mg/L，增产106.6％。将菌株在5L发酵罐中进一步优化黄杉素发酵条件，最终得到3.54g·L^-1的产量，是目前可见报道的最高产量，是之前已报道最高产量的10.5倍。本发明所获得的高产黄杉素菌株的获得对于推动高产圣草酚在工业中的应用具有重要意义。

附图说明

图1为柚皮素经过SmF3′H/SmCPR/SmF3H催化产黄杉素示意图；

图2为水飞蓟来源SmF3H催化功能鉴定及产黄杉素能力验证；

图3为启动子优化表达SmF3H黄杉素产量图；

图4为最佳启动子组合菌株在5L发酵罐生产黄杉素动态变化图。

具体实施方式

(1)RNA提取试剂盒购自赛默飞公司。

(2)T载体：pMD19-T。

(3)YNB培养基：0.72g/L酵母氮源基础培养基、20g/L葡萄糖、50mg/L亮氨酸、50mg/L色氨酸、50mg/L组氨酸。

固体培养基中添加2g/L的琼脂粉。

(4)YPD培养基：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖。

(5)用于5L发酵罐的流加培养基A：葡萄糖400g·L^-1，KH₂PO₄ 18g·L^-1，MgSO₄·7H₂O10.24g·L^-1，K₂SO₄ 7g·L^-1，Na₂SO₄ 0.56g·L^-1，金属盐母液20mL·L^-1，维生素母液24mL·L^-1，添加组氨酸、亮氨酸、色氨酸各1g·L^-1。

金属盐母液：ZnSO₄·7H₂O 5.75g·L^-1，MnCl₂·4H₂O 0.32g·L^-1，CoCl₂·6H₂O0.47g·L^-1，NaMoO₄·2H₂O 0.48g·L^-1，CaCl₂·2H₂O 2.9g·L^-1，FeSO₄·7H₂O 2.8g·L^-1，80mL的0.5M EDTA(pH 8.0)。

维生素母液：生物素(Biotin)0.05g·L^-1，泛酸钙(Calcium pantothenate)1g·L^-1，烟酸(Nicotinic acid)1g·L^-1，myo-肌醇(myo-Inositol)25g·L^-1，盐酸硫胺素(Thiamine HCl)1g·L^-1，盐酸吡哆醛(Pyridoxal HCl)1g·L^-1，p-氨基苯甲酸(p-Aminobenzoic acid)0.02g·L^-1。

(6)流加培养基B为柚皮素浓度为50g·L^-1的95％乙醇溶液，超声波助溶后过滤除菌备用。

(7)检测方法：

取100μL的发酵液添加900μL甲醇，涡旋震荡30s混合后，13500rpm离心5min，取上清液过滤后备用检测。样品使用安捷伦高效液相检测(Agilent 1100，US)，C18反相色谱柱(4.6mm×250mm,Thermo)，柱温25℃。流动相为甲醇：水(41:59)并添加3‰的磷酸。流速1mL/min，进样量10μL，检测波长为290nm。

(8)pY26-P05mut12构建方法：

使用引物mut-F和mut-R环化扩增原始质粒pY26-TEF-GPD，再经过自连接获得caaggtttataa，在质粒pY26-TEF-GPD-mut引入新的酶切位点PmlI，构建得到pY26-TEF-GPD-mut用于后续构建质粒。

使用BamHI和PmlI内切酶分别酶切pMD-T-SmF3′H和pY26-TEF-GPD-mut，将酶切后的片段分别回收并进行连接获得pY26-GR。使用NotI和PacI内切酶分别酶切pMD-T-SmCPR和pY26-GR，将酶切后的片段进行回收并进行连接获得pY26-THGR。

将包含上述启动子P_INO1(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)和P_TDH1(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)的质粒pMD19T-PINO1和pMD19T-PTDH1(质粒具体的构建见文献Gao,S.,et al.,Promoter-library-based pathway optimization for efficient(2S)-naringenin production from p-coumaric acid in Saccharomyces cerevisiae.JAgric Food Chem,2020.68(25):p.6884-6891.)上扩增启动子序列。

使用引物PINO1-homo-F和PINO1-homo-R和从质粒pMD19T-PINO1扩增下启动子序列P_INO1；

使用引物PTDH1-homo-F和PTDH1-homo-R和从质粒pMD19T-PTDH1扩增下启动子序列P_TDH1；

使用引物pY26-THGR-homo-F和pY26-THGR-homo-R从质粒pY26-THGR上扩增载体骨架(包含基因SmF3′H和SmCPR，但是不包含启动子P_TEF1和P_GPD1；基因SmF3′H(黄酮3β-羟化酶)和SmCPR(黄酮3β-羟化酶的辅酶)对应的碱基序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)；

将载体骨架、扩增的启动子P_INO1片段和扩增的启动子P_TDH1片段使用胶回收方式进行回收，然后将三种产物混合至50μL(启动子PINO1：启动子组PTDH1：载体骨架＝2：2：1，mol/mol/mol，总计约2-3μg)，将混合的体系通过醋酸锂高效转化法(具体转化方法参见文献：Gietz,R.D.and R.A.Woods,Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.Methods Enzymol,2002.350:p.87–96.)转化到酿酒酵母菌株C800中，片段会在酿酒酵母体内完成组装，将转化体系涂布在YNB琼脂平板上，将琼脂板在30℃下孵育3-4天，待长出单菌落后，挑取单菌落并进行测序，测序正确的即为阳性转化子，利用酵母质粒提取试剂盒(购自赛默飞公司)提取质粒，即得到载体pY26-P05(pY26-P_INO1-SmF3′H-P_TDH1-SmCPR)。

将质粒pY26-P05中的SmF3′H第285位氨基酸突变为天冬酰胺、并将SmCPR第453位氨基酸突变为缬氨酸的到质粒pY26-P05mut12(pY26-P_INO1-SmF3′H^D285N-P_TDH1-SmCPR^I453V)。

表1菌株和质粒的基因型

表2所用引物序列

实施例1：扩增和鉴定SmF3H

使用试剂盒从水飞蓟花蕊中提取总RNA、逆转录获得cDNA。使用引物F3H-F和F3H-R扩增黄酮3-羟化酶(长度为1 321bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，将获得的基因命名为SmF3H，并将扩增得到的序列插入到T(pMD19-T-Simple)载体中，获得pMD-T-SmF3H。含有常用F3H基因的质粒pUC57-SlF3H(在载体pUC57上连接SlF3H，SlF3H基因的GeneID:100736482)。

以pMD-T-SmF3H，pMD-T-GAL7和T载体为模板，使用引物SmF3H-homo1-F和SmF3H-homo1-R(pMD-T-SmF3H)、PGAL7-homo1-F和PGAL7-homo1-R(pMD-T-GAL7)、pMD-homo1-F和pMD-homo1-R(T载体)分别扩增SmF3H、启动子P_GAL7、并线性化T载体，分别获得SmF3H基因片段、启动子P_GAL7片段和T载体片段，将得SmF3H基因片段、启动子P_GAL7片段和T载体片段经过Gibson组装后获得pMD-G7SmF3H。

同理，以pUC57-SlF3H、pMD-T-GAL7和T载体为模板，使用引物SlF3H-homo2-F和SlF3H-homo2-R(pUC57-SlF3H)、PGAL7-homo2-F和PGAL7-homo2-R(pMD-T-GAL7)、pMD-homo2-F和pMD-homo2-R(T载体)分扩增获得SlF3H基因片段、启动子P_GAL7片段和T载体片段，将上述片段经过Gibson组装后获得pMD-G7SlF3H。

使用引物mut-F和mut-R环化扩增原始质粒pY26-TEF-GPF，再经过自连接获得caaggtttataa，在质粒pY26-TEF-GPD-mut引入新的酶切位点PmlI，用于后续构建质粒。

对已报道的基因GhF3′H(GenBank ID：ABA64468.1)和CrCPR(GenBank ID：KM111538.1)进行化学合成，分别连接至T载体上进行保存，分别为pUC57-GhF3′H和pUC57-CrCPR。使用BamHI和PmlI内切酶分别酶切pMD-T-SmF3′H和pY26-TEF-GPD-mut，将酶切后的片段分别回收并进行连接获得pY26-GR。使用NotI和PacI内切酶分别酶切pMD-T-SmCPR和pY26-GR，将酶切后的片段进行回收并进行连接获得pY26-THGR。同理使用BamHI和BspDI内切酶酶切pUC57-GhF3′H和pY26-TEF-GPD，将酶切后的片段进行回收并连接获得pY26-GR2。使用NotI和PacI内切酶分别酶切pUC57-CrCPR和pY26-GR2，将酶切后的片段进行回收并连接后获得pY26-THGR2。

使用BsiWI和PacI限制性内切酶分别从pMD-G7SmF3H和pMD-G7SlF3H上酶切下基因表达框P_GAL7-SlF3H和P_GAL7-SmF3H，同时使用BsiWI和PacI限制性内切酶处理质粒pY26-THGR和pY26-THGR2，回收长的片段。将酶切将得到的片段P_GAL7-SlF3H连接到pY26-THGR的BsiWI/PacI酶切位点；将酶切得到的片段P_GAL7-SmF3H连接到pY26-THGR2的BsiWI/PacI酶切位点，依次获得pY26-THGRGF和pY26-THGRGF2。将pY26-THGRGF和pY26-THGRGF2分别转化到菌株C800中，得到菌株C800THGRGF和C800THGRGF2。

实施例2：基于启动子对SmF3H进行表达水平优化

从已报道的启动子库(公开于Gao,S.,et al.,Promoter-library-based pathwayoptimization for efficient(2S)-naringenin production from p-coumaric acid inSaccharomyces cerevisiae.J Agric Food Chem,2020.68(25):p.6884-6891)中选择6个梯度强度启动子起始表达SmF3H，选取的启动子为启动子P_PGK1、P_TPI1、P_ACS2、P_GAL7、P_LEU2和P_ARO7(启动子核苷酸序列依次如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.8所示)。

(1)首先在T载体上构建SmF3H与不同启动子融合的表达框：

以pMD-G7SmF3H和pMDT-PGK1、pMDT-TPI1、pMDT-ACS2、pMDT-GAL7、pMDT-LEU2和pMDT-ARO7(pMDT-PGK1、pMDT-TPI1、pMDT-ACS2、pMDT-GAL7、pMDT-LEU2和pMDT-ARO7载体的构建方法记载于文献Gao,S.,et al.,Promoter-library-based pathway optimizationfor efficient(2S)-naringenin production from p-coumaric acid in Saccharomycescerevisiae.J Agric Food Chem,2020.68(25):p.6884-6891中)为模板，使用SmF3H-homo3-F和SmF3H-homo3-R将pMD-T-SmF3H线性化；使用PGK1-homo3-F和PGK1-homo3-R(以pMDT-PGK1为模板)、TPI1-homo3-F和TPI1-homo3-R(以pMDT-TPI1为模板)、ACS2-homo3-F和ACS2-homo3-R(以pMDT-ACS2为模板)、GAL7-homo3-F和GAL7-homo3-R(以pMDT-GAL7为模板)、LEU2-homo3-F和LEU2-homo3-R(以pMDT-LEU2为模板)和ARO7-homo3-F和ARO7-homo3-R(以pMDT-ARO7为模板)，得到启动子P_PGK1、P_TPI1、P_ACS2、P_GAL7、P_LEU2和P_ARO7。将获得启动子和线性化的载体经过Gibson分别组装得到pMD-P1SmF3H、pMD-P2SmF3H、pMD-P3SmF3H、pMD-P4SmF3H、pMD-P5SmF3H和pMD-P6SmF3H。

(2)构建得到的载体测序正确后，以pMD-P1SmF3H、pMD-P2SmF3H、pMD-P3SmF3H、pMD-P4SmF3H、pMD-P5SmF3H和pMD-P6SmF3H质粒为模板，使用PGK1-homo4-F和SmF3H-homo4-R(以pMD-P1SmF3H为模板)、TPI1-homo4-F和SmF3H-homo4-R(以pMD-P2SmF3H为模板)、ACS2-homo4-F和SmF3H-homo4-R(以pMD-P3SmF3H为模板)、GAL7-homo4-F/SmF3H-homo4-R(以pMD-P4SmF3H为模板)、LEU2-homo4-F和SmF3H-homo4-R(以pMD-P5SmF3H为模板)和ARO7-homo4-F和SmF3H-homo4-R(以pMD-P6SmF3H为模板)扩增对应SmF3H的表达框；以pY26-P05mut12为模板，分别使用P51-homo4-F和P51-homo4-R、P52-homo4-F和P51-homo4-R、P53-homo4-F和P51-homo4-R、P54-homo4-F和P51-homo4-R、P55-homo4-F和P51-homo4-R和P56-homo4-F和P51-homo4-R将pY26-P05mut12线性化；将不同的SmF3H表达框(分别含有P_PGK1、P_TPI1、P_ACS2、P_GAL7、P_LEU2和P_ARO7启动子的表达框)经Gibson组装技术组装到线性化化后的pY26-P05mut12上，依次获得pY26-P5m1、pY26-P5m2、pY26-P5m3、pY26-P5m4、pY26-P5m5和pY26-P5m6。

(3)测序正确后将pY26-P5m1、pY26-P5m2、pY26-P5m3、pY26-P5m4、pY26-P5m5和pY26-P5m6这六个质粒转化到菌株C800中获得菌株C800P5m1、C800P5m2、C800P5m3、C800P5m4、C800P5m5、C800P5m6。

实施例3：高产黄杉素菌株的发酵培养

1、重组菌的培养发酵

(1)实施例1中构建得到的菌株C800THGRGF和C800THGRGF2在250mL摇瓶中发酵条件：挑取至少10个单菌落接种在含有20mL YNB液体培养基的250mL摇瓶中，30℃，220rpm培养16-18h，获得种子培养基；

将种子培养基以2mL/100mL转接到含有20mL新鲜YNB液体培养基的250mL摇瓶中，培养基中含有250mg·L^-1柚皮素，30℃，220rpm培养72小时后检测黄杉素及中间产物圣草酚的产量。

用于验证SmF3H基因功能的菌株C800THGRGF和菌株C800THGRGF2在YNB培养基中进行发酵验证，发酵液中添加250mg·L^-1的柚皮素为前体。菌株C800THGRGF可以合成16.69mg·L^-1的黄杉素，同时积累9.85mg·L^-1的圣草酚。而菌株C800THGRGF2可以合成6.48mg·L^-1的圣草酚，而圣草酚没有积累。两株菌的柚皮素消耗都很低。经过检测，菌株C800THGRGF和C800THGRGF2菌体OD₆₀₀在3-4之间，较常规培养下OD₆₀₀在6-8之间相比，菌体生长受到抑制，经过检测培养基的pH在1.5-2.0之间，较常规培养下pH维持在5-6之间相比，下降显著，可能由于pH的影响，导致了菌体生长受到抑制，而且在较低pH下可能导致酶活受到影响，从而导致产量有较大误差。因此在培养基中添加浓度为10g·L^-1的碳酸钙控制pH，进行发酵验证，相同培养条件下，发酵结束时，培养基的pH维持在4-4.5之间，此时菌体的生长得到改善，OD₆₀₀维持在5-6之间。在控制pH条件下，菌株C800THGRGF可以合成73.38mg·L^-1的黄杉素，同时积累37.33mg·L^-1的圣草酚。而菌株C800THGRGF2可以合成60.68mg·L^-1的圣草酚，积累32.02mg·L^-1的圣草酚。底物柚皮素的消耗较不控制pH时有了明显提高(图3)。经过发酵检验，从水飞蓟中分离的酶具有黄酮3-羟化酶SmF3H作用，并且SmF3H较SlF3H的催化活性更高(图2)。

(2)菌株C800P5m1、C800P5m2、C800P5m3、C800P5m4、C800P5m5、C800P5m6在250mL摇瓶中发酵条件：种子培养基同菌株C800THGRGF，将种子培养基以2mL/100mL转接到含有20mL新鲜YPD液体培养基的250mL摇瓶中，在第0、12、24和36h时，分别向培养基中添加250mg·L^-1柚皮素。30℃，220rpm培养72h后，检测黄杉素和中间产物圣草酚的产量。

挑选菌株C800P5m4在5L发酵罐发酵优化：种子培养基同C800P5m1，按照2mL/100mL转接到含有2.5L新鲜YPD培养基的5L发酵罐中。在第0和12h时补加250mg/L的柚皮素。在葡萄糖浓度为0g·L^-1时(一般在第12～15h之间)开始流加培养基A和流加培养基B，设定流速分别为1.3mL·h^-1和2.5mL·h^-1；1.9mL·h^-1和3.8mL·h^-1；3.1mL·h^-1和6.3mL·h^-1。根据起始流加时间不同，总计添加的柚皮素总量分别为2.50、3.50和5.50g·L^-1时，停止流加培养基。每3h取样检测OD₆₀₀、柚皮素、圣草酚、黄杉素的产量。

菌株C800P5m1、C800P5m2、C800P5m3、C800P5m4、C800P5m5、C800P5m6积累的黄杉素依次为534.36、474.98、361.39、695.90、367.00和213.31mg·L^-1。中间代谢产物圣草酚的积累量依次为414.76、585.68、569.42、334.30、592.58和693.87mg·L^-1。前体柚皮素的剩余量依次为76.41、57.94、108.10、67.33、153.00和160.99mg·L^-1。总体看来，随着启动子强度的增强，黄杉素的积累也随之增加，其中黄杉素积累量最高时，SmF3H是由P_GAL7起始转录的(菌株C800P5m4)(图3)。

将菌株C800P5m4在5L发酵罐水平进行补料速度的优化。当流加培养A和B的流加速度分别控制在1.3mL·h^-1和2.5mL·h^-1时，菌株OD₆₀₀最高达到179.17，黄杉素的最高产量达到1.60g·L^-1，中间产物圣草酚的积累为0.32g·L^-1，而柚皮素剩余约0.55g·L^-1。黄杉素的摩尔转化率约为57.3％(图4A)。当培养A和B的流加速度分别控制在1.9mL·h^-1和3.8mL·h^-1时，菌株OD₆₀₀最高达到235.18，黄杉素的最高产量达到2.28g·L^-1，中间产物圣草酚的积累为0.92g·L^-1，而柚皮素剩余约0.40g·L^-1，黄杉素的摩尔转化率约为58.4％(图4B)。当培养A和B的流加速度分别控制在3.1mL·h^-1和6.3mL·h^-1时，菌株OD₆₀₀最高达到159.60，黄杉素的最高产量达到3.54g·L^-1，中间产物圣草酚的积累为0.30g·L^-1，而柚皮素剩余约2.33g·L^-1，黄杉素的摩尔转化率约为57.6％(图4C)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 水飞蓟来源黄酮3-羟化酶及其应用

<130> BAA201248A

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1035

<212> DNA

<213> Silybum marianum

<400> 1

atgcttgaaa acaggttcgt tcgcgatgaa gacgagcgtc caaaagtggc gtacaataat 60

tttagcaacg agattccggt gatctcactt gaaggtatcg acgatactag tagtagggcg 120

gagatttgcg agaagatcgt taaggcttgt gaagattggg gggtttttca ggtggtggat 180

cacgggatcg ataatagatt gttgacggag atgacgaggc tcgccacgga gttcttcatg 240

atgccgccgg aggagaaact ccgatttgat atgagtggcg ggaaaaaagg cggtttcatt 300

gtttccagcc atcttcaagg agaaacggtg caagattgga gggagattgt aaccttcttc 360

tcgtacccaa caaaagcaag agactactct aggtggcccg ataagcccaa agagtggagg 420

gcagttactg aggaatatag caaggtgtta atgggcctgg cctgcaagct actagaggta 480

ttgtctgagg caatgggcct tgagaaagag gccttgacca aagcttgtgt agatatggac 540

caaaaggtgg tggtcaatta ctatccaaaa tgccctcatc ccgacctcac gttgggcctg 600

aaacgacata cggatccggg aacaatcacg ttgttgcttc aggaccaagt tggtgggctt 660

caggcgactc gtgatggtgg tcaaagttgg atcacagttc agccgattga aggtgctttt 720

gtggttaatc ttggtgatca tggacattat ttgagcaacg ggaggttcaa gaacgcagac 780

caccaagccg tggtgaactc aaacacgagc cgactctcca tagctacgtt tcaaaaccct 840

gcaccggatg cgattgtata cccgctgaaa gtgaatgagg gagataaatc gataatggaa 900

gaagctataa ctttcatgga gatgtacaag aagaagatgg gtcgagacct tgagttggct 960

cggcttaaga agctagccaa ggacaagcaa caagatttgg agaaagagaa gccaatcgag 1020

aatatatttg cttag 1035

<210> 2

<211> 344

<212> PRT

<213> Silybum marianum

<400> 2

Met Leu Glu Asn Arg Phe Val Arg Asp Glu Asp Glu Arg Pro Lys Val

1 5 10 15

Ala Tyr Asn Asn Phe Ser Asn Glu Ile Pro Val Ile Ser Leu Glu Gly

20 25 30

Ile Asp Asp Thr Ser Ser Arg Ala Glu Ile Cys Glu Lys Ile Val Lys

35 40 45

Ala Cys Glu Asp Trp Gly Val Phe Gln Val Val Asp His Gly Ile Asp

50 55 60

Asn Arg Leu Leu Thr Glu Met Thr Arg Leu Ala Thr Glu Phe Phe Met

65 70 75 80

Met Pro Pro Glu Glu Lys Leu Arg Phe Asp Met Ser Gly Gly Lys Lys

85 90 95

Gly Gly Phe Ile Val Ser Ser His Leu Gln Gly Glu Thr Val Gln Asp

100 105 110

Trp Arg Glu Ile Val Thr Phe Phe Ser Tyr Pro Thr Lys Ala Arg Asp

115 120 125

Tyr Ser Arg Trp Pro Asp Lys Pro Lys Glu Trp Arg Ala Val Thr Glu

130 135 140

Glu Tyr Ser Lys Val Leu Met Gly Leu Ala Cys Lys Leu Leu Glu Val

145 150 155 160

Leu Ser Glu Ala Met Gly Leu Glu Lys Glu Ala Leu Thr Lys Ala Cys

165 170 175

Val Asp Met Asp Gln Lys Val Val Val Asn Tyr Tyr Pro Lys Cys Pro

180 185 190

His Pro Asp Leu Thr Leu Gly Leu Lys Arg His Thr Asp Pro Gly Thr

195 200 205

Ile Thr Leu Leu Leu Gln Asp Gln Val Gly Gly Leu Gln Ala Thr Arg

210 215 220

Asp Gly Gly Gln Ser Trp Ile Thr Val Gln Pro Ile Glu Gly Ala Phe

225 230 235 240

Val Val Asn Leu Gly Asp His Gly His Tyr Leu Ser Asn Gly Arg Phe

245 250 255

Lys Asn Ala Asp His Gln Ala Val Val Asn Ser Asn Thr Ser Arg Leu

260 265 270

Ser Ile Ala Thr Phe Gln Asn Pro Ala Pro Asp Ala Ile Val Tyr Pro

275 280 285

Leu Lys Val Asn Glu Gly Asp Lys Ser Ile Met Glu Glu Ala Ile Thr

290 295 300

Phe Met Glu Met Tyr Lys Lys Lys Met Gly Arg Asp Leu Glu Leu Ala

305 310 315 320

Arg Leu Lys Lys Leu Ala Lys Asp Lys Gln Gln Asp Leu Glu Lys Glu

325 330 335

Lys Pro Ile Glu Asn Ile Phe Ala

340

<210> 3

<211> 700

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc 240

tcgacttcct gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag 300

cgacggctca caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt 360

agtaccacat gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg 420

ttactctctc tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca 480

cacactcttt tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac 540

atttacatat atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt 600

tctaattcgt agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc 660

aaggaagtaa ttatctactt tttacaacaa atataaaaca 700

<210> 4

<211> 623

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acccaaatgg actgattgtg agggagacct aactacatag tgtttaaaga ttacggatat 60

ttaacttact tagaataatg ccattttttt gagttataat aatcctacgt tagtgtgagc 120

gggatttaaa ctgtgaggac cttaatacat tcagacactt ctgcggtatc accctactta 180

ttcccttcga gattatatct aggaacccat caggttggtg gaagattacc cgttctaaga 240

cttttcagct tcctctattg atgttacacc tggacacccc ttttctggca tccagttttt 300

aatcttcagt ggcatgtgag attctccgaa attaattaaa gcaatcacac aattctctcg 360

gataccacct cggttgaaac tgacaggtgg tttgttacgc atgctaatgc aaaggagcct 420

atataccttt ggctcggctg ctgtaacagg gaatataaag ggcagcataa tttaggagtt 480

tagtgaactt gcaacattta ctattttccc ttcttacgta aatatttttc tttttaattc 540

taaatcaatc tttttcaatt ttttgtttgt attcttttct tgcttaaatc tataactaca 600

aaaaacacat acataaacta aaa 623

<210> 5

<211> 553

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

accttcagta atggcgccat cctctcggga aacacaataa ctggcaagat agtttcagtg 60

aataattacg aaagagaggg cactgatcgc aacgaattgg cgcgattgca agaattgatc 120

tccctcatcg atgtcataaa tcagtaaata taaacattaa atacattaca cgtagccacc 180

cgctgtatag cataaaacta acttaaaatt attcatatgc gtttcccggg gccgaagcgt 240

tattgccgat attcggtagc cgattccgct ggcttttttt ttttgaacga ggcaaaaaag 300

tttcgtgact gaacttcttc gtcactggtt ttgttgataa tttttatcgt tttttacttc 360

gagattgaaa acagtgttct gaattttagc aacgatatcg caccgcacgt ttagcctgat 420

caaaccttat atatacctct accttaaaat atatatatat atagtattcg aattccgaat 480

tgtgtgtctc cgcggttagt gattgttata cacaaacaga atacaggaaa gtaaatcaat 540

acaataataa aat 553

<210> 6

<211> 725

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tttgccagct tactatcctt cttgaaaata tgcactctat atcttttagt tcttaattgc 60

aacacataga tttgctgtat aacgaatttt atgctatttt ttaaatttgg agttcagtga 120

taaaagtgtc acagcgaatt tcctcacatg tagggaccga attgtttaca agttctctgt 180

accaccatgg agacatcaaa aattgaaaat ctatggaaag atatggacgg tagcaacaag 240

aatatagcac gagccgcgga gttcatttcg ttacttttga tatcactcac aactattgcg 300

aagcgcttca gtgaaaaaat cataaggaaa agttgtaaat attattggta gtattcgttt 360

ggtaaagtag agggggtaat ttttcccctt tattttgttc atacattctt aaattgcttt 420

gcctctcctt ttggaaagct atacttcgga gcactgttga gcgaaggctc attagatata 480

ttttctgtca ttttccttaa cccaaaaata agggaaaggg tccaaaaagc gctcggacaa 540

ctgttgaccg tgatccgaag gactggctat acagtgttca caaaatagcc aagctgaaaa 600

taatgtgtag ctatgttcag ttagtttggc tagcaaagat ataaaagcag gtcggaaata 660

tttatgggca ttattatgca gagcatcaac atgataaaaa aaaacagttg aatattccct 720

caaaa 725

<210> 7

<211> 510

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaagacgatg aggccggtgc cgatgtgccc ttgatggaca acaaacaaca gctctcttcc 60

ggccgtactt agtgatcgga acgagctctt tatcaccgta gttctaaata acacatagag 120

taaattattg cctttttctt cgttcctttt gttcttcacg tcctttttat gaaatacgtg 180

ccggtgttcc ggggttggat gcggaatcga aagtgttgaa tgtgaaatat gcggaggcca 240

agtatgcgct tcggcggcta aatgcggcat gtgaaaagta ttgtctattt tatcttcatc 300

cttctttccc agaatattga acttatttaa ttcacatgga gcagagaaag cgcacctctg 360

cgttggcggc aatgttaatt tgagacgtat ataaattgga gctttcgtca cctttttttg 420

gcttgttctg ttgtcgggtt cctaatgtta gttttatcct tgatttattc tgtttcattc 480

cctttttttt ccagtgaaaa agaagtaaca 510

<210> 8

<211> 530

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaaaccacac cgtggggcct tgttgcgcta ggaataggat atgcgacgaa gacgcttctg 60

cttagtaacc acaccacatt ttcagggggt cgatctgctt gcttccttta ctgtcacgag 120

cggcccataa tcgcgctttt tttttaaaag gcgcgagaca gcaaacagga agctcgggtt 180

tcaaccttcg gagtggtcgc agatctggag actggatctt tacaatacag taaggcaagc 240

caccatctgc ttcttaggtg catgcgacgg tatccacgtg cagaacaaca tagtctgaag 300

aaggggggga ggagcatgtt cattctctgt agcagtaaga gcttggtgat aatgaccaaa 360

actggagtct cgaaatcata taaatagaca atatattttc acacaatgag atttgtagta 420

cagttctatt ctctctcttg cataaataag aaattcatca agaacttggt ttgatatttc 480

accaacacac acaaaaaaca gtacttcact aaatttacac acaaaacaaa 530

<210> 9

<211> 1557

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgactatcc tacccctgct actctacgcc tccataactg gtttactaat ctatgtattg 60

cttaacctac gcaccacccc tcgttctaac cacctcccac tcccacccgg cccaacccca 120

tggccaatca tcggaaactt acctcatctt ggaagaatac cgcaccatgc gctggcggcc 180

atggctacaa agtacggccc gttgatgcat ctccggctcg gcgtcgttga cgtggtggtg 240

gcggcgtctg cgtcggtggc ggcacagttt ttgaaggttc atgacgccaa tttcgcgagt 300

aggccgccga actccggcgc gaaacacatc gcgtataatt atcaggatct ggtgtttgca 360

ccttatggtc agaaatggcg gatgcttagg aagatttgct ccgtgcatct gttctctaac 420

aaagcactcg atgatttccg tcacgttcgt caggaggagg tggcgattct ggtgcgcgct 480

ttggccggag ccggtcgatc tacggcggcg gcgttaggtc aactacttaa cgtttgcacc 540

acaaacgcgt tggcacgagt gatgttaggt cggagagtgt tcgtggacgg aagtgaaggc 600

aatcgagacg cggatgaatt caaggatatg gtggttgaag tgatggtatt ggccggagaa 660

ttcaacatcg gcgacttcat tccggcgctt gattggctgg atctgcaaag cgtgacgaag 720

aagatgaaga aactccatct ccgattcgat tcgtttctta acaaaatcct ggaagaccat 780

agaaatggag gtgacgtcac ttcgggtaac gtggatttgc tgagcacgtt gatttcgctc 840

aaggatgacg ccgatggaga gggcgggaag ctttcagata tcgaaatcaa agctttgctt 900

ctgaatttat tcactgcggg aacagacaca tcatctagta cggtggaatg ggcaatggct 960

gaactcattc gccatccgca attattgaag caagcccaag aagaattgga cactgttgtt 1020

ggtaaagacc ggcttgtatc cgaattggac ctgagtagac taacattcct cgaagccatt 1080

gtgaaggaaa ccttcaggct ccacccatcg accccactct ctttgccacg gattgcatca 1140

gagagctgtg aagtcgatgg gtattacatt cctaagggaa ccacacttct tgttaacgtg 1200

tgggccattg cccgagaccc aaaaatgtgg accgacccgc ttgaattccg acccacccgg 1260

ttcttgccgg gaggtgaaaa gccgaatgct aatgtaaagg gaaatgattt tgaaataata 1320

ccgtttgggg ctggtcgaag gatttgtgcg ggtatgagcc tagggttacg gatggttcag 1380

ttgctcactg cgactctggt tcatgccttt gattggaaat tggctaacgg gttagaccca 1440

gagaagctca atatggaaga agcttatggg ttgacccttc aaagggctgc acccttgatg 1500

gtgcacccaa ccccacggtt agctccccat ttgtatgaaa gcagtcaagg tttataa 1557

<210> 10

<211> 2133

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atgcaatcgg actcgtctct ggaaacgtcg tcgtttgatt tgattaccgc agctcttaag 60

gagaaagtta ttgatacagc aaacgcatct gatagtggag attcaacgat gcctccggct 120

ttggcgatga ttttggaaaa ccgtgagctg tttatgatgc tgactacaac agtggctctt 180

ttgcttggat ttattgtcgt ttcgttctgg aagagatctt ctgagaagaa gtcggctaag 240

gatttggagc taccgaagat cgttgtgcct aagagacagc aggaacagga ggttgatgac 300

ggtaagaaga aggttacgat tctttttgga acgcagaccg gaacggcgga aggtttcgct 360

aaggcactgt tggaagaagc taaagcgcga tatgaaaagg cgacctttaa agtagtcgat 420

ttggatgatt atgctgttga tgatgatgag tacgaagaga aactaaagaa ggagtcattt 480

gctttcttct tcttggctac atatggagat ggtgagccaa ctgataatgc tgccagattt 540

tataaatggt ttacagaggg aggtgagaaa ggagtttggc ttgaaaagct tcaatatgga 600

gtatttggcc ttggcaatag acaatacgag catttcaaca agattgcaaa agaggttgac 660

gatggtctcg cagagcaggg tgcaaagcgc cttgttccag ttggccttgg agatgatgat 720

caatccattg aagatgattt tactgcatgg aaagagttag tgtggcctga gttggatgaa 780

ttgcttcgtg acgaggatga caaaggcgtt gctactcctt acacagctgc tattccggaa 840

taccgagttg tgtttcatga gaaacatgat acatctgctg aagatcaaat tcagacaaat 900

ggtcatgctg ttcatgatgc tcaacatcca tgcagatcca atgtggctgt taaaaaggag 960

ctccataccc ctgaatctga tcgctcttgc acgcatctgg aatttgacat ctcacacact 1020

ggactatcat acgaaactgg ggaccatgtt ggtgtctact gtgagaactt aagtgaagtt 1080

gtggaggagg ctgagaggtt aataggttta ccatcggata cttatttctc agttcacacg 1140

gataacgaag atggaacacc acttggtgga gcttccttac tacctccttt ccctccatgc 1200

actttaagaa aagcattggc taattacgca gatgtattga cttctcccaa aaagtcggcc 1260

ttgattgctc tagctgctca tgcttctgat cctactgaag ctgaacgact aaaatttctt 1320

gcatctcctg ctgggaagga tgaatattct caatggatta ttgcaagcca aagaagcctg 1380

cttgaggtca tggaagcttt cccatcggct aagcctccac ttggggtttt ctttgcagct 1440

attgctccac gcttacagcc tcgatactac tctatttctt cctccccgaa gatggcacct 1500

agcaggattc atgttacttg tgcattagtt tatgagaaaa cacctgcagg ccgtctccat 1560

aaaggaatct gttcaacctg gatgaagaat gctgtgccta tgacggaaag tcaggattgc 1620

agctgggcac ctattttcgt tagaacgtct aacttcagac ttcccactga tcctaaagtt 1680

cctgttatca tgattggccc tggaaccgga ttggctccgt tcagaggttt tcttcaagaa 1740

agattagctc tgaaggaagc cggaactgaa ctgggatcat ccattttatt cttcggatgt 1800

agaaatcgca aagtggattt catatatgag aatgaactga aagactttgt tgagaatggt 1860

gctgtttccg agcttattgt tgccttctcc cgtgaaggcc ccaataagga atatgtgcaa 1920

cataaaatga gcgatagggc ttcggatcta tggaacttgc tttcggaggg agcatattta 1980

tacgtttgtg gtgatgccaa aggcatggct aaagatgtac accggaccct tcacacaatt 2040

gtgcaagaac agggatctct agactcgtca aaggcagagc tgtatgtgaa gaatctacaa 2100

atgtcaggaa gatacctccg tgatgtttgg tag 2133

<210> 11

<211> 1557

<212> DNA

<213> Silybum marianum

<400> 11

atgactatcc tacccctgct actctacgcc tccataactg gtttactaat ctatgtattg 60

cttaacctac gcaccacccc tcgttctaac cacctcccac tcccacccgg cccaacccca 120

tggccaatca tcggaaactt acctcatctt ggaagaatac cgcaccatgc gctggcggcc 180

atggctacaa agtacggccc gttgatgcat ctccggctcg gcgtcgttga cgtggtggtg 240

gcggcgtctg cgtcggtggc ggcacagttt ttgaaggttc atgacgccaa tttcgcgagt 300

aggccgccga actccggcgc gaaacacatc gcgtataatt atcaggatct ggtgtttgca 360

ccttatggtc agaaatggcg gatgcttagg aagatttgct ccgtgcatct gttctctaac 420

aaagcactcg atgatttccg tcacgttcgt caggaggagg tggcgattct ggtgcgcgct 480

ttggccggag ccggtcgatc tacggcggcg gcgttaggtc aactacttaa cgtttgcacc 540

acaaacgcgt tggcacgagt gatgttaggt cggagagtgt tcgtggacgg aagtgaaggc 600

aatcgagacg cggatgaatt caaggatatg gtggttgaag tgatggtatt ggccggagaa 660

ttcaacatcg gcgacttcat tccggcgctt gattggctgg atctgcaaag cgtgacgaag 720

aagatgaaga aactccatct ccgattcgat tcgtttctta acaaaatcct ggaagaccat 780

agaaatggag gtgacgtcac ttcgggtaac gtggatttgc tgagcacgtt gatttcgctc 840

aaggatgacg ccgatggaga gggcgggaag ctttcagata tcgaaatcaa agctttgctt 900

ctgaatttat tcactgcggg aacagacaca tcatctagta cggtggaatg ggcaatggct 960

gaactcattc gccatccgca attattgaag caagcccaag aagaattgga cactgttgtt 1020

ggtaaagacc ggcttgtatc cgaattggac ctgagtagac taacattcct cgaagccatt 1080

gtgaaggaaa ccttcaggct ccacccatcg accccactct ctttgccacg gattgcatca 1140

gagagctgtg aagtcgatgg gtattacatt cctaagggaa ccacacttct tgttaacgtg 1200

tgggccattg cccgagaccc aaaaatgtgg accgacccgc ttgaattccg acccacccgg 1260

ttcttgccgg gaggtgaaaa gccgaatgct aatgtaaagg gaaatgattt tgaaataata 1320

ccgtttgggg ctggtcgaag gatttgtgcg ggtatgagcc tagggttacg gatggttcag 1380

ttgctcactg cgactctggt tcatgccttt gattggaaat tggctaacgg gttagaccca 1440

gagaagctca atatggaaga agcttatggg ttgacccttc aaagggctgc acccttgatg 1500

gtgcacccaa ccccacggtt agctccccat ttgtatgaaa gcagtcaagg tttataa 1557

<210> 12

<211> 2133

<212> DNA

<213> Silybum marianum

<400> 12

atgcaatcgg actcgtctct ggaaacgtcg tcgtttgatt tgattaccgc agctcttaag 60

gagaaagtta ttgatacagc aaacgcatct gatagtggag attcaacgat gcctccggct 120

ttggcgatga ttttggaaaa ccgtgagctg tttatgatgc tgactacaac agtggctctt 180

ttgcttggat ttattgtcgt ttcgttctgg aagagatctt ctgagaagaa gtcggctaag 240

gatttggagc taccgaagat cgttgtgcct aagagacagc aggaacagga ggttgatgac 300

ggtaagaaga aggttacgat tctttttgga acgcagaccg gaacggcgga aggtttcgct 360

aaggcactgt tggaagaagc taaagcgcga tatgaaaagg cgacctttaa agtagtcgat 420

ttggatgatt atgctgttga tgatgatgag tacgaagaga aactaaagaa ggagtcattt 480

gctttcttct tcttggctac atatggagat ggtgagccaa ctgataatgc tgccagattt 540

tataaatggt ttacagaggg aggtgagaaa ggagtttggc ttgaaaagct tcaatatgga 600

gtatttggcc ttggcaatag acaatacgag catttcaaca agattgcaaa agaggttgac 660

gatggtctcg cagagcaggg tgcaaagcgc cttgttccag ttggccttgg agatgatgat 720

caatccattg aagatgattt tactgcatgg aaagagttag tgtggcctga gttggatgaa 780

ttgcttcgtg acgaggatga caaaggcgtt gctactcctt acacagctgc tattccggaa 840

taccgagttg tgtttcatga gaaacatgat acatctgctg aagatcaaat tcagacaaat 900

ggtcatgctg ttcatgatgc tcaacatcca tgcagatcca atgtggctgt taaaaaggag 960

ctccataccc ctgaatctga tcgctcttgc acgcatctgg aatttgacat ctcacacact 1020

ggactatcat acgaaactgg ggaccatgtt ggtgtctact gtgagaactt aagtgaagtt 1080

gtggaggagg ctgagaggtt aataggttta ccatcggata cttatttctc agttcacacg 1140

gataacgaag atggaacacc acttggtgga gcttccttac tacctccttt ccctccatgc 1200

actttaagaa aagcattggc taattacgca gatgtattga cttctcccaa aaagtcggcc 1260

ttgattgctc tagctgctca tgcttctgat cctactgaag ctgaacgact aaaatttctt 1320

gcatctcctg ctgggaagga tgaatattct caatggatta ttgcaagcca aagaagcctg 1380

cttgaggtca tggaagcttt cccatcggct aagcctccac ttggggtttt ctttgcagct 1440

attgctccac gcttacagcc tcgatactac tctatttctt cctccccgaa gatggcacct 1500

agcaggattc atgttacttg tgcattagtt tatgagaaaa cacctgcagg ccgtctccat 1560

aaaggaatct gttcaacctg gatgaagaat gctgtgccta tgacggaaag tcaggattgc 1620

agctgggcac ctattttcgt tagaacgtct aacttcagac ttcccactga tcctaaagtt 1680

cctgttatca tgattggccc tggaaccgga ttggctccgt tcagaggttt tcttcaagaa 1740

agattagctc tgaaggaagc cggaactgaa ctgggatcat ccattttatt cttcggatgt 1800

agaaatcgca aagtggattt catatatgag aatgaactga aagactttgt tgagaatggt 1860

gctgtttccg agcttattgt tgccttctcc cgtgaaggcc ccaataagga atatgtgcaa 1920

cataaaatga gcgatagggc ttcggatcta tggaacttgc tttcggaggg agcatattta 1980

tacgtttgtg gtgatgccaa aggcatggct aaagatgtac accggaccct tcacacaatt 2040

gtgcaagaac agggatctct agactcgtca aaggcagagc tgtatgtgaa gaatctacaa 2100

atgtcaggaa gatacctccg tgatgtttgg tag 2133

Claims (10)

1.一种黄酮3-羟化酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述的黄酮3-羟化酶的核苷酸序列。

3.携带权利要求2所述核苷酸序列的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，启动子PGK1、TPI1、GAL7、ACS2或LEU2位于权利要求2所述核苷酸序列的上游。

5.表达权利要求1所述的黄酮3-羟化酶，或携带权利要求3或4所述表达载体的微生物细胞。

6.一种微生物细胞，其特征在于，在权利要求5所述微生物细胞中表达黄酮3β-羟化酶和黄酮3β-羟化酶的辅酶。

7.一种生产黄杉素的方法，其特征在于，以圣草酚为底物，以权利要求1所述的黄酮3-羟化酶为催化剂，或加入权利要求5所述微生物细胞。

8.一种全细胞生产黄杉素的方法，其特征在于，以柚皮素为底物，将权利要求6所述的微生物细胞加入反应体系中，转化生产黄杉素。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，反应体系中含有碳酸钙。

10.权利要求1所述黄酮3-羟化酶，或权利要求5或6所述微生物细胞在生产黄杉素中的应用。

Images