JPH0158953B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造
法に関する。その目的とするところは、食品添加
物等として利用される重要なアミノ酸であるＬ−
グルタミン酸を工業的安価に製造することにあ
る。 従来、発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法
に関してはアデニン等の要求株（特公昭49−
1557）、Ｌ−リジン要求株（特公昭53−28991）、
モノフロロ酢酸等の耐性株（特公昭54−9197）、
フロロクエン酸等の耐性株（特公昭56−50837）
等を用いる方法が知られている。 本発明者らは発酵法によるＬ−グルタミン酸の
製造法を改良すべく鋭意検討した結果、従来知ら
れているコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属のＬ−グルタミン酸生産菌にピリミジ
ンアナログおよびプリンアナログの１種以上の耐
性を付与した変異株を誘導したところ、Ｌ−グル
タミン酸生産能が著しく向上することを認め、か
つ従来Ｌ−グルタミン酸発酵に用いられているよ
うに多量のビオチンを含む培地においても界面活
性剤やペニシリン等を添加せずに、そのまま培養
することによりＬ−グルタミン酸を著量蓄積する
ことを認め本発明を完成するにいたつた。発酵法
によるＬ−グルタミン酸の製造に際し、プリンア
ナログ抵抗性、ピリミジンアナログ抵抗性の性質
を持つた菌株を用いればＬ−グルタミン酸の生産
性が飛躍的に改善されることは本発明者らによつ
てはじめて見出された知見である。 以下、本発明を詳細に説明する。 本発明方法では、コリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属し、プリンアナログ抵
抗性およびピリミジンアナログ抵抗性の少なくと
も１種の性質を有するＬ−グルタミン酸生産菌株
であればいかなる菌株をも用いることができる。
すなわち、本発明ではコリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属に属し、Ｌ−グルタミン
酸生産能を既に有する菌株にプリンアナログ抵抗
性およびピリミジンアナログ抵抗性の少なくとも
１種の性質を付与せしめた菌株を用いてもよい
し、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属し、プリンアナログ抵抗性およびピリ
ミジンアナログ抵抗性の少なくとも１種の性質を
有する菌株にＬ−グルタミン酸生産能を付与せし
めた菌株を用いてもよい。たとえば、コリネバク
テリウム属またはブレビバクテリウム属に属する
Ｌ−グルタミン酸生産能を有する菌株としては、
各種の栄養（例えばアデニン、メチオニン、フエ
ニルアラニン、リジン、イソロイシン、オレイン
酸、グリセロール、酢酸）要求性、各種の薬剤
（例えばコバラミン、モノフロロ酢酸、マロン酸、
フロロクエン酸、Ｓ−アミノエチル−アラニン、
２−アミノ−３−ホスホブロピオン酸、グルタミ
ン酸−γ−モノヒドロキサメート、ケトマロン
酸、各種呼吸阻害剤、ADPリン酸化阻害剤）耐
性および各種の薬剤（例えば、リゾチーム、フロ
ロピルビン酸）感受性、その他温度感受性の１種
あるいはこれらの組合せの性質を有するＬ−グル
タミン酸生産株があげられる。 したがつて、かくの如きＬ−グルタミン酸生産
菌株に、さらにプリンアナログ抵抗性およびピリ
ミジンアナログ抵抗性の少なくとも１種の性質を
付与することによつて本発明に使用する菌株を得
ることもできるし、コリネバクテリウム属に属
し、プリンアナログ抵抗性およびピリミジンアナ
ログ抵抗性の少なくとも１種の性質を有する菌株
に上記のごとき各種栄養要求性、各種アミノ酸ア
ナログ抵抗性、またはその他薬剤の抵抗性を付与
することによつて得られるＬ−グルタミン酸生産
菌株を本発明で使用することもできる。また、本
発明に用いる菌株は上記のごとき性質の他にＬ−
グルタミン酸生産に寄与するかいかなる性質を備
えていてもさしつかえない。 本発明に用いる菌株のプリンアナログ抵抗性と
しては、たとえば、６−メルカプトグアニン、８
−アザグアニン、２−フロロアデニン、ツベルシ
ジン、６−メチルプリン、８−アザキサンチン、
８−アザアデニン、８−メルカプトグアノシン、
６−メルカプトグアノシン、２−アミノプリン、
２−アミノ−６−メルカプトプリン、デコイニ
ン、サイコフラニンなどに対する抵抗性があげら
れる。また本発明に用いる菌株のピリミジンアナ
ログ抵抗性としては、たとえば、５−ブロモウラ
シル、６−アザウラシル、５−フロロウラシル、
５−ブロモ−２−デオキシウリジン、２−チオウ
ラシル、６−メチル−２−チオウラシル、アミセ
チンなどに対する抵抗性があげられる。 発明の変異株を誘導する際に用いられる親株
は、従来、Ｌ−グルタミン酸生産菌として知られ
ているコリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属に属する微生物であり、例えば、コリネ
バクテリウム・グルタミクムATCC13032、コリ
ネバクテリウム・アセトアシドフイラム
ATCC13870、ブレビバクテリウム・ラクトフエ
ルメンタムATCC13869、ブレビバクテリウム・
フラバムATCC14067などがある。 本発明に使用する微生物のうち、プリンアナロ
グ抵抗性菌株の具体的一例としてコリネバクテリ
ウム属・グルタミクムＨ−3280（NRRL Ｂ−
15503）、同Ｈ−3281（NRRL Ｂ−15504）、ブレ
ビバクテリウム・ラクトフエルメンタムＨ−3284
（NRRL Ｂ−15507）、同Ｈ−3285（NRRL Ｂ−
15508）を、またピリミジンアナログ抵抗性菌株
の具体的例としてコリネバクテリウム・グルタミ
クムＨ−3282（NRRL Ｂ−15505）、同Ｈ−3283
（NRRL Ｂ−15506）、ブレビバクテリウム・ラ
クトフエルメンタムＨ−3286（NRRL Ｂ−
15509）、同Ｈ−3287（NRRL Ｂ−15510）をあげ
ることができる。これらのうち、微工研菌寄第Ｈ
−3281号の菌株は、グルタミン酸生産能を有する
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032
の細胞を0.1規定トリス・マレイン酸緩衝液（PH
6.0）中に10⁸cells／mlの濃度に懸濁し、ここにＮ
−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ンを最終濃度0.2mg／mlになるように添加し、室
温で30分間静置した後、プリンアナログの１種で
ある６−メルカプトグアノシン（6MG）（0.4
mg／ml）を含む下記のごとき組成を有する最小培
地寒天平板培地に塗沫し、生育するコロニーの中
から選択された変異株であり、6MG抵抗性を有
する点で、、第１表に示すように親株の
ATCC13032と明らかに区別できる。またＨ−
3280、Ｈ−3283およびＨ−3282の菌株は上記と同
様にして、それぞれ６−メチルプリン（6MP）
（0.2mg／ml）、ピリミジンアナログである６−ア
ザウラシル（6AU）（0.1mg／ml）または５−ブロ
モウラシル（5BU）（0.1mg／ml）を含む寒天平板
培地で生育可能な変異株として取得した菌株であ
り、第１表に示すように6MP、6AU、5BUに抵
抗性を有する点で親株と明らかに区別できる。 またＨ−3284、Ｈ−3285、Ｈ−3286、Ｈ−3287
の菌株は、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するブレ
ビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
ATCC13869から同様の変異処理によつて6MG、
6MP、6AUまたは5BU抵抗性株としてそれぞれ
選択された変異株であり第１表に示すように親株
と明らかに区別できる。

【表】 上記最少培地寒天平板培地の組成：グルコース
10ｇ／、塩化アンモニウム４ｇ／、
KH₂PO₄1ｇ／、K₂HPO₄3ｇ／、mgSO₄・
7H₂O 0.4ｇ／、FeSO₄・7H₂O 0.01ｇ／、
MnSO₄・4H₂O 0.01ｇ／、尿素２ｇ／、ビ
オチン50μｇ／、寒天20ｇ／、PH7.2。 本発明に使用する培地組成としては使用菌株の
利用しうる炭素源、無機物その他の必要な栄養素
を程良く含有するものであれば合成培地、天然培
地のいずれも使用できる。 すなわち炭素源としてはグルコース、フラクソ
ース、ソルビトール、グリセロール、蔗糖、澱
粉、澱粉加水分解物、糖蜜、果汁などの各種炭水
化物、酢酸、フマール酸、乳酸、コハク酸などの
有機酸、さらにエタノール、メタノールなどのア
ルコール類も使用できる。 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン
酸アンモニウム等の各種無機産のアンモニウム
塩、尿素、アミン類、その他含窒素化合物、なら
びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・
スチーブ・リカー、カゼイン加水分解物、大豆粕
酸加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物な
どが使用できる。 さらに無機物としては、リン酸第一カリウム、
リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸
マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫
酸マンガン、炭酸カルシウムなどを使用する。勿
論、本発明に使用する微生物が生育のために特定
の栄養素を必要とする場合には、その栄養素を適
当量培地中に存在させなければならないが、これ
らの物質は窒素源として例示した天然物に含まれ
て添加される場合もある。また培地中に各種の添
加物、例えば各種抗生物質、有機酸、脂肪酸、ア
ミノ酸などを添加することによりＬ−グルタミン
酸生産量を増加させうる場合がある。 培養は振盪培養あるいは深部通気撹拌培養など
の好気的条件下で行なう。培養温度は通常25〜40
℃の範囲で、培地のPHは３〜９の範囲で、好まし
くは中性付近に保持することが望ましいが、これ
以外の条件下でも使用菌株が生育すれば実施でき
る。培地のPH調節は炭酸カルシウム、酸あるいは
アルカリ溶液、PH緩衝剤などによつて行なう。培
養時間は通常１〜４日間で培養液中にＬ−グルタ
ミン酸が生成蓄積する。 またＬ−グルタミン酸を蓄積させるため、従来
知られているように、ビオチン量を低くおさえた
り、ビオチン含量の高い培地の場合には界面活性
剤、ペニシリン等を添加して培養してもよいし、
ビオチン量に関係なく、そのまま培養してもよ
い。 培養終了後、培養液より菌体などの沈澱物を除
去し、公知のイオン交換処理法、濃縮法、吸着
法、塩析法などを併用することにより、培養液か
らＬ−グルタミン酸を回収することができる。 以下、実施例をあげて本発明を具体的に示す。 実施例 １ グルコース50ｇ／、KH₂PO₄ １ｇ／、
MgSO₄・7H₂O 0.5／、サイアミン・HC
200μｇ／ml、尿素５ｇ／、FeSO₄・7H₂O 10
mg／、MnSO₄・4H₂O 10mg／、CuSO₄・
4H₂O １mg／、ビオチン3μｇ／、PH7.0の培
地（生産培地）を調製し、その20mlずつを250ml
容三角フラスコに入れ120℃10分間加熱殺菌した。
この培地に第２表に示した菌が増殖した種培養物
（上記培地にビオチン100μｇ／添加した種培地
に培養したもの）を0.5mlずつ植菌し30℃で振盪
培養した。培養中、培養液のPHが6.5〜8.0に保た
れるように殺菌した尿素液を添加しながら32℃で
30時間培養した。かくして培養液中に蓄積したＬ
−グルタミン酸の量を第２表に示した。

【表】 実施例 ２ 廃糖蜜（グルコース換算）60ｇ／、尿素５
ｇ／、（NH₄）₂SO₄2ｇ／、KH₂PO₄1ｇ／、
K₂HPO₄1ｇ／、MnSO₄・4H₂O20mg／、PH
6.5の培地（生産培地）を調製し、16mlずつ250ml
容三角フラスコに入れ120℃、10分間加熱殺菌し
た。この培地に第３表に示した菌が増殖した種培
養物（同上培地組成の培地に培養したものの）３
mlずつを植菌し、さらに、ペニシリンＧ溶液を最
終濃度5U／mlになるように添加して34℃で振盪
培養した。培養中、培養液のPHを6.5〜8.0に保つ
ように殺菌した10％尿素液0.5mlを添加しながら
30時間培養した。かくして培養液中に蓄積したＬ
−グルタミン酸量は第３表に示す通りである。

【表】 実施例 ３ 実施例２で用いた種培地を用い第４表に示した
菌株が増殖した種培養物３mlを、実施例２で用い
た生産培地にさらにポリオキシエチレンソルビタ
ンモノパルミテートを0.08ｇ／添加した培地16
mlに植菌し、34℃で培養した。培養中、培養液の
PHを6.5〜8.0に保つように殺菌した10％尿素0.5ml
を添加しながら30時間培養した。かくして培養液
中に蓄積したＬ−グルタミン酸の量は第４表に示
す通りである。

【表】 実施例 ４ 実施例２で用いた種培地を用い第５表に示した
菌が増殖した種培養物３mlを実施例２で用いた生
産培地16mlに殺菌し、34℃で培養した。培養中、
培養液のPHを6.5〜8.0に保つように殺菌した尿素
液0.5mlを添加しながら30時間培養した。かくし
て培養液中に蓄積したＬ−グルタミン酸は第５表
に示す通りである。

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
   ウム属に属しプリンアナログ抵抗性およびピリミ
   ジンアナログ抵抗性の少なくとも１種の性質を有
   するＬ−グルタミン酸生産株を栄養培地に培養
   し、培養液中にＬ−グルタミン酸を蓄積せしめ、
   該培養液からＬ−グルタミン酸を採取することを
   特徴とする発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造
   法。