JPH1052289A - Ｄ−リンゴ酸の製造方法 - Google Patents
Ｄ−リンゴ酸の製造方法Info
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- JPH1052289A JPH1052289A JP12709497A JP12709497A JPH1052289A JP H1052289 A JPH1052289 A JP H1052289A JP 12709497 A JP12709497 A JP 12709497A JP 12709497 A JP12709497 A JP 12709497A JP H1052289 A JPH1052289 A JP H1052289A
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- maleic acid
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 シュードモナス属に属し、マレイン酸を
Ｄ−リンゴ酸に変換する能力を有し、かつ４５℃以上で
生育可能な微生物の菌体、菌体処理物、またはその培養
液にてマレイン酸を処理してＤ−リンゴ酸を製造するこ
とを特徴とする、Ｄ−リンゴ酸の製造方法、ならびにマ
レイン酸をＤ−リンゴ酸に変換する能力を有し、４０〜
６５℃で培養して得られた微生物の菌体、菌体処理物、
またはその培養液にて５〜４０％濃度のマレイン酸溶液
を処理してＤ−リンゴ酸を製造することを特徴とする、
Ｄ−リンゴ酸の製造方法。 【効果】 本発明方法によれば、高濃度基質、高温の反
応条件下でも、マレイン酸から効率的にＤ−リンゴ酸を
製造することができる。
Ｄ−リンゴ酸に変換する能力を有し、かつ４５℃以上で
生育可能な微生物の菌体、菌体処理物、またはその培養
液にてマレイン酸を処理してＤ−リンゴ酸を製造するこ
とを特徴とする、Ｄ−リンゴ酸の製造方法、ならびにマ
レイン酸をＤ−リンゴ酸に変換する能力を有し、４０〜
６５℃で培養して得られた微生物の菌体、菌体処理物、
またはその培養液にて５〜４０％濃度のマレイン酸溶液
を処理してＤ−リンゴ酸を製造することを特徴とする、
Ｄ−リンゴ酸の製造方法。 【効果】 本発明方法によれば、高濃度基質、高温の反
応条件下でも、マレイン酸から効率的にＤ−リンゴ酸を
製造することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物を用いて、
マレイン酸からＤ−リンゴ酸を効率良く製造する方法に
関する。
マレイン酸からＤ−リンゴ酸を効率良く製造する方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】光学純度の高いＤ−リンゴ酸は、医農薬
中間体等の不斉合成の原料として有用である。Ｄ−リン
ゴ酸の製造方法としては、ＤＬ−リンゴ酸をジアステレ
オマー塩法により分割する方法（特開昭57-56439号) 、
ＤＬ−リンゴ酸を微生物に不斉資化させ、Ｄ−リンゴ酸
を得る方法（特開平2-242699号) 等があるが、いずれも
原料をマレイン酸からと考えられると、収率は最高でも
50% 程度であり、効率的な方法とはいえない。
中間体等の不斉合成の原料として有用である。Ｄ−リン
ゴ酸の製造方法としては、ＤＬ−リンゴ酸をジアステレ
オマー塩法により分割する方法（特開昭57-56439号) 、
ＤＬ−リンゴ酸を微生物に不斉資化させ、Ｄ−リンゴ酸
を得る方法（特開平2-242699号) 等があるが、いずれも
原料をマレイン酸からと考えられると、収率は最高でも
50% 程度であり、効率的な方法とはいえない。
【０００３】一方、マレイン酸から各種の微生物または
微生物処理物を作用させて、D-リンゴ酸を製造する方法
が知られている [Enzymic Formation of D-Malete [(Bi
ochem J. (1968) 110, 798-800; Hopper et al.)、特開
平3-53888 号、特開平4-316491号、特開平7-143891号、
特開平5-103680号、特開平7-188 号等] 。また、マレイ
ン酸からＤ−リンゴ酸を生産する微生物として、シュー
ドモナス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウ
ム属、コリネバクテリウム属、バチルス属、アースロバ
クター属、アシネトバクター属、ミクロバクテリウム
属、ウスチラゴ属、パラコッカス属、カンジダ属、ペニ
シリウム属等が上記の各先行文献に開示されている。
微生物処理物を作用させて、D-リンゴ酸を製造する方法
が知られている [Enzymic Formation of D-Malete [(Bi
ochem J. (1968) 110, 798-800; Hopper et al.)、特開
平3-53888 号、特開平4-316491号、特開平7-143891号、
特開平5-103680号、特開平7-188 号等] 。また、マレイ
ン酸からＤ−リンゴ酸を生産する微生物として、シュー
ドモナス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウ
ム属、コリネバクテリウム属、バチルス属、アースロバ
クター属、アシネトバクター属、ミクロバクテリウム
属、ウスチラゴ属、パラコッカス属、カンジダ属、ペニ
シリウム属等が上記の各先行文献に開示されている。
【０００４】しかしながら、上記の微生物を用いたD-リ
ンゴ酸の製造においても、その生産能、特に工業的に意
味のある高濃度基質（基質濃度５％以上) 、高温(45 ℃
以上)の条件下の反応性は必ずしも満足できるものでは
なく、かかる条件下でも効率よくD-リンゴ酸を製造でき
る方法が求められている。
ンゴ酸の製造においても、その生産能、特に工業的に意
味のある高濃度基質（基質濃度５％以上) 、高温(45 ℃
以上)の条件下の反応性は必ずしも満足できるものでは
なく、かかる条件下でも効率よくD-リンゴ酸を製造でき
る方法が求められている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、高濃度基
質、高温の反応条件下でも、マレイン酸から効率的にＤ
−リンゴ酸を製造する方法を提供することを目的とす
る。
質、高温の反応条件下でも、マレイン酸から効率的にＤ
−リンゴ酸を製造する方法を提供することを目的とす
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、シュードモナ
ス属に属する特定の菌株が、高濃度基質、高温の反応条
件下でもマレイン酸から効率的にＤ−リンゴ酸を生産で
きることを見出し、本発明を完成した。
を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、シュードモナ
ス属に属する特定の菌株が、高濃度基質、高温の反応条
件下でもマレイン酸から効率的にＤ−リンゴ酸を生産で
きることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】即ち、本発明は、シュードモナス属に属
し、マレイン酸をＤ−リンゴ酸に変換する能力を有し、
かつ４５℃以上で生育可能な微生物の菌体、菌体処理
物、またはその培養液にてマレイン酸を処理してＤ−リ
ンゴ酸を製造することを特徴とする、Ｄ−リンゴ酸の製
造方法である。
し、マレイン酸をＤ−リンゴ酸に変換する能力を有し、
かつ４５℃以上で生育可能な微生物の菌体、菌体処理
物、またはその培養液にてマレイン酸を処理してＤ−リ
ンゴ酸を製造することを特徴とする、Ｄ−リンゴ酸の製
造方法である。
【０００８】本発明はまた、マレイン酸をＤ−リンゴ酸
に変換する能力を有し、４０〜６５℃で培養して得られ
た微生物の菌体、菌体処理物、またはその培養液にて５
〜４０％濃度のマレイン酸溶液を処理してＤ−リンゴ酸
を製造することを特徴とする、Ｄ−リンゴ酸の製造方法
である。
に変換する能力を有し、４０〜６５℃で培養して得られ
た微生物の菌体、菌体処理物、またはその培養液にて５
〜４０％濃度のマレイン酸溶液を処理してＤ−リンゴ酸
を製造することを特徴とする、Ｄ−リンゴ酸の製造方法
である。
【０００９】上記菌体処理物としては、例えば菌体また
は菌体から調製した酵素を固定化したものも含まれる。
さらに、本発明は、マレイン酸をＤ−リンゴ酸に変換す
る能力を有し、かつ４５℃以上で生育可能な新規微生
物、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＮＳＭ−
５株またはＮＳＭ−６株である。
は菌体から調製した酵素を固定化したものも含まれる。
さらに、本発明は、マレイン酸をＤ−リンゴ酸に変換す
る能力を有し、かつ４５℃以上で生育可能な新規微生
物、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＮＳＭ−
５株またはＮＳＭ−６株である。
【００１０】さらに、本発明は、５０℃以上でマレイン
酸をＤ−リンゴ酸に変換する能力の極大値を有する微生
物の菌体、菌体処理物、またはその培養液にてマレイン
酸を処理してＤ−リンゴ酸を製造することを特徴とす
る、Ｄ−リンゴ酸の製造方法である。そして、前記微生
物としては、シュードモナス・シュードアルカリゲネス
ＮＳＭ−５株またはＮＳＭ−６株があげられる。以下、
本発明を詳細に説明する。
酸をＤ−リンゴ酸に変換する能力の極大値を有する微生
物の菌体、菌体処理物、またはその培養液にてマレイン
酸を処理してＤ−リンゴ酸を製造することを特徴とす
る、Ｄ−リンゴ酸の製造方法である。そして、前記微生
物としては、シュードモナス・シュードアルカリゲネス
ＮＳＭ−５株またはＮＳＭ−６株があげられる。以下、
本発明を詳細に説明する。
【００１１】
【発明の実施の態様】本発明において用いる微生物であ
る、ＮＳＭ−５株またはＮＳＭ−６株は、本発明者等に
より、日光湯本温泉地の土壌中より分離されたものであ
る。ＮＳＭ−５株の菌学的性質は、以下の通りである。
る、ＮＳＭ−５株またはＮＳＭ−６株は、本発明者等に
より、日光湯本温泉地の土壌中より分離されたものであ
る。ＮＳＭ−５株の菌学的性質は、以下の通りである。
【００１２】
【００１３】ＮＳＭ−６株の菌学的性質は、以下の通り
である。
である。
【００１４】
【００１５】以上の菌学的性質について、バージイズ・
マニュアル・オブ・システマティク・バクテリオロジー
vol.1〜4 (1986 年) をもとに検索を行った結果、NSM-
5 株およびNSM-6 株はいずれも、グラム陰性、運動性陽
性、ＯＦテスト陰性、オキシダーゼ陽性、糖の資化性、
有機酸の資化性等の点から、シュードモナス・シュード
アルカリゲネスに属する菌株であると同定し、それぞれ
をシュードモナス・シュードアルカリゲネスＮＳＭ−
５、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＮＳＭ−
６と命名した。
マニュアル・オブ・システマティク・バクテリオロジー
vol.1〜4 (1986 年) をもとに検索を行った結果、NSM-
5 株およびNSM-6 株はいずれも、グラム陰性、運動性陽
性、ＯＦテスト陰性、オキシダーゼ陽性、糖の資化性、
有機酸の資化性等の点から、シュードモナス・シュード
アルカリゲネスに属する菌株であると同定し、それぞれ
をシュードモナス・シュードアルカリゲネスＮＳＭ−
５、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＮＳＭ−
６と命名した。
【００１６】シュードモナス・シュードアルカリゲネス
ＮＳＭ−５およびシュードモナス・シュードアルカリゲ
ネスＮＳＭ−６は、工業技術院生命工学工業技術研究所
にそれぞれ寄託番号FERM P-15561（寄託日平成８年４月
12日）、FERM P-15562（寄託日平成８年４月12日）とし
て寄託されている。
ＮＳＭ−５およびシュードモナス・シュードアルカリゲ
ネスＮＳＭ−６は、工業技術院生命工学工業技術研究所
にそれぞれ寄託番号FERM P-15561（寄託日平成８年４月
12日）、FERM P-15562（寄託日平成８年４月12日）とし
て寄託されている。
【００１７】さらに、このシュードモナス・シュードア
ルカリゲネスＮＳＭ−５、シュードモナス・シュードア
ルカリゲネスＮＳＭ−６とシュードモナス・シュードア
ルカリゲネスの公知の菌株であるNCIMB9867 との45℃お
よび30℃における生育状態の比較を次表に示す。
ルカリゲネスＮＳＭ−５、シュードモナス・シュードア
ルカリゲネスＮＳＭ−６とシュードモナス・シュードア
ルカリゲネスの公知の菌株であるNCIMB9867 との45℃お
よび30℃における生育状態の比較を次表に示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】
【表２】
【００２０】菌体培養用培地Ｃ: マレイン酸 10 g 硫酸アンモニア 1.4 g ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2Ｏ 0.5 g ＫＨ2 ＰＯ4 1.0 g Ｋ2 ＨＰＯ4 3.0 g ＮａＯＨ 5.5 g 酵母エキス 0.1 g 水道水 全量を１Lとする。
【００２１】N.A : Difico社製の Bacto Nutrient Agar N.B : Difico社製の Bacto Nutrient Broth
【００２２】表１及び表２から、ＮＳＭ菌株とNCIMB986
7とはNCIMB9867が45℃では生育せず、また、マレイン酸
を資化しない点でＮＳＭ菌株と相違する。本発明に用い
る微生物は、シュードモナス属に属する公知の微生物と
同様な方法により培養することができる。培地として
は、資化可能な炭素源、窒素源、無機物及び必要な生育
促進物質を適当に含有する培地であれば、合成培地、天
然培地のいずれも用いることができる。炭素源として
は、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸などの有機酸、グ
ルコース、廃糖蜜等を用いることでき、窒素源として
は、アンモニア、硫安、ペプトン、酵母エキス、コーン
スティプリカー等を用いることができる。そのほか必要
に応じてリン酸塩、硫酸マグネシウム、微量の重金属塩
等の無機塩類等、マロン酸等の酵素誘導物質を加えるこ
とができる。
7とはNCIMB9867が45℃では生育せず、また、マレイン酸
を資化しない点でＮＳＭ菌株と相違する。本発明に用い
る微生物は、シュードモナス属に属する公知の微生物と
同様な方法により培養することができる。培地として
は、資化可能な炭素源、窒素源、無機物及び必要な生育
促進物質を適当に含有する培地であれば、合成培地、天
然培地のいずれも用いることができる。炭素源として
は、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸などの有機酸、グ
ルコース、廃糖蜜等を用いることでき、窒素源として
は、アンモニア、硫安、ペプトン、酵母エキス、コーン
スティプリカー等を用いることができる。そのほか必要
に応じてリン酸塩、硫酸マグネシウム、微量の重金属塩
等の無機塩類等、マロン酸等の酵素誘導物質を加えるこ
とができる。
【００２３】培養温度は、４０〜６５℃、好ましくは４
５〜６０℃であり、培地のpHは塩酸などの鉱酸、マレイ
ン酸などの有機酸等により５〜９に維持することが好ま
しい。このような条件で培養開始から６〜48時間で充分
な量の微生物が得られる。
５〜６０℃であり、培地のpHは塩酸などの鉱酸、マレイ
ン酸などの有機酸等により５〜９に維持することが好ま
しい。このような条件で培養開始から６〜48時間で充分
な量の微生物が得られる。
【００２４】以上のようにして得られた微生物の菌体、
菌体処理物、またはその培養液を用いて、マレイン酸を
処理することによりＤ−リンゴ酸を製造する。なお、本
発明において「マレイン酸を処理する」とは、マレイン
酸に由来する物質、例えば、マレイン酸イオン、マレイ
ン酸を含む塩等を処理することを意味する。
菌体処理物、またはその培養液を用いて、マレイン酸を
処理することによりＤ−リンゴ酸を製造する。なお、本
発明において「マレイン酸を処理する」とは、マレイン
酸に由来する物質、例えば、マレイン酸イオン、マレイ
ン酸を含む塩等を処理することを意味する。
【００２５】本発明において、微生物の菌体、菌体処理
物、またはその培養液を用いてマレイン酸を処理するに
は、(i) 微生物の培養終了後、基質を添加して反応を行
う方法、(ii)培地に基質を添加し、培養と反応を同時に
行う方法、(iii) 固定化担体に固定化させた菌体処理物
をカラムに充填したもの等に、基質を加えて反応を行う
方法を用いることができる。具体的には以下のようにし
て行う。
物、またはその培養液を用いてマレイン酸を処理するに
は、(i) 微生物の培養終了後、基質を添加して反応を行
う方法、(ii)培地に基質を添加し、培養と反応を同時に
行う方法、(iii) 固定化担体に固定化させた菌体処理物
をカラムに充填したもの等に、基質を加えて反応を行う
方法を用いることができる。具体的には以下のようにし
て行う。
【００２６】第１に、微生物の菌体を用いて処理するに
は、以下のような方法を例示することができる。まず、
本発明の微生物を培地で培養し、培養物の中から菌体を
回収する。ここでの培養は、微生物の増殖を目的とする
ものであるから、上述した培地を用い、上述した温度、
ｐＨ等で培養を行う。
は、以下のような方法を例示することができる。まず、
本発明の微生物を培地で培養し、培養物の中から菌体を
回収する。ここでの培養は、微生物の増殖を目的とする
ものであるから、上述した培地を用い、上述した温度、
ｐＨ等で培養を行う。
【００２７】次に、回収した菌体をマレイン酸を含む培
地に接種し、培養する。培養（反応）時の温度は、２０
〜６５℃、好ましくは２５〜６０℃、ｐＨは５〜９と
し、１２〜２４時間行う。培地中のマレイン酸濃度は
０．１〜１０％が適当である。
地に接種し、培養する。培養（反応）時の温度は、２０
〜６５℃、好ましくは２５〜６０℃、ｐＨは５〜９と
し、１２〜２４時間行う。培地中のマレイン酸濃度は
０．１〜１０％が適当である。
【００２８】培養物からＤ−リンゴ酸の回収は、反応液
から菌体を遠心分離により除去してから、リンゴ酸の分
離精製に用いる公知の方法、例えば、濃縮、晶析、イオ
ン交換樹脂処理により行うことができる。
から菌体を遠心分離により除去してから、リンゴ酸の分
離精製に用いる公知の方法、例えば、濃縮、晶析、イオ
ン交換樹脂処理により行うことができる。
【００２９】第２に、微生物の培養液を用いて処理する
には、以下のような方法を例示することができる。ま
ず、本発明の微生物を培地で培養し、培養物の中から培
養液を回収する。ここでの培養は、上述した培地、温
度、ｐＨ等で行う。
には、以下のような方法を例示することができる。ま
ず、本発明の微生物を培地で培養し、培養物の中から培
養液を回収する。ここでの培養は、上述した培地、温
度、ｐＨ等で行う。
【００３０】次に、得られた培養液をマレイン酸溶液と
混合し、培養液中に含まれる微生物酵素と、マレイン酸
を反応させる。反応は、温度４０〜６５℃、好ましくは
４５〜６０℃、ｐＨ５〜９にて行う。また、マレイン酸
濃度は５〜４０％、好ましくは１０〜２０％が適当であ
る。この反応により、マレイン酸は、Ｄ−リンゴ酸に変
化する。反応時間は、菌体を用いて処理する場合と同様
に、１２〜２４時間とするのが好ましい。反応液からＤ
−リンゴ酸を回収する方法は、上述した菌体を用いて処
理する場合と同様にして行うことができる。
混合し、培養液中に含まれる微生物酵素と、マレイン酸
を反応させる。反応は、温度４０〜６５℃、好ましくは
４５〜６０℃、ｐＨ５〜９にて行う。また、マレイン酸
濃度は５〜４０％、好ましくは１０〜２０％が適当であ
る。この反応により、マレイン酸は、Ｄ−リンゴ酸に変
化する。反応時間は、菌体を用いて処理する場合と同様
に、１２〜２４時間とするのが好ましい。反応液からＤ
−リンゴ酸を回収する方法は、上述した菌体を用いて処
理する場合と同様にして行うことができる。
【００３１】第３に、微生物の菌体処理物を用いて処理
するには、以下のような方法を例示することができる。
まず、微生物をゲルで包括固定化、あるいは微生物から
調製した酵素含有物をイオン交換体に担持させて固定化
生体触媒とする。ここで、微生物を包括固定化するゲル
としては、例えば、カラーギナンゲル、寒天ゲル、マン
ナンゲル、ＰＶＡゲル、ポリアクリルアミドゲル等を挙
げることができる。ゲル球の大きさは、ゲルの種類によ
り異なるが、直径１〜１０ｍｍ程度が適当である。ま
た、酵素含有物を担持させるイオン交換体としては、例
えば、セルロース系、スチレンジビニルベンゼン系、フ
ェノールホルマリン系などのイオン交換体を挙げること
ができる。次に、上記の固定化生体触媒をカラムに充填
し、これにマレイン酸溶液を流通させる。このマレイン
酸溶液の濃度は、５〜４０％、好ましくは１０〜２０％
が適当である。また、当該溶液に、メルカプトエタノー
ル、システイン、グルタチオンなどのＳＨ化合物、亜硫
酸塩などの還元剤、マグネシウムイオン、マンガンイオ
ンなどの酵素活性化剤等を添加することもできる。カラ
ム中を流通させるマレイン酸溶液の速度は、カラムの大
きさ、固定化生体触媒の量により異なるが、ＳＶ＝0.05
〜10程度が適当である。カラムを通過した液体は、微生
物または酵素の作用により多量のＤ−リンゴ酸を含む。
該液体よりＤ−リンゴ酸を回収する方法は、上記の菌体
を用いた処理方法と同様にして行うことができる。以
下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本
発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
するには、以下のような方法を例示することができる。
まず、微生物をゲルで包括固定化、あるいは微生物から
調製した酵素含有物をイオン交換体に担持させて固定化
生体触媒とする。ここで、微生物を包括固定化するゲル
としては、例えば、カラーギナンゲル、寒天ゲル、マン
ナンゲル、ＰＶＡゲル、ポリアクリルアミドゲル等を挙
げることができる。ゲル球の大きさは、ゲルの種類によ
り異なるが、直径１〜１０ｍｍ程度が適当である。ま
た、酵素含有物を担持させるイオン交換体としては、例
えば、セルロース系、スチレンジビニルベンゼン系、フ
ェノールホルマリン系などのイオン交換体を挙げること
ができる。次に、上記の固定化生体触媒をカラムに充填
し、これにマレイン酸溶液を流通させる。このマレイン
酸溶液の濃度は、５〜４０％、好ましくは１０〜２０％
が適当である。また、当該溶液に、メルカプトエタノー
ル、システイン、グルタチオンなどのＳＨ化合物、亜硫
酸塩などの還元剤、マグネシウムイオン、マンガンイオ
ンなどの酵素活性化剤等を添加することもできる。カラ
ム中を流通させるマレイン酸溶液の速度は、カラムの大
きさ、固定化生体触媒の量により異なるが、ＳＶ＝0.05
〜10程度が適当である。カラムを通過した液体は、微生
物または酵素の作用により多量のＤ−リンゴ酸を含む。
該液体よりＤ−リンゴ酸を回収する方法は、上記の菌体
を用いた処理方法と同様にして行うことができる。以
下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本
発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００３２】
〔実施例１〕 (1) 使用菌株 シュードモナス・シュードアルカリゲネス (Pseudomona
s Pseudoalcaligenes) ＮＳＭ−５ シュードモナス・シュードアルカリゲネス(Pseudomonas
Pseudoalcaligenes) ＮＳＭ−６
s Pseudoalcaligenes) ＮＳＭ−５ シュードモナス・シュードアルカリゲネス(Pseudomonas
Pseudoalcaligenes) ＮＳＭ−６
【００３３】(2) 培養菌体の取得 ＮＢ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に上記の各菌株を培養し、
そのブロス５ｍｌを、500 ml坂口フラスコ入れた菌体培
養用培地Ａ（表３) ５０ｍｌに接種し、３０℃で、１６
時間培養した後、ブロス４０ｍｌ分の菌体を遠心分離
（15,000rpm, 15分) により回収した。
そのブロス５ｍｌを、500 ml坂口フラスコ入れた菌体培
養用培地Ａ（表３) ５０ｍｌに接種し、３０℃で、１６
時間培養した後、ブロス４０ｍｌ分の菌体を遠心分離
（15,000rpm, 15分) により回収した。
【００３４】
【表３】
【００３５】3) 基質溶液との反応 １％濃度のマレイン酸基質溶液Ａ（1%マレイン酸及びMg
SO4・7H2O 0.025% を含む1Lの蒸留水，水酸化ナトリウ
ムでpH7.0 に調節) ５．７ｍｌに上記菌体を懸濁したの
ち、３０℃で緩やかに２時間振とうして反応させ、活性
を測定した。その結果を表４に示す（実施例１−１〜
２）。活性値は、Ｄ−リンゴ酸生成量をＨＰＬＣ分析に
より測定し、反応液中の菌体濃度（OD:660nmにおける吸
光度) と時間で割った値である。
SO4・7H2O 0.025% を含む1Lの蒸留水，水酸化ナトリウ
ムでpH7.0 に調節) ５．７ｍｌに上記菌体を懸濁したの
ち、３０℃で緩やかに２時間振とうして反応させ、活性
を測定した。その結果を表４に示す（実施例１−１〜
２）。活性値は、Ｄ−リンゴ酸生成量をＨＰＬＣ分析に
より測定し、反応液中の菌体濃度（OD:660nmにおける吸
光度) と時間で割った値である。
【００３６】
【表４】
【００３７】〔比較例１〕 (1) 使用菌株 シュードモナス・シュードアルカリゲネス (Pseudomona
s Pseudoalcaligenes) NCIMB 9867 アシネトバクター・カルコアセチクス (Acinetobacter
calcoaceticus) IFO12552
s Pseudoalcaligenes) NCIMB 9867 アシネトバクター・カルコアセチクス (Acinetobacter
calcoaceticus) IFO12552
【００３８】(2) 培養菌体の取得 上記各菌株を用い、菌体培養用培地Ｂ（表５) に接種す
る以外は、実施例１と同様な操作にて菌体を作製した。
る以外は、実施例１と同様な操作にて菌体を作製した。
【００３９】
【表５】
【００４０】(3) 基質溶液との反応 １％濃度のマレイン酸基質溶液Ｂ（1%マレイン酸及び0.
1%塩化ナトリウムを含む50mMリン酸緩衝液, 水酸化ナト
リウムでpH7.0 に調節) を用いる以外は実施例１と同様
の操作を行い、活性を測定した。その結果を前記表４に
併せて示す（比較例１−１〜２）。
1%塩化ナトリウムを含む50mMリン酸緩衝液, 水酸化ナト
リウムでpH7.0 に調節) を用いる以外は実施例１と同様
の操作を行い、活性を測定した。その結果を前記表４に
併せて示す（比較例１−１〜２）。
【００４１】〔実施例２〕 (1) 使用菌株 シュードモナス・シュードアルカリゲネス (Pseudomona
s Pseudoalcaligenes)ＮＳＭ−５ シュードモナス・シュードアルカリゲネス(Pseudomonas
Pseudoalcaligenes) ＮＳＭ−６
s Pseudoalcaligenes)ＮＳＭ−５ シュードモナス・シュードアルカリゲネス(Pseudomonas
Pseudoalcaligenes) ＮＳＭ−６
【００４２】(2) 培養菌体の調製 ＮＢ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に上記の各菌株を培養し、
そのブロス５ｍｌを、500 ml坂口フラスコ入れた菌体培
養用培地Ａ（前記表１) ５０ｍｌに接種し、５０℃で、
１６時間培養した後、ブロス４０ｍｌ分の菌体を遠心分
離（15,000rpm,15 分) により回収した。
そのブロス５ｍｌを、500 ml坂口フラスコ入れた菌体培
養用培地Ａ（前記表１) ５０ｍｌに接種し、５０℃で、
１６時間培養した後、ブロス４０ｍｌ分の菌体を遠心分
離（15,000rpm,15 分) により回収した。
【００４３】(3) 基質溶液との反応 前記の１％濃度のマレイン酸基質溶液Ａ ５．７ｍｌに
菌体を懸濁したのち、５０℃で緩やかに２時間振とうし
て反応させ、活性を測定した。その結果を表６に示す
（実施例２−１〜２）。
菌体を懸濁したのち、５０℃で緩やかに２時間振とうし
て反応させ、活性を測定した。その結果を表６に示す
（実施例２−１〜２）。
【００４４】
【表６】
【００４５】〔比較例２〕 (1) 使用菌株 シュードモナス・シュードアルカリゲネス (Pseudomona
s pseudoalcaligenes) NCIMB 9867 シュードモナス・フルオレセンス (Pseudomonas fluore
scens) IFO 3081 アシネトバクター・カルコアセチクス (Acinetobacter
calcoaceticus) IFO12552
s pseudoalcaligenes) NCIMB 9867 シュードモナス・フルオレセンス (Pseudomonas fluore
scens) IFO 3081 アシネトバクター・カルコアセチクス (Acinetobacter
calcoaceticus) IFO12552
【００４６】(2) 培養菌体の調製 比較例１と同様にして菌体を作製した。 (3) 基質溶液との反応 前記１％濃度のマレイン酸基質溶液Ｂ（1%マレイン酸及
び0.1%塩化ナトリウムを含む50mMリン酸緩衝液, 水酸化
ナトリウムでpH7.0 に調節) を用いる以外は、実施例２
と同様の操作を行い、活性を測定した。その結果を前記
表４に併せて示す（比較例２−１〜３）。
び0.1%塩化ナトリウムを含む50mMリン酸緩衝液, 水酸化
ナトリウムでpH7.0 に調節) を用いる以外は、実施例２
と同様の操作を行い、活性を測定した。その結果を前記
表４に併せて示す（比較例２−１〜３）。
【００４７】〔実施例３〕 (1) 使用菌株 実施例２と同じ。 (2) 培養菌体の調製 培養温度を30℃または50℃のそれぞれで行う以外は、実
施例２と同様にして行った。
施例２と同様にして行った。
【００４８】(3) 基質溶液との反応 １０％濃度のマレイン酸基質溶液Ｃ（10% マレイン酸及
びMgSO4・7H20 0.025%を含む蒸留水, 水酸化ナトリウム
でpH7.0 に調節) を基質溶液に用いる以外は、実施例２
と同様の操作を行い、活性を測定した。その結果を表７
に示す（実施例３−１〜４）。
びMgSO4・7H20 0.025%を含む蒸留水, 水酸化ナトリウム
でpH7.0 に調節) を基質溶液に用いる以外は、実施例２
と同様の操作を行い、活性を測定した。その結果を表７
に示す（実施例３−１〜４）。
【００４９】
【表７】
【００５０】〔比較例３〕 (1) 使用菌株 比較例２と同じ。 (2) 培養菌体の調製 比較例２と同様にして菌体を作製した。
【００５１】(3) 基質溶液との反応 １０％濃度のマレイン酸基質溶液Ｄ（10 %マレイン酸及
び0.1%塩化ナトリウムを含む50mMリン酸緩衝液, 水酸化
ナトリウムでpH7.0 に調節) を基質溶液に用いる以外
は、比較例２と同様の操作を行い、活性を測定した。そ
の結果を前記表５に併せて示す（比較例３−１〜３）。
び0.1%塩化ナトリウムを含む50mMリン酸緩衝液, 水酸化
ナトリウムでpH7.0 に調節) を基質溶液に用いる以外
は、比較例２と同様の操作を行い、活性を測定した。そ
の結果を前記表５に併せて示す（比較例３−１〜３）。
【００５２】〔実施例４〕シュードモナス・シュードア
ルカリゲネスＮＳＭ−５が有するマレイン酸をリンゴ酸
に変換する能力（変換率）を５０℃で測定した。 （１）菌体の調製 ５００mlの坂口フラスコに菌体培養用培地Ａを１００ml
入れ、１２１℃で１５分間滅菌処理したものに１白菌耳
のシュードモナス・シュードアルカリゲネスＮＳＭ−５
の菌体を接種し、４５℃にて１６時間振とう培養した。
培養後、菌体を遠心分離し（１００００rpm 、１０
分）、５０mMリン酸カリウム緩衝液ｐＨで洗浄した。
ルカリゲネスＮＳＭ−５が有するマレイン酸をリンゴ酸
に変換する能力（変換率）を５０℃で測定した。 （１）菌体の調製 ５００mlの坂口フラスコに菌体培養用培地Ａを１００ml
入れ、１２１℃で１５分間滅菌処理したものに１白菌耳
のシュードモナス・シュードアルカリゲネスＮＳＭ−５
の菌体を接種し、４５℃にて１６時間振とう培養した。
培養後、菌体を遠心分離し（１００００rpm 、１０
分）、５０mMリン酸カリウム緩衝液ｐＨで洗浄した。
【００５３】（２）反応 １０％濃度のマレイン酸基質溶液Ｃ５mlに菌体湿重１ｇ
を加え懸濁させ所定（６０、５０、３０℃）の温度にて
反応させた。 （３）変換率の測定 変換率の測定はＤ−リンゴ酸生成量をＰＨＬＣにて測定
した。なお、変換率は３０℃におけるそれを１００とし
た相対値とした。
を加え懸濁させ所定（６０、５０、３０℃）の温度にて
反応させた。 （３）変換率の測定 変換率の測定はＤ−リンゴ酸生成量をＰＨＬＣにて測定
した。なお、変換率は３０℃におけるそれを１００とし
た相対値とした。
【００５４】
【表８】
【００５５】表８の結果より最大変換率は５０℃以上と
確認された。 〔実施例５〕シュードモナス・シュードアルカリゲネス
ＮＳＭ−６が有するマレイン酸をリンゴ酸に変換する能
力（変換率）を５０℃で測定した。
確認された。 〔実施例５〕シュードモナス・シュードアルカリゲネス
ＮＳＭ−６が有するマレイン酸をリンゴ酸に変換する能
力（変換率）を５０℃で測定した。
【００５６】（１）菌体の調製 ５００mlの坂口フラスコに菌体培養用培地Ａを１００ml
入れ、１２１℃で１５分間滅菌処理したものに１白菌耳
のシュードモナス・シュードアルカリゲネスＮＳＭ−６
の菌体を接種し、４５℃にて１６時間振とう培養した。
培養後、菌体を遠心分離し（１００００rpm 、１０
分）、５０mMリン酸カリウム緩衝液ｐＨで洗浄した。
入れ、１２１℃で１５分間滅菌処理したものに１白菌耳
のシュードモナス・シュードアルカリゲネスＮＳＭ−６
の菌体を接種し、４５℃にて１６時間振とう培養した。
培養後、菌体を遠心分離し（１００００rpm 、１０
分）、５０mMリン酸カリウム緩衝液ｐＨで洗浄した。
【００５７】（２）反応 １０％濃度のマレイン酸基質溶液Ｃ５mlに菌体湿重１ｇ
を加え懸濁させ所定（６０、５０、３０℃）の温度にて
反応させた。 （３）変換率の測定 変換率の測定はＤ−リンゴ酸生成量をＰＨＬＣにて測定
した。なお、変換率は３０℃におけるそれを１００とし
た相対値とした。
を加え懸濁させ所定（６０、５０、３０℃）の温度にて
反応させた。 （３）変換率の測定 変換率の測定はＤ−リンゴ酸生成量をＰＨＬＣにて測定
した。なお、変換率は３０℃におけるそれを１００とし
た相対値とした。
【００５８】
【表９】
【００５９】表９の結果より最大変換率は５０℃以上と
確認された。
確認された。
【００６０】
【発明の効果】本発明方法によれば、高濃度基質、高温
の反応条件下でも、マレイン酸から効率的にＤ−リンゴ
酸を製造することができる。
の反応条件下でも、マレイン酸から効率的にＤ−リンゴ
酸を製造することができる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:38）
Claims (6)
- 【請求項１】 シュードモナス属に属し、マレイン酸を
Ｄ−リンゴ酸に変換する能力を有し、かつ４５℃以上で
生育可能な微生物の菌体、菌体処理物、またはその培養
液にてマレイン酸を処理してＤ−リンゴ酸を製造するこ
とを特徴とする、Ｄ−リンゴ酸の製造方法。 - 【請求項２】 マレイン酸をＤ−リンゴ酸に変換する能
力を有し、４０〜６５℃で培養して得られた微生物の菌
体、菌体処理物、またはその培養液にて５〜４０％濃度
のマレイン酸溶液を処理してＤ−リンゴ酸を製造するこ
とを特徴とする、Ｄ−リンゴ酸の製造方法。 - 【請求項３】 菌体処理物が、菌体または菌体から調製
した酵素を固定化したものであることを特徴とする請求
項１または２記載のＤ−リンゴ酸の製造方法。 - 【請求項４】 マレイン酸をＤ−リンゴ酸に変換する能
力を有し、かつ４５℃以上で生育可能な新規微生物、シ
ュードモナス・シュードアルカリゲネスＮＳＭ−５株ま
たはＮＳＭ−６株。 - 【請求項５】 ５０℃以上でマレイン酸をＤ−リンゴ酸
に変換する能力の極大値を有する微生物の菌体、菌体処
理物、またはその培養液にてマレイン酸を処理してＤ−
リンゴ酸を製造することを特徴とする、Ｄ−リンゴ酸の
製造方法。 - 【請求項６】 微生物がシュードモナス・シュードアル
カリゲネスＮＳＭ−５株またはＮＳＭ−６株である、請
求項５記載のＤ−リンゴ酸の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12709497A JPH1052289A (ja) | 1996-05-16 | 1997-05-16 | Ｄ−リンゴ酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12193396 | 1996-05-16 | ||
| JP8-121933 | 1996-05-16 | ||
| JP12709497A JPH1052289A (ja) | 1996-05-16 | 1997-05-16 | Ｄ−リンゴ酸の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1052289A true JPH1052289A (ja) | 1998-02-24 |
Family
ID=26459177
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12709497A Pending JPH1052289A (ja) | 1996-05-16 | 1997-05-16 | Ｄ−リンゴ酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1052289A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011125825A (ja) * | 2009-12-21 | 2011-06-30 | Sumitomo Heavy Ind Ltd | 油脂分解菌及び油脂分解剤 |
-
1997
- 1997-05-16 JP JP12709497A patent/JPH1052289A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011125825A (ja) * | 2009-12-21 | 2011-06-30 | Sumitomo Heavy Ind Ltd | 油脂分解菌及び油脂分解剤 |
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| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20061024 |
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20070306 |