CN101434969A - 一种生物转化生产丁醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物法生产丁醇，一种生物转化生产丁醇的方法，以菊粉植物为原料，将菊粉植物富含菊粉的器官预处理后经灭菌接入微生物，进行生物转化反应，生产丁醇。其生产成本低，原料来源广泛，工艺简单，技术路线成熟，可产业化实施。
Description
技术领域
本发明涉及由一类含有果聚糖的生物质，特别是菊芋或菊苣，通过生物或化学的方法将果聚糖降解，使其成为供微生物可以利用的以果糖为主要成分的碳源，通过微生物发酵的方法生产丁醇。
背景技术
丁醇，也作正丁醇，俗称1—丁醇，英文简写为n-butanol；n-butyl alcohol；1-butanol，它是无色液体，有酒精味，相对密度0.8109，熔点—90.2℃，沸点117.7℃，与乙醇、乙醚及其它多种有机溶剂混溶。蒸汽与空气形成爆炸性混合物，爆炸极限1.45—11.25％(体积)。
丁醇是一种重要的有机化工原料，用途非常广泛，主要用于邻苯二甲酸正丁酯、脂肪二元酸和磷酸丁酯、丙烯酸丁酯及醋酸丁酯等；可经过氧化生产丁醛或丁酸；还可用作油脂、医药和香料的提取溶剂以及醇酸树脂的添加剂等。还可用作有机染料和印刷油墨的溶剂、脱蜡剂。我国丁醇主要用于生产醋酸丁酯、丙烯酸丁酯、邻苯二甲酸二丁酯及医药中间体等，用量较大的是醋酸丁酯、丙烯酸丁酯和邻二甲酸丁酯(DBP)，分别占我国丁醇消费总量的32.7％、15.3％和9％。
目前，正丁醇的生产方法有正丁醛加氢法、丙烯羰基合成一步法、丁烯醛加氢法、发酵法、乙烯齐聚制高级脂肪醇副产丁醇法。随着上世纪70年代后期石油化工业的迅猛发展，发酵法逐渐被淘汰。而近年来由于石油价格的飞速上涨，加之石油资源的日益紧缺，粮食发酵法生产丁醇的技术重新显示出其优势。我国的丁醇生产自80年代开始才有较大的发展，其中以乙醛缩合法和发酵法生产正丁醇的装置由于成本高，纷纷停产或转产。21世纪伊始，随着世界石油价格的飞涨，发酵法重新得到了业内人士的重视。菊芋、菊苣等果糖源生物质具有糖含量高，价格低廉，容易转化利用等特点，完全可以代替传统的玉米、马铃薯、糖蜜等价格高的物质作为丁醇生产的良好底物应用到发酵工业中。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物转化生产丁醇的方法；其生产成本低，原料来源广泛，工艺简单，技术路线成熟，可产业化实施。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种生物转化生产丁醇的方法，以菊粉植物为原料，将菊粉植物富含菊粉的器官预处理后经灭菌接入微生物，进行生物转化反应，生产丁醇；产生的丁醇可以是正丁醇，也可以是丁醇的其他同分异构体。
1)将碳水化合物，通过生物和/或化学的方法，将其降解为微生物可以利用的以果糖为主要成分的碳源。
2)对上述的以果糖为主要成分的碳源，经过预处理，使其满足微生物生长的要求。预处理是指调节pH值，添加营养成分，去除影响丁醇生产的有害成分，培养基灭菌或它们的组合；所述pH值是指在丁醇发酵过程中适合各种丁醇菌以及各种基因工程构建的菌种生长代谢的培养基的pH值，范围为3-9；
3)将具有转化果糖和/或葡萄糖生产丁醇能力的菌株作为生产菌株，将经降解后以果糖为主要成分的碳源作为供微生物生长和转化丁醇所需的碳源，发酵生产丁醇。
菊粉是指一系列果糖多聚物，末端带有一个葡萄糖残基；所述菊粉植物是指菊芋、菊苣和/或大丽花富含菊粉的植物；所述富含菊粉的器官是指菊粉植物的块根或块茎。
所述预处理是指将菊粉植物富含菊粉的器官通过物理，化学或生物的方法加工成菊芋片、菊芋粉、菊粉等便于后续加工的原料；或进一步将上述原料通过化学法：如稀酸水解法，或生物法；利用菊粉酶将其降解成为微生物可以利用的富含糖的原料，如：利用菊粉酶水解果聚糖、阳离子交换树脂水解果聚糖、酸水解果聚糖。
生物转化反应包括微生物的厌氧发酵生产丁醇，同时也包括微生物有氧生物转化生产丁醇；所述微生物是指一类可利用葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖等单糖，或蔗糖、麦芽糖、果寡糖等寡糖，或菊粉等多糖碳源，生产丁醇的常用微生物。如：野生型微生物拜氏丁醇梭菌(C.beijerinckii)，丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)或Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum，或经过基因工程改造具有转化果糖、葡萄糖生产丁醇能力的C.beijerinckii，C.acetobutylicum，Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum，以及大肠杆菌(E.coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。
可利用菊粉的微生物为Clostridium pasteurianum var.I-53(文献：HitoshiOiwa，Mutsuo Naganuma and Shun-ichi Ohnuma Agric.Biol.Chetn.，51(10)，2819-2820，1987)
具体过程可为：
1)将菊粉植物的块茎按常规方法加工成菊芋粉和/或菊粉后，制成质量浓度2～20％的溶液；
2)发酵丁醇：将可利用菊粉的微生物接入灭菌的以菊芋粉或菊粉为主要碳源的培养基中，菊芋粉或菊粉质量浓度为2～20％，培养温度20～60℃，培养40～300h，得丁醇。丁醇菌培养基重量组成为：菊芋粉或菊粉10-200g/L、酵母膏5-30g/L、蛋白胨5-30g/L、CH3COONH41-3g/L、MgSO4·7H2O0.1-0.5g/L、KH2PO4 0.1-0.5g/L、FeSO4·7H2O 0.04g/L；
或者为：
1)将菊粉植物的块茎按常规方法加工成菊芋粉和/或菊粉后，制成质量浓度2～20％的溶液；
2)菊芋粉酶解过程如下：
A.在每升质量浓度为2～20％的菊芋粉或菊粉溶液中，加入1000U～100000U单位的菊粉酶的比例配制菊粉或菊芋粉酶解反应液，菊粉酶酶活定义为每分钟水解底物产生1微摩尔果糖所需要的酶量，调pH＝4～6，50～65℃反应2～60h，酶反应进行完全，成为微生物可以利用的富含单糖的原料，将反应液调至中性，灭菌；
或B.将菊芋粉用盐酸、硫酸等酸处理(pH介于1-6之间)，使之水解；或是利用阳离子交换树脂使之水解；成为微生物可以利用的富含单糖的原料。
3)丁醇发酵：将可利用单糖碳源生产丁醇的常用微生物接入灭菌的菊粉酶解液中，使培养基中糖浓度达到2％～20％，培养温度为20～60℃，培养40～300h，得丁醇。丁醇菌培养基重量组成为：菊芋粉或菊粉10-200g/L、酵母膏5-30g/L、蛋白胨5-30g/L、CH3COONH41-3g/L、MgSO4·7H2O0.1-0.5g/L、KH2PO4 0.1-0.5g/L、FeSO4·7H2O 0.04g/L：
本发明可避免出现工业生物技术产业与人畜争粮争地的局面，利用菊芋、菊苣、大丽花等富含菊粉的植物，特别是那些可在盐碱、荒涂地生长的菊粉植物，如：菊芋，通过将其预处理成菊芋片、菊芋粉、菊粉或这些原料经进一步加工，通过稀酸处理或菊粉酶处理，形成可供微生物利用的发酵底物，通过E.coli，Saccharomyces cereviciae，C.beijerinckii，C.acetobutylicum，Clostridium saccharoperbutylacetonicum，，Zymomonas mobilis等微生物，生物转化法生产丁醇的技术。
自然界中存在一大类富含菊粉的植物，而菊粉不仅可供某些微生物直接利用，还可以通过水解成果糖、葡萄糖等易于微生物利用的糖。同时，这一类植物中的菊芋等，还具有能在盐碱地、荒漠地生长，抗虫抗病的特点。因此，利用这一类的菊粉植物对我国发展工业生物技术具有重要意义。其生产成本低，原料来源广泛，工艺简单，技术路线成熟，可产业化实施。
具体实施方式
实施例1 菊芋粉的制备
将菊芋块茎晒干，经粉碎机粉碎成粉，制成菊芋粉。
实施例2 菊粉的制备
将菊芋块茎洗净，浸入90℃的重量浓度5％NaOH溶液中1min，捞出脱皮洗净，将脱皮菊芋块茎，经4000W微波炉加热，每加热2kg需8min，将加热的菊芋块茎放入榨汁机中榨汁，榨出的汁液经板框过滤，再经过阳离子交换树脂柱阴、离子交换树脂柱，形成富含菊粉的澄清液体(pH5.0～8.0)，经浓缩喷雾干燥，制成菊粉。
实施例3 果糖化菊芋粉的制备
将实施例1制成的菊芋粉用55℃水溶解制成重量浓度10％溶液后，通过1M NaOH，1M HCl调节其pH值至6.5，按每升加入10000U单位的菊粉酶的比例配制菊芋粉酶解反应液(菊粉酶酶活定义为每分钟水解底物产生1微摩尔果糖所需要的酶量)，在反应器中45℃反应9h，经HPLC检测，酶解反应完全后，形成果糖化的菊芋粉液体(葡萄糖重量体积含量0.9％，果糖重量体积含量3.7％)，经喷雾干燥，制成果糖化的菊芋粉。
实施例4 果糖化菊芋粉的制备
将实施例1制成的菊芋粉用70℃水溶解制成重量浓度20％溶液后，通过1M NaOH，1M HCl调节其pH值至4.2，按每升加入50000U单位的菊粉酶的比例配制菊芋粉酶解反应液(菊粉酶酶活定义为每分钟水解底物产生1微摩尔果糖所需要的酶量)，在反应器中70℃反应5h，经HPLC检测，酶解反应完全后，形成果糖化的菊芋粉液体(葡萄糖重量体积含量1.8％，果糖重量体积含量7.4％)，经喷雾干燥，制成果糖化的菊芋粉。
实施例5 果糖化菊芋粉的制备
将实施例1制成的菊芋粉用60℃水溶解制成重量浓度16％溶液后，通过1M NaOH，1M HCl调节其pH值至5，按每升加入100000U单位的菊粉酶的比例配制菊芋粉酶解反应液(菊粉酶酶活定义为每分钟水解底物产生1微摩尔果糖所需要的酶量)，在反应器中60℃反应3h，经HPLC检测，酶解反应完全后，形成果糖化的菊芋粉液体(葡萄糖重量体积含量1.5％，果糖重量体积含量6.2％)，经喷雾干燥，制成果糖化的菊芋粉。
实施例6 果糖化菊芋粉的制备
将实施例1制成的菊芋粉用70℃水溶解制成重量浓度20％溶液后，加入10mol/L的盐酸，在80℃下，水解30分钟。经HPLC检测，酶解反应完全后，形成果糖化的菊芋粉液体(葡萄糖重量体积含量1.0％，果糖重量体积含量14.9％)，经喷雾干燥，制成果糖化的菊芋粉。
实施例7 利用C.beijerinckii BA101以菊粉为原料生产丁醇
取10ml菊粉酶，活力单位3800U/ml，加入0.5L质量浓度15％的菊粉溶液(pH＝4)，65℃反应30h，经HPLC检测，酶反应进行完全，产物中葡萄糖质量浓度1.6％，果糖质量浓度13.2％。将反应液调至中性，121℃灭菌20min。
将C.beijerinckii BA101在丁醇菌培养基(菊芋粉或菊粉100g/L、酵母膏20g/L、蛋白胨20g/L、CH3COONH4·2g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、KH2PO40.4g/L、FeSO4·7H2O 0.04g/L)中30℃培养14h，离心获得菌体，接入100ml丁醇菌培养基中(250ml锥形瓶)中厌氧培养，培养温度为30℃，培养至OD600吸光度值达到0.6时，接入含1升丁醇菌培养基的5L发酵罐中培养，培养温度为30℃，培养液pH控制在6.5(通过1M NaOH，1M HCl调节)，并通无菌CO2缓慢搅拌培养，至OD600值为4.2。
然后，通过发酵罐补料系统，加入灭菌的果糖化的菊芋粉液体0.5L，使培养基中糖质量浓度达到5％，同时停止供氧并通入无菌CO2，培养温度为30℃，培养80h，得18.5g丁醇。
使用气相色谱检测丁醇的含量，使用HPLC-脉冲安培检测器和阴离子交换柱(HAMILTON RCX-10)检测葡萄糖，果糖浓度。
实施例8 利用C.acetobutylicum AS1.70以菊粉为原料生产丁醇
取10ml菊粉酶，活力单位5000U/ml，加入1L质量浓度10％的菊粉溶液(pH＝6)，55℃反应5h，经HPLC检测，酶反应进行完全，产物中葡萄糖质量浓度1.1％，果糖质量浓度8.4％。将反应液调至中性，121℃灭菌20min。
将C.acetobutylicum AS1.70在丁醇菌培养基中30℃培养14h，离心获得菌体，接入100ml丁醇菌培养基中(250ml锥形瓶)中培养，培养温度为30℃，培养至OD600吸光度值达到0.8时，接入含1升LB培养基的5L发酵罐中培养，培养温度为30℃，培养液pH控制在6.2(通过1M NaOH，1M HCl调节)，并通无菌CO2搅拌培养，至OD600值为5.8。
然后，通过发酵罐补料系统，加入灭菌的果糖化的菊芋粉液体2L，使培养基中糖质量浓度达到10％，同时停止供氧并通入无菌CO2，培养温度为40℃，培养60h，得26.8g丁醇。
实施例9利用Clostridium saccharoperbutylacetonicum以菊芋粉为原料生产丁醇
取10ml菊粉酶，活力单位8000U/ml，加入1.5L质量浓度20％的菊芋粉溶液(pH＝4)，50℃反应7h，经HPLC检测，酶反应进行完全，产物中葡萄糖质量浓度1.2％，果糖质量浓度17.7％。将反应液调至中性，121℃灭菌20min。
将Clostridium saccharoperbutylacetonicum在丁醇菌培养基中40℃培养12h，离心获得菌体，接入100ml丁醇菌培养基中(250ml锥形瓶)中培养，培养温度为40℃，培养至OD600吸光度值达到0.53时，接入含1升丁醇菌培养基的5L发酵罐中培养，培养温度为40℃，培养液pH控制在6.5(通过1M NaOH，1M HCl调节)，并通无菌空气搅拌培养，至OD600值为12.5。
然后，通过发酵罐补料系统，加入灭菌的果糖化的菊芋粉液体1.5L，使培养基中糖质量浓度达到8％，同时停止供氧并通入无菌CO2，培养温度为36℃，培养50h，得11.5g丁醇。
使用气相色谱检测丁醇的含量，使用HPLC-脉冲安培检测器和阴离子交换柱(HAMILTON RCX-10)检测葡萄糖，果糖浓度。
实施例10 利用基因工程改造过的大肠杆菌以菊芋粉为原料生产丁醇
取10ml菊粉酶，活力单位4900U/ml，加入2L质量浓度5％的菊芋粉溶液(pH＝5)，60℃反应3.5h，经HPLC检测，酶反应进行完全，产物中葡萄糖质量浓度0.3％，果糖质量浓度4.6％。将反应液调至中性，121℃灭菌20min。
将基因工程改造过的大肠杆菌(保藏号：KCTC 0506BP)在LB培养基中40℃培养12h，离心获得菌体，接入100mlLB中(500ml锥形瓶)中培养，培养温度为40℃，培养至OD600吸光度值达到0.3时，接入含1升LB培养基的5L发酵罐中培养，培养温度为40℃，培养液pH控制在7.0(通过1MNaOH，1M HCl调节)，并通无菌空气搅拌培养，至OD600值为10。
然后，通过发酵罐补料系统，加入灭菌的果糖化的菊芋粉液体1L，使培养基中糖质量浓度达到6％，同时停止供氧并通入无菌CO2，培养温度为32℃，培养40h，得13.9g丁醇。
使用气相色谱检测丁醇的含量，使用HPLC-脉冲安培检测器和阴离子交换柱(HAMILTON RCX-10)检测葡萄糖，果糖浓度。
Claims (7)
1.一种生物转化生产丁醇的方法，其特征在于：以菊粉植物为原料，将菊粉植物富含菊粉的器官预处理后经灭菌接入微生物，进行生物转化反应，生产丁醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：菊粉是指一系列果糖多聚物，末端带有一个葡萄糖残基；所述菊粉植物是指菊芋、菊苣和/或大丽花富含菊粉的植物；所述富含菊粉的器官是指菊粉植物的块根或块茎。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述预处理是指将菊粉植物富含菊粉的器官其通过物理、化学或生物的方法加工成片、粉、菊粉便于后续加工的原料，
或进一步将上述原料通过化学法或生物法将其降解成为微生物可以利用的富含糖的原料。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微生物是指一类可利用单糖、寡糖或多糖碳源生产丁醇的常用微生物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述微生物是指具有利用果糖、葡萄糖生产丁醇能力的微生物，其为拜氏丁醇梭菌，丙酮丁醇梭菌或Clostridium saccharoperbutylacetonicum，或经过基因工程改造具有转化果糖、葡萄糖生产丁醇能力的C.beijerinckii，C.acetobutylicum，Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum，以及大肠杆菌、酿酒酵母或运动发酵单胞菌；
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：具体过程可为，
1)将菊粉植物的块茎按常规方法加工成菊芋粉和/或菊粉后，制成质量浓度2～20％的溶液；
2)发酵丁醇：将可利用菊粉的微生物接入灭菌的以菊芋粉或菊粉为主要碳源的培养基中，菊芋粉或菊粉质量浓度为2～20％，培养温度20～60℃，培养40～300h，得丁醇；培养基重量组成为：菊芋粉或菊粉10-200g/L、酵母膏5-30g/L、蛋白胨5-30g/L、CH3COONH41-3g/L、MgSO4·7H2O 0.1-0.5g/L、KH2PO4 0.1-0.5g/L、FeSO4·7H2O 0.04g/L；
所述可利用菊粉的微生物为Clostridium pasteurianum var.I-53。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：具体过程可为，
1)将菊粉植物的块茎按常规方法加工成菊芋粉和/或菊粉后，制成质量浓度2～20％的溶液；
2)菊芋粉酶解过程如下：
A.在每升质量浓度为2～20％的菊芋粉或菊粉溶液中，加入1000U～100000U单位的菊粉酶的比例配制菊粉或菊芋粉酶解反应液，菊粉酶酶活定义为每分钟水解底物产生1微摩尔果糖所需要的酶量，调pH＝4～6，50～65℃反应2～60h，酶反应进行完全，成为微生物可以利用的富含单糖的原料，将反应液调至中性，灭菌；
或B.将菊芋粉用pH为1-6的盐酸或硫酸处理使之水解；或是利用阳离子交换树脂使之水解，成为微生物可以利用的富含单糖的原料；
3)丁醇发酵：将可利用果糖、葡萄糖碳源生产丁醇的常用微生物接入灭菌的菊粉酶解液中，使培养基中糖浓度达到2％～20％，培养温度为20～60℃，培养40～300h，得丁醇；培养基重量组成为：菊芋粉或菊粉10-200g/L、酵母膏5-30g/L、蛋白胨5-30g/L、CH3COONH41-3g/L、MgSO4·7H2O0.1-0.5g/L、KH2PO40.1-0.5g/L、FeSO4·7H2O0.04g/L；
所述微生物是指具有利用果糖、葡萄糖生产丁醇能力的微生物，其为拜氏丁醇梭菌，丙酮丁醇梭菌或Clostridium saccharoperbutylacetonicum，或经过基因工程改造具有转化果糖、葡萄糖生产丁醇能力的C.beijerinckii，C.acetobutylicum，Clostridium saccharoperbutylacetonicum，以及大肠杆菌、酿酒酵母或运动发酵单胞菌。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20090520 |