CN102168099A - 3-甾酮-△1-脱氢酶和工程菌及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了3-甾酮-△1-脱氢酶基因及其编码的胆固醇氧化酶，提供了含有其基因序列的表达载体和含有该表达载体的基因工程重组菌株，提供了制备该3-甾酮-△1-脱氢酶的方法。本发明提供的3-甾酮-△1-脱氢酶为一新的3-甾酮-△1-脱氢酶，本发明提供的重组菌株可用于转化3-酮基甾体化合物，其中优选的重组菌株还可用于将雄甾-4-烯-3，17-二酮转化为宝丹酮，且表达的目的蛋白为可溶性蛋白，打破了以往工业生产中膜蛋白的瓶颈，对于KSDD的工业化生产具有重大意义。还实现甾体化合物的微生物转化法生产，提高了甾体医药生产体系的生产效率与产品品质，降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，更具体地，涉及一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶和工程菌及应用。
背景技术
许多真菌，例如Aspergillus sp.、Metarhizium sp.、Fusarium sp.、Neurospora sp.、Neosartorya sp.等，可产生甾型抗生素。甾体型抗生素包括烟曲霉酸、夫西地酸及相关类似物，其中，结构式I分别显示了环戊烷多氢菲(Cyclopentanoperhydrophen antrene)、胆固醇(Cholesterol)、烟曲霉酸(Helvolic acid)与夫西地酸(Fusidic acid)的结构。这些甾型抗生素对细菌具有较好的抑制作用，例如夫西地酸在临床上已应用三十多年；但是，对于一些真菌而已，甾型抗生素又会是一种重要致病性毒力因子，例如烟曲霉酸是金龟子绿僵菌杀昆虫的一种毒力因子。
式I
目前工业上制备甾体药物雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(androsta-1，4-diene-3，17-dione，简称ADD)主要途径是分支杆菌以植物甾醇为原料转化生产雄甾-4-烯-3，17- 二酮(AD)/ADD混合液，再从中分离雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)，但利用植物甾醇等为底物进行微生物转化的一个显著问题是生物转化的最终产物典型地含有显著的AD和ADD。由于AD和ADD具有相似的化学结构，将这两种甾类化合物进行相互分离是困难和昂贵的。
由于3-甾酮-1-脱氢酶(KSDD)可催化3-酮基甾体化合物的C1，2位脱氢反应，该反应如图1所示。因此，另一种途径是构建表达3-甾酮-1-脱氢酶基因(ksdD)的工程菌，但由于细菌来源的ksdD基因均表达膜蛋白，极大地了该蛋白在工业上的应用。
因此，有必要对此加以改进，以解决AD、ADD难以分离的工业难题，从而打破工业生产ADD的瓶颈。
发明内容
在对烟曲霉的研究过程中，本申请的发明人从金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopise)中寻找到烟曲霉酸基因簇，并成功克隆到3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因，经测序比对发现来源于金龟子绿僵菌的烟曲霉酸基因未经报道，为一新发现的基因。因此，本发明的目的之一在于提供一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶及其基因；目的之二是提供包括该3-甾酮-Δ1-脱氢酶的表达载体和利用该载体转化的重组微生物，如基因工程菌株；目的之三是提供该3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因工程菌株的应用。
本发明的3-甾酮-Δ1-脱氢酶得自金龟子绿僵菌。本发明采用的技术方案是：构建金龟子绿僵菌基因文库，并从文库中钓取3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因(如SEQ ID NO：1所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)。当然，如本领域的技术人员所知，本发明的3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因还可以是编码由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其他核苷酸序列；而本发明的3-甾酮-Δ1-脱氢酶不仅限是具有序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，还可以是将SEQ ID NO：2中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有相同酶活性的由序列2衍生的蛋白质，比如在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，如与载体编码的氨基酸融合、不影响序列的修饰形式上的差异等情况。
本发明提供的包括3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因的核苷酸序列的表达载体是用常规方法将本发明的3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成，该载体可以是市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，如pUC，pBluescript(Stratagene)，pET(Novagen，Inc.，Madison，Wis)，PQE(Qiagen)，pREP，pSE420和pLEX(Invitrogen)，但不限于这些载体。
较佳的是将PCR扩增到的3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因产物和表达载体pPIC3.5K连接得到重组质粒。
本发明提供的转化体，其是将包含本发明的3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因核苷酸序列的表达载体转化到宿主微生物，如感受态毕赤酵母KM71或GS115中得到基因工程菌。
其中，该宿主细胞可以为原核、真核微生物或昆虫等。较佳的是毕赤酵母，得到相应的转化体为上述的基因工程菌株。
本发明提供的3-甾酮-Δ1-脱氢酶重组菌株可用于转化3-酮基甾体化合物，优选的还可用于将雄甾-4-烯-3，17-二酮转化为宝丹酮的应用。
在本发明中，3-酮基甾体化合物可以是所有的现有3-甾酮-1-烯甾体化合物，常见的有：双稀醇酮醋酸酯、黄体酮、可的松、氢化可的松、霉菌氧化物、雄甾-1-烯-3，17-二酮、睾酮等以及这些化合物的相应衍生物。本发明中，我们表达该真菌源蛋白将底物雄甾-4-烯-3，17-二酮(androsta-4-ene-3，17-dione，简称AD)转化为雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(androsta-1，4-diene-3，17-dione，简称ADD)，其反应如图2所示；优选的菌株还可将雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)转化为宝丹酮(boldenone)，其反应如图3所示。除AD外，我们还尝试了一系列的底物谱，例如黄体酮，氢化可的松等，也获得了良好的转化效果。
本发明提供的真菌源的3-甾酮-Δ1-脱氢酶与其它细菌来源的3-甾酮-Δ1-脱氢酶相比，其优势主要体现在：目前发现的细菌来源的3-甾酮-Δ1-脱氢酶均为膜结合蛋白，在酶蛋白中有跨膜区域(或称插入膜的区域)，对这些酶进行异源表达构建基因工程的难度非常大，表达这些酶的基因工程菌大都活性很低、所表达的酶蛋白经常不具有正常的活性；而本发明发现真菌源3-甾酮-Δ1-脱氢酶，其蛋白序列中不存在跨膜区域，可以在异源微生物中进行可溶性表达，我们在酵母中对其进行了异源表达构建，获得了高活性表达3-甾酮-Δ1-脱氢酶并展现高催化3-酮基甾体化合物C1，2脱氢活性的基因工程菌。
本发明提供的重组菌株能够高效积累雄甾二烯二酮和宝丹酮，且其表达的目的蛋白为可溶性蛋白，打破了以往工业生产中膜蛋白的瓶颈，对于KSDD的工业化生产具有重大意义。使用本发明提供的重组菌株可实现许多甾体化合物的微生物转化法生产，可以大大提高甾体医药生产体系的生产效率与产品品质，有助于降低甾体药物生产过程中的能耗、提高药物前提的利用率、简化生产步骤，降低生产成本，且反应条件温和、环境友好，适合于大力推广应用，具有较高的经济效益和社会效益。
附图说明
图1为甾体1-位脱氢反应示意图，其中，R为电子传递受体。
图2为微生物降解甾醇制备AD与ADD反应式与关键酶示意图。
图3为雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)转化为宝丹酮(boldenone)的反应式与关键酶示意图。
图4-1为3-甾酮-1-脱氢酶基因(ksdD)的克隆，ksdD大小约1.8k；图4-2为pPIC3.5K-ksdD用EcoRI和NotI酶切的验证结果，其中，1为pPIC3.5K-ksdD，2为pPIC3.5K。
图5为毕赤酵母KM71-ksdD和GS115-ksdD重组子PCR鉴定的电泳结果。其中1，2，3分别是毕赤酵母空宿主、KM71-ksdD和GS115-ksdD用引物对1克隆ksdD基因的结果，4，5，6分别是毕赤酵母空宿主、KM71-ksdD和GS115-ksdD用引物对3克隆乙醇脱氢酶的结果。
图6为毕赤酵母KM71-ksdD和GS115-ksdD的生长曲线。
图7为毕赤酵母KM71-ksdD和GS115-ksdD蛋白电泳结果，其中，1为毕赤酵母空宿主，2、3分别为KM71-ksdD、GS115-ksdD蛋白表达结果，目的蛋白在66.4KDa左右。
图8为毕赤酵母工程菌KM71-ksdD转化底物AD的实验，其中，1、2、3、4摇瓶底物AD的终浓度分别为1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L，其中条带2为雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)，条带1为底物雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)。
图9为毕赤酵母工程菌GS115-ksdD转化底物AD的实验，其中，1、2、3、4摇瓶底物AD的终浓度分别为1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L，其中条带2为雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)，条带1为底物雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)。
图10为毕赤酵母工程菌GS115-ksdD积累宝丹酮的优化实验，其中，各摇瓶内底物AD的终浓度均为1.5g/L，2、3、4分别添加2％、3％和4％葡萄糖培养基，1为对照。其中条带1为雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)，条带2为宝丹酮。
图11为毕赤酵母工程菌KM71-ksdD转化底物1.0g/LAD发酵液HPLC结果，其中，图11-1为空宿主投加1.0g/L AD的检测结果，图11-2为毕赤酵母工程菌KM71-ksdD投加1.0g/L AD的检测结果。
图12为筛选高效积累雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮和宝丹酮的毕赤酵母菌株的技术路线图。
具体实施方式
为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。
本申请所采用的基因操作技术主要有：基因表达技术。基因表达技术，主要是指染色体整合式的单拷贝或多拷贝3-甾酮-1-脱氢酶基因的表达方式。
在本发明的实施例中使用的毕赤酵母Pichia patoris KM71、Pichia patoris GS115及pPIC3.5K载体均购自Novagen公司，引物均由英俊(invitrogen)公司合成。
本发明所指甾体化合物底物为3-酮基甾体化合物，包括双稀醇酮醋酸酯、黄体酮、可的松、氢化可的松、霉菌氧化物、雄甾-1-烯-3，17-二酮、睾酮等以及这些化合物的相应衍生物。
本发明所指甾体化合物产物为3-酮基甾体化合物，一般为AD、ADD等衍生物，本发明仅以产ADD的工程菌株为例，其余转化黄体酮、氢化可的松等衍生物的工程菌株与产ADD的工程菌株在涉及本发明的3-甾酮-1-脱氢酶相关方面无任何差异，因此，本发明虽以产ADD的工程菌株为例，但并不局限于产ADD的工程菌株。任何具有普通基因操作技能的人均可按照本发明的内容，构建与3-甾酮-1-脱氢酶相关的积累ADD及其衍生物的工程菌株。
在本发明的下述实施例中，
Luria Bertani培养基的配方如下：1％蛋白胨，0.5％酵母粉，1％氯化钠；
BMGY培养基的配方如下：1％酵母粉，2％蛋白胨，100mM磷酸钾，pH 7.0，1.34％无氨基酵母氮源，4×10-5％生物素，1％甘油；
BMMY培养基的配方如下：1％酵母粉，2％蛋白胨，100mM磷酸钾，pH 7.0，1.34％无氨基酵母氮源，4×10-5％生物素，0.5％甲醇；
YPD液体培养基培养的配方如下：1％酵母粉，2％蛋白胨，1％葡萄糖；
MD固体培养基配方如下：1.34％无氨基酵母氮源，4×10-5％生物素，2％葡萄糖，1.5％琼脂粉。
在本发明的下述实施例中，薄层层析(TLC)的制备条件如下：
展层剂采用石油醚∶乙酸乙酯(6∶4)；
薄板采用烟台硅胶厂出品的5X10cm的预制板；
显色，采用20％的硫酸溶液均匀喷淋，并与100℃烘箱内烘烤5min至显出斑点。
高效液相色谱(HPLC)的检测条件为：流动相为甲醇∶水(70∶30)；柱子采用Agilent生产的Eclipse XDB-C18(USA)；柱温30℃，流速1ml/min，在254nm波长下检测。
在本发明的下述实施例中使用的引物对有：引物对1(上游引物如SEQ ID NO：3所示，下游引物如SEQ ID NO：4所示)、引物对2(上游引物如SEQ ID NO：5所示，下游引物如SEQ ID NO：6所示)和引物对3(上游引物如SEQ ID NO：7所示，下游引物如SEQ ID NO：8所示)。
在本发明的下述实施例中使用的金龟子绿僵菌是Metarhizium anisopliae ACCC(中国农业微生物菌种保藏管理中心)30131(购自ACCC)。
真菌基因组提取试剂盒购自Invitrogen(USA)，金龟子绿僵菌EST标签库源自NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库。
本发明的下述实施例中筛选高效积累雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮和宝丹酮的毕赤酵母菌株的技术路线如图12所示，具体过程见下述实施例。
实施例1、金龟子绿僵菌3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因的获取
1.1、构建金龟子绿僵菌基因文库
参考厂商提供的方法，使用真菌基因组提取试剂盒，提取金龟子绿僵菌基因组并送到英俊生物公司(introvigen)制备可覆盖金龟子绿僵菌基因组10遍的基因文库。
1.2、兼并引物的设计
通过金龟子绿僵菌EST标签库、报道的烟曲霉的烟曲霉酸基因簇(Silvia Lodeiro.Protostadienol Biosynthesis and Metabolism in the Pathogenic Fungus Aspergillus fumigatus.Organic Letters，11，2009)以及获取的金龟子绿僵菌基因片段，设计ksdD基因的兼并引物对，ksdD基因的兼并引物对序列如引物对2所示。
1.3、PCR法钓取金龟子绿僵菌烟曲霉酸基因簇
将基因文库中大肠杆菌分批次涂布Luria_Bertani(LB)平板，并确保细胞浓度稀释到全部细菌均以单克隆形式出现，37℃培养14-16h。挑取单克隆，接入LB液体培养基，37℃，200rmp，培养10h，取1ul菌液，使用引物对2进行PCR，直至发现含有阳性PCR结果的克隆子，其中，PCR条件如下：
25ul PCR反应体系如下：
2×PCR mix 12.5ul
上游引物 0.5ul
下游引物 0.5ul
菌液 0.5ul
水 11ul
反应程序如下：
预变性94℃ 5min；
变性94℃ 30sec
退火55℃ 30sec 30个循环；
延伸72℃ 10min；
4℃保温。
1.4、测序
通过对步骤1.3中获得的克隆子进行测序、基因走读和基因拼接，获得了金龟子绿僵菌烟曲霉酸基因簇全序列(23Kb)，通过与已获得的ksdD片段和烟曲霉ksdD序列比对，获得3-甾酮-1-脱氢酶全部序列(1740bp，如SEQ ID NO：1所示)，经NCBI比对其编码的氨基酸序列(如SEQ ID NO：2所示)与现有KSDD氨基酸序列同源性仅为63％，因此，确定为一新的ksdD基因。
实施例2、构建毕赤酵母工程菌KM71-ksdD和GS115-ksdD
2.1、构建毕赤酵母(P.pastoris)表达载体pPIC3.5K-ksdD
根据pPIC3.5K质粒多克隆位点的序列特点，构建上游引物和下游引物，分别如引物对1所示。采用该引物对，进行PCR，其中，PCR反应条件及反应体系如下：
50ul PCR反应体系如下：
2×PCR mix 25ul
上游引物 1ul
下游引物 1ul
模板 0.5ul
水 22.5ul
反应程序如下：
预变性94℃ 5min；
变性94℃ 30sec
退火50℃ 30sec 30个循环；
延伸72℃ 10min；
4℃保温。
PCR产物用PCR cycle pure kit(Omega，USA)回收，回收片段直接连入T-vector得到pMD-ksdD，用EcoRI和NotI酶切得到ksdD基因片段；质粒pPIC3.5K用EcoRI和NotI酶切后回收大片段；将ksdD基因片段与pPIC3.5K大片段通过T4DNA连接酶连接，转入大肠杆菌感受态DH5α(天根公司)，然后涂布含有ampicillin抗性(100ug/ml)的LB平板。挑去单克隆，接入含有ampicillin抗性(100ug/ml)的LB液体培养基，菌液用plasmid extraction kit(Omega，USA)提质粒，用EcoRI和NotI酶切，酶切验证ksdD基因(结果如图4-2所示)。筛选阳性转化子，获得表达载体pPIC3.5K-ksdD。
2.2、构建毕赤酵母KM71-ksdD和GS115-ksdD生产菌株
用SalI酶切重组质粒pPIC3.5K-ksdD使之线性化，再以电转法分别转化入毕赤酵母KM71和GS115感受态细胞；在MD培养基上(28℃)培养两天，挑取阳性转化子，分别获得毕赤酵母KM71-ksdD和GS115-ksdD生产菌株。
2.3、筛选毕赤酵母KM71-ksdD1和GS115-ksdD1菌株
将步骤2.2中获得的毕赤酵母KM71-ksdD和GS115-ksdD生产菌株，在含有1mg/ml遗传霉素的YPD液体培养基培养，酵母基因组已整合pPIC3.5K质粒的转化子可在该条件下生长，于28℃，200rmp，培养30h。取1ul菌液进行菌落PCR(引物对1和引物对3)，引物对1条件同上，引物对3条件如下。对转化子进行分子检测，结果如图5所示。根据图5结果，ksdD基因已整合到毕赤酵母基因组并正确表达，且为MutS表型。将该两株菌分别命名为KM71-ksdD1和GS115-ksdD1。
50ul PCR反应体系如下：
2×PCR mix 25ul
上游引物 1ul
下游引物 1ul
菌液 1ul
水 23ul
反应程序如下：
预变性94℃ 5min；
变性94℃ 30sec
退火53℃ 30sec 30个循环；
延伸72℃ 10min；
4℃保温。
实施例3、毕赤酵母的发酵培养和蛋白表达检测
3.1、毕赤酵母的发酵培养
将步骤2.3中获得的毕赤酵母KM71-ksdD1和GS115-ksdD1菌株分别以1％接种量接种于30ml BMGY液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养40-48小时后，于无菌条件下离心(5000rmp，5mim，4℃)，将沉淀转入30ml BMMY液体培养基中28℃、200rpm振荡培养每24小时加入0.5％甲醇诱导培养，培养7天，并以不含ksdD的空宿主为空白对照。
3.2生长曲线的测定
将步骤2.3中获得的毕赤酵母KM71-ksdD1和GS115-ksdD1菌株分别以1％接种量接种于30ml BMGY液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养，每隔2小时取样，测OD600nm。绘制生长曲线见图6。
3.3、目的蛋白的电泳检测
诱导第6天，每天收集菌体，用玻璃珠破碎法破碎菌体细胞，离心(5000rmp，5mim，4℃)收集上清，然后采用SDS-PAGE来确定目的蛋白的表达情况，结果见图7。
3.4、工程菌转化能力的检测
诱导第6天，取1ml发酵液(含菌体)，向发酵液中直接投加不同浓度(1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L)的底物，30℃，200rpm，反应4小时。向反应液中加等体积乙酸乙酯，剧烈振荡5min终止反应，离心(12000rpm，10min)，取上层溶液做薄板层析(thin-layer chromatography)和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography)检测。
实施例4、毕赤酵母工程菌KM71-ksdD1和GS115-ksdD1对甾体化合物的转化
将底物AD以甲醇为溶剂配置成50g/L的浓度。
将实施例3中获得的菌株KM71-ksdD1和GS115-ksdD1分别在摇瓶(30ml/250m1)中采用二级培养，接种于30ml BMGY液体培养基中，30℃振荡培养40-48小时，无菌条件下离心弃上清，将沉淀转入30ml BMMY液体培养基。每个摇瓶分别加入AD使其摇瓶终浓度达1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L。在诱导过程中，每24小时加入0.5％甲醇。诱导6天后离心收集菌体，不含ksdD的空宿主为空白对照，并进行薄层层析和高效液相检测，其中，KM71-ksdD1和GS115-ksdD1的薄层层析的检测结果分别如图8和9所示，KM71-ksdD1的高效液相色谱检测结果如图11所示(GS115-ksdD1的高效液相色 谱检测结果与图11的结果相似，因此未提供)。
根据图8、9和11的结果，本发明KSDD高产菌株可在摇瓶(30ml/250ml)中完全转化1.0g/L AD，AD转化率100％，GS115-ksdD1可在摇瓶(30ml/250ml)中完全转化1.5g/L底物AD，均远远高于阿克佐诺贝尔公司运用植物甾醇生产ADD的方法(AD转化为ADD转化率60.37％)。
由于AD为脂溶性甾体药物，只能用乙醇，甲醇等作溶剂，而上述有机溶剂对细胞都有毒性，极大的限制了KSDD活性的发挥。本发明酵母菌株以甲醇为诱导剂，相对毒性较小，且真菌来源的基因在真菌系统表达也有利于活性的提高。在此，本发明成功的构建了高效积累甾体药物ADD的工程菌。此外，本发明菌株KM71-ksdD1表达可溶性蛋白。由于细菌基因来源的KSDD均是膜蛋白，膜蛋白的高效表达在工业应用方面一直是一个需要克服的瓶颈问题。所以，本发明对于KSDD的工业化生产具有重大意义。
实施例5、毕赤酵母高产菌株GS115-ksdD1积累宝丹酮的优化实验
采用与实施例4相同的方法，培养并诱导毕赤酵母GS115-ksdD1，各摇瓶中底物AD终浓度均为1.5g/L。诱导4天后，分别向摇瓶中投加2％、3％葡萄糖，4％葡萄糖，并以不加葡萄糖的摇瓶作为对照。发酵8天后，取样品1ml。加入等体积乙酸乙酯，振荡5min。离心(12000rpm，10mim)。去上层溶液进行薄板层析(见图10)。实验证明，3％葡萄糖条件下宝丹酮积累值较高。宝丹酮是睾甾酮衍生物，主要作用有：增肌长力，凸显血管，增进食欲，析水，是临床上很受欢迎的类固醇。本发明为工业上生产宝丹酮的工程菌的构建提供了思路。
实施例6、毕赤酵母工程菌KM71-ksdD1和GS115-ksdD1对其他甾体化合物的转化
在此，我们尝试了毕赤酵母工程菌KM71-ksdD 1和GS115-ksdD 1对其他甾体化合物的转化，所述甾体化合物包括黄体酮，氢化可的松。发酵、诱导条件及检测方法与前面相同。对于黄体酮，KM71-ksdD1和GS115-ksdD1的转化底物最大量分别是750mg/l，500mg/l。对于氢化可的松，KM71-ksdD1和GS115-ksdD1的转化底物最大量分别是250mg/l，500mg/l。根据上述结果，毕赤酵母工程菌KM71-ksdD1和GS115-ksdD1均具有较强的转化3-酮基甾体化合物的活性。
根据上述试验，本发明提供的重组菌株能够高效积累雄甾二烯二酮和宝丹酮，且其表达的目的蛋白为可溶性蛋白，打破了以往工业生产中膜蛋白的瓶颈，对于KSDD的工业化生产具有重大意义。使用本发明提供的重组菌株可实现许多甾体化合物的 微生物转化法生产，可以大大提高甾体医药生产体系的生产效率与产品品质，有助于降低甾体药物生产过程中的能耗、提高药物前提的利用率、简化生产步骤，降低生产成本，且反应条件温和、环境友好，适合于大力推广应用，具有较高的经济效益和社会效益。
Claims (10)
1.一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因，是下列核苷酸序列之一：
1)其为序列表中SEQ ID NO：1所示的碱基序列；
2)编码由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其无义突变序列组成的蛋白质。
2.一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶，其是序列表中SEQ ID NO：2所示氨基酸序列或其无义突变序列组成的蛋白质。
3.包括权利要求1所述的3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因的核苷酸序列的表达载体。
4.一种高效表达3-甾酮-1-脱氢酶的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株表达3-甾酮-Δ1-脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示或为其无义突变序列。
5.如权利要求4所述的基因工程菌株，其特征在于，编码所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
6.如权利要求4所述的基因工程菌株，其特征在于，编码所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因位于重组质粒上或整合在染色体上。
7.如权利要求4所述的基因工程菌株，其是将权利要求3所述的表达载体转化到宿主微生物中得到的基因工程菌株。
8.如权利要求7所述的基因工程菌株，其特征在于，该宿主微生物为毕赤酵母KM71或GS115，得到的基因工程菌株为毕赤酵母KM71-ksdD1或GS115-ksdD1。
9.如权利要求4或5所述的3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因工程菌株在用于转化3-酮基甾体化合物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述的转化3-酮基甾体化合物是将雄甾-4-烯-3，17-二酮转化为雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮或宝丹酮。
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