KR20170042959A - 새로운 자일란 분해 균주 스트렙토마이세스 아트로비랜스 wj2 - Google Patents

Abstract

본 발명은 새로운 자일란 분해 균주 스트렙토마이세스 아트로비랜스 WJ2에 관한 것으로, 구체적으로 제주도 토양에서 분리되어 농업유전자원센터에 KACC92087P의 수탁번호로 기탁된 스트렙토마이세스 아트로비랜스(Streptomyces atrovirens) WJ2 균주로, 우수한 자일란(xylan) 분해 활성을 갖는 새로운 균주에 관한 것이다.
본 발명의 새로운 균주는 자일란을 효과적으로 분해할 수 있어 자일란의 분해가 필요한 산업분야 또는 자일란의 분해에 의해 생성되는 다양한 생리활성 물질을 이용하는 산업분야에서 매우 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 균주를 사용하면 산업상 매우 유용한 자일란 분해 효소를 매우 효과적으로 생산할 수 있다.

Description

새로운 자일란 분해 균주 스트렙토마이세스 아트로비랜스 WJ2{Streptomyces atrovirens WJ2, a new microbe having great activity degrading xylan}

본 발명은 새로운 자일란 분해 균주 스트렙토마이세스 아트로비랜스 WJ2에 관한 것으로, 구체적으로 제주도 토양에서 분리되어 농업유전자원센터에 KACC92087P의 수탁번호로 기탁된 스트렙토마이세스 아트로비랜스(Streptomyces atrovirens) WJ2 균주로, 우수한 자일란(xylan) 분해 활성을 갖는 새로운 균주에 관한 것이다.

식물 바이오매스는 바이오제품(bioproduct) 및 바이오연료(biofuel) 생산을 위한 가장 풍부하면서 널리 확산된 물질이다. 식물체 바이오매스(biomass)의 가수분해는 자연계에 엄청난 양으로 존재하는 헤미셀룰로오스계 물질이 유용하게 사용되는데 있어서 가장 중요한 단계이다.

자일란(xylan)은 육상 식물체 세포벽의 약 20 ~ 40%를 차지하는 주요 구성성분의 하나인 헤미셀룰로오스(hemicellulose)로서, 아세틸(acetyl), 아라비노실(arabinosyl), 및 메틸글루쿠로노실(methylglucuronosyl) 잔기로 치환된 β-1,4-결합 자일로오스 단위의 골격으로 이루어지는 이종 다당류이다(Subramaniyan and PREMA 2002). 구조의 복잡한 이질성 때문에 많은 상이한 자일란 분해 효소의 상승 작용이 필요하나, 주로 베타-1,4-엔도자일라나아제(β-1,4-endoxylanases)(EC. 3.2.1.8)와 베타-1,4-자일로시다제(β-xylosidases)(EC 3.2.1.37)가 자일란 뼈대를 가수 분해한다. 특히 베타-1,4-엔도자일라나아제(-1,4-endoxylanase)에 의한 자일란 가수분해산물인 자일란 유래 올리고당은 항균, 항산화, 항염증 등 다양한 생리활성을 갖는 것으로 알려져 있어 식-의약 산업, 농-축산업, 화장품 산업 등 다양한 분야에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

자일라나아제는 펄프 표백(pulp bleaching), 식품 및 사료, 제빵 산업, 및 헤미셀룰로오스 바이오매스를 연료화하기 위한 생물전환을 포함하는 다양한 생명 공학 및 산업 응용에 중요하다(Beg et al., 2001; Nath and Rao, 2001; Dhiman et al., 2008). 최근, 자일란 유래 올리고당(XOSs)의 항알레르기, 항산화, 항균 및 항염증 활성 및 프리 바이오틱 효과가 보고 되었다(Kallel et al., 2015; Aachary and Prapulla 2009). 미생물 효소에 의한 리그노셀룰로오스 바이오매스 (lignocellulosic biomass)의 가수 분해는 유해 부산물을 생성하는 화학 가수 분해에 대한 대안으로서 환경 친화적인 방법으로 받아들여졌다(Biely 1985). 이에 많은 연구자들은 좀 더 적합한 자일라나아제를 생산하는 신규 미생물의 분리를 시도하였다(Hwang et al., 2010; Brennan et al., 2004; Lee et al., 2006).

스트렙토마이세스(Streptomyces) 속은 항종양제 및 항생제를 포함하는 다양한 화학 물질을 생산하는 것으로 알려져 있다. 또한, 스트렙토마이세스는 단백질 분해효소(proteolytic enzymes)와 셀룰라아제(cellulase), 자일라나아제(xylanase) 및 아가레이즈(agarase)와 같은 글리코시드 가수분해효소(glycosidic hydrolases)를 포함하는 중요한 단백질의 생산에 사용될 수 있어 산업적으로 중요한 균주이다(Shin et al. 2009; El-Sersy et al., 2010; Temuujin et al., 2011). 분류학적 연구에서, 스트렙토마이세스에 대한 연구의 대부분이 화합물을 생산하는 균주를 스크리닝하는데 집중되었다(Al-Bari et al., 2005).

이에, 본 발명자는 이러한 자일라나아제, 즉 자일란 분해효소를 생산하는 새로운 균주를 동정함으로써 자일란 분해효소 관련 산업에서 유용하게 이용할 수 있도록 하고자 하였다.

Al-Bari, M. A. A., M. S. A. Bhuiyan, M. E. Flores, P. Petrosyan, M. Garcia-Varela, and M. A. U. Islam. 2005. Streptomyces bangladeshensis sp. nov., isolated from soil, which produces bis-(2-ethylhexyl) phthalate. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 1973-1977. Bajaj, B. K., and N. P. Singh. 2010. Production of xylanase from an alkalitolerant Streptomyces sp. 7b under solid-state fermentation, its purification, and characterization. Appl. Biochem. Biotechnol. 162: 1804-1818. Sasser M. 1990. Identification of bacteria by gas chromatography of cellular fatty acids. MIDI Technical Note 101. MIDI Inc., Newark, DE. Mesbah, M., U. Premachandran, and W. B. Whitman. 1989. Precise measurement of the G+C content of deoxyribonucleic acid by high-performance liquid chromatography. Int. J. Syst. Bacteriol. 39: 159-167. Van Trappen, S., T. L. Tan, J. Yang, J. Mergaert, and J. Swings. 2004. Alteromonas stellipolaris sp. nov., a novel, budding, prosthecate bacterium from Antarctic seas, and emended description of the genus Alteromonas. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 1157-1163.

따라서 본 발명의 주된 목적은 자일란 분해 활성을 나타내어 자일란 분해 산물을 제조하는데 유용한 새로운 균주를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용한 자일란 분해 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 이용한 자일란 분해 효소 생산 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 자일란(xylan) 분해 활성을 갖는 토양 유래 스트렙토마이세스 아트로비랜스(Streptomyces atrovirens) WJ2(수탁번호 KACC92087P)를 제공한다.

본 발명의 미생물은 제주도 토양으로부터 분리되었으며, 16S rRNA 유전자 염기서열을 통한 계통 분석결과를 바탕으로 스트렙토마이세스 아트로비랜스(S. atrovirens)의 신규 아종 박테리아로 분류될 수 있다.

본 발명의 미생물은 그람 양성의 특성을 나타내며 포자를 형성한다. 생장에 Na⁺ 이온이 요구되며, pH6 ~ 10, 15 ~ 50℃에서 성장할 수 있다. 탄소원으로 D-glucose, L-arabinose, D-mannose, D-mannitol, N-acetyl-glucosamine, D-maltose, potassium gluconate, adipic acid(약) 및 malic acid 등을 이용할 수 있다. 유전체 DNA 내 G+C 함량은 약 73.98%이고, 암피실린(ampicillin), 카나마이신(kanamycin), 아프라마이신(apramycin) 및 클로람페니콜(chloramphenicol)에 내성을 나타낸다. 주요 지방산(4% 이상)은 C_15:0 Anteiso (36.19%), C_15:0 Iso (10.58%), C_16:0 (10.20%), C_16:0 Iso (9.84%) 및 C_14:0 Iso (4.18%)으로 구성되어 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명의 미생물을 이용하는 것을 특징으로 하는 자일란 분해 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면 본 발명의 미생물은 자일란을 자일로비오스(xylobiose) 및 자일로트리오스(xylotriose)로 분해하는 엔도타입 자일라나아제(endo-type xylanase)를 생산한다. 따라서 자일란을 분해하기 위한 대상 시료에 본 발명의 균주를 직접 접종하거나 배양액을 첨가하는 방법을 사용하면 자일란을 분해하여 자일로비오스(xylobiose) 및 자일로트리오스(xylotriose)를 생산할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명의 미생물을 배양하되, 배양 배지에 자일란을 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 자일란 분해 효소 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 미생물은 자일란 분해 효소를 생산하여 세포 외부로 분비하는 특성을 나타낸다. 따라서 액체배양한 다음 배양액을 회수하는 것만으로도 자일란 분해 효소를 수득할 수 있다. 본 발명의 미생물은 자일란의 존재 하에서 자일란 분해 효소를 생산하는 것으로 나타났기 때문에, 자일란 분해 효소의 생산을 위해서는 배양배지에 자일란을 포함시키는 것이 필요하다. 또한, 질소원으로 소이톤(soytone)을 포함시키면 보다 효율적으로 자일란 분해 효소를 생산할 수 있다. 자일란은 배양배지의 부피를 기준으로 0.2 ~ 0.4%(w/v), 소이톤은 0.1 ~ 0.3%(w/v)로 포함시키는 것이 효율적인 자일란 분해 효소 생산을 위해 바람직하다. 그리고 35 ~ 45℃, pH6 ~ 8에서 배양하는 것이 좋다.

본 발명의 새로운 균주는 자일란을 효과적으로 분해할 수 있어 자일란의 분해가 필요한 산업분야 또는 자일란의 분해에 의해 생성되는 다양한 생리활성 물질을 이용하는 산업분야에서 매우 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 균주를 사용하면 산업상 매우 유용한 자일란 분해 효소를 매우 효과적으로 생산할 수 있다.

도 1은 본 발명 미생물의 분리 동정을 위해 LB 한천 배지에서 배양된 WJ2 균주를 나타내는 사진이다.
도 2는 본 발명 미생물의 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용하여 제작한 Neighbor Joining 계통수를 나타낸다.
도 3는 본 발명의 미생물인 WJ2의 유전체 염기서열을 탐침으로 하여 각각 (1) WJ2; (2) S. atrovirens NRRL B-16357^T; (3) S. flavoviridis NBRC12772^T; (4) S. pilosus NBRC12807^T; (5) S. longispororuber NBRC13488^T; (6) E. coli KCCM12119의 유전체 DNA와 DNA-DNA hybridaztion한 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 배지 조성 중 질소원에 따른 본 발명 미생물 WJ2에 의해 분비된 자일라나아제의 활성도를 나타내는 그래프이다.
도 5는 배지 조성 중 탄소원에 따른 본 발명 미생물 WJ2에 의해 분비된 자일라나아제의 활성도를 나타내는 그래프이다.
도 6은 배지 조성 중 자일란의 농도에 따른 본 발명 미생물 WJ2에 의해 분비된 자일라나아제의 활성도를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명 미생물 WJ2의 개량 배지에서의 균체 생산 및 자일라나아제 활성을 나타내는 그래프이다(■, 고유 배지에서의 균체 성장; ●, 최적화된 배지로부터의 균체 성장; □, 고유 배지에서의 자일라나아제 활성; ○, 최적화된 배지로부터의 자일라나아제 활성).
도 8은 본 발명 미생물 WJ2의 자일라나아제 활성에 대한 pH 조건의 효과를 나타내는 그래프이다(●, 20 mM MOPS 완충액; ■, 20 mM Tris-Cl 완충액).
도 9는 본 발명 미생물 WJ2의 자일라나아제 활성에 대한 온도 조건의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명 미생물 WJ2의 자일라나아제 활성에 대한 열안정성(Thermostability)을 나타내는 그래프이다.
도 11은 본 발명 미생물 WJ2의 최적 배양조건에서 수행되어 수득한 효소반응물을 TLC(Thin layer chromatography) 분석한 결과이다(X1, 자일로스(xylose); X2, 자일로비오스(xylobiose); X3, 자일로트리오스(xylotriose); X4, 자일로테트라오스(xylotetraose). 자일로올리고당(Xylooligosaccharides) 화살표 표시).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 자일라나아제 생산 미생물의 분리

우선, 균주 WJ2를 썩은 나무들이 섞여 있는 토양 샘플로부터 자일란 분해 박테리아(xylan-hydrolyzing bacterium)로서 분리하였다(도 1 참조). 구체적으로, 제주도의 송악산으로부터 토양 샘플을 수집하였고, 증류수에 연속하여 10^-1 ~ 10^-5으로 희석하였다. 그리고 나서, 상기 희석액을 각각 100㎕씩 0.1% xylan azure(Sigma, USA)가 함유된 LB 고체배지에 도말한 후 40℃에서 48시간 배양하였다. 자일라나아제 활성을 나타내는 콜로니를 선택하여 새로운 LB 배지에 계대하였다. 이들 중, 균주 WJ2라 명명한 콜로니를 최종적으로 선택하여 추가 실험에 사용하였다. 균주 WJ2의 16S rRNA 유전자 염기서열을 GenBank에 JN578482로 등록하였다. 상기 분리된 균주는 국립농업과학원 농업유전자원센터에 KACC92087P의 수탁번호로 기탁되었다.

실시예 2. 균주 WJ2의 16S rRNA 유전자 염기서열 해독 및 계통수 분석

균주 WJ2를 0.2% 자일란이 함유된 LB 액체배지에 배양하여 40℃에서 2일간 배양한 후 10,000 rpm으로 원심분리하여 균체를 회수하였다. 유전체 DNA를 추출하여, bacterial universal primer(27F와 1492R)를 사용한 16S rRNA 유전자의 증폭을 위해 주형(template)으로 사용하였다(Baker et al., 2003). 증폭된 유전자 단편의 염기서열분석은 Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer를 이용하여 직접 수행하였다. NCBI의 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST) program(Altschul et al. 1990)을 사용하여 균주 WJ2의 16S rRNA 유전자 염기서열을 바탕으로 GenBank database에서 관련된 표준균주를 조사하였다. 관련된 타입 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열은 ExTaxon server에서 수집하였다(Chun et al. 2007). 상기 관련된 스트렙토마이세스의 염기서열 다중 얼라인먼트(Multiple alignment)를 Clustal W software(Thompson et al. 1994)를 사용하여 수행하였고, 5′및 3′의 갭(gap)은 BioEdit program(Hall 1999)을 사용하여 편집하였다. PHYLIP suit program (Felsenstein 1993)의 Neighbour-Joining(NJ)법(Saitou 1987)과 Maximum Parsimony(MP)법(Kluge 1969)을 계통수(Phylogenetic tree)의 제작에 사용하였다. Bootstrap 분석은 1,000회의 재구성된 Neighbor-Joining 자료로부터 tree topology를 계산하는데 사용되었다. 진화적인 거리(evolutionary distance matrix)는 Kimura′s two-parameter model(Kimura 1983)에 따라서 계산되었다.

균주 WJ2로부터 16S rRNA 유전자(1,399bp)를 PCR로 증폭하여 염기서열 분석하였다. 표 1은 16S rRNA 유전자 염기서열 상동성 검색 결과를 나타낸 것이다. 표 1에서와 같이, 균주 WJ2의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석결과는 상기 균주가 스트렙토마이세스 속에 속하는 것임을 나타낸다.

균주	GenBank accession no.	상동성
Streptomyces longispororuber NBRC13488T	AB184440	99.425
Streptomyces atrovirens NRRL B-16357T	DQ026672	99.357
Streptomyces pilosus NBRC12807T	AB184161	99.142
Streptomyces flavoviridis NBRC12772T	AB184842	99.142
Streptomyces griseoflavus LMG19344T	AJ781322	98.928
Streptomyces speibonae PK-BlueT	AF452714	98.928
Streptomyces viridodiastaticus NBRC13106T	AB184317	98.928
Streptomyces albogriseolus NRRL B-1305T	AJ494865	98.928
Streptomyces lusitanus NBRC13464T	AB184424	98.927
Streptomyces violaceochromogenes NBRC13100T	AB184312	98.922
Streptomyces lakyrus NBRC13401T	AB184877	98.856
Streptomyces coerulescens ISP5146T	AY999720	98.850
Streptomyces bellus ISP5185T	AJ399476	98.847
Streptomyces luteogriseus NBRC13402T	AB184379	98.782
Streptomyces djakartensis NBRC15409T	AB184657	98.713

상기 표 1에서와 같이, 균주 WJ2는 Streptomyces longispororuber NBRC 13488^T, Streptomyces atrovirens NRRL B-16357^T, Streptomyces pilosus NBRC12807^T, Streptomyces flavoviridis NBRC12772^T, Streptomyces griseoflavus LMG19344^T, Streptomyces speibonae PK-Blue^T, Streptomyces viridodiastaticus NBRC13106^T, 및 Streptomyces albogriseolus NRRL B-1305^T 와 각각 99.42%, 99.35%, 99.14%, 99.14%, 98.92%, 98.92%, 98.92% 및 98.92%의 16S rRNA 유전자 염기서열 상동성을 보였다. 16S rRNA 유전자 염기서열을 근거로 하는 Neighbor-Joining 계통수(phylogenetic tree)에 있어서, 균주 WJ2는 Streptomyces atrovirens NRRL B-16357^T를 포함하는 클레이드(clade)를 형성하였다(도 2 참조). 계통수 결과를 기반으로 Streptomyces atrovirens NRRL B-16357^T 를 DNA-DNA hybridization 분석에서 대조균주로 사용하였다(Gause et al., 1983). 16S rRNA 유전자 염기서열 상동성 99% 이상을 포함하는 균주가 같은 종에 속하지 않을 수 있다는 것을 보여주는 다수 연구가 보고되었기 때문에(La Duc et al., 2004; Satomi et al., 2002), 균주 WJ2와 유전적으로 가장 근접한 대조균주 간의 DNA-DNA hybridization을 수행하였다 (도 3 참조).

DNA-DNA hybridization 분석을 위해서, LB 배지에서 배양된 균주 WJ2와 이의 대조균주인 Streptomyces atrovirens NRRL B-16357^T 의 균체로부터 Genomic DNA Extraction Kit(DyneBio, Korea)를 이용하여 유전체 DNA를 준비하였다. E. coli KCCM12119^T 는 음성대조군으로 사용하였다. DNA-DNA hybridization 실험은 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II를 사용하여 메뉴얼에 제시된 방법(Roche Applied Science, Germany)에 따라 수행하였고, 이의 hybridization signal을 Quantity One Program(Bio-rad, USA)으로 측정하였다. 균주 WJ2의 self-hybridization signal을 100%로 하여 값을 환산하였다.

이의 결과, Streptomyces longispororuber NBRC13488^T, Streptomyces pilosus NBRC12807^T, Streptomyces flavoviridis NBRC12772^T 와 같은 표준균주와 균주 WJ2의 DNA-DNA hybridization 값은 약 70%로 나타났다. 균주 WJ2 및 Streptomyces atrovirens NRRL B-16357^T 간의 DNA 연관성은 87%였으며, 이는 이들 균주들이 단일종임을 나타낸다(Van Trappen et al., 2001). 그러나, 균주 WJ2는 DNA-DNA hybridization 수준(90% 이하이나, 70% 이상)을 기준으로 하여 S. atrovirens의 신규 아종으로 분류되었다. 16S rRNA 유전자 염기서열 상동성(similarity) 검색, 계통발생학적 분석(phylogenetic analysis) 및 DNA-DNA hybridization 분석 결과를 바탕으로 균주 WJ2가 Streptomyces atrovirens의 신규 아종 박테리아로 분류될 수 있는 것으로 나타났고, 이에 따라 Streptomyces atrovirens WJ2로 명명하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열을 기준으로 하는 계통발생학적 분석에서, NJ 및 MP법에 의해 얻어진 계통수는 거의 동일한 tree topology를 보여주었다.

실시예 3. 균주 WJ2의 형태적-생리적 특성 분석

균의 형태적 특성을 알아보기 위해서, Gram stain kit(BD, USA)를 사용하여 제시된 방법에 따라 균체를 염색한 후 광학 현미경으로 관찰하였다. 이의 결과, 분리된 균주는 그람 양성균이고 호기성인 것으로 나타났다.

균주 WJ2의 탄소 이용 및 효소 생산은 API 20NE 와 API ZYM kit(Biomerieux, France)를 사용하여 제시된 방법에 따라 조사하였다. 단, 세균현탁액(bacterial suspension)은 1.0% NaCl 및 trace element가 첨가된 AUX 배지를 사용하여 준비하였다. 리보스타마이신(ribostamycin)(100㎍/㎖), 파로모마이신(paromomycin)(100㎍/㎖), 티오스트렙톤(thiostrepton)(100㎍/㎖), 카나마이신(kanamycin)(100㎍/㎖), 네오마이신(neomycin)(100㎍/㎖), 암피실린(ampicillin)(100㎍/㎖), 아프라마이신(apramycin)(100㎍/㎖) 및 클로람페니콜(chloramphenicol)(100㎍/㎖)과 같은 다양한 항생제에 대한 항생제 감수성(antibiotics susceptibility)을 종이 디스크 확산법(paper disk diffusion method)을 이용하여 LB 배지에서 측정하였다. 다양한 pH(pH4.0 ~ 11.0, pH 1.0 간격) 및 다양한 NaCl 농도(0 ~ 10%, 1% 간격)에서의 성장을 LB 고체배지를 이용하여 조사하였다.

균주 WJ2의 형태학적-생리학적 특성을 알아보기 위해서, LB, LBX(0.2% 자일란 첨가한 LB), ISP-2(BD, USA), ISP-4(BD, USA)와 같은 다양한 한천고체배지(agar plates)에서 40℃에서 5일간 배양하여 형태학적 변화 및 색소 생산을 관찰하였다.

이의 결과, 확산성 색소(Diffusible pigment)는 한천 배지, LB, ISP-2, ISP-4, 및 R2YE에서는 형성하지 않았다(Kieser et al., 2000). 회색 포자는 한천 배지(agar plates)에서 배양된 기균사(aerial mycelium)에 형성되었다(표 2 참조).

한천 배지 (Agar medium)	포자괴 (Spore mass)	기저균사체 (Substrate mycelium)	기중균사체 (Aerial mycelium)	가용성 색소 (Soluble pigments)
LB	없음	베이지	없음	없음
LBX*	없음	베이지	흰색	없음
ISP-2	풍부함, 회색	베이지	흰색	없음
ISP-4	풍부함, 회색	베이지	흰색	없음
R2YE	적음, 회색	베이지	흰색	없음

*LBX는 0.2% xylan을 함유하는 LB 배지임

또한, 15℃(매우 약함)와 50℃ 사이에서 생장이 관찰되었으나, 12℃ 및 55℃에서는 관찰되지 않았다. pH6.0 내지 pH10.0(pH10.0에서 약함)에서 생장이 관찰되었으나, pH5.0 및 pH11.0에서는 관찰되지 않았다. 균체(Cells)는 티오스트렙톤 (thiostrepton)(약), 네오마이신(neomycin)(약), 리보스타마이신(ribostamycin)(강), 및 파로모마이신(paromomycin)(강)에 감수성을 보인 반면, 암피실린(ampicillin), 카나마이신(kanamycin), 아프라마이신(apramycin) 및 클로람페니콜(chloramphenicol)에 내성을 나타냈다. 균주 WJ2는 질산 환원, 아가레이즈(agarase), 아밀라아제(amylase), 젤라티나제(gelatinase), 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase), 에스테라제(esterase)(C4), 에스테라제 리파제(esterase lipase)(C8), 류신 아릴아미다제(leucine arylamidase), 발린 아릴아미다제(valine arylamidase), 산 포스파타아제(acid phosphatase), 나프톨-AS-BI-포스포하이드롤라아제(naphtol-AS-BI-phosphohydrolase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), α-글루코시다아제(α-glucosidase) 및 α-만노시다제(α-mannosidase)에 대해 양성반응이었으나, 인돌 생산(indole production), 아르기닌 디하이드롤라아제(arginine dihydrolase), 우레아제(urease), 리파아제(lipase)(C14), 시스틴 알릴아미다제(cystine arylamidase), 트립신, α-키모트립신(α-chymotrypsin), α-갈락토시다아제(α-galactosidase), β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase), N-아세틸-β-글루코사미니다아제(N-acetyl-β-glucosaminidase)에 대해 음성반응이었고, α-푸코시다아제(α-fucosidase), β-글루코시다아제(β-glucosidase)는 6-브롬-2-naphythyl-β-D-글루코피라노사이드(6-Br-2-naphythyl-β-D-glucopyranoside) 가수분해(API ZYM strip)에 대해 음성반응이지만, 에스쿨린(esculin) 가수분해(API 20NE strip)에 대해 양성반응이었다. D-glucose, L-arabinose, D-mannose, D-mannitol, N-acetyl-glucosamine, D-maltose, potassium gluconate, adipic acid(약) 및 malic acid의 이용은 양성반응이었으나, trisodium citrate, capric acid 및 phenylacetic acid는 음성반응이었다. D-Glucose 발효는 음성반응이었다.

실시예 4. 균주 WJ2의 생화학적 특성 분석

균체 지방산을 Microbial Identification system(MIDI)를 이용한 gas chromatography(GC)에 의하여 Methyl esters로 분석하였다. Genome 내 DNA G+C content를 언급된 방법에 따라(Mesbah et al., 1989) reverse phase HPLC를 사용하여 분석하였다. 호흡 퀴논(Respiratory quinone)은 Komagata와 Suzuki(1987)에 의해서 언급된 방법에 따라서 reverse phase HPLC를 사용하여 분석하였다(Komagata and Suzuki, 1987).

이의 결과, 주요 지방산(4% 이상)은 C_15:0 Anteiso(36.19%), C_15:0 Iso(10.58%), C_16:0(10.20%), C_16:0 Iso(9.84%) 및 C_14:0 Iso(4.18%)였다. 총 균체 지방산 조성(≥ 1%)을 표 3에 나타내었다. 또한 DNA의 G+C content는 73.98mol% 이었다.

지방산	균주 WJ2 (%)
C14:0 Iso	4.18
C15:0 Iso	10.58
C15:0 Anteiso	36.19
C15:0	2.96
C16:1 Iso H	2.04
C16:0 Iso	9.84
C16:0	10.20
C16:0 9 Methyl	1.31
C17:1 Anteiso C	1.99
C17:0 Iso	2.52
C17:0 Anteiso	7.54

실시예 5. 균주 WJ2의 배지 조성의 최적화 특성 분석

자일라나아제 생산을 향상시키는 배양액 조성을 알아보기 위해서, 배지의 질소원 및 탄소원을 변경하였다. Hopwood et al(1985)에 의해 언급된 최소 배지를 기준으로 상기 0.2%(NH₄)₂SO₄, 0.05% K₂HPO₄, 0.02% MgSO₄·7H₂O, 0.001% FeSO₄·7H₂O, 및 0.1% beechwood xylan을 함유하는 고유 배지를 pH7.2로 준비하였다. 박토 펩톤(bacto peptone), 박토 트립톤(bacto tryptone), 소이톤(soytone), 효모 추출물(yeast extract), 고기 추출물(meat extract), 및 아스파라긴(asparagines)과 같은 다양한 질소원을 (NH₄)₂SO₄ 대신에 0.2%의 최종 농도로 고유 배지에 첨가하였다. 단독의 질소원으로서 0.2% 소이톤(soytone)을 함유하는 배지에 maltose, carboxyl methyl cellulose(CMC), glucose, xylan, xylose, sucrose, starch, 및 fructose와 같은 8종의 탄소원을 각각 0.1%의 최종 농도로 첨가하였다.

또한, 자일라나아제 생산에서 0.1 내지 0.5% 범위의 탄소원 농도 차이에 따른 효과를 측정하였다. 액체배양액을 일정한 간격으로 샘플링하고 10,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 균체를 제거한 상등액을 수득하였다. 자일라나아제 활성은 dinitrosalicylic acid(DNS)법(Miller, 1959)에 따라 540nm에서 측정하였다. 0.2%(w/v)의 beechwood xylan을 반응 용액에 기질로서 첨가하였다. 자일라나아제의 1 unit(U)은 상기 분석 조건 하에서 분(min) 당 1μmol의 자일로오스(xylose)를 생산하는 효소의 양으로 정의하였다. 검량선 제조를 위해 자일로오스를 참조 환원당으로 사용하였다.

발효를 위한 배지 조성을 알아보기 위하여, 자일라나아제 생산에 대한 다양한 질소원 및 탄소원의 효과를 조사하였다. 이의 결과, 0.2% 소이톤(soytone)은 황산암모늄(ammonium sulfate) 보다 4배 높은 자일라나아제 생산을 나타냈으므로, 소이톤(soytone)을 테스트된 질소원 중에 가장 좋은 질소원으로 선택하였다(도 4 참조). 자일란(xylan)은 다른 탄소원 보다 약 2배 자일라나아제 생산을 향상시키므로, 가장 좋은 탄소원으로 선택하였다(도 5 참조). 또한, 자일라나아제 생산에 대한 자일란 농도의 가장 좋은 효과는 0.3%로 나타났다(도 6 참조). 따라서, 0.2% soytone, 0.05% K₂HPO₄, 0.02% MgSO₄·7H₂O, 0.001% FeSO₄·7H₂O, 및 0.3% 자일란으로 구성되는 pH7.2의 최적화된 배지를 균주 WJ2의 발효에 사용하였다.

균주 WJ2를 최적화된 배지에 접종하여 교반하면서 40℃에서 4일 동안 배양하였다. 도 7은 개량 배지에서 본 발명의 미생물인 WJ2의 균체 생산 및 자일라나아제 활성을 나타내는 그래프이다(■, 고유 배지에서의 균체 성장; ●, 최적화된 배지로부터의 균체 성장; □, 고유 배지에서의 자일라나아제 활성; ○, 최적화된 배지로부터의 자일라나아제). 도 7에서와 같이, 활성 균체량은 2일 배양까지 급격하게 상승되었고 가장 높은 자일라나아제 생산이 2일 및 3일 배양에서 나타나는 동안 천천히 감소하였고, 그 후에 자일라나아제 생산의 감소가 관찰되었다. 반면에, 고유 배지에서의 균체 성장은 상대적으로 낮은 수준이었으며, 자일라나아제 생산은 또한 매우 낮은 수준이었다. 따라서 배지 중의 자일란은 자일란을 분해함으로써 더욱 성장을 용이하게 하도록 작용하는 자일라나아제 생산을 위한 제한된 탄소원으로 간주될 수 있다.

실시예 6. 균주 WJ2의 자일라나아제 활성을 위한 최적 조건 특성 분석

균체 및 자일라나아제 생산 특성을 확인하기 위하여, 균주 WJ2를 0.2% 소이톤(soytone), 0.05% K₂HPO₄, 0.02% MgSO₄·7H₂O, 0.001% FeSO₄·7H₂O, 및 0.3% beechwood xylan, pH 7.2로 이루어지는 최적화된 배지에서 배양하였고 일정한 간격으로 샘플링하였다. 배양액으로부터 균체량(wet cell weight)을 측정하여 성장 곡선을 확인하였고 균체가 제거된 배양액을 20분 동안 14,000rpm에서 원심 분리하고 수집하여 자일라나아제 활성을 측정하였다. 균체가 제거된 배양액의 자일라나아제 활성을 0.2%(w/v) 자일란을 기질로서 이용하여 dinitrosalicylic acid(DNS)법(Miller, 1959)에 의해 측정하였다. 반응은 40℃에서 30분 동안 수행하였다. 자일라나아제 활성의 1unit(U)은 상기 분석 조건 하에서 분 당 1μmol의 자일로오스를 생산하는 효소의 양으로 정의하였다. 검량선 제조를 위해 자일로오스를 표준 환원당으로 사용하였다.

자일라나아제 활성의 최적 pH를 측정하기 위하여, 최적 pH 조건을 다양한 pH 조건의 40℃에서 측정하였다. 20mM MOPS 완충액(pH 6.0 ~ 7.0)과 20mM Tris-Cl 완충액(pH 7.0 ~ 9.0)을 각각 사용하였다. 이의 결과, 균주 WJ2의 조효소는 40℃에서 반응할 때 가장 높은 총 자일라나아제 활성을 나타냈다. 도 8은 본 발명의 미생물의 자일라나아제 활성을 위한 pH 조건의 효과를 나타내는 그래프이다(●, 20 mM MOPS 완충액; ■, 20 mM Tris-Cl 완충액). pH 7.0에서 얻어진 값을 100% 로 하였으며, 모든 데이타는 적어도 3회 반복 실험으로부터 얻어진 평균값이다. 도 8에서 보는 바와 같이, pH 6.0 및 8.0에서 상대적 활성은 최대 활성의 약 70% 였다.

자일라나아제 활성의 최적 온도를 측정하기 위하여, 20mM Tris-Cl 완충액 (pH 7.0)에서 45 내지 70℃(5℃ 간격)를 범위로 하는 상이한 온도에서 측정하였다. 도 9는 본 발명의 미생물의 자일라나아제 활성을 위한 온도 조건의 효과를 나타내는 그래프이다. 55℃에서 얻어진 값을 100%로 하였다. 상대 활성도는 3회의 독립적인 실험의 평균값이다. 도 9에서 보는 바와 같이, pH 7.0에서 반응할 때 55℃에서 최대 활성을 나타냈다.

열안정성(Thermostability)을 측정하기 위하여, 효소를 2시간 동안 55 내지 65℃(5℃ 간격)를 범위로 하는 상이한 온도에서 예비-배양시키면서 일정한 간격으로 효소 반응액을 샘플링하였다. 잔존 효소 활성을 55℃에서 30분 동안 측정하였다. 이의 결과, 자일라나아제 활성은 60℃ 및 65℃에서 각각 약 80% 및 50%였다. 총 자일라나아제 활성은 55℃에서 20분 동안 약 50%로 유지되었고, 그 후 120분 배양에서 약 30%로 감소되었다. 그러나, 60℃에서 30분, 65℃에서 20분 동안 활성을 거의 잃는 것으로 나타났다. 0(zero)-배양 시간에서 얻어진 값을 100%로 하여 값을 환산하였다. 상대 활성도는 3회의 독립 실험의 평균값이다(도 10 참조).

실시예 7. 자일란 가수분해산물 분석

균주 WJ2의 자일라나아제에 의한 자일란의 가수분해산물을 분석하기 위해서, 0.5% beechwood xylan을 함유하는 pH 7.0의 20mM Tris-Cl에 조효소액(crude enzyme)을 최종 부피 80 ㎕로 혼합하였다. 이 반응혼합물을 55℃에서 2일 동안 배양하여 일정한 간격으로 샘플링하였다. 반응혼합물의 15㎕를 Silica gel 60 plate(Merck, Germany)에 가하고, n-부탄올:아세트산:증류수(2:1:2, v/v/v)의 용매 시스템에서 이중으로 전개하였으며, 이후 100%(w/v) EtOH 중 10%(w/v) 황산을 분무하고 플레이트를 120℃에서 가열하여 발색시켰다.

이의 결과, 자일란의 해중합(depolymerization)으로 자일로트리오스(xylotriose) 및 자일로테트라오스(xylotetraose) 해당하는 스팟이 주로 나타났다(도 11 참조). 또한, 추가 배양을 통해 자일로비오스(xylobiose)를 검출할 수 있었다. 자일란 가수분해 산물의 TLC 분석을 통해 균주 WJ2는 주요한 최종분해산물로 자일란을 자일로비오스(xylobiose) 및 자일로트리오스(xylotriose)로 분해하는 엔도타입 자일라나아제(endo-type xylanase)를 생산한다는 것을 확인하였다.

산업에 적합한 자일라나아제를 생산하는 미생물의 동정 및 특성은 이의 성공적인 생명 공학 응용을 위한 중요한 전제 조건이다. 높은 온도에서 활성이 있고 안정한 자일라나아제는 다양한 산업에 유용하다. 본 발명에서, 토양 샘플에서 동정한 Streptomyces atrovirens WJ2는 균체외(extracellular) 적정한 내열성(thermotolerant) 자일라나아제의 우수한 생산자임을 발견하였다. 산업용 효소의 다량 생산을 위해, 배양 배지의 조건 및 활성은 중요한 요소 중 하나를 구성한다(Bajaj et al., 2010; Gupta et al., 2001). 균주 WJ2는 가장 효율적인 질소원으로 소이톤(soytone)을 이용하였다. 그러나, 펩톤, 트립톤, 효모 추출물(yeast extract), 고기 추출물(meat extract), 아스파라긴, 황산 암모늄 및 대두박은 다양한 미생물에 의해 자일라나아제의 생산 향상을 위한 좋은 질소원으로 또한 알려져 있다(Bajaj et al., 2010; Sharma et al., 2005; Virupakshi et al., 2005; Sa Pereria et al., 2002; Bakri et al., 2003; Ding et al., 2004; Subramanian et al., 2001). 자일란이 균주 WJ2에 의해 자일라나아제의 생산을 위한 가장 좋은 탄소원일 수 있음을 발견했다. 이는 균주 WJ2에 의한 자일라나아제의 생산이 배지 중 자일란의 존재에 매우 의존적이며, 이의 암호화 유전자(들)(encoding gene(s))의 발현이 자일란 분해 필요성에 따라 발현되도록 규제될 수 있음을 의미한다. Maltose, CMC, glucose, sucrose, xylose, starch, 및 fructose를 포함하는 다른 탄소원은 비교적 낮은 수준의 자일라나아제 생산을 나타냈으며, 이는 탄소 이화 대사 억제(carbon catabolite repression, CCR)에 따른 것일 수 있다(Bajaj et al., 2010; Virupakshi et al., 2005). 이와 같이 변경된 배지는 균체외 자일라나아제를 생산하는 미생물을 배양하기 위한 상당한 이점을 보여 주었다. 변경 배지에서의 균주 WJ2의 배양에 의한 균체량 및 총 자일라나아제 활성은 LB 배지에서 관찰되는 것보다 약 9배 더 높았다. 균주 WJ2은 pH7.0 및 55℃에서 최대의 총 자일라나아제 활성을 나타냈으며, 이것은 스트렙토마이세스에서 공지된 다른 자일라나아제의 대부분의 경우 pH 5.0 ~ 7.0 및 50 ~ 65℃에서 최적 활성의 평균 범위 내에 있는 것이다(Bajaj et al., 2010; Wang et al., 2003; Techapun et al., 2002; Georis et al., 2000). 균주 WJ2의 이러한 속성 및 총 자일라나아제는 박테리아 균주가 바이오연료 생산, 펄프의 생물학적 표백, 그리고 식품 및 제빵 산업용 리그노셀룰로오스계 바이오매스 (lignocellulosic biomass)의 활용을 포함하는 산업 공정에서 사용하기에 적합할 수 있음을 나타냈다. 본 발명에서는 한국의 제주도에서 분리된 토양 균주로부터 배지 조성의 변경을 통해 자일라나아제를 생산할 수 있다는 것을 밝혔다. 자일라나아제를 생산하는 미생물에 대해 많은 연구가 보고 되었으나, S. atrovirens으로부터 자일라나아제를 생산하는 것은 본 발명을 통해 처음으로 확인되었다.

농업생명공학연구원 KACC92087 20150916

Claims (3)

1. 자일란(xylan) 분해 활성을 갖는 토양 유래 스트렙토마이세스 아트로비랜스(Streptomyces atrovirens) WJ2(수탁번호 KACC92087P).
2. 제 1항의 미생물을 이용하는 것을 특징으로 하는 자일란 분해 방법.
3. 제 1항의 미생물을 배양하되, 배양 배지에 자일란을 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 자일란 분해 효소 생산 방법.
   

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