JPH03259088A - 発酵法によるｌ―スレオニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、Ｌ−セリンおよび／またはエチオニンに耐性
を有し、かつＬ−スレオニン生産能を有するエシェリヒ
ア属に属する微生物を用いるＬ−スレオニンの製造法に
関する。Ｌ−スレオニンは、アミノ酸製剤などの医薬品
として有用であるだけでなく、飼料添加用としても利用
できるアミノ酸である。

従来の技術 発酵法によるＬ−スレオニンの製造法において、エシェ
リヒア属に属する微生物を用いる方法として、ボレリジ
ン感受性を示す微生物を用いる方法（特公昭５ｌ−６７
５２）、ジアミノピメリン酸とメチオニンの要求性を示
し、かつスレオニンの生合成系がスレオニンのフィード
バック阻害に対して抵抗性を示す微生物を用５する方法
（特公昭５６−１００３７）、リファンピシン、リジン
、メチオニン、アスパラギン酸およびホモセリンの少な
くとも１種に耐性を有するか、またはＬ−スレオニンの
分解能の低下した微生物を用いる方法〈特開昭６３−２
７３４８７）などが知られている。さらに、エシェリヒ
ア属に属する微生物以外の微生物を用いる方法として、
セラチア属に属し、スレオニン脱水素酵素が欠損し、か
つスレオニン代謝拮抗物質に耐性を示す微生物を用いる
方法（特公昭５２−４８１９５）　、コリネバクテリウ
ム属に属し、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸および
５−（２−アミノエチル）−Ｌ−システィンに耐性で、
かつメチオニンの要求性を有する微生物を用いる方法（
特開昭４７−１９０８７１　、ブレビバクテリウム属に
属し、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸および５−（
２−アミノエチル）−Ｌ−システィンに耐性で、かつＬ
−ロイシンの要求性を有する微生物を用いる方法（特開
昭５Ｏ−３１０９３）、ブレビバクテリウム属に属し、
α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸およびＳ−（２−ア
ミノエチル）−Ｌ−システィンに耐性で、かつＬ−イソ
ロイシンおよびＬ　−ＩＪジンの要求性を有する微生物
を用いる方法（特開昭５８−２２４６８４＞、セラチア
属に属し、メチオニン代謝拮抗物質に耐性を有する変異
株を用いる方法（特開昭５６−１３４９９３＞、プロビ
デンシア属に属し、メチオニン代謝拮抗物質に耐性を有
する変異株を用いる方法（特開昭６ｌ−２１６６９８）
などが知られている。

発明が解決しようとする課題 アミノ酸製剤や飼料添加物として有用なＬ−スレオニン
を、より収率良く安価に製造する方法が求められている
。

課題を解決するための手段 本発明者らは、Ｌ−スレオニンを高収率で得るた約によ
り優れたＬ−スレオニン生産菌の研究を行った。その結
果、エシェリヒア属に属し、Ｌセリンおよび／またはエ
チオニンに耐性を有する変異株が著量のＬ−スレオニン
を蓄積することを見いだし、本発明を完成した。

本発明は、エシェリヒア属に属し、Ｌ−セリンおよび／
またはエチオニンに耐性を有し、かつＬ−スレオニン生
産能を有する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−ス
レオニンを生成Ｍ積させ、該培養物よりＬ−スレオニン
を採取することを特徴とする発酵法によるＬ−スレオニ
ンの製造法を提供する。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明に使用する微生物の例としては、エシェリヒア属
に属し、Ｌ−セリンおよび／またはエチオニンに耐性を
有し、かつＬ−スレオニン生産能を有する微生物であれ
ば、いずれも用いることができる。

本発明のＬ−スレオニン生産菌は、エシェリヒア属のＬ
−スレオニン生産能を有する微生物を、通常の変異手段
により変異させ、Ｌ−セリン耐性および／またはエチオ
ニン耐性を付与することにより取得できる。また野生株
から誘導したＬ−セリン耐性および／またはエチオニン
耐性変異株に栄養要求性やスレオニン代謝拮抗物質耐性
などのＬ−スレオニン生産性を向上させる変異を付与す
ることによっても得ることができる。好適な例としては
エシェリヒア・コリＨ−７７０Ｌ　Ｈ−７７０２または
Ｈ−７７２９をあげることができる。エシェリヒア属の
Ｌ−スレオニン生産菌においては、副生のアミノ酸が少
ないという利点がある。

本発明の微生物によるＬ−スレオニンの生産は、通常の
培養法にて実施可能である。使用培地としては、炭素源
、窒素源、無機物、その他使用菌株の必要とする微量の
栄養素を程良く含有するものならば、合成培地または天
然培地いずれも使用可能である。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクトー
ス、ａＳ、セルロース加水分解物、粗糖加水分解物、ｆ
ｆｉ扮加水加水分解物の炭水化物、ピルビン酸、酢酸、
プロピオン酸、フマール酸、リンゴ酸、蟻酸、乳酸など
の有機酸が使用できる。

さらに微生物の資化性によってグリセリン、エタノール
などのアルコールプ＝ども用いられる。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸
７ンモニウム、酢酸アンモニウム、燐酸アンモニウムな
どの各種無機塩類や有機酸のアンモニウム塩、アミン類
、その他の窒素化合物、ならびにペプトン、肉エキス、
コーンステイープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕
加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物などが用い
られる。

無機物としては、燐酸第一カリウム、燐酸第二カリウム
、燐酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化す）　Ｉ
Ｊウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫Ｍｕ、炭酸カル
シウムなどが用いられる。

培養は、深部振盪培養または通気攪拌培養などの好気的
条件下にて行う。培養温度は２０〜４０℃で、好ましく
は２５〜３８℃の範囲である。培地のａＨはｐＨ５〜９
の範囲で、好ましくは中性付近に保持する。培地のｐＨ
調整は炭酸カルシウム、無機あるいは有機の酸、アルカ
リ溶液、アンモニア、ｐＨ緩衝液などによって行う。通
常２〜７日間の培養により、培養液中にＬ−スレオニン
が生成Ｍ積する。

培養終了後、培養液から菌体などの沈澱物を除去し、イ
オン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併用することに
より、培養液からＬ−スレオニンを回収することができ
る。

以下に実施例をあげて、本発明を具体的に説明する。

実施例１　　変異株の取得 エシェリヒア・コリＨ−４５８１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１
４１１＋ジアミノピメリン酸要求性、メチオニン要求性
、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性、Ｌ−スレオ
ニン分解能低下、リファンピシン耐性、リジン耐性、メ
チオニン耐性、ホモセリン耐性、アスパラギン酸耐性）
より誘導したジアミノピメリン酸非要求株Ｈ−７７００
に、Ｎ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジ
ンによる常法の変異処理（０，２ｍｇ／ｄ、３０℃、３
０分間）を施した後、ＤＬ−エチオニン（１０ｇ／ｊり
を含む最少培地（グルコース０．５％、ＮＨ，Ｃｕ２　
０．２％、ＫＨ２ＰＯ，０，２％、Ｍｇ５Ｏ，−７８２
０００１％、Ｆｅ５Ｏ＝７Ｈｚ０　２０ｍｇ／Ａ、ＤＬ
−メチオニン５０ｍｇ／β、寒天２％、ｐ　Ｈ７，２）
に塗布した。３０℃で２〜６日間培養し、生育してくる
大きなコロニーをエチオニン耐性株として釣菌分離し、
Ｈ−７７０２を取得した。この菌株は平成２年３月６日
付で、工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）にＦ
ＥＲＭ　ＢＰ−２７９１として寄託されている。なお、
上記のＤＬ−エチオニンを含有する最少培地には、親株
であるＨ−７７００は生育しなかった（第１表参照）。

さらに、上記のエシェリヒア・コリＨ−７７００および
エシェリヒア・コリＨ−７７０２に、上記と同様にＮ−
メチル−Ｎ’−二トローＮ−二トロソグアニジンによる
変異処理（０，２ｍｇ／　ｒｎｌ、３０℃、３０分間）
を施した後、Ｌ−セリン（７ｇ／β）を含む最少培地（
グルコース０．５％、ＮＨ，ＣＩｏ、２％、ＫＨ，ＰＯ
Ｏ，２％、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７ｆ（，００，０１％、
Ｆ　ｅ　Ｓ　０４　・７　Ｈ２Ｏ２０ｍｇ／　ｆ、ＤＬ
−メチオニン５０ｍｇ／ｊ！、寒天２％、ｐＨ７，２）
に塗布した。３０℃で２〜６日間培養し、生育してくる
大きなコロニーをＬ−セリン耐性株として釣菌分離し、
Ｈ−７７０１株およびＨ−７７２９株を取得した。これ
らの菌株は平成２年３月６日付で、微工研にそれぞれＦ
ＥＲＭ　ＢＰ−２７９０、ＦＥＲＭ　ＢＰ２７９２とし
て寄託されている。なお、上記のＬ−セリンを含有する
最少培地には、親株であるエシェリヒア・コリＨ−７７
００やＨ−７７０２は生育しなかった（第１表参照）。

第　　　　１　　　　表 生育しない 実施例２　　Ｌ−スレオニンの生産試験実施例１で得ら
れた変異株を用い、Ｌ−スレオニンの発酵生産試験を行
った。エシェリヒア・コリＨ−７７００、エシェリヒア
・コリＨ−７７０１、エシェリヒア・コリＨ−７７０２
およびエシェリヒア・コリＨ−７７２９を、グルコース
２％、ペプトン１％、酵母エキス１％、ＮａＣ１０，２
５％、ｐ　Ｈ７，４の組成の種培地にて、それぞれ３０
℃、１６時間振盪培養した。得られた種培養液１００ｍ
１を、１にの下記発酵培地を含む２βの小型発酵槽に植
菌し、３０℃、攪拌数８０Ｏｒｐｍ、通気Ｒ１，１１分
間にて培養した。培養中のｐＨ調整およびｖｓ源の供給
はアンモニア水にて行い、ｐ＋Ｈは６．５土０．２に維
持した。グルコースを適宜供給しつつ、８０時間培養を
行った。その際のＬ−スレオニン生成量を高速液体クロ
マトグラフィー法により定量した。結果を第２表に示す
。

発酵培地の組成 グルコース４％、（ＮＨ，）２５０．１．２％、ＫＨ，
Ｐｏ、０．２％、Ｍ　ｇ　Ｓ　０４・７Ｈ２００，０１
％、コーンステイープリカー０．５％、ＤＬ−メチオニ
ン０．３ｇ／ｌ、ｐＨ７，４ 第 表 Ｈ−７７０２エチツ゛ニン耐性　（１８３Ｈ−７７０２
株およびＨ−７７２９株を用いて得たＬ−スレオニン含
有培養液１１を、それぞれ遠心分離（３０００ｒｐｍ％
ＩＯ分）にかけ、菌体その他の不純物を除去した。得ら
れた上澄液を強酸性陽イオン交換樹脂ダイヤイオン５Ｋ
ＩＢ（Ｈ型）のカラムに通し、Ｌ−スレオニンを吸着さ
せ、水洗後０、ＪＬｌ！のアンモニア水で溶出して、Ｌ
−スレオニン画分を集めた。築島た両分をａ縮し、エタ
ノールを加えて玲却下で保存することにより、純度９８
％以上のＬ−スレオニン結晶がそれぞれ１５．０ｇ方よ
び３０．６　ｇ得られた。

発明の効果 本発明により、収率良くＬ−スレオニンを得ることがで
きる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. エシェリヒア属に属し、Ｌ−セリンおよび／またはエチ
   オニンに耐性を有し、かつＬ−スレオニン生産能を有す
   る微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−スレオニンを
   生成蓄積させ、該培養物よりＬ−スレオニンを採取する
   ことを特徴とするＬ−スレオニンの製造法。