JPWO2012077741A1 - カダベリンの製造方法 - Google Patents

Abstract

要約従来の発酵法による製造方法よりも効率的且つ高収率にカダベリンを製造することができる、新規なカダベリンの製造方法が開示されている。カダベリンの製造方法は、カダベリンを生産する能力を有し、かつ２，２’−チオビス（エチルアミン）に対する耐性を有するコリネ型細菌を培養することを含む。好ましくは、コリネ型細菌がリジン脱炭酸酵素活性を有し、また、好ましくは、コリネ型細菌は、ホモセリン栄養要求性および／またはＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性を有する。

Description

本発明は、カダベリン生産能を有するコリネ型細菌を用いたカダベリンの製造方法に関する。

カダベリンはジアミン構造を有し、別名１，５−ペンタンジアミンやペンタメチレンジアミン等と呼ばれているものである。最近カダベリンは、ポリアミドのモノマー原料として注目されているため、大量生産が望まれている。カダベリンの製造方法としては、コリネ型細菌を利用した発酵法が知られており、具体的には、カダベリン生産能を有し、かつカダベリンの前駆物質であるリジン合成能を強化したコリネ型細菌の発酵によるカダベリンの製造方法（特許文献１〜４、非特許文献１参照。）や、リジン脱炭酸酵素遺伝子のコピー数を高めることによってリジン脱炭酸酵素活性を強化したコリネ型細菌の発酵によるカダベリンの製造方法（特許文献５参照。）が知られている。

特開２００４−２２２５６９号公報 特開２００２−２２３７７０号公報 ＷＯ２００７／１１３１２７号 ＷＯ２００８／１０１８５０号 ＷＯ２００８／０９２７２０号

Ｓｔｅｆａｉｎｅ Ｋｉｎｄ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．（メタボリック エンジニアリング）１２，３４１−３５１，（２０１０）

本発明の課題は、従来の発酵法によるカダベリンの製造方法よりも効率的且つ高収率のカダベリン製造プロセスを創出することである。

本発明者は、カダベリンを生産する能力を有し、かつ２，２’−チオビス（エチルアミン）に対する耐性を有するコリネ型細菌がカダベリン生産菌として有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下の（１）〜（５）を提供する。
（１）カダベリンを生産する能力を有し、かつ２，２’−チオビス（エチルアミン）に対する耐性を有するコリネ型細菌を培養することを含む、カダベリンの製造方法。
（２）前記コリネ型細菌が２５０ｍＭ以上の２，２’−チオビス（エチルアミン）に対する耐性を有する、（１）に記載のカダベリンの製造方法。
（３）前記コリネ型細菌がリジン脱炭酸酵素活性を有する、（１）または（２）に記載のカダベリンの製造方法。
（４）前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属からなる群より選ばれる、（１）〜（３）のいずれかに記載のカダベリンの製造方法。
（５）前記コリネ型細菌がホモセリン栄養要求性および／またはＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性を有する、（１）〜（４）のいずれかに記載のカダベリンの製造方法。

本発明によれば、従来の発酵法によるカダベリンの製造方法よりも効率的且つ高収率でカダベリンを製造することができる。

上記の通り、本発明の方法では、コリネ型細菌を用いる。コリネ型細菌とは好気性のグラム陽性桿菌であり、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在、コリネバクテリウム属に統合された細菌も含まれる（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（１９８１）４１,ｐ．２２５）。また、コリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。

このようなコリネ型細菌の例として、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｙｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｋａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・リリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ）、コリネバクテリウム・メラセコーラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌｌａｓｓｅｃｏｌａ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・エッフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ハーキュリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ）、ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・アルバム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｂｕｍ）、ブレビバクテリウム・セリヌム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｅｒｉｎｕｍ）、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）が挙げられる。

また、各コリネ型細菌の具体的な菌株として、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アルカノリティカム ＡＴＣＣ２１５１１、コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０２０，ＡＴＣＣ１３０２０，ＡＴＣＣ１３０６０、コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ１５９９０、コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６５、コリネバクテリウム・エッフィシエンス ＡＪ１２３４０（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９）、コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６８、ブレビバクテリウム・ディバリカタム ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ１３８２６，ＡＴＣＣ１４０６７，ＡＪ１２４１８（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−２２０５）、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８７１，ＡＴＣＣ６８７２、ブレビバクテリウム・アルバム ＡＴＣＣ１５１１１、ブレビバクテリウム・セリヌム ＡＴＣＣ１５１１２、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラス ＡＴＣＣ１５３５４が挙げられる。

前述のコリネ型細菌は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）より分譲を受けることができる。ＡＴＣＣでは菌株毎に対応する登録番号を付与しており、この登録番号はＡＴＣＣのカタログに記載され、この番号を参照して各菌株の分譲を受けることができる。

本発明において、カダベリンを生産する能力を有するコリネ型細菌としては、外部からリジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドを導入されることによりリジン脱炭酸酵素活性を有するようになったコリネ型細菌が好ましく使用される。リジン脱炭酸酵素活性を有していれば、リジンを原料とし、これを脱炭酸することによりカダベリンを生産することができる。

リジン脱炭酸酵素はＬ−リジン脱炭酸酵素であることが好ましい。また、リジン脱炭酸酵素の由来については特に制限はないが、例えば、バシラス・ハロドゥランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；大腸菌）、セレノモナス・ルミナンチウム（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｒｕｍｉｎａｍｔｉｕｍ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・コエリカーラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・ピロサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｉｌｏｓｕｓ）、エイケネラ・コロデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、イユバクテリウム・アシダミノフィルム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ）、ナイセリア・メニンギチデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、テルモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、またはピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）由来のものが好ましく用いられ、安全性の認められている大腸菌由来のものがより好ましく用いられる。これらリジン脱炭酸酵素（「ＬＤＣ」と呼ぶことがある）のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されている。例えば、本発明において好ましく用いることができる大腸菌由来のＬＤＣ遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ７６４１１として登録されている。

本発明で使用されるリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子は、使用するコリネ型細菌のコドン使用頻度に応じて核酸配列を再設計してもよい。なお、上記の通り、前述の各生物由来のリジン脱炭酸酵素遺伝子は、データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されており、生物名とリジン脱炭酸酵素をキーワードとして検索すれば容易に各ＬＤＣ遺伝子の塩基配列を知ることができる。

リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子としては、その機能を有する限りにおいては、上記した各生物種の天然のＬＤＣ遺伝子に加え、これらのＬＤＣ遺伝子の各塩基配列において、１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は付加されたポリヌクレオチドも含まれる。ここで、「数個」とは、通常１〜４０個、好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜２０個、特に好ましくは１〜１０個、最適に好ましくは１〜５個程度である。また、前記リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子としては、その機能を有する限りにおいては、該遺伝子を構成するポリヌクレオチドもしくはその相補鎖の全体またはその一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、もとの塩基配列の任意の少なくとも２０個、好ましくは２５個、より好ましくは少なくとも３０個の連続した配列を１つあるいは複数個選択した核酸配列をプローブとして、公知のハイブリダイセーション技術（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ． Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８７） Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ ６．３−６．４）などを用いて、ハイブリダイズする核酸配列である。ここでストリンジェントな条件としては、例えば５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が３７℃、より厳しい条件としては４２℃、さらに厳しい条件としては６５℃で、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成：１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）を用いて洗浄することにより達成することができる。また、前記リジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドとしては、その機能を有する限りにおいては、配列同一性が、通常８５％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上有するポリヌクレオチドであってもよい。ここで、「配列同一性」は、配列を比較する２つの塩基配列の塩基ができるだけ多く一致するように２つの配列を整列させ（必要に応じてギャップを挿入する）、一致する塩基の数を全塩基数で除し、百分率で表した数値を意味する。両者の塩基数が異なる場合には、長い方の塩基数で除す。配列同一性を算出するソフトは周知であり、インターネット上でも無料公開されている。このようなリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子は、本来の宿主以外からも取得され得るし、本来の宿主から得られた遺伝子を、当業者に周知のインビトロ変異処理、あるいは部位特異的変異処理することによっても取得され得る。

コリネ型細菌へリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子（以下、「リジン脱炭酸酵素遺伝子」または「ＬＤＣ遺伝子」と呼ぶことがあるが、上記の通り天然の遺伝子に限定されるものではない）を導入する場合、リジン脱炭酸酵素遺伝子は、コリネ型細菌染色体外で維持されるプラスミドなどにおいて保持されていても、コリネ型細菌の染色体に組み込まれて保持されていてもよい。

コリネ型細菌の染色体にリジン脱炭酸酵素遺伝子を組み込む場合、トランスポゾンを利用することにより相同組換えまたはそれ自身の転移能によってリジン脱炭酸酵素遺伝子がコリネ型細菌の染色体中に導入することができる。なお、導入する遺伝子配列の構築や、その確認方法については当業者に周知の分子生物学的手法になされるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄＩＩ （Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒｅｄ．１９８５）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９４） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ等を参照することができる。

前記遺伝子構築物のコリネ型細菌への導入方法は特に限定されず、例えば、プロトプラスト法（Ｇｅｎｅ，（１９８５），３９，ｐ．２８１−２８６）、エレクトロポレーション法（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（１９８９），７，１０６７−１０７０）等により導入することができる。

なお、外来のＬＤＣ遺伝子を導入し、カタベリン産生能を有するコリネ型細菌は、例えば特許文献１に記載されているとおり公知である（下記参考例参照）。

次に、２，２−チオビスエチルアミンに耐性を有するコリネ型細菌について具体的に説明する。

２，２−チオビスエチルアミンは、
ＮＨ_２−（ＣＨ_２）_２−Ｓ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ_２
の構造式で表される強アルカリ性の化学物質である。本発明において、２，２−チオビスエチルアミンに対して耐性を有するとは、２，２−チオビスエチルアミンを含有する培地において野生株よりも早く生育する性質をいう。具体的には、２００ｍＭ以上の２，２−チオビスエチルアミンを含有するプレート培地上では、野生株はコロニーを形成できないが、２〜３日でコロニーを形成する株については２，２−チオビスエチルアミン耐性を有すると判断することができる。なお、コリネ型細菌がプレート培地上で耐性を示すチオビスエチルアミンの濃度には特に制限はないが、２５０ｍＭ以上が好ましく、３００ｍＭ以上がより好ましく、４００ｍＭ以上がさらに好ましい。

コリネ型細菌の２，２−チオビスエチルアミン耐性を評価するための２，２−チオビスエチルアミンを含有する培地は、コリネ型細菌が培養可能な培地であれば特に制限はないが、アミノ酸などが添加されていない最小培地であることが好ましく、表１に示される最小培地であることがより好ましい。

コリネ型細菌に２，２−チオビスエチルアミンに耐性を付与する方法としては、特に制限はないが、例えば、親株の染色体に何らかの変異をもたらすものであればよい。染色体に変異を導入する技術としては、ＵＶ、レーザーなどの照射によって変異をもたらす方法、エタンスルホン酸メチル（ＥＭＳ）、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、4−ジメチルアミノベンゼンジアゾスルホン酸ナトリウム（ＤＡＰＡ）等の変異誘発剤を用いる方法などがある。また、コリネ型細菌を培養している際に生じる自然変異を利用してもよい。なお、カダベリンを生産する能力を有し、かつ２，２−チオビスエチルアミンに耐性を有するコリネ型細菌を提供する方法としては、カダベリンを生産する能力を有するコリネ型細菌に該耐性を付与してもよく、また、該耐性を付与したコリネ型細菌に前述の通りカダベリンを生産する能力を付与してもよい。なお、上記した突然変異誘発処理は、微生物の突然変異誘発処理に採用されている周知の条件で行えばよく、例えば、ＵＶ照射の場合、照射量は光源からの距離に依存するが、通常、１０秒〜３０分照射を行う。また、上記したＮＴＧ等の各変異誘発剤で処理する場合には、処理濃度は、例えば、１００μｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌ、好ましくは３００μｇ／ｍｌ〜１．３μｇ／ｍｌであり、この濃度の培養液中で例えば１２時間〜４８時間培養することにより行うことができる。

このような突然変異誘発処理後、上記した２，２−チオビスエチルアミン耐性を評価するための培地上で培養し、２，２−チオビスエチルアミン耐性を獲得した株をスクリーニングすることにより２，２−チオビスエチルアミン耐性を有するコリネ型細菌を得ることができる。なお、下記実施例に具体的に記載する通り、ＮＴＧ処理により、２，２−チオビスエチルアミン耐性を獲得した株が複数得られていることから明らかなように、突然変異誘発処理によって２，２−チオビスエチルアミン耐性株を再現性をもって作出することが可能である。

その他、本発明で使用するコリネ型細菌は、リジン合成能が向上した変異株であることが好ましい。リジン合成能が向上した変異株としては、例えば、Ｌ−リジンもしくは、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除された変異株を利用することができる。これら変異株の取得方法としては、例えば、野生型株に、先の例と同様な変異操作を施した後、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）耐性を指標に選択され、Ｌ−リジン生産性となった変異株から取得する方法をあげることができる（特許文献１参照）。なお、ＡＥＣ耐性を有するか否かは、特許文献１に記載の通り、５０μｇ／ｍｌのＡＥＣを含む最少寒天培地上で、３０℃で２４時間の培養後に増殖が起きるか否かにより判定することができる。

あるいは、野生型株にＡＥＣ耐性を付与する更に好ましい方法として、遺伝子工学的手法を用いる方法である。遺伝子工学的手法を用いる方法に特に制限はなく、例えばコリネ型細菌で複製可能な組み換え体ＤＮＡを用いる方法、または相同組換えによって染色体中の目的遺伝子を組み換える方法である。例えば、配列番号１４記載のアミノ酸配列において３１１番目のアミノ酸残基がＴｈｒ以外のアミノ酸に置換された変異アスパルトキナーゼ遺伝子（「脱感作型ＡＫ遺伝子」ということがある）を有することによりＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性を獲得することができる。更に好ましい遺伝子工学的手法は、コリネ型細菌の染色体にあるＡＫ遺伝子を脱感作型ＡＫ遺伝子に相同組み換えにより組み換える方法である。さらに、脱感作型ＡＫ遺伝子は、ＡＫ遺伝子に望みの変異導入する周知の技法（例えば、サイトダイレクテッド・ミュータジェネシス）を利用することができ、このためのキットも市販されている。

また、リジン合成能が向上した変異株として、ＡＥＣ耐性変異株の他に、ホモセリン栄養要求性変異株があげられる。野生株はホモセリン栄養要求性を有していないが、ホモセリン栄養要求性株を取得する方法としては、先の例と同様に、例えば、野生型株から変異操作を施した後、ホモセリン栄養要求性を指標に選択され、Ｌ−リジン生産性となった変異株から取得する方法や、遺伝子工学的手法によりコリネ型細菌のホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損させる方法を挙げることができる（特許文献１）。

また野生型株にホモセリン栄養要求性を付与する更に好ましい方法として、相同組換えによって染色体中のホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下ＨＯＭ遺伝子と略す） にその他の遺伝子を挿入する方法等によりホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損させる方法があげられる。その他の遺伝子に特に制限はない。好ましくはＬＤＣ遺伝子であり、更に好ましくはＬＤＣ遺伝子が野生型株で構成的に発現できるプロモーターとカセットになっているものである。

本発明では、前記カダベリンを生産する能力を有し、かつ２，２−チオビスエチルアミンに対する耐性を有するコリネ型細菌を培養することでカダベリンを製造する。培養方法としては、回分培養、流加培養または連続培養を用いることができる。連続培養の場合、例えば特開２００８−１０４４５３号公報に記載のような公知の方法により連続培養を行うことが好ましい。

カダベリンを製造するための培養培地としては、同化可能な炭素源及び窒素源並びに無機塩類などを含む通常の栄養培地を用いることができる。炭素源としては、例えばグルコース、果糖、シュークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、エタノールなどのアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類、尿素、その他窒素含有化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。無機塩としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム等を用いることができる。その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン、ビタミンＢ６等の微量栄養源を加えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。

また、培養培地にカダベリンの前駆体であるリジンを予め添加しておいても良い。培養培地にリジンを予め添加しておけば、コリネ型細菌がリジンを菌体内に取り込み、リジン脱炭酸酵素がリジンを基質にしてカダベリンに変換をするため、カダベリンの製造効率を高めることができる。培養培地に予めリジンを添加する場合の培養培地中のリジン濃度としては特に制限はないが、コリネ型細菌の増殖へ悪影響がおこらずかつリジン脱炭酸酵素への阻害がおこらない濃度が好ましく、具体的には、０．０１から２Ｍであることが好ましい。

添加するリジンはＬ−リジンであることが好ましい。また、添加するリジンはフリー体であってもリジン塩であってもよいが、リジン塩であることが好ましく、リジン塩としてはリジン塩酸塩または後述のジカルボン酸由来のリジン・ジカルボン酸塩が好ましく、より好ましい具体例としては、リジン・アジピン酸塩、リジン・セバシン酸塩、リジン・１，１２−ドデカンジカルボン酸塩、リジン・コハク酸塩、リジン・イソフタル酸塩、リジン・テレフタル酸塩が挙げられるが、より好ましい具体例としてはリジン・アジピン酸塩が挙げられる。

培養条件には特に制限はなく、振とう培養、深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は一般に２５℃〜４２℃に、好ましくは２８℃〜３８℃である。培養時間は、通常１日から６日間である。

培養ｐＨ調整にはアルカリ側に調整する場合はアンモニアを使用することが好ましく、酸性側に調整する場合は塩酸またはジカルボン酸を使用することが好ましく、ジカルボン酸を使用することがより好ましい。これら中和剤を用いて培養ｐＨを５〜８に、好ましくはｐＨ６．５〜７．５に制御するのがよい。なお、中和剤の状態に制限はなく、気体、液体、固体または水溶液で使用される。特に好ましくは水溶液である。

中和剤として好ましく使用されるジカルボン酸には特に制限はないが、好ましくは、前記２つのカルボキシル基以外には、実質上、官能基が存在しないジカルボン酸である。ここでいう官能基とは、ポリアミド重合反応（反応条件としては、例えば、反応温度２５０〜２７０℃、圧力１０〜２０ｋｇ／ｃｍ^２で反応時間１から５時間）の際にアミノ基やカルボキシル基等と反応して、ポリマーの分岐を引き起こしたり、ポリマーの結晶化度を低下（結晶化度８０％以下）させるような反応基であり、例えば、アミノ基やカルボキシル基がこれに該当するが、それ以外には、酸性基（スルホン酸基、リン酸基、フェノール性水酸基等）や塩基性基（ヒドラジノ基等）やプロトニックな極性基（水酸基等）や開裂性を有する基（エポシキ基、過酸化基等）やその他反応性の高い基（イソシアナート基等）が該当する。一方、ハロゲン置換基や芳香族性置換基、エーテル基、エステル基、アミド基等は反応性が低く、ここでいう官能基には該当しない。

ジカルボン酸として、より好ましくは、以下の一般式（１）、（２）または（３）で示されるジカルボン酸である。
ＨＯＯＣ−（ＣＨ_２）_ｍ−ＣＯＯＨ・・・（１）
（但し、一般式（１）において、ｍ＝０〜１６）。

（但し、一般式（２）において、ｎ，ｏ＝０〜１６）。

（但し、一般式（３）において、ｐ，ｑ＝０〜１６）。

また、ジカルボン酸として、更に好ましくは、アジピン酸、セバシン酸、１，１２−ドデカンジカルボン酸、コハク酸、イソフタル酸、テレフタル酸である。

培養液中のカダベリンは、カダベリンのフリー体またはカダベリン塩として存在する（なお、本発明ではこれらを総称して「カダベリン」という。）。培養液中のカダベリンを回収するためにはまず、培養液中からコリネ型細菌を除去する。その際、コリネ型細菌が増殖し、発酵が十分進んでカダベリンが生成した後、菌体と培養上清を分離（分離方法としては、菌体を沈殿除去・遠心分離・膜ろ過分離）しても良いし、あるいは始めから菌体を保持材等で分離・保持あるいは固定化していても良い。菌体が除去されたカダベリンを含む培養液からカダベリンを回収する方法自体は周知であり、例えば、特開２００９−２０７４９５号公報に記載のようにカダベリン・ジカルボン酸塩として晶析して採取することもできる。また、特開２００９−２９８７２号公報に記載のようにＮＦ膜を利用してカダベリンのフリー体を精製し採取することもできる。また、特開２００９−２８０４５号公報に記載のように極性有機溶媒で抽出し、蒸留することによりカダベリンのフリー体を採取することもできる（下記参考例参照）。

以下、本発明について、実施例、比較例を挙げて詳細に説明する。

参考例１ カダベリンおよびリジン濃度のＨＰＬＣによる分析方法
分析サンプル２５μｌに、内標として１，４−ジアミノブタン（０．０３Ｍ）を２５μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．０７５Ｍ）を１５０μｌ、２，４−ジニトロフルオロベンゼン（０．２Ｍ）のエタノール溶液を添加混合し３７℃で１時間保温し、反応溶液５０μｌを１ｍｌアセトニトリルに溶解後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した後の上清１０μｌを以下の条件でＨＰＬＣ分析した。
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８（資生堂）
移動相：０．１％（ｗ／ｗ）リン酸水溶液：アセトニトリル＝４．５：５．５
検出：ＵＶ３６０ｎｍ。

参考例２ Ｌ−リジン脱炭酸活性を有し、かつホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損しているコリネバクテリウム・グルタミカム（ＴＲ−ＣＡＤ１株）の作製（特許文献１）
（１）ＨＯＭ遺伝子のクローニング
ＨＯＭ活性を欠損させるために、Ｎ末端から３００アミノ酸領域に該当する遺伝子をクローニングを行った。

データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているＨＯＭ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡ００００３６）の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー５’−ｇａａｇａａｔｔｃｔａａａｃｃｔｃａｇｃａｔｃｔｇｃｃｃｃ−３’（配列番号１）および５’−ｇａａｇｇａｔｃｃａａａｇｇａｃｔｔｇｔｔｔａｃｃｇａｃｇｃ−３’（配列番号２）を合成した。コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２から常法に従い調製したゲノムＤＮＡの溶液を増幅鋳型として０．２ｍｌのミクロ遠心チューブに０．２μｌづつ取り、各プライマーを２０ｐｍｏｌ、トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０（２０ｍＭ）、塩化カリウム（２．５ｍＭ）、ゼラチン（１００μｇ／ｍｌ）、各ｄＮＴＰ（５０μＭ）、ＬＡＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２単位）（宝酒造製）となるように各試薬を加え、全量を５０μｌとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃、３０秒、プライマーのアニーリング条件を５５℃、３０秒、ＤＮＡプライマーの伸長反応条件を７２℃、３分の各条件でＢｉｏＲａｄ社のサーマルサイクラーを用い、３０サイクルポリメラーゼ連鎖反応させた（以下ＰＣＲ法と略す）。尚、本参考例におけるＰＣＲ法は特に断らない限り、本条件にて行った。このＰＣＲ法により得られた産物を１％アガロースにて電気泳動し、ＨＯＭ遺伝子を含む約０．９ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キット（ＢＩＯ１０１社製）により精製した。この断片を、制限酵素のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られた０．９ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、予めＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化しておいたｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ間隙にライゲーションキットｖｅｒ．１（宝酒造製）を用いて挿入し、得られたプラスミドをｐＨＯＭ１と命名した。

（２）ＬＤＣ発現カセットの作成
まず、ＬＤＣをコリネバクテリウム・グルタミカムで構成的に発現させるためのプロモーターとしてカナマイシン耐性遺伝子のプロモーターのクローニングを行った。

データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているｐＨＳＧ２９９（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｍ１９４１５）の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー５’−ｇａａｃｃｇｃｇｇｃｃｔｇａａｔｃｇｃｃｃｃａｔｃａｔｃｃ−３’（配列番号３）および５’−ｇａａｃｃａｔｇｇｃｃｃｃｔｔｇｔａｔｔａｃｔｇ−３’（配列番号４）を合成した。プラスミドｐＨＳＧ２９９を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号３）、（配列番号４）をプライマーセットとしたＰＣＲ法により得られた産物を１．０％アガロースゲル電気泳動し、カナマイシン耐性遺伝子のプロモーター領域を含む０．３ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ切断部位の３’−末端にＴ塩基が付加された間隙に、ライゲーションキットｖｅｒ．１を用いて挿入し、得られたプラスミドのうち制限酵素のＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩＩで消化した際に３．２ｋｂの単一断片になるプラスミドをｐＫＭＰ１と命名した。

次に、ＬＤＣ遺伝子のクローニングを行った。データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているＬＤＣ遺伝子（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｍ７６４１１）の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー５’−ｇａａｃｃａｔｇｇａｃｇｔｔａｔｔｇｃａａ−３’（配列番号５）、５’−ｇａａｃｃｇｃｇｇｔｔａｔｔｔｔｔｔｇｃｔｔｔｃｔｔｃｔｔｔ−３’（配列番号６）を合成した。エシェリシア・コリＡＴＣＣ１０７９８から常法に従い調整したゲノムＤＮＡの溶液を増幅鋳型としてオリゴヌクレオチド（配列番号５）、（配列番号６）をプライマーセットとしたＰＣＲ法により得られた産物を１．０％アガロースゲル電気泳動し、ＬＤＣ遺伝子を含む２．１ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅのＥｃｏＲＶ切断部位の３’−末端にＴ塩基が付加された間隙に、ライゲーションキットｖｅｒ．１を用いて挿入し、得られたプラスミドのうちＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｃｏＩで消化した際に４．０ｋｂの単一断片になるプラスミドをｐＣＡＤＡと命名した。

最後に、ｐＫＭＰ１をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｃｏＩで消化し、この産物を１．２％アガロースゲル電気泳動し、カナマイシン耐性遺伝子のプロモーター領域を含む０．３ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した。こうして得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｃｏＩ断片を、予めＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｃｏＩで消化しておいたｐＣＡＤＡのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｃｏＩ間隙にライゲーションキットｖｅｒ．１を用い挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ１００と命名した。

（３）ＨＯＭ遺伝子破壊およびＬＤＣ遺伝子発現ベクターの作成
ｐＴＭ１００をＳａｃＩＩで消化し、この産物を１．０％アガロースゲル電気泳動し、ＬＤＣ発現カセットを含む２．４ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した。こうして得られたＳａｃＩＩ断片を、予めＳａｃＩＩで消化しておいたｐＨＯＭ１のＳａｃＩＩ間隙にライゲーションキットｖｅｒ．１を用い挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ１０１と命名した。

（４）ｐＴＭ１０１の染色体への組み込み
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２（以下ＡＴＣＣ１３０３２株と略す）にプラスミドｐＴＭ１０１を、電気穿孔法［ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，６５，ｐ．２９９（１９８９）］により導入し、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）が添加されているＬＢ（トリプトン（１０ｇ／ｌ）（Ｂａｃｔｏ社製）、酵母エキス（５ｇ／ｌ）（Ｂａｃｔｏ社製）、塩化ナトリウム（１０ｇ／ｌ））寒天培地上で選択した。

こうして選択された形質転換体から常法に従いゲノムＤＮＡ溶液を調製した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレオチド（配列番号５）（配列番号６）をプライマーセットとして用いたＰＣＲ法を行い、得られた産物を１．０％アガロースゲルにて電気泳動したところ、２．１ｋｂの単一のバンドが観察された。このことから、選択された形質転換体が、ＨＯＭ遺伝子座に、ＬＤＣ遺伝子が挿入されていることが確認できた。この形質転換体を、コリネバクテリウム・グルタミカムＴＲ−ＣＡＤ１（以下ＴＲ−ＣＡＤ１株と略す）と命名した。

１３０３２株はＬＤＣ活性を有していないが、ＴＲ−ＣＡＤ１株はＬＤＣ活性を有していることが確認された。また、１３０３２株はＨＯＭ活性を有しているが、ＴＲ−ＣＡＤ１株はＨＯＭ活性を欠損していた。１３０３２株はホモセリンを要求しないが、ＴＲ−ＣＡＤ１株は、ホモセリンを要求した。こうして、ＬＤＣ活性を有し、かつＨＯＭ活性を欠損（ホモセリン栄養要求性）しているコリネバクテリウム・グルタミカムＴＲ−ＣＡＤ１株が作製できた。

参考例３ Ｌ−リジン脱炭酸活性を有し、かつホモセリン要求性を有し、かつＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性を有するコリネバクテリウム・グルタミカム（ＴＲ−ＣＡＤ２）株の作製（特許文献１）
（１）脱感作型ＡＫ遺伝子の作成
ＡＫ遺伝子に変異を導入し、脱感作型ＡＫ遺伝子を作成するためにＡＫ遺伝子をクローニングを行った。

データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているＡＫ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡ００００３６）の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー５’−ａｃａｇａａｔｔｃｇｔｇｇｃｃｃｔｇｇｔｃｇｔａｃａｇａａ−３’（配列番号７）および５’−ｃａｔｃｔｃｇａｇｔｔａｇｃｇｔｃｃｇｇｔｇｃｃｔｇｃａｔ−３’（配列番号８）を合成した。コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２から常法に従い調整したゲノムＤＮＡの溶液を増幅鋳型として、オリゴヌクレオチド（配列番号７）、（配列番号８）をプライマーセットとしたＰＣＲ法により得られた産物を１．０％アガロースゲル電気泳動し、ＡＫ遺伝子を含む約１．３ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した。この断片を、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、得られた１．３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片を、予めＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化しておいたｐＨＳＧ３９６（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ間隙にライゲーションキットｖｅｒ．１を用いて挿入し、得られたプラスミドをｐＡＫ１と命名した。

次に、クローニングしたＡＫ遺伝子の９３１番目から９３３番目のａｃｃ（Ｔｈｒ）をａｔｇ（Ｉｌｅ）に変異させるためにオリゴヌクレオチドプライマー５’−ｃｇａｃａｔｃａｔｃｔｔｃａｃｃｔｇｃｃ−３’（配列番号９）および５’−ｇｇｃａｇｇｔｇａａｇａｔｇａｔｇｔｃｇ−３’（配列番号１０）を合成した。ｐＡＫ１を増幅鋳型として、オリゴヌクレオチド（配列番号９）、（配列番号１０）をプライマーセットとしてＱｕｉｋＣｈａｎｇｅサイトダイレクテッド・ミュータジェネシス・キット（ストラタジーン社製）を用い得られたプラスミドをｐＴＭ１０２と命名した。このｐＴＭ１０２中のＡＫ遺伝子を常法によりシークエンスしたところ、目的通り９３１番目から９３３番目のａｃｃ（Ｔｈｒ）をａｔｇ（Ｉｌｅ）に変異されており、脱感作型ＡＫ遺伝子が作成できていることが確認できた。

（２）ｐＴＭ１０２の染色体への組み込み
データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているｐＦＫ３９８（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｄ２９８２６）の塩基配列を参考にクロラムフェニコール耐性遺伝子のオリゴヌクレオチドプライマー５’−ａｃｇｇｔｃｇａｃｔｃｇｃａｇａａｔａａａｔａａａｔｃｃｔｇｇｔｇ−３’（配列番号１１）および５’−ａｔｇａｇｇｃｃｔｇａｇａｇｇｃｇｇｔｔｔｇｃｇｔａｔｔｇｇａ−３’（配列番号１２）を合成した。

ＴＲ−ＣＡＤ１株にプラスミドｐＴＭ１０２を、電気穿孔法により導入し、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）が添加されているＬＢ寒天培地上で選択した。

こうして選択された形質転換体から常法に従いゲノムＤＮＡ溶液を調製した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレオチド（配列番号１１）（配列番号１２）をプライマーセットとして用いたＰＣＲ法を行い、得られた産物を１．０％アガロースゲルにて電気泳動したところ、１．０ｋｂの単一のバンドが観察された。このことから、選択された形質転換体が、ＡＫ遺伝子座に、クロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されていることが確認できた。この形質転換体を、コリネバクテリウム・グルタミカムＴＲ−ＣＡＤ２（以下ＴＲ−ＣＡＤ２株と略す）と命名した。

（３）脱感作型ＡＫ遺伝子のＴＲ−ＣＡＤ２株の染色体上への導入の確認
データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているＡＫ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡ００００３６）の塩基配列を参考に、ＡＫのＮ末端より上流０．１ｋｂのオリゴヌクレオチドプライマー５’−ｔｔｇｇａａｃｇｃｇｔｃｃｃａｇｔｇｇｃ−３’（配列番号１３）を合成した。

ＴＲ−ＣＡＤ２株から常法に従いゲノムＤＮＡ溶液を調整した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレオチド（配列番号１２）（配列番号１３）をプライマーセットとして用いたＰＣＲ法を行い、得られた産物を１．０％アガロースゲルにて電気泳動し、ＡＫ遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む３．１ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅのＥｃｏＲＶ切断部位の３’−末端にＴ塩基が付加された間隙に、ライゲーションキットｖｅｒ．１を用いて挿入し、得られたプラスミドをｐＡＫ２と命名した。このｐＡＫ２中のＡＫ遺伝子を常法によりシークエンスしたところ、目的通りの変異が含まれていることが確認できたため、ＴＲ−ＣＡＤ２株は染色体上で発現可能な脱感作型ＡＫ遺伝子が導入できたことが確認できた。こうして、ＬＤＣ活性を有し、かつＨＯＭ活性を欠損（ホモセリン栄養要求性）し、かつＡＥＣ耐性であるコリネバクテリウム・グルタミカム（ＴＲ−ＣＡＤ２株）が作製できた。

実施例１ カダベリンを生産する能力を有し、かつ２，２’−チオビス（エチルアミン）に対する耐性を有するコリネ型細菌の取得
上記の通り得られた、Ｌ−リジン脱炭酸酵素活性を有し、かつホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損することによりホモセリン栄養要求性変異株となったコリネバクテリウム・グルタミカム（ＴＲ−ＣＡＤ１株）、およびＬ−リジン脱炭酸酵素活性を有し、かつホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損することによりホモセリン栄養要求性変異株となり、かつＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性（ＡＥＣ耐性）を有するコリネバクテリウム・グルタミカム（ＴＲ−ＣＡＤ２株）を、各々５ｍｌのＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）液体培地で一晩前培養し、得られた前培養液のうち２．５ｍｌを新しいＢＨＩ液体培地に植菌、濁度（Ａ６００）が１〜２に達するまで培養した。培養後、菌体をトリスマレイン酸緩衝液で２回洗浄し、洗浄した菌体を１２ｍｌのトリスマレイン酸緩衝液に懸濁、懸濁液を９００μｌずつ試験管に分注し、各々６４０μｇ／ｍｌのＮＴＧ溶液を添加した。混合溶液を、３０℃で４０分激しく振とうし、２ｍｌのＢＨＩ培地に懸濁して氷冷。懸濁液をトリスマレイン酸緩衝液で２回洗浄後、５０ｍｌのＢＨＩ培地を添加し、２８度で一晩培養した。培養液を、トリスマレイン酸緩衝液で２回洗浄し、２，２−チオビスエチルアミンを１８０ｍＭ、２２０ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭまたは４００ｍＭを添加した表１に示す培地で２〜３日培養後、コロニーを形成した菌体を２，２−チオビスエチルアミン耐性株として取得し、それぞれＴＲ−ＣＡＤＡ１−Ｃ、ＴＲ−ＣＡＤＡ１−０〜６株、ＴＲ−ＣＡＤＡ２−Ｃ、ＴＲ−ＣＡＤＡ２−０〜６株（表２）とした。更に取得した耐性株は、該耐性株を取得した培地で３日間培養し、コロニーを形成すること、すなわち２，２−チオビスエチルアミン耐性が付与されたことを確認した。

なお、ＴＲ−ＣＡＤＡ１−６株、ＴＲ−ＣＡＤＡ２−５株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）にそれぞれ受領番号ＮＩＴＥ ＢＰ−１００２、ＮＩＴＥ ＢＰ−１００３として国際寄託されている。

実施例２，３、比較例１，２
ＴＲ−ＣＡＤＡ１−１〜６株（実施例２）、ＴＲ−ＣＡＤＡ２−１〜６（実施例３）、ＴＲ−ＣＡＤＡ１株（比較例１）、ＴＲ−ＣＡＤＡ１−０株（比較例２）、ＴＲ−ＣＡＤＡ２（比較例３）、ＴＲ−ＣＡＤＡ２−０(比較例４)によるカダベリン発酵を行った。滅菌したＢＨＩ培地５ｍｌに各株を１白金耳植菌し、３０℃で２４時間振とうして前々培養を行った。この前々培養液を前々培養と同じ培地５０ｍｌに全量植菌し、３０℃、振幅３０ｃｍで、１２０ｒｐｍの条件下で２４時間培養して前培養を行った。次に、表３に示すＭＭＰ培地９５０ｍｌに前培養液全量を植菌し、滅菌した空気を０．０７ｖｖｍで通気しながら、３０℃、攪拌翼回転数８００ｒｐｍ、ｐＨを６．７に調整しながら５０時間培養を行った。中和剤として硫酸水溶液（３Ｍ）およびアンモニア水（３Ｍ）で行った。

培養終了後、４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで菌体を除去し、培養上清を回収した。この培養上清中のカダベリンおよびリジンをＨＰＬＣにより分析した。また、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。カダベリン対糖収率（生産されたカダベリン重量／消費したグルコース重量）×１００（％））を計算し、それら結果を表４に示す。

その結果、実施例２と比較例１、比較例２及び実施例３と比較例３、比較例４をそれぞれ比較すると、親株に対し、２，２−チオビスエチルアミン耐性を付与することによって、カダベリンの蓄積濃度および対糖収率が向上していることが明らかになった。

得られた培養上清からのカダベリンの回収は、種々の公知の方法により可能である。以下に好ましい公知の回収方法を例示する。

参考例４ 培養上清からのカダベリンの回収
前述の方法で得られたカダベリン発酵液の培養上清に５規定の水酸化ナトリウムを添加し、ｐＨを１３に調整する。次いで、ナノ濾過膜に通じて、無機塩成分および、微量の残留菌体を除去し、ナノ濾過膜透過液を回収する。次いで、回収したナノ濾過膜透過液を逆浸透膜に通じてカダベリン濃度が１８重量％程度になるまで濃縮、回収する。次いで、回収した濃縮液をさらにロータリーエバポレーターなどにより減圧濃縮することにより水を除去し、５０重量％程度のカダベリン水溶液が得られる。次にクロロホルムを等量加え、クロロホルム相にカダベリンを抽出する。最後にこのクロロホルム相を、減圧蒸留（３０ｍｍＨｇ、８０℃）することによりフリーのカダベリンを単離する。

本発明により、カダベリンを工業的に製造することができる。

ＮＩＴＥ ＢＰ−１００２
ＮＩＴＥ ＢＰ−１００３

Claims (5)

1. カダベリンを生産する能力を有し、かつ２，２’−チオビス（エチルアミン）に対する耐性を有するコリネ型細菌を培養することを含む、カダベリンの製造方法。
2. 前記コリネ型細菌が２５０ｍＭ以上の２，２’−チオビス（エチルアミン）に対する耐性を有する、請求項１に記載のカダベリンの製造方法。
3. 前記コリネ型細菌がリジン脱炭酸酵素活性を有する、請求項１または２に記載のカダベリンの製造方法。
4. 前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属からなる群より選ばれる、請求項１〜３のいずれかに記載のカダベリンの製造方法。
5. 前記コリネ型細菌がホモセリン栄養要求性および／またはＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性を有する、請求項１〜４のいずれかに記載のカダベリンの製造方法。