CN113416657A - 一株淡紫拟青霉m-1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株淡紫拟青霉M‑1及其应用。淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)M‑1于2019年3月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：中国广东省广州市先烈中路100号59号楼5楼，保藏编号为GDMCCNo：60596。本发明获得了淡紫拟青霉M‑1，并将淡紫拟青霉M‑1孢子悬浮剂接种于羽毛基础培养基(天然羽毛10g/L，氯化钠0.5g/L，磷酸二氢钠0.1035g/L，磷酸氢二钠1.3277g/L)，培养3天后，羽毛基本被降解，羽毛降解率达到92.24％，同时发酵液中角蛋白酶活性达到63.24U/mL，表明本发明的淡紫拟青霉M‑1具有快速降解羽毛的能力，经测定，发酵3天获得的氨基酸溶液中复合氨基酸种类齐全，氨基酸含量达到2.9755g/kg。因此可以用其降解羽毛生产含氨基酸水溶肥。

Description

一株淡紫拟青霉M-1及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株淡紫拟青霉M-1及其应用。
背景技术
羽毛是家禽处理后剩余的废弃物，在全世界的范围内，每年有数百万吨羽毛废弃物产生，而我国每年产生的废弃羽毛将近70万t，固体废弃物的管理问题成了家禽屠宰企业亟待解决的问题。然而羽毛废弃物是一种丰富的天然蛋白质资源，其粗蛋白含量高达85％-90％，也含有维生素B12和一些未知的生长因子。羽毛蛋白中除赖氨酸、蛋氨酸的含量明显较低外，其它动物必需氨基酸的组成略高于鱼粉，这意味着利用羽毛蛋白质水解生产复合氨基酸具有潜在的经济效益。但禽类羽毛中的蛋白质主要由角质蛋白构成，角蛋白中含有较多的胱氨酸，他们之间形成大量的二硫键，再加上氢键和分子间作用力很难被普通蛋白酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等)水解。利用高温高压蒸煮、酶解法、膨化、酸碱水解和利用氧化剂或者还原等传统方法加工处理废弃羽毛，氨基酸破坏严重、酶制剂成本高、能耗高、污染大等问题，而利用微生物对角蛋白进行降解可以提高水解产物的营养价值，降低能耗、成本以及对环境的污染问题，是一种环境友好型的废弃物资源化利用方式。
自然界中有多种微生物可以降解羽毛角蛋白，自1899年Ward报道了真菌马爪甲团囊菌(Onygenaequina)能分解角蛋白以来，迄今为止已发现30多种，主要包括细菌类的芽孢杆菌属、真菌类的曲霉属和放线菌的链霉菌属。
我国在羽毛角蛋白分解菌的筛选及应用方面的研究落后于国外，分离筛选出的高效菌株并不多，并多是芽孢杆菌类和放线菌，绝大多数都不在中国农业菌种目录里面，生物安全性有待验证，因而筛选高角蛋白酶活性且具有生物安全性的新菌群也是一个研究热点。羽毛废弃物经过适当处理，使废弃的羽毛角蛋白直接转变成复合氨基酸或相应产物，从而变废为宝，既能保护环境又能加强资源化利用，这将具有十分显著的经济效益和深远的社会效益。
发明内容
本发明之目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种具有生物安全性的高效角蛋白降解性能的淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)M-1，该菌于2019年3月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：中国广东省广州市先烈中路100号59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：60596。
本发明还提供上述淡紫拟青霉M-1在降解羽毛中的应用。
优选，是淡紫拟青霉M-1在降解羽毛生产含氨基酸水溶肥中的应用。
优选，是淡紫拟青霉M-1在降解羽毛生产角蛋白酶中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种降解羽毛的方法，将淡紫拟青霉M-1接种到羽毛上进行降解。
优选，将淡紫拟青霉M-1接种到羽毛上进行降解获得角蛋白酶和/或氨基酸。
本发明获得了淡紫拟青霉M-1，并将淡紫拟青霉M-1孢子悬浮剂接种于羽毛基础培养基(天然羽毛10g/L，氯化钠0.5g/L，磷酸二氢钠0.1035g/L，磷酸氢二钠1.3277g/L)，培养3天后，羽毛基本被降解，羽毛降解率达到92.24％，同时发酵液中角蛋白酶活性达到63.24U/mL，表明本发明的淡紫拟青霉M-1具有快速降解羽毛的能力，经测定，发酵3天获得的氨基酸溶液中复合氨基酸种类齐全，氨基酸含量达到2.9755g/kg。因此可以用其降解羽毛生产含氨基酸水溶肥。
Paecilomyces lilacinus M-1于2019年3月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：中国广东省广州市先烈中路100号59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：60596
附图说明
图1为淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)M-1菌落形态图。
图2为淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)M-1显微形态图。
图3为淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)M-1系统发育树图。
图4为淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)M-1降解羽毛的效果图，其中锥形瓶M-1为加入淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)M-1的实验组，锥形瓶CK为空白对照组。
图5为淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)M-1降解羽毛得到复合氨基酸溶液中氨基酸谱图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例进一步解释本发明，但不对本发明构成任何限定。以下实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。
实施例1淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)M-1的分离
本发明所述的淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)M-1，从根结线虫卵囊中分离获得，根结线虫卵囊采自华南地区带有大量根结线虫卵囊的番茄病根。
将带有大量卵囊的病根洗净，在解剖镜下挑取多个卵囊，用1％的次氯酸钠表面消毒3min,用无菌水漂洗4～5次，然后卵囊多个悬浮于90mL 0.05％的吐温80溶液中，并用镊子捣碎卵囊，振荡摇匀30min，然后静置15min。将0.1mL悬浮液接种于孟加拉红琼脂培养基平板上，用三角涂布棒均匀涂布。28℃下，恒温培养3-6d，然后用接种环于单菌落上挑取菌丝，接种于PDA平板上继续培养，纯化后保存于4℃冰箱中备用。挑选纯化后单菌落菌丝于基础盐羽毛培养基中，置于28℃摇床，180rpm培养，以未接种的培养基作对照，观察羽毛降解情况。
孟加拉红培养基配方：蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸二氢钾10g/L，硫酸镁0.5g/L，琼脂15g/L，孟加拉红0.03g/L，氯霉素0.1g/L，溶剂为水。
PDA培养基配方：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，溶剂为水。
基础盐羽毛培养基配方：天然羽毛10g/L，氯化钠0.5g/L，磷酸二氢钠0.1035g/L，磷酸氢二钠1.3277g/L。经过基础盐羽毛培养基的进一步培养，筛选出分解羽毛效率最高的真菌，编号M-1。
实施例2菌株M-1的鉴定
1、实施例1筛选菌株M-1菌落形态：该菌株在PDA培养基上，菌落圆形隆起，菌丝致密，表面无分泌物。培养初期菌落颜色为白色，产孢后呈淡紫色，富生粉质状的分生孢子。菌落方面呈黄色(图1)。
2、显微形态：分生孢子梗单生或聚集成孢梗束，长度为18-36um。通常3-5个瓶梗着生于分生孢子梗顶部，瓶梗几部柱状或瓶状，向上变为细长管状，大小为(7.6～9.1)um×(1.8～3.2)um。分生孢子为单细胞，卵形或纺锥形，大小为(1.5～2.8)um×(1.3～2.5)um，在孢子梗上呈链状排列(图2)。
3、菌株的稳定性：该菌株生长温度范围在15～37℃，最适生长温度为30℃，生长pH值为5.5～8.0，最适宜pH值为7.0。
4、分子生物学鉴定
4.1DNA提取：将菌株M-1划线接种在PDA培养基的平板上，30℃培养3d后，小心挂去菌丝体于研钵中，采用CTAB法提取该菌株DNA。
4.2rDNA-ITS基因PCR扩增
PCR引物由上海生工公司合成。
Primer A：B5.1F 5’-CGACCCGGCCAACTTTGA-3’Primer B：B3.1R 5’-GTCTTCCAGTACCACTACGCC-3’
PCR反应体系如下：
10×PCRbuffer 5uL
2mmol/LdNTP 4uL
10pmol/LPrimerA 1uL
10pmol/LPrimerB 1uL
2U/LTaq酶 0.4uL
DNA模板 1uL
灭菌ddH<sub>2</sub>O 37.4uL
总体积 50uL
PCR扩增条件：95℃5min；95℃50s，56℃50s,72℃90s，30个循环；72℃10min；4℃保藏。采用1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)回收纯化PCR产物。
4.3序列测定：
PCR产物纯化后，送上海美吉公司进行测序，其序列如SEQ ID NO:1所示。该序列与NCBI数据库已知标准菌株比对表明，该菌株与淡紫拟青霉(Purpureocillium lilacinus)的同源性最高，达99％。应用MEGA7.0软件采用Neighbor-Joining法绘制系统发育树(见于图3)，确定其进化地位，结合其形态特征和生理生化特征，该菌株分类地位属于真菌界(Eumycetes)、半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝孢纲(Hyphmycetes)、丝孢目(Hphomycetales)、丛梗孢科(Monilaceae)、拟青霉属(Paecilomyces)、淡紫拟青霉种(Paecilomyces lilacinus)，并命名为淡紫拟青霉(Purpureocillium lilacinus)M-1，该菌于2019年03月01日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No:60596。
实施例3淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)M-1发酵降解纯羽毛生产复合氨基酸溶液及其相关指标测定。
(1)羽毛原料的预处理：将鸡羽毛用粉碎机破碎，成蓬松的絮状。
(2)淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)M-1种子液制备：将实施例1筛选出的淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)M-1接种到PDA固体培养基平板上，30℃培养144h，使其活化；将上述活化的种子转接到PDA液体种子培养基中，培养72h。
(3)将预处理后的羽毛与无机盐溶液按照质量比1:100的比例混合，加入质量比5％的淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)M-1种子液，在30℃下，200rpm下培养3d，得到复合氨基酸溶液，观察羽毛的降解情况(见图4)，测定羽毛降解率，角蛋白酶活以及复合氨基酸溶液中氨基酸种类及含量。所述无机盐溶液成分如下：Nacl 0.5g/L；NaH2PO40.1035 g/L；Na2HPO41.3277g/L，溶剂为水。
(4)羽毛降解率测定：将复合氨基酸溶液先用溶壁酶对菌丝体进行破壁处理，然后用200目过滤，用蒸馏水把菌丝体冲洗掉，收集滤渣于105℃烘干至恒重，计算降解率。
羽毛降解率(％)＝(对照样品干重-实验样品干重)/对照样品干重×100。
(5)角蛋白酶活性的测定按照文献“Gradisar H,Kern S,FriedrichJ.Keratinase of Doratomyces microsporus.Appl Microbiol Biotechnol[J].AppliedMicrobiology&Biotechnology,2000,53(2):196-200.”所描述的方法为基础，并加以修改。具体方法为：将复合氨基酸溶液用2层纱布过滤，去滤液，12000×g，4℃离心10min，取上清液1.0mL加入2.0mL 0.05mol/LTris/HCl缓冲液(pH7.5)与10mg羽毛粉底物，37℃恒温水浴锅反应，100rpm保温处理1h。反应结束时添加2.0mL 10％三氯乙酸终止反应，10000×g离心15min。上清液于595nm下测定其吸光值，采用保温前添加TCA的反应管作为对照。酶活单位定义：实验条件下，单位mL分解角蛋白产生的酶量是ΔOD595值升高0.001个单位所需的酶量为一个活力单位(U)。
(6)复合氨基酸溶液中水溶性游离氨基酸测定：取5mL复合氨基酸溶液至10mL比色管中，加ddH2O定容至10mL，静置过夜。取2mL上清液至10mL离心管中，加入2mL磺基水杨酸，混匀，静置1h使蛋白沉淀。加入1mL EDTA和1mL盐酸后4℃、6000×g离心15min(或用0.22μm微孔滤膜过滤)。取上清液1mL至培养皿中，蒸干。加入1mL 20mmol/LHCl溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤。至少取500μL至进样瓶。用L-8900全自动氨基酸分析仪测定。
测试结果发现，培养基中羽毛被降解(见图4)，发酵3天后对羽毛的降解率达到92.24％，同时发酵液中角蛋白酶活性达到63.24U/mL，表明本发明所述淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)M-1具有快速降解羽毛的能力，经测定，发酵3天获得的氨基酸溶液中复合氨基酸种类齐全，氨基酸含量达到2.9755g/kg，氨基酸谱图见图5。因此可将淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)M-1用于羽毛的降解和资源化利用，以及角蛋白酶的生产。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施内容方式不收上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、代替、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
<120> 一株淡紫拟青霉M-1及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 510
<212> DNA
<213> 淡紫拟青霉M-1(Paecilomyces lilacinus)
<400> 1
gaccttacct cagttgcctc ggcgggaccg ccccggccgc cgcgcaagcg gcgccggact 60
ccaaggcgcc ggccgcaggg acccaaaact cttttgcatt acgcccaacg gcgggaattt 120
tttctctgag tgcataagca aaacaaatga atcaaaactt tcaacaacgg atctcttggt 180
tctggcatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc agaattcagt 240
gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg cccgccagca ttctggcggg catgcctgtt 300
cgagcgtcat ttcaaccctc gagccccccc gggggcctcg gtgttggggg acggcacacc 360
agccgccccc gaaatgcagt ggcgacctcg ccgcagcctc ccctgcgtag tagcacacac 420
ctcgcaccgc agcgcggaga cggtcacgcc gtaaaacgcc caacttctta gagttgacct 480
cggatcaggt aggaataccc gctgaactta 510

Claims (6)

1.淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)M-1，保藏编号为GDMCCNo：60596。
2.权利要求1所述的淡紫拟青霉M-1在降解羽毛中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是淡紫拟青霉M-1在降解羽毛生产含氨基酸水溶肥中的应用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是淡紫拟青霉M-1在降解羽毛生产角蛋白酶中的应用。
5.一种降解羽毛的方法，其特征在于，将权利要求1所述的淡紫拟青霉M-1接种到羽毛上进行降解。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，是将淡紫拟青霉M-1接种到羽毛上进行降解获得角蛋白酶和/或氨基酸。
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