CN111065280A - 氨基甲酸乙酯的分解 - Google Patents

Abstract

本发明的课题在于提供能够将食品或饮料中的氨基甲酸乙酯有效地分解的实用性优异的方法。使酯酶与含有氨基甲酸乙酯的食品或饮料作用，将氨基甲酸乙酯分解。

Description

氨基甲酸乙酯的分解

技术领域

本发明涉及将氨基甲酸乙酯分解的方法。详细而言，涉及将食品或饮料中的氨基甲酸乙酯分解的方法。本申请要求基于2017年3月30日提出申请的日本专利申请第2017－068426号的优先权，该专利申请的全部内容通过参照而被引用。

背景技术

氨基甲酸乙酯(以下，有时简称为“EC”)是虽然有过去被用作医药品的实例但怀疑有致癌性或诱变性的化合物，在经由食品或饮料等而被摄取时，担心对人体造成影响。特别是在绍兴酒、雪利酒或发酵食品中含有较多的EC，期望开发一种减少或除去EC的方法。迄今为止也进行了各种尝试，例如提出了利用氨基甲酸乙酯降解酶的方法(例如参照专利文献1、非专利文献1～3)、利用产生EC分解酶的微生物的菌体的方法(例如参照专利文献2、3)等。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平4－325079号公报

专利文献2：中国专利第102492633B号公报

专利文献3；日本特开H1－24017号公报

非专利文献

非专利文献1：Kobashi K.et al.,Chem.Pharm.Bull.38(5)1326-1328(1990)

非专利文献2：Zhao C.-J.et al.,Chem.Pharm.Bull.39(12)3303-3306(1991)

非专利文献3：B.R.Mohapatra and M.Bapuji,Letters in Applied Microbiology 1997,25,393-396

发明内容

对于利用氨基甲酸乙酯降解酶将EC分解的方法，存在酒精存在下的氨基甲酸乙酯降解酶的稳定性低、而且热稳定性也低这样的问题。另一方面，利用微生物菌体的分解方法特别是在实用性方面不能说充分。

酒类、发酵食品可每天持续摄取，认为其EC含量在今后会成为很大的问题。为了应对这样的状况，本发明的课题在于提供能够将食品或饮料中的EC有效地分解的实用性优异的方法。

为了解决上述课题，本发明人等以确立利用酶的EC的分解方法为目标，以广泛的酶为对象实施了大规模的筛选。其结果明确了来自乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)的酯酶对EC显示高分解活性。另外，令人惊讶的是，该酯酶在高酒精浓度下也发挥分解活性。该事实表示作为将酒精饮料中的EC分解的方法，来自乙酸钙不动杆菌的酯酶是有用的。在此，酯酶被归类为丝氨酸蛋白酶，通常因酒精的羟基而受到活性抑制。从该技术常识出发，由本发明人等的研究明确的酯酶的新型利用形态，即，“酒精饮料中的EC的分解使用酯酶”可以说极其独特。

另一方面，对来自乙酸钙不动杆菌的酯酶的相关酶(氨基酸序列的同源性为70％以上)的EC分解活性进行确认，结果相关酶也显示分解活性，可知能够将EC分解这样的特性并不是来自乙酸钙不动杆菌的酯酶所固有的特性。

通过进一步的研究，判明来自乙酸钙不动杆菌的酯酶在酒精中的稳定性和温度稳定性高，实用性优异。另外，也明确了该酯酶的诸性质，在实用化方面也带来了有用的信息。

以下的发明基于上述成果和考察。

[1]一种将食品或饮料中的氨基甲酸乙酯分解的方法，其特征在于，使酯酶与含有氨基甲酸乙酯的食品或饮料作用，所述酯酶由与序列号1的氨基酸序列70％以上相同的氨基酸序列构成。

[2]根据[1]所述的分解方法，其中，所述酯酶的氨基酸序列包含序列号1～18中的任一氨基酸序列。

[3]根据[1]所述的分解方法，其中，所述酯酶来自不动杆菌属微生物、假单胞菌属微生物、伯克氏菌属微生物或副伯克氏菌属微生物。

[4]根据[3]所述的分解方法，其中，所述不动杆菌属微生物为乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、吉洛氏不动杆菌(Acinetobacter guillouiae)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)或塞氏不动杆菌(Acinetobacter seifertii)，所述假单胞菌属微生物为绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，所述伯克氏菌属微生物为乌汶伯克氏菌(Burkholderia ubonensis)或假多噬伯克氏菌(Burkholderia pseudomultivorans)，所述副伯克氏菌属微生物为铁矿副伯克氏菌(Paraburkholderia ferrariae)。

[5]根据[1]所述的分解方法，其中，所述酯酶来自不动杆菌属NBRC 110496(Acinetobacter sp.NBRC 110496)、不动杆菌属NIPH809(Acinetobacter sp.NIPH809)、荧光假单胞菌A506(Pseudomonas fluorescens A506)、假单胞菌属ABAC61(Pseudomonassp.ABAC61)、恶臭假单胞菌IFO12996(Pseudomonas putida IFO12996)或恶臭假单胞菌MR2068(Pseudomonas putida MR2068)。

[6]根据[1]所述的分解方法，其中，所述酯酶具备以下的特征：

(1)最适温度：20～30℃，

(2)最适pH：pH7，

(3)温度稳定性：到70℃为止稳定(pH7、1小时)，

(4)pH稳定性：在pH5～11的范围内稳定，

(5)分子量：约85kDa(利用凝胶渗透色谱测得)。

[7]根据[6]所述的分解方法，其中，所述酯酶进一步具备以下的特征：

(6)酒精稳定性：如果酒精浓度为40％以下，则即使在30℃处理8天也不会失活。

[8]根据[1]～[7]中任一项所述的分解方法，其中，所述饮料为酒精饮料。

[9]根据[8]所述的分解方法，其中，所述酒精饮料为绍兴酒、以核果为原料的蒸馏酒、威士忌、白兰地、龙舌兰酒、巴西甘蔗酒、烧酒、清酒、葡萄酒、酒精强化葡萄酒、梅酒、雪利酒或混合酒。

[10]一种除去或减少了氨基甲酸乙酯的食品或饮料的制造方法，包括利用酯酶进行的处理工序，所述酯酶由与序列号1的氨基酸序列70％以上相同的氨基酸序列构成。

[11]根据[10]所述的制造方法，其中，所述酯酶为[2]～[7]中任一项中所定义的酯酶。

[12]根据[10]或[11]所述的制造方法，其中，所述饮料为酒精饮料。

[13]根据[12]所述的制造方法，其中，所述酒精饮料为绍兴酒、以核果为原料的蒸馏酒、威士忌、白兰地、龙舌兰酒、巴西甘蔗酒、烧酒、清酒、葡萄酒、酒精强化葡萄酒、梅酒、雪利酒或混合酒。

[14]一种除去或减少了氨基甲酸乙酯的食品或饮料，通过[10]～[13]中任一项所述的制造方法而得到。

附图说明

图1是相关酶的EC分解活性。使来自乙酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)的酯酶的相关酶在E.coli表达系统中表达，调查EC分解能力的有无。上：相关酶No.1～No.10在pH7.0时的EC分解能力。下：相关酶No.11～No.16在pH7.0时的EC分解能力。

图2是来自乙酸钙不动杆菌的酯酶的酒精稳定性。

图3是来自乙酸钙不动杆菌的酯酶的最适温度。

图4是来自乙酸钙不动杆菌的酯酶的最适pH。

图5是来自乙酸钙不动杆菌的酯酶的温度稳定性。

图6是来自乙酸钙不动杆菌的酯酶的pH稳定性。

具体实施方式

<食品或饮料中的氨基甲酸乙酯的分解>

本发明是将食品或饮料中的氨基甲酸乙酯分解的方法，特征在于，使酯酶与含有氨基甲酸乙酯的食品或饮料作用。根据本发明，可得到除去或减少了氨基甲酸乙酯的食品或饮料。

1.限定酯酶的氨基酸序列

本发明中使用的酯酶只要对氨基甲酸乙酯显示分解活性就没有特别限定。优选的酯酶之一为包含序列号1的氨基酸序列的酯酶。如后述的实施例所示，该酯酶是通过本发明人等的研究而发现的来自乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)的酯酶，具备对酒精的耐性高、而且温度稳定性优异这样的特征。另一方面，考虑到由与序列号1的氨基酸序列显示70％以上同源性的氨基酸序列特定的17种酯酶也与来自乙酸钙不动杆菌的酯酶同样地对氨基甲酸乙酯显示分解活性的事实(参照后述的实施例)，具有与序列号1的氨基酸序列70％以上相同的氨基酸序列的酯酶也适于本发明。符合的酯酶的具体例为来自吉洛氏不动杆菌(Acinetobacter guill ouiae)、具有序列号2的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性98％)，来自鲍氏不动杆菌ABNIH3(Acinetobacter baumannii ABNIH3)、具有序列号3的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性97％)，来自塞氏不动杆菌(Acinetobacter seifertii)、具有序列号4的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性90％)，来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、具有序列号5的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性80％)，来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、具有序列号6的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性80％)，来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、具有序列号7的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性80％)，来自乌汶伯克氏菌(Burkholderia ubonensis)、具有序列号8的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性81％)，来自铁矿副伯克氏菌(Paraburkhol deria ferrariae)、具有序列号9的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性81％)，来自假多噬伯克氏菌(Burkholderiapseudomultivorans)、具有序列号10的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性81％)，来自不动杆菌属NBRC 110496(Acinetobacter sp.NBRC 110496)、具有序列号11的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性81％)，来自塞氏不动杆菌(Acin etobacter seifertii)、具有序列号12的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性90％)，来自不动杆菌属NIPH809(Acinetobacter sp.NIPH809)、具有序列号13的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性80％)，来自荧光假单胞菌A506(A506Pseudomonas fluorescens A506)、具有序列号14的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性80％)，来自假单胞菌属AB AC61(Pseudomonassp.ABAC61)、具有序列号15的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性79％)，来自恶臭假单胞菌IFO12996(Pseudomon as putida IFO12996)、具有序列号16的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性76％)，来自恶臭假单胞菌MR2068(Pseudomonas putida MR2068)、具有序列号17的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性76％)，来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、具有序列号18的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性80％)。应予说明，不显示对氨基甲酸乙酯的分解活性的来自分枝节杆菌(Arthrobacterramosus)的酯酶(参照实施例)的氨基酸序列的同源性停留于21％。

也可以使用具有与上述氨基酸序列等效的氨基酸序列的酯酶。在此的“等效的氨基酸序列”是指与作为基准的氨基酸序列(序列号1～18中的任一序列)一部分不同，但该不同不会对蛋白质的功能(在此是对氨基甲酸乙酯的分解活性)造成实质性影响的氨基酸序列。因此，具有由等效的氨基酸序列构成的多肽链的酶显示对氨基甲酸乙酯的分解活性。相对于氨基甲酸乙酯的分解活性的程度优选与具有由作为基准的氨基酸序列构成的多肽链的酶为同等程度或比其高。

“氨基酸序列的一部分不同”典型而言是指因构成氨基酸序列的1～几个氨基酸的缺失、取代、或者1～几个氨基酸的附加、插入或它们的组合而导致氨基酸序列发生变异(变化)。在此的氨基酸序列的不同只要可保持对氨基甲酸乙酯的分解活性就被允许(活性可以稍微变动)。只要满足该条件，氨基酸序列不同的位置没有特别限定，另外，可以在多个位置产生不同。在此的“多个”例如是相当于小于全部氨基酸的约30％的数量，优选为相当于小于约20％的数量，进一步优选为相当于小于约10％的数量，更进一步优选为相当于小于约5％的数量，最优选为相当于小于约1％的数量。即等效蛋白质与作为基准的氨基酸序列具有例如约60％以上、约70％以上、约75％以上、约76％以上、约79％以上、约80％以上、约81％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约97％以上、约98％以上或约99％以上(同源性的百分比越高越优选)的同源性。应予说明，对于由序列号1的氨基酸序列特定的乙酸钙不动杆菌的酯酶，优选推定构成活性中心的97位丝氨酸(Ser97)、227位天冬氨酸(Asp227)和256位组氨酸(His256)不是缺失或取代的对象。

优选通过在对氨基甲酸乙酯的分解活性非必需的氨基酸残基中发生保守性氨基酸取代而得到等效的氨基酸序列。在此的“保守性氨基酸取代”是指将某氨基酸残基取代成具有同样性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链而被归类为碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、非电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)之类的几个家族。保守性氨基酸取代优选为相同家族内的氨基酸残基间的取代。

目前，两个氨基酸序列或两个核酸(以下，作为包含它们的术语，使用“两个序列”)的同源性(％)例如可以通过以下的步骤确定。首先，以能够进行最佳比较的方式将两个序列进行排列(例如，可以在第一序列导入空位(gap)而将与第二序列的比对最优化)。第一序列的特定位置的分子(氨基酸残基或核苷酸)与第二序列的对应的位置的分子相同时，可以说该位置的分子相同。两个序列的同源性是指该两个序列共同的相同位置的数量的函数(即，同源性(％)＝相同位置的数量/位置的总数×100)，优选将比对的最优化所需的空位的数量和尺寸也纳入考虑。

两个序列的比较和同源性的确定可以使用数学算法来实现。作为可用于比较的数学算法的具体例，有在Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Ac ad.Sci.USA 87:2264-68中记载的、在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.A cad.Sci.USA 90:5873-77中进行了改变的算法，但并不限定于此。这样的算法已被编入Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10中记载的NBLAS T程序和XBLAST程序(版本2.0)。为了得到与本发明的核酸分子等效的核苷酸序列，例如只要在NBLAST程序中使score＝100、wordlength＝12进行BLAST核苷酸检索即可。为了得到等效的氨基酸序列，例如只要在XBLAST程序中使score＝50、wordlength＝3进行BLAST多肽检索即可。为了得到用于比较的空位比对，可以利用Altschul等(1997)AminoA cids Research 25(17):3389-3402中记载的Gapped BLAST。利用BLAST和Gapped BLAST时，可以采用对应的程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。详细内容请参照http://www.ncbi.nlm.nih.gov。作为可用于序列的比较的其它数学算法的例子，有Myers和Miller(1988)Comput Appl B iosci.4:11-17中记载的算法。这样的算法例如已被编入可在GENESTREA M网络服务器(IGH Montpellier、法国)或ISREC服务器所利用的ALIG N程序。氨基酸序列的比较利用ALIGN程序时，例如可以使用PAM120残基质量表，使空位长罚分＝12、空位罚分＝4。

可以使用GCG软件包的GAP程序，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，使空位权重＝12、10、8、6或4、空位长权重＝2、3或4来确定两个氨基酸序列的同源性。另外，可以使用GCG软件包(可在http://www.gcg.com中利用)的GAP程度，使空位权重＝50、空位长权重＝3来确定两个核酸序列的相同度。

本发明中使用的酯酶可以为更大的蛋白质(例如融合蛋白质)的一部分。作为在融合蛋白质中附加的序列，例如可举出多重组氨酸残基这样的对纯化有用的序列、确保重组生产时的稳定性的附加序列等。

具有上述氨基酸序列的酯酶可以通过基因工程学方法而容易地制备。例如可以通过用编码目标酯酶的DNA转化适当的宿主细胞(例如大肠杆菌)并回收转化体内表达的蛋白质而制备。所回收的蛋白质可以根据目的适当纯化。如果如此以重组蛋白质的形式得到目标酶，则可以进行各种修饰。例如，如果将编码目标酶的DNA和其它适当的DNA插入到相同的载体中并使用该载体进行重组蛋白质的生产，则能够得到由连接有任意的肽或蛋白质的重组蛋白质构成的目标酶。另外，可以实施发生糖链和/或脂质的附加、或者N末端或C末端的加工这样的修饰。通过如上所述的修饰，可以简化重组蛋白质的提取、纯化，或者附加生物学功能等。

2.酯酶的来源

酯酶的来源也没有特别限定。例如可以使用来自乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)、吉洛氏不动杆菌(Acinetobacter guillouiae)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、塞氏不动杆菌(Acinetobacter seifertii)等不动杆菌属微生物、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等假单胞菌属微生物、乌汶伯克氏菌(Burkholderia ubonensis)、假多噬伯克氏菌(Burkholderia pseudomultivorans)等伯克氏菌属微生物、或铁矿副伯克氏菌(Paraburkholderia ferrariae)等副伯克氏菌属微生物等微生物的酯酶。应予说明，作为不动杆菌属微生物的具体例，可举出鲍氏不动杆菌ABNIH3(Acinetobacter baumannii ABNIH3)、不动杆菌属NBRC 110496(Acinetobacter sp.NBRC110496)和不动杆菌属NIPH809(Acinetobacter sp.NIPH809)，作为假单胞菌属微生物的具体例，可举出荧光假单胞菌A506(Pseudomonas fluorescens A506)、假单胞菌属ABAC61(Pseudomonas sp.ABAC61)、恶臭假单胞菌IFO12996(Pseudomonas putida IFO 12996)和恶臭假单胞菌MR2068(Pseudomonas putida MR2068)。

在此的“来自微生物的酯酶”是指上述的各属微生物(可以为野生株，也可以为变异株)生产的酯酶或者利用上述的各属微生物(可以为野生株，也可以为变异株)的酯酶基因并通过基因工程学方法而得到的酯酶。因此，利用导入有由上述所归类的微生物获得的酯酶基因(或者改变了该基因的基因)的宿主微生物生产的酯酶也属于来自上述所归类的微生物的酯酶。

酯酶的生产菌可以为野生株(来自天然的分离株，并且未未进行基因操作等变异·改变处理的菌株)，也可以为变异株。另外，也可以以将从原来的生产菌分离的酯酶基因导入适当的宿主微生物(大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌属细菌、曲菌、出芽酵母(酿酒酵母)等)而得到的转化体作为生产菌。

3.来自乙酸钙不动杆菌的酯酶的诸性质

由序列号1的氨基酸序列特定的来自乙酸钙不动杆菌的酯酶是特别适于本发明的分解方法的酯酶。如下所示，本发明人等也成功地确定了本酯酶的诸性质。

(1)关于酯酶活性的最适温度

本酯酶的最适温度为20℃～30℃。应予说明，最适温度可以基于pH7(例如使用50mM磷酸缓冲液)的条件下的测定结果进行评价。

(2)关于酯酶活性的最适pH

本酯酶的最适pH为7。最适pH例如可以基于对于pH3.0～8.0的pH区域而言在100mMMcIlvaine缓冲液中，对于pH8.0～11.0的pH区域而言在100mM Atkins缓冲液中测得的结果进行判断。

(3)关于酯酶活性的温度稳定性

对于本酯酶的温度稳定性，即使在50mM磷酸缓冲液(pH7)中、在70℃以下的条件下处理1小时也残留80％以上的活性。

(4)关于酯酶活性的pH稳定性

本酯酶在pH5～11稳定。即，如果供于处理的酶溶液的pH为该范围内，则在37℃处理1小时后，残留90％以上的活性。

(5)分子量

本酯酶的分子量为约85kDa(利用凝胶渗透色谱测得)。应予说明，形成同源三聚体。

(6)酒精稳定性

本酯酶在酒精中显示高稳定性。如果酒精浓度为40％以下，则即使在30℃下处理8天也不会失活(残留活性为90％以上)。

4.使酯酶作用的食品或饮料

使酯酶作用的对象(以下有时称为“处理对象”)，即，食品或饮料没有特别限定。如果例示可成为处理对象的食品和饮料，则为各种发酵食品(例如酸奶、奶酪、腌制物、酱油、味增)、面包、绍兴酒、以核果(樱桃、桃、李子、杏等)为原料的蒸馏酒、威士忌、白兰地、龙舌兰酒、巴西甘蔗酒、烧酒、清酒、葡萄酒、酒精强化葡萄酒(雪利酒、波尔图葡萄酒、马德拉酒、玛萨拉酒等)、梅酒、雪利酒、混合酒(甜露酒、苦艾酒、药酒等)。优选的一个方式中，以酒精饮料例如绍兴酒、雪利酒、清酒为处理对象。

除作为成品的食品或饮料以外，也可以以制造中途的食品或饮料(即中间制品)作为处理对象。

5.作用条件

为了使酯酶作用于食品或饮料，例如在作为处理对象的食品或饮料中添加酯酶，使其反应规定时间。或者，使作为处理对象的食品或饮料与固定于载体的酯酶接触，发生酶反应。使用的酶量(酶浓度)、温度条件、反应时间等只要通过初步实验来决定即可。

<食品或饮料的制造方法>

由以上的说明可知，通过将本发明的分解方法引入其制造过程中，能够得到除去或减少了氨基甲酸乙酯的食品或饮料。因此，本发明的第2方面提供利用了本发明的分解方法的食品或饮料的制造方法。本发明的制造方法中，在制造过程中进行利用酯酶的处理工序(以下有时称为“酶处理工序”)。只要可发挥本发明所特有的效果，即，通过酯酶的作用将氨基甲酸乙酯分解，则酶处理工序在全部制造工序中的位置(即，与其它制造工序的顺序)就没有特别限定。但是，除例外的情况以外，考虑到在制造过程的后期或作为最终阶段的发酵工序至熟化·贮藏工序中生成氨基甲酸乙酯这样的方面，优选在这些工序后实施酶处理工序。因此，优选的一个方式中，在发酵工序后实施酶处理工序，或者在熟化·贮藏工序之后实施酶处理工序。

也可以在特定的工序中添加酯酶使其作用而不设置专门的酶处理工序。此时，与特定的工序的进行并行地发生酶反应。作为在此的“特定的工序”，可例示发酵工序、熟化工序、贮藏工序。

对于本发明所特有的工序(酶处理工序)以外的工序，只要依照通常的制造方法即可。术语“通常的制造方法”用于与应用本发明的制造方法相区別，并不是限定于特定的制造方法。因此，可应用本发明的“通常的制造方法”没有特别限定。

实施例

1.氨基甲酸乙酯(EC)分解酶的筛选

为了发现可将氨基甲酸乙酯(EC)分解的酶，以130种酶(除脂肪酶或酯酶23种以外，还包含蛋白酶、淀粉酶等各种水解酶)和微生物为对象实施了大规模筛选。将筛选方法示于以下。首先，对于筛选对象的各酶，制备EC反应液(100mM磷酸缓冲液pH7.0：2mL,EC：10mM，酶：2mg)(对于微生物，使用培养液代替酶)，使其反应(30℃，搅拌器搅拌、48小时)。反应结束后，在反应液0.4mL中添加1N HCl 0.1mL和氯仿0.6mL(Wako)后，充分混合。将混合液离心分离(15000rpm×5分钟，4℃)后，将氯仿层回收到小瓶作为GC分析样品。使用如此制备的样品，通过GC分析检测EC。应予说明，EC分解率由氨基甲酸乙酯(EC)的峰面积(R.T＝8.9分钟)算出。

(GC分析条件)

使用气相色谱(GC7700，Agilent)，在以下的条件下进行分析。

柱：DB-WAX(60m×0.25mm×0.25um)(Agilent J&W)

注射器：250℃

检测器：FID,250℃

烘箱：100℃(0分钟)→以10℃/分钟升温→在250℃保持5分钟

流速：2.0mL/分钟

注入量：5μL

GC分析的结果发现来自乙酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)的酯酶能够将EC分解。另一方面，判明脂肪酶、来自分枝节杆菌的酯酶无法分解EC，对EC的分解活性是来自乙酸钙不动杆菌的酯酶所特有的性质。

2.利用来自乙酸钙不动杆菌的酯酶的EC的分解(绍兴酒)

对通过筛选而发现的来自乙酸钙不动杆菌的酯酶在绍兴酒中的EC分解能力进行研究。制备EC反应液(绍兴酒(pH5.0)：60mL，EC：1.3ppm，E-2酶制剂：3g(终浓度800U/mL))，在300mL锥形瓶中使其反应(30℃，100rpm，9天)。反应后，将EC反应液进行离心分离(7000g×10分钟，4℃)，进行膜过滤(0.45μm或0.2μm)后，通过气相色谱-质谱法分析EC浓度。

分析的结果确认了来自乙酸钙不动杆菌的酯酶能够将绍兴酒(pH5.0)中的EC分解(表1)。

[表1]

	反应9天后的EC浓度(ppm)
		没有酶	1.3
有酶	0.66

3.相关酶的EC分解能力的研究

通过2.的研究确认了来自乙酸钙不动杆菌的酯酶能够将绍兴酒中的EC分解。对于来自乙酸钙不动杆菌的酯酶的相关酶是否具有EC分解能力，进行以下的研究。

(1)来自乙酸钙不动杆菌的酯酶和来自相关菌株的酯酶的E.coli表达系统的构建

(1-1)酯酶基因的全合成(E.coli优化)

在构建E.coli表达系统时，将来自乙酸钙不动杆菌和相关菌株的酯酶基因进行密码子优化以用于E.coli表达，然后，进行全合成。应予说明，将来自乙酸钙不动杆菌和相关菌株的酯酶的氨基酸序列和基因序列(密码子优化后)示于以下。

<来自乙酸钙不动杆菌的酯酶>

氨基酸序列：序列号1

基因序列：序列号19

<相关酶No.1>

来源：吉洛氏不动杆菌(Acinetobacter guillouiae)

氨基酸序列：序列号2

基因序列：序列号20

<相关酶No.2>

来源：鲍氏不动杆菌ABNIH3(Acinetobacter baumannii ABNIH3)

氨基酸序列：序列号3

基因序列：序列号21

<相关酶No.3>

来源：塞氏不动杆菌(Acinetobacter seifertii)

氨基酸序列：序列号4

基因序列：序列号22

<相关酶No.4>

来源：绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

氨基酸序列：序列号5

基因序列：序列号23

<相关酶No.5>

来源：绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

氨基酸序列：序列号6

基因序列：序列号24

<相关酶No.6>

来源：绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

氨基酸序列：序列号7

基因序列：序列号25

<相关酶No.7>

来源：乌汶伯克氏菌(Burkholderia ubonensis)

氨基酸序列：序列号8

基因序列：序列号26

<相关酶No.8>

来源：铁矿副伯克氏菌(Paraburkholderia ferrariae)

氨基酸序列：序列号9

基因序列：序列号27

<相关酶No.9>

来源：假多噬伯克氏菌(Burkholderia pseudomultivorans)

氨基酸序列：序列号10

基因序列：序列号28

<相关酶No.10>

来源：不动杆菌属NBRC 110496(Acinetobacter sp.NBRC 110496)

氨基酸序列：序列号11

基因序列：序列号29

<相关酶No.11>

来源：塞氏不动杆菌(Acinetobacter seifertii)

氨基酸序列：序列号12

基因序列：序列号30

<相关酶No.12>

来源：不动杆菌属NIPH809(Acinetobacter sp.NIPH809)

氨基酸序列：序列号13

基因序列：序列号31

<相关酶No.13>

来源：荧光假单胞菌A506(Pseudomonas fluorescens A506)

氨基酸序列：序列号14

基因序列：序列号32

<相关酶No.14>

来源：假单胞菌属ABAC61(Pseudomonas sp.ABAC61)

氨基酸序列：序列号15

基因序列：序列号33

<相关酶No.15>

来源：恶臭假单胞菌IFO12996(Pseudomonas putida IFO12996)

氨基酸序列：序列号16

基因序列：序列号34

<相关酶No.16>

来源：恶臭假单胞菌MR2068(Pseudomonas putida MR2068)

氨基酸序列：序列号17

基因序列：序列号35

<相关酶No.17>

来源：绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

氨基酸序列：序列号18

基因序列：序列号36

(1－2)E.coli表达用质粒的获得和E.coli表达系统的构建

以全合成的酯酶基因作为模板，使用附加有接头序列(Eco RI,Hind III)的引物进行PCR(PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(Takara))。PCR条件如下。

<PCR条件>

反应液的组成：5×PrimeSTAR GXL Buffer 10μl、dNTP Mixture(各2.5mM)4μl、正向引物10pmol、反向引物10pmol、模板10ng、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(Takara)1μl(用无菌蒸馏水调整为总量50μl)

反应条件：将在98℃下10秒、在60℃下30秒、在68℃下1.5分钟进行30个循环

将扩增产物进行纯化(NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(MACHERE Y-NAGEL))而获得各基因片段。将各基因片段和pUC18(Takara)用限制性内切酶(Eco RI(Takara),Hind III(Takara))处理后，进行连接(DNA Ligation Kit<Mighty Mix>(Takara))而转化至E.coli DH5α(Takara)，从而得到各E.coli重组体。将各E.coli重组体接种于LB BrothBase(invitrogen)+Amp：100μg/mL：5mL进行振荡培养(37℃、16h、140rpm)后，使用NucleoSpin Plasmid EasyPure(MACHEREY-NAGEL)进行提取，获得E.coli表达用质粒。将获得的各E.coli表达用质粒转化至E.coli BL21(DE3)(Nippongene)，获得各E.coli表达菌株。应予说明，使用Sequence Primer(M13 M4 Primer：5’-GTTTT CCCAGTCACGAC-3’(序列号：37)、M13 RV Primer：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’(序列号：38))确认各E.coli表达用质粒的序列。

(2)各酯酶的培养液(培养菌体)和菌体提取液的获得

使用构建的各酯酶基因重组E.coli表达菌株(宿主：E.coli BL21(DE3))尝试获得培养液(培养菌体)。各酯酶基因重组E.coli表达菌株的培养液(培养菌体)的获得以2个阶段的培养进行。首先，将各酯酶基因重组E.coli表达菌株接种于L Broth(inbitrogen公司)(Amp：100μg/mL)5mL，利用振荡培养机培养(140rpm,37℃)16小时后，将0.5mL接种于Teriffic Broth(invitrogen公司)(Amp：100μg/mL)50mL。然后，在200rpm、33℃的条件下进行48小时培养，在自培养开始起24小时的时刻将0.1mM IPTG添加于培养液，从而诱导酶的表达。将培养液50mL进行离心分离(7500g×10分钟，4℃)后，除去离心上清液，从而回收培养菌体。

将获得的各培养菌体悬浮于20mM磷酸缓冲液(pH7.0)20mL后，添加珠子(0.1mm)(安井器械)10g，利用珠破碎仪(2500rpm,on：60秒,off：30秒,15个循环,4℃)(安井器械)进行物理破碎。将物理破碎液进行离心分离(7500g×10分钟,4℃)后，回收离心上清液，作为菌体提取液。

(3)利用相关酶的EC的分解(缓冲液pH7.0)

使用获得的菌体提取液确认在缓冲液中(pH7.0)的EC分解能力。制备EC反应液(缓冲液(100mM磷酸缓冲液pH7.0)：1.3mL,EC：10mM,各菌体提取液：1.3mL)，使其反应(30℃,100rpm,9天)。反应期间中，适当对反应液进行取样(0.4mL)，制备分析样品。通过GC对分析样品进行分析。分析的结果是确认了虽然有活性的强弱，但任一相关酶均具有EC分解能力(图1)。

4.来自乙酸钙不动杆菌的酯酶的酒精稳定性

对显示优异的EC分解能力的来自乙酸钙不动杆菌的酯酶研究酒精稳定性。首先，将各浓度的酒精溶液(乙醇-特级试剂(Wako))(0～70％)9mL和来自乙酸钙不动杆菌的酯酶1g混合，从而制备处理液。将各处理液在30℃静置，在16小时后、4天后、8天后进行取样(1mL)。通过以下的测定法测定各样品的酶活性。

(以3,4-二氢香豆素为底物的活性测定法)

将50mM磷酸缓冲液(pH7.0)2.1mL、5mM 3,4-二氢香豆素(Sigma-aldrich(代码：D104809))溶液(含40％EtOH)0.3mL、酶溶液0.6mL混合，使其反应。本测定法中，对通过反应而产生的生成物(3－(2－羟基苯基)丙酸)的吸光值变化进行动力学测定(Abs.270nm,30℃,5分钟)，从而将1分钟生成1nmol的生成物(3-(2-羟基苯基)丙酸)的酶量定义为1单位(U)。应予说明，本测定中得到准确的测定值的ΔOD为ΔOD＝0.01～0.05/2分钟(Abs.250nm)的范围，根据需要将酶溶液用50mM磷酸缓冲液pH7.0进行稀释。

由测定值(活性值)算出残留活性，对各处理液的残留活性进行比较。其结果确认了来自乙酸钙不动杆菌的酯酶如果酒精浓度为40％以下，则即使在30℃处理8天也不会失活(图2)。

5.来自乙酸钙不动杆菌的酯酶的诸性质

使用上述的“以3,4-二氢香豆素为基质的活性测定法”(样品的前处理条件等单独记载)，确定来自乙酸钙不动杆菌的酯酶的酶性质。

(1)最适温度

将吸光度计的样品区设定为规定的温度而测定活性，确定最适温度。用于符合测定范围的酶的稀释使用50mM磷酸缓冲液(pH7.0)。测定的结果，最适温度为20～30℃(图3)。

(2)最适pH

在将反应液中的“50mM磷酸缓冲液pH7.0 2.1mL”替换成调整为规定pH的缓冲液的测定系统中测定活性，确定最适pH。为了以规定pH进行测定，准备将2种缓冲液(McIlvaine、Atkins)调整为各pH的缓冲液(McIlvaine缓冲液：pH3.0,pH4.0,pH5.0,pH6.0,pH7.0,pH8.0。Atkins缓冲液：pH8.0,pH9.0,pH10.0,pH11.0)。用于符合测定范围的酶的稀释使用50mM磷酸缓冲液(pH7.0)。测定的结果，最适pH为pH7(图4)。

(3)温度稳定性

将酶在各温度下进行处理后测定残留活性，从而评价温度稳定性。首先，使用50mM磷酸缓冲液pH7.0制备酶稀释液后，在规定的温度下进行1小时处理，利用冰水冷却5分钟。该处理后，使用50mM磷酸缓冲液pH7.0以落入测定范围内的方式进行稀释，测定活性。结果，到70℃为止稳定(80％以上的残留活性)(图5)。

(4)pH稳定性

将酶在各pH下处理后，测定残留活性，从而评价pH稳定性。首先，使用调整为各pH的缓冲液制备酶稀释液后，在37℃下进行1小时处理(pH处理)。作为酶的pH处理中使用的缓冲液，使用将2种缓冲液(McIlvaine、Atkins)调整为各pH的缓冲液(McIlvaine缓冲液：pH3.0,pH4.0,pH5.0,pH6.0,pH7.0,pH8.0。Atkins缓冲液：pH8.0,pH9.0,pH10.0,pH11.0)。pH处理后，加入与酶稀释液等量的1M磷酸缓冲液pH7.0，从而停止pH处理。使用50mM磷酸缓冲液pH7.0以落入测定范围内的方式进行稀释后，测定活性。测定的结果，在pH5～11稳定(90％以上的残留活性)(图6)。

(5)分子量

在以下的条件下，通过凝胶渗透色谱测定非变性条件下的分子量。测定的结果，推定分子量为约85kDa。

(实验条件)

使用柱：Amersham pharmacia(现GE Healthcare)制Superdex 200HR 10/30

使用缓冲液：50mmol/L NaCl磷酸缓冲液(pH 7.0)+0.15mol/L NaCl

分子量标记：使用High Molecular Weight Gel Filtration Calibration Kit(Amersham公司制)(Aldolase 158k,Catalase 232k,Ferritin 440k,Thyroglo bulin669k)。

产业上的可利用性

根据本发明，能够将食品或饮料中的氨基甲酸乙酯(EC)分解。特别是本发明在除去或减少酒类、发酵食品中的EC方面有用。

本发明不受上述发明的实施方式和实施例的说明的任何限制。在不脱离权利要求书的记载的情况下本领域技术人员能够容易地想到的范围内的各种变形方式也包含在本发明中。本说明书中明示的论文、公开专利公报和专利公报等的内容通过援引而引用其全部的内容。

序列表自由文本

序列号37：人工序列的说明：引物

序列号38：人工序列的说明：引物

序列表

<110> 天野酶株式会社

江南大学

<120> 氨基甲酸乙酯的分解

<130> AE16005P

<150> JP P2017-068426

<151> 2017-03-30

<160> 38

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 276

<212> PRT

<213> 乙酸钙不动杆菌

<400> 1

Met Gly Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Asp Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Pro Val Ile Phe Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ser Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Lys Glu

35 40 45

Gly Phe Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Thr

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Glu Tyr Leu Gly Val Gln Gly Ala Val His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Ala Tyr Tyr Val Ala Arg Tyr Pro Asn

100 105 110

Asp Pro Val Ala Lys Ala Val Leu Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Lys Thr Glu Ser Asn Pro Asp Gly Leu Pro Lys Glu Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Asn Gln Leu Phe Lys Asn Arg Ser Gln Phe Tyr His Asp

145 150 155 160

Val Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Phe Asn Arg Pro Gly Ala Lys Val

165 170 175

Ser Glu Pro Val Val Leu Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Ala Leu Lys Lys Ile Glu Val Pro Val Leu Ile Leu His Gly

210 215 220

Glu Asp Asp Gln Val Val Pro Phe Glu Ile Ser Gly Lys Lys Ser Ala

225 230 235 240

Glu Leu Val Lys Asn Gly Lys Leu Ile Ser Tyr Pro Gly Phe Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr Glu Ala Glu Thr Ile Asn Lys Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Ser

275

<210> 2

<211> 276

<212> PRT

<213> 吉洛氏不动杆菌

<400> 2

Met Gly Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Glu Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Lys Asp Ala Pro Val Ile Phe Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ala Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Lys Glu

35 40 45

Gly Phe Arg Val Ile Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Thr

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Glu His Leu Gly Val Gln Gly Ala Val His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Ala Tyr Tyr Val Ala Arg Tyr Pro Asn

100 105 110

Asp Pro Val Ala Lys Ala Val Leu Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Lys Thr Glu Ser Asn Pro Asp Gly Leu Pro Lys Glu Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Asn Gln Leu Phe Lys Asn Arg Ser Gln Phe Tyr His Asp

145 150 155 160

Val Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Phe Asn Arg Pro Gly Ala Lys Val

165 170 175

Ser Glu Pro Val Val Leu Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Ala Leu Lys Lys Ile Glu Val Pro Val Leu Ile Leu His Gly

210 215 220

Glu Asp Asp Gln Val Val Pro Phe Glu Ile Ser Gly Lys Lys Ser Ala

225 230 235 240

Glu Leu Val Lys Asn Gly Thr Leu Ile Ser Tyr Pro Gly Phe Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr Glu Ala Glu Thr Ile Asn Lys Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Ser

275

<210> 3

<211> 276

<212> PRT

<213> 鲍氏不动杆菌ABNIH3

<400> 3

Met Gly Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Asp Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Pro Val Ile Phe Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ser Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Lys Glu

35 40 45

Gly Phe Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Thr

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Val Val Val Glu His Leu Gly Val Gln Gly Ala Val His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Ala His Tyr Val Ala Arg Tyr Pro Asn

100 105 110

Asp Pro Val Ala Lys Ala Val Leu Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Lys Thr Glu Ser Asn Pro Asp Gly Leu Pro Lys Glu Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Asn Gln Leu Phe Lys Asn Arg Ser Gln Phe Tyr His Asp

145 150 155 160

Val Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Ala Lys Val

165 170 175

Ser Glu Pro Val Val Leu Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Asp Leu Lys Lys Ile Glu Ile Pro Val Leu Ile Leu His Gly

210 215 220

Glu Asp Asp Gln Val Val Pro Phe Glu Ile Ser Gly Lys Lys Ser Ala

225 230 235 240

Glu Leu Val Lys Asn Gly Thr Leu Ile Ser Tyr Pro Gly Phe Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr Glu Ala Glu Thr Ile Asn Lys Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Ser

275

<210> 4

<211> 276

<212> PRT

<213> 塞氏不动杆菌

<400> 4

Met Gly Tyr Val Thr Thr Lys Asp Asn Val Glu Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Lys Asp Ala Pro Val Ile Phe Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ser Asp Asp Trp Asp Ala Gln Leu Leu Phe Phe Leu Lys Glu

35 40 45

Gly Phe Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Ser Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Asp His Leu Gly Val His Gly Ala Val His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Ala His Tyr Val Ala Asn Tyr Gln Asn

100 105 110

Asp Pro Val Ala Lys Ala Val Leu Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Lys Thr Glu Asn Asn Pro Asn Gly Leu Pro Lys Glu Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Asn Gln Leu Phe Lys Asn Arg Ser Gln Phe Tyr Tyr Asp

145 150 155 160

Val Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Ala Lys Val

165 170 175

Ser Glu Pro Val Ile Leu Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Asp Leu Lys Lys Ile Lys Ile Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Glu Asp Asp Gln Ile Val Pro Ile Glu Ile Ser Gly Lys Leu Ser Ala

225 230 235 240

Glu Leu Val Gln Asn Gly Lys Leu Ile Thr Tyr Pro Gly Phe Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr Glu Ala Glu Thr Ile Asn Lys Asp Leu Leu Glu

260 265 270

Phe Ile Arg Ser

275

<210> 5

<211> 276

<212> PRT

<213> 绿脓假单胞菌

<400> 5

Met Gly Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Glu Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Gln Val Ile Cys Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ala Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Ala Glu

35 40 45

Gly Phe Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Glu His Leu Gly Val Arg Gly Ala Ile His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Val Arg Tyr Ile Ala Arg Tyr Pro Asp

100 105 110

Asp Pro Val Pro Lys Ala Ala Ile Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Lys Thr Glu Gly Asn Pro Gly Gly Leu Pro Lys Ser Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Ala Gln Leu Ala Ala Asn Arg Ala Gln Phe Tyr Gln Asp

145 150 155 160

Ile Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Ala Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Gly Ile Ile Arg Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Ser Glu Asp Leu Lys Arg Ile Asp Ile Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Ile Val Pro Tyr Glu Asn Ser Gly Val Arg Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Leu Arg Asn Gly Thr Leu Lys Thr Tyr Pro Gly Tyr Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr Gln Ala Glu Val Ile Asn Ala Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Gly

275

<210> 6

<211> 276

<212> PRT

<213> 绿脓假单胞菌

<400> 6

Met Gly Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Glu Leu Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Gln Val Ile Tyr Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ser Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Ala Glu

35 40 45

Gly Phe Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Glu Arg Leu Gly Val Arg Gly Ala Ile His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Val His Tyr Ile Ala Arg Tyr Pro Asp

100 105 110

Asp Pro Val Pro Lys Ala Ala Ile Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Lys Thr Glu Gly Asn Pro Gly Gly Leu Pro Lys Ser Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Ala Gln Leu Ala Thr Asn Arg Ala Gln Phe Tyr Gln Asp

145 150 155 160

Ile Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Ala Gln Pro

165 170 175

Ser Glu Gly Ile Val Arg Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Ser Asp Asp Leu Lys Arg Ile Asp Ile Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Ile Val Pro Tyr Glu Asn Ser Gly Val Leu Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Leu Arg Asn Gly Thr Leu Lys Thr Tyr Pro Gly Phe Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr Gln Ala Glu Val Ile Asn Ala Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Gly

275

<210> 7

<211> 276

<212> PRT

<213> 绿脓假单胞菌

<400> 7

Met Gly Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Glu Leu Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Gln Val Ile Tyr Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ser Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Ala Glu

35 40 45

Gly Phe His Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Glu Tyr Leu Gly Val Arg Gly Ala Ile His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Val His Tyr Ile Ala Arg Tyr Pro Asp

100 105 110

Asp Pro Val Pro Lys Ala Ala Ile Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Lys Thr Glu Gly Asn Pro Gly Gly Leu Pro Lys Ser Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Ala Gln Leu Ala Ala Asn Arg Ala Gln Phe Tyr Gln Asp

145 150 155 160

Ile Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Ala Gln Pro

165 170 175

Ser Glu Gly Ile Val Arg Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Ile Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Ser Asp Asp Leu Lys Arg Ile Asp Ile Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Ile Val Pro Tyr Glu Asn Ser Gly Val Leu Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Leu Arg Asn Gly Thr Leu Lys Ile Tyr Pro Gly Tyr Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr Gln Ala Glu Val Ile Asn Ala Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Ser

275

<210> 8

<211> 276

<212> PRT

<213> 乌汶伯克氏菌

<400> 8

Met Gly Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Asp Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Pro Val Val Phe Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ala Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Ala His

35 40 45

Gly Tyr Arg Val Ile Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Asn His Leu Gly Val Gln Gly Ala Val His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Ala His Tyr Ile Ala Arg His Gly Glu

100 105 110

Asp Arg Ala Ser Lys Ala Val Leu Ile Ser Ala Val Pro Pro Ile Met

115 120 125

Val Lys Thr Glu Arg Asn Pro Gly Gly Leu Pro Lys Glu Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Ala Gln Leu Ala Ala Asn Arg Ala Gln Phe Tyr His Asp

145 150 155 160

Ile Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Ala Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Gly Val Ile Leu Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Ser

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Asp Leu Glu Ala Ile Ser Ile Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Ile Val Pro Tyr Ala Asp Ser Gly Pro Leu Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Leu Arg Asn Gly Thr Leu Lys Thr Tyr Pro Gly Phe Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Ser Asn Ala Glu Thr Ile Asn Ala Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Ser

275

<210> 9

<211> 276

<212> PRT

<213> 铁矿副伯克氏菌

<400> 9

Met Gly Phe Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Asp Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Gln Val Ile Phe Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ala Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Ala His

35 40 45

Gly Tyr Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Thr

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Asn His Leu Gly Val Gln Gly Ala Val His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Ala His Tyr Ile Ala Arg His Gly Glu

100 105 110

Asp Arg Val Ala Lys Gly Val Leu Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Leu Lys Thr Glu Ala Asn Pro Gly Gly Leu Pro Lys Ser Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Ala Gln Leu Ala Ala Asn Arg Ala Gln Phe Tyr His Asp

145 150 155 160

Val Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Ala Lys Pro

165 170 175

Glu Ala Gly Val Ile Trp Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Asp Leu Lys Arg Ile Ser Ile Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Ile Val Pro Tyr Ala Asp Ser Gly Pro Leu Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Leu Lys Asn Gly Thr Leu Lys Thr Tyr Ala Gly Phe Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr Gln Ala Glu Thr Ile Asn Ala Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Gly

275

<210> 10

<211> 276

<212> PRT

<213> 假多噬伯克氏菌

<400> 10

Met Gly Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Asp Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Gln Val Ile Phe Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ala Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Ala Gln

35 40 45

Gly Tyr Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Gln His Leu Gly Val Gln Gln Ala Val His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Ile His Tyr Val Ala Arg His Gly Glu

100 105 110

Asp Arg Val Ser Lys Ala Val Leu Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Lys Thr Glu Ser Asn Pro Gly Gly Leu Pro Lys Gln Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Ala Gln Leu Ala Ala Asn Arg Ala Gln Phe Tyr Tyr Asp

145 150 155 160

Ile Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Asp Gly Ala Lys Pro

165 170 175

Ser Gln Gly Val Ile Trp Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Ser

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Asp Leu Lys Arg Ala Thr Ile Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Ile Val Pro Tyr Glu Asp Ser Gly Leu Leu Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Val Lys Asn Gly Thr Leu Lys Thr Tyr Ser Gly Phe Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr Gln Ala Glu Thr Ile Asn Ala Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Ser

275

<210> 11

<211> 276

<212> PRT

<213> 不动杆菌属NBRC 110496

<400> 11

Met Ala Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Asp Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Gln Val Leu Phe Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ser Asp Asp Trp Asp Ala Gln Leu Leu Phe Phe Leu Asn Glu

35 40 45

Gly Phe Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Gln His Leu Gly Ile Lys Asn Ala Val His Ile Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Ala His Tyr Ile Ala Arg His Gly Glu

100 105 110

Ala Asn Val Ser Lys Ala Val Leu Val Ser Ala Val Pro Pro Ile Met

115 120 125

Val Lys Thr Ala Ser Asn Pro Asn Gly Leu Pro Lys Glu Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Asn Gln Leu Phe Lys Asn Arg Ser Gln Phe Tyr Tyr Asp

145 150 155 160

Leu Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Phe Asn Arg Pro Asn Ala Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Pro Val Ile Trp Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Asp Leu Lys Lys Ile Ser Val Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Val Val Pro Tyr Glu Asn Ser Gly Val Leu Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Val Lys Asn Gly Thr Leu Lys Thr Tyr Lys Gly Phe Ser His

245 250 255

Gly Met Leu Thr Val Asn Ala Asp Val Ile Asn Pro Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Ala

275

<210> 12

<211> 276

<212> PRT

<213> 塞氏不动杆菌

<400> 12

Met Gly Tyr Val Thr Thr Lys Asp Asn Val Glu Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Lys Asp Ala Pro Val Ile Phe Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ser Asp Asp Trp Asp Ala Gln Leu Leu Phe Phe Leu Lys Glu

35 40 45

Gly Phe Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Ser Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Asp His Leu Gly Val His Gly Ala Val His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Ala His Tyr Val Ala Asn Tyr Gln Asn

100 105 110

Asp Pro Val Ala Lys Ala Val Leu Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Lys Thr Glu Asn Asn Pro Asn Gly Leu Pro Lys Glu Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Asn Gln Leu Phe Lys Asn Arg Ser Gln Phe Tyr Tyr Asp

145 150 155 160

Val Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Ala Lys Val

165 170 175

Ser Glu Pro Val Ile Leu Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Asp Leu Lys Lys Ile Lys Ile Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Glu Asp Asp Gln Ile Val Pro Ile Glu Ile Ser Gly Lys Leu Ser Ala

225 230 235 240

Glu Leu Val Gln Asn Gly Lys Leu Ile Thr Tyr Pro Gly Phe Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr Glu Ala Glu Thr Ile Asn Lys Asp Leu Leu Glu

260 265 270

Phe Ile Arg Ser

275

<210> 13

<211> 276

<212> PRT

<213> 不动杆菌属NIPH809

<400> 13

Met Ala Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Asp Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Gln Val Leu Phe Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ser Asp Asp Trp Asp Ala Gln Leu Leu Phe Phe Leu Asn Glu

35 40 45

Gly Phe Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Gln His Leu Gly Ile Lys Ser Ala Ile His Ile Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Ala His Tyr Ile Ala Arg His Gly Glu

100 105 110

Ala Asn Val Ala Lys Ala Val Leu Val Ser Ala Val Pro Pro Ile Met

115 120 125

Val Lys Thr Ala Asn Asn Pro Asp Gly Leu Pro Lys Glu Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Asn Gln Leu Phe Lys Asn Arg Ser Lys Phe Tyr Tyr Asp

145 150 155 160

Leu Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Phe Asn Arg Pro Asp Ala Asn Ala

165 170 175

Ser Glu Pro Val Ile Trp Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Asp Leu Lys Lys Ile Ser Val Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Val Val Pro Tyr Glu Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Val Gln Asn Gly Thr Leu Lys Thr Tyr Lys Gly Phe Ser His

245 250 255

Gly Met Leu Thr Val Asn Ala Asp Val Ile Asn Pro Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Ala

275

<210> 14

<211> 276

<212> PRT

<213> 荧光假单胞菌 A506

<400> 14

Met Gly Tyr Val Thr Thr Arg Asp Gly Val Glu Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Gln Val Ile Phe Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ala Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Gly Glu

35 40 45

Gly Tyr Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Glu His Leu Gly Val Gln Thr Ala Val His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Val His Tyr Ile Ala Arg His Gly Glu

100 105 110

Asp Arg Val Ser Lys Ala Ala Ile Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Gln Thr Pro Ser Asn Pro Gly Gly Leu Pro Lys Ser Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Ala Gln Leu Lys Ala Asn Arg Ala Gln Phe Tyr His Asp

145 150 155 160

Val Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Ala Thr Pro

165 170 175

Ser Glu Gly Ile Ile Leu Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Cys

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Asp Leu Lys Arg Ile Gln Ile Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Ile Val Pro His Glu Asn Ala Gly Val Leu Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Leu Lys Asn Ser Thr Leu Lys Ile Tyr Pro Gly Phe Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr His Ala Asp Thr Ile Asn Ala Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Ser

275

<210> 15

<211> 276

<212> PRT

<213> 假单胞菌属ABAC61

<400> 15

Met Gly Tyr Val Thr Thr Gln Asp Gly Val Asp Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Gln Ile Ile Tyr Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ser Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Lys Gln

35 40 45

Gly Phe Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Lys His Leu Gly Val Glu Lys Ala Ile His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Val Arg Tyr Ile Ala Arg Tyr Pro Glu

100 105 110

Asp Ser Val Pro Lys Ala Val Leu Ile Ser Ser Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Lys Thr Asp Lys Asn Pro Asp Gly Leu Pro Lys Ser Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Val Gln Leu Glu Ala Asn Arg Ala Gln Phe Tyr Gln Asp

145 150 155 160

Ile Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Ala Lys Pro

165 170 175

Ser Gln Gly Ile Ile Leu Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Ser

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Ser Glu Asn Leu Ala Ser Ile Lys Ile Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Ile Val Pro Tyr Glu Asn Ser Gly Val Leu Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Val Ala Asn Gly Thr Leu Lys Leu Tyr Pro Gly Phe Ser His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Ile Asn Ala Asp Thr Ile Asn Ala Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Val Arg Ser

275

<210> 16

<211> 276

<212> PRT

<213> 恶臭假单胞菌IFO12996

<400> 16

Met Ser Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Gln Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Pro Val Ile His Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ala Asp Asp Trp Asp Ala Gln Leu Leu Phe Phe Leu Ala His

35 40 45

Gly Tyr Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Ala His Leu Gly Ile Gln Gly Ala Val His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Val Arg Tyr Met Ala Arg His Pro Glu

100 105 110

Asp Lys Val Ala Lys Ala Val Leu Ile Ala Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Gln Thr Pro Gly Asn Pro Gly Gly Leu Pro Lys Ser Val Phe Asp

130 135 140

Gly Phe Gln Ala Gln Val Ala Ser Asn Arg Ala Gln Phe Tyr Arg Asp

145 150 155 160

Val Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Val Glu Ala

165 170 175

Ser Glu Gly Ile Ile Gly Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Ile Gly Ser

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Asp Leu Lys Gly Ile Gln Gln Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Ile Val Pro Tyr Glu Asn Ser Gly Val Leu Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Leu Pro Asn Gly Ala Leu Lys Thr Tyr Lys Gly Tyr Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr His Ala Asp Val Ile Asn Ala Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Ser

275

<210> 17

<211> 276

<212> PRT

<213> 恶臭假单胞菌MR2068

<400> 17

Met Ser Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Gln Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Pro Val Ile His Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ala Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Ala His

35 40 45

Gly Tyr Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Ala His Leu Gly Ile Gln Gly Ala Val His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Val Arg Tyr Met Ala Arg His Pro Ala

100 105 110

Asp Lys Val Ala Lys Ala Val Leu Ile Ala Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Gln Thr Pro Asp Asn Pro Gly Gly Leu Pro Lys Ser Val Phe Asp

130 135 140

Gly Phe Gln Ala Gln Val Ala Ser Asn Arg Ala Gln Phe Tyr Arg Asp

145 150 155 160

Val Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Val Asp Ala

165 170 175

Ser Glu Gly Ile Ile Gly Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Ile Gly Ser

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Asp Leu Lys Gly Ile Thr Gln Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Ile Val Pro Tyr Glu Asn Ser Gly Leu Leu Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Leu Pro Asn Gly Thr Leu Lys Thr Tyr Gln Gly Tyr Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr His Ala Asp Val Ile Asn Ala Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Ser

275

<210> 18

<211> 276

<212> PRT

<213> 绿脓假单胞菌

<400> 18

Met Gly Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Glu Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Gln Val Ile Cys Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ala Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Ala Glu

35 40 45

Gly Phe Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Glu His Leu Gly Val Arg Gly Ala Ile His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Val His Tyr Ile Ala Arg Tyr Pro Asp

100 105 110

Asp Pro Val Pro Lys Ala Ala Ile Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Lys Thr Glu Gly Asn Pro Gly Gly Leu Pro Lys Ser Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Ala Gln Leu Ala Ala Asn Arg Ala Gln Phe Tyr Gln Asp

145 150 155 160

Ile Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Ala Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Gly Ile Ile Arg Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Ser Glu Asp Leu Lys Arg Ile Asp Ile Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Ile Val Pro Tyr Glu Asn Ser Gly Val Arg Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Leu Arg Asn Gly Thr Leu Lys Thr Tyr Pro Gly Tyr Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr Gln Ala Glu Val Ile Asn Ala Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Gly

275

<210> 19

<211> 831

<212> DNA

<213> 乙酸钙不动杆菌

<400> 19

atgggctacg ttaccaccaa agacggcgtt gacattttct acaaagactg gggtccgcgt 60

gatgctccgg ttattttctt ccaccacggt tggccgctga gcagcgatga ttgggatgcg 120

cagatgctgt ttttcctgaa agaaggcttt cgtgtggttg cccatgatcg tcgcggtcat 180

ggccgcagca cccaagtgtg ggatggtcat gatatggatc attatgcgga tgatgtggcg 240

gccgtggttg aatatctggg tgttcagggc gccgtgcatg ttggtcacag caccggcggt 300

ggcgaagtgg cctattatgt tgcccgttat ccgaacgatc cggtggcgaa agccgttctg 360

attagcgcgg tgccgccgct gatggttaaa accgaaagca atccggatgg tctgccgaaa 420

gaagtgtttg atgatctgca gaaccagctg tttaaaaatc gcagccagtt ttatcatgat 480

gtgccggcgg gtccgtttta tggctttaac cgtccgggcg ccaaagttag cgaaccggtg 540

gttctgaatt ggtggcgcca gggtatgatg ggtggcgcga aagcccatta tgatggcatc 600

gtggcgttta gccagaccga ttttaccgaa gcgctgaaga aaattgaagt gccggttctg 660

atcctgcatg gtgaagatga tcaggtggtt ccgtttgaaa ttagcggcaa aaaatctgcc 720

gaactggtta aaaacggcaa actgatcagc tatccgggtt ttccgcatgg catgccgacc 780

acggaagcgg aaaccatcaa taaagacctg ctggcgttca ttcgttcgta a 831

<210> 20

<211> 831

<212> DNA

<213> 吉洛氏不动杆菌

<400> 20

atgggctacg ttaccaccaa agacggcgtt gaaattttct acaaagactg gggtccgaaa 60

gatgctccgg ttattttctt ccaccacggt tggccgctga gcgcggatga ttgggatgcg 120

cagatgctgt ttttcctgaa agaaggcttt cgtgtgattg cccatgatcg tcgcggtcat 180

ggccgcagca cccaagtgtg ggatggtcat gatatggatc attatgcgga tgatgtggcg 240

gccgtggttg aacatctggg tgttcagggc gccgtgcatg ttggtcacag caccggcggt 300

ggcgaagtgg cctattatgt tgcccgttat ccgaacgatc cggtggcgaa agccgttctg 360

attagcgcgg tgccgccgct gatggttaaa accgaaagca atccggatgg tctgccgaaa 420

gaagtgtttg atgatctgca gaaccagctg tttaaaaatc gcagccagtt ttatcatgat 480

gtgccggcgg gtccgtttta tggctttaac cgtccgggcg ccaaagttag cgaaccggtg 540

gttctgaatt ggtggcgcca gggtatgatg ggtggcgcga aagcccatta tgatggcatc 600

gtggcgttta gccagaccga ttttaccgaa gcgctgaaga aaattgaagt gccggttctg 660

atcctgcatg gtgaagatga tcaggtggtt ccgtttgaaa ttagcggcaa aaaatctgcc 720

gaactggtta aaaacggcac cctgatcagc tatccgggtt ttccgcatgg catgccgacc 780

acggaagcgg aaaccatcaa taaagacctg ctggcgttca ttcgttcgta a 831

<210> 21

<211> 831

<212> DNA

<213> 鲍氏不动杆菌ABNIH3

<400> 21

atgggctacg ttaccaccaa agacggcgtt gacattttct acaaagactg gggtccgcgt 60

gatgctccgg ttattttctt ccaccacggt tggccgctga gcagcgatga ttgggatgcg 120

cagatgctgt ttttcctgaa agaaggcttt cgtgtggttg cccatgatcg tcgcggtcat 180

ggccgcagca cccaagtgtg ggatggtcat gatatggatc attatgcgga tgatgtggcg 240

gtggtggttg aacatctggg tgttcagggc gccgtgcatg ttggtcacag caccggcggt 300

ggcgaagtgg cccattatgt tgcccgttat ccgaacgatc cggtggcgaa agccgttctg 360

attagcgcgg tgccgccgct gatggttaaa accgaaagca atccggatgg tctgccgaaa 420

gaagtgtttg atgatctgca gaaccagctg tttaaaaatc gcagccagtt ttatcatgat 480

gtgccggcgg gtccgtttta tggctataac cgtccgggcg ccaaagttag cgaaccggtg 540

gttctgaatt ggtggcgcca gggtatgatg ggtggcgcga aagcccatta tgatggcatc 600

gtggcgttta gccagaccga ttttaccgaa gatctgaaga aaattgaaat cccggttctg 660

atcctgcatg gtgaagatga tcaggtggtt ccgtttgaaa ttagcggcaa aaaatctgcc 720

gaactggtta aaaacggcac cctgatcagc tatccgggtt ttccgcatgg catgccgacc 780

acggaagcgg aaaccatcaa taaagacctg ctggcgttca ttcgttcgta a 831

<210> 22

<211> 831

<212> DNA

<213> 塞氏不动杆菌

<400> 22

atgggttatg tcaccaccaa agacaatgtt gaaatcttct acaaagactg gggtccgaaa 60

gacgctccgg tcatcttctt ccaccacggt tggccgctga gcagcgatga ttgggatgcg 120

cagctgctgt ttttcctgaa agaaggcttt cgtgtggttg cccatgatcg tcgcggtcat 180

ggccgcagca gccaagtgtg ggatggtcat gatatggatc attatgcgag cgatgtggcg 240

gccgtggttg atcatctggg tgttcatggc gccgtgcatg ttggtcacag caccggcggt 300

ggcgaagtgg cccattatgt tgccaactat cagaatgatc cggtggcgaa agccgttctg 360

attagcgcgg tgccgccgct gatggttaaa accgaaaaca atccgaacgg tctgccgaaa 420

gaagtgtttg atgatctgca gaaccagctg ttcaaaaacc gtagccagtt ctactacgat 480

gttccggcgg gtccgtttta tggctataac cgtccgggcg ccaaagtgag cgaaccggtt 540

attctgaatt ggtggcgcca gggtatgatg ggtggcgcga aagcccatta tgatggcatc 600

gtggcgttta gccagaccga tttcaccgaa gatctgaaga aaattaaaat cccggtgctg 660

gttatgcatg gtgaagatga tcagattgtg ccgattgaaa tcagcggtaa actgagcgcc 720

gaactggttc agaatggcaa actgatcacc tatccgggtt ttccgcatgg catgccgacg 780

accgaagccg aaaccatcaa caaagacctg ctggaattta tccgctccta a 831

<210> 23

<211> 831

<212> DNA

<213> 绿脓假单胞菌

<400> 23

atgggttatg tcaccaccaa agacaatgtt gaaatcttct acaaagactg gggtccgaaa 60

gacgctccgg tcatcttctt ccaccacggt tggccgctga gcagcgatga ttgggatgcg 120

cagctgctgt ttttcctgaa agaaggcttt cgtgtggttg cccatgatcg tcgcggtcat 180

ggccgcagca gccaagtgtg ggatggtcat gatatggatc attatgcgag cgatgtggcg 240

gccgtggttg atcatctggg tgttcatggc gccgtgcatg ttggtcacag caccggcggt 300

ggcgaagtgg cccattatgt tgccaactat cagaatgatc cggtggcgaa agccgttctg 360

attagcgcgg tgccgccgct gatggttaaa accgaaaaca atccgaacgg tctgccgaaa 420

gaagtgtttg atgatctgca gaaccagctg ttcaaaaacc gtagccagtt ctactacgat 480

gttccggcgg gtccgtttta tggctataac cgtccgggcg ccaaagtgag cgaaccggtt 540

attctgaatt ggtggcgcca gggtatgatg ggtggcgcga aagcccatta tgatggcatc 600

gtggcgttta gccagaccga tttcaccgaa gatctgaaga aaattaaaat cccggtgctg 660

gttatgcatg gtgaagatga tcagattgtg ccgattgaaa tcagcggtaa actgagcgcc 720

gaactggttc agaatggcaa actgatcacc tatccgggtt ttccgcatgg catgccgacg 780

accgaagccg aaaccatcaa caaagacctg ctggaattta tccgctccta a 831

<210> 24

<211> 831

<212> DNA

<213> 绿脓假单胞菌

<400> 24

atgggctatg ttaccaccaa agatggcgtt gaactgtttt acaaagactg gggtccgcgt 60

gatgctcagg ttatttactt ccaccacggt tggccgctga gcagcgatga ttgggatgcg 120

cagatgctgt ttttcctggc cgaaggcttt cgtgtggttg cgcatgatcg tcgcggtcat 180

ggccgcagca gccaagtgtg ggatggtcat gatatggatc attatgccga tgatgttgcg 240

gccgtggttg aacgtctggg tgtgcgtggc gcgattcatg ttggccatag caccggcggt 300

ggcgaagtgg ttcattatat cgcccgttat ccggatgatc cggtgccgaa agccgcaatt 360

atcagcgccg tgccgccgct gatggttaaa accgaaggta acccgggtgg cctgccgaaa 420

agcgtgtttg atgatctgca ggcgcagctg gccaccaatc gtgcccagtt ttatcaggat 480

attccggcgg gtccgtttta tggttataat cgcccgggtg cacagccgag cgaaggtatc 540

gtgcgtaatt ggtggcgcca gggtatgatg ggtggcgcga aagcccatta tgatggcatt 600

gttgcgttta gccagaccga ttttagcgat gatctgaaac gtattgatat cccggtgctg 660

gttatgcatg gcgatgatga tcagatcgtg ccgtatgaaa acagcggtgt tctgagcgcg 720

aaactgctgc gcaatggcac cctgaaaacc tatccgggtt ttccgcatgg catgccgacg 780

acgcaagcgg aagtcatcaa cgccgacctg ctggccttta ttcgtggcta a 831

<210> 25

<211> 831

<212> DNA

<213> 绿脓假单胞菌

<400> 25

atgggttatg tgacgacgaa agacggcgtt gaactgtttt acaaagactg gggtccgcgt 60

gatgctcagg ttatttactt ccaccacggt tggccgctga gcagcgatga ttgggatgcg 120

cagatgctgt ttttcctggc cgaaggcttt catgtggttg cgcatgatcg tcgcggtcat 180

ggccgtagca gccaagtgtg ggatggtcat gatatggatc attatgccga tgatgttgcg 240

gccgtggttg aatatctggg tgtgcgtggc gcgatccatg ttggccatag caccggcggt 300

ggcgaagtgg ttcattatat tgcccgctat ccggatgatc cggtgccgaa agccgcaatt 360

atcagcgccg tgccgccgct gatggttaaa accgaaggta acccgggtgg cctgccgaaa 420

agcgtgtttg atgatctgca ggcacagctg gccgcaaatc gtgcccagtt ttatcaggat 480

atcccggccg gtccgtttta tggttataat cgcccgggtg cccagccgag cgaaggtatt 540

gtgcgtaatt ggtggcgcca gggtatgatc ggtggcgcga aagcccatta tgatggcatt 600

gttgccttta gccagaccga ttttagcgat gatctgaaac gtattgatat cccggtgctg 660

gttatgcatg gcgatgatga tcagatcgtg ccgtatgaaa acagcggtgt tctgagcgcg 720

aaactgctgc gcaatggcac cctgaaaatt tatccgggtt atccgcatgg catgccgacc 780

acccaggctg aagttatcaa tgccgatctg ctggcgttta tccgctccta a 831

<210> 26

<211> 831

<212> DNA

<213> 乌汶伯克氏菌

<400> 26

atgggctacg ttaccaccaa agatggcgtt gacattttct ataaagactg gggtccgcgc 60

gatgctccgg ttgtgttttt ccaccatggt tggccgctga gcgcggatga ttgggatgcc 120

cagatgctgt ttttcctggc gcatggctat cgtgttattg cccatgatcg tcgcggtcat 180

ggccgcagca gccaagtgtg ggatggtcat gatatggatc attatgcgga tgatgttgcg 240

gccgtggtta accatctggg tgtgcagggc gccgtgcatg ttggtcatag caccggcggt 300

ggcgaagttg cgcattatat cgcccgtcat ggcgaagatc gcgcgagcaa agccgtgctg 360

attagcgcgg ttccgccgat catggtgaaa accgaacgta acccgggtgg cctgccgaaa 420

gaagtgtttg atgatctgca ggcccagctg gccgcaaatc gtgcacagtt ttatcatgat 480

attccggcgg gtccgtttta tggctataac cgtccgggtg ccaaaccgag cgaaggcgtt 540

attctgaatt ggtggcgcca gggtatgatg ggcagcgcga aagcccatta tgatggtatc 600

gtggcgttta gccagaccga ttttaccgaa gatctggaag ccattagcat cccggtgctg 660

gttatgcatg gcgatgatga tcagatcgtt ccgtatgcgg atagcggtcc gctgagcgcc 720

aaactgctgc gtaatggcac cctgaaaacc tatccgggtt ttccgcatgg catgccgacg 780

agtaatgccg aaaccatcaa tgctgacctg ctggctttta tccgttccta a 831

<210> 27

<211> 831

<212> DNA

<213> 铁矿副伯克氏菌

<400> 27

atgggtttcg tgacgaccaa agacggtgtt gacattttct acaaagactg gggcccgcgt 60

gacgctcagg ttattttctt ccatcatggt tggccgctga gcgcggatga ttgggatgcc 120

cagatgctgt ttttcctggc gcatggctat cgtgtggttg cccatgatcg tcgcggtcat 180

ggccgcagca cccaagtgtg ggatggtcat gatatggatc attatgcgga tgatgtggcg 240

gccgtggtta accatctggg tgttcagggc gccgtgcatg ttggtcacag caccggcggt 300

ggcgaagtgg cccattatat tgcccgtcat ggtgaagatc gcgtggcgaa aggcgttctg 360

atcagcgcgg tgccgccgct gatgctgaaa accgaagcga acccgggtgg cctgccgaaa 420

agcgtttttg atgatctgca ggcccagctg gccgcaaatc gtgcacagtt ttatcatgat 480

gtgccggccg gtccgtttta tggctataat cgcccgggtg ccaaaccgga agccggcgtt 540

atttggaatt ggtggcgcca gggtatgatg ggtggcgcga aagcccatta tgatggcatc 600

gtggcgttta gccagaccga ttttaccgaa gatctgaaac gcattagcat cccggtgctg 660

gttatgcatg gtgatgatga tcagattgtt ccgtatgcgg atagcggtcc gctgagcgcc 720

aaactgctga aaaatggcac cctgaaaacc tatgcgggtt ttccgcatgg catgccgacg 780

acgcaagcgg aaaccatcaa cgccgacctg ctggccttca tccgtggcta a 831

<210> 28

<211> 831

<212> DNA

<213> 假多噬伯克氏菌

<400> 28

atgggttacg ttaccaccaa agacggtgtc gatattttct acaaagactg gggtccgcgt 60

gatgctcaag ttattttctt ccaccacggt tggccgctga gcgcggatga ttgggatgcc 120

cagatgctgt ttttcctggc gcagggctat cgtgtggttg cccatgatcg tcgcggtcat 180

ggccgcagca gccaagtgtg ggatggtcat gatatggatc attatgcgga tgatgtggcg 240

gccgtggttc agcatctggg tgttcagcag gccgtgcatg ttggccatag caccggcggt 300

ggcgaagtga ttcattatgt tgcgcgtcat ggcgaagatc gcgtgagcaa agccgttctg 360

atcagcgcgg tgccgccgct gatggttaaa accgaaagca acccgggtgg cctgccgaaa 420

caggtgtttg atgatctgca ggcccagctg gccgcaaatc gtgcacagtt ttattatgat 480

attccggcgg gtccgtttta tggctataac cgtgatggtg ccaaaccgag ccagggcgtg 540

atttggaatt ggtggcgcca gggtatgatg ggcagcgcga aagcccatta tgatggtatc 600

gttgcgttta gccagaccga ttttaccgaa gatctgaaac gcgccaccat tccggtgctg 660

gttatgcatg gcgatgatga tcagatcgtg ccgtatgaag atagcggtct gctgagcgcg 720

aaactggtta aaaacggcac cctgaaaacc tatagcggtt ttccgcatgg catgccgacc 780

acccaagccg aaaccatcaa tgccgacctg ctggcgttca tccgctcata a 831

<210> 29

<211> 831

<212> DNA

<213> 不动杆菌属NBRC 110496

<400> 29

atggcttacg ttacgaccaa agacggtgtt gacattttct acaaagactg gggtccgcgt 60

gatgcacaag ttctgttttt ccaccacggt tggccgctga gcagcgatga ttgggatgcg 120

cagctgctgt ttttcctgaa cgaaggcttt cgtgtggttg cccatgatcg tcgcggtcat 180

ggccgcagca gccaggtttg ggatggtcat gatatggatc attatgcgga tgatgtggcg 240

gccgtggttc agcatctggg tattaaaaac gccgttcata tcggccatag caccggcggt 300

ggcgaagttg cgcattatat cgcccgtcat ggtgaagcga atgtgagcaa agccgtgctg 360

gttagcgcgg ttccgccgat tatggtgaaa accgccagca atccgaatgg cctgccgaaa 420

gaagtttttg atgatctgca gaaccagctg ttcaaaaacc gcagccagtt ctactacgat 480

ctgccggcgg gtccgtttta tggctttaac cgtccgaatg cgaaaccgag cgaaccggtt 540

atctggaact ggtggcgcca gggtatgatg ggtggcgcga aagcccatta tgatggcatt 600

gtggccttta gccagaccga ttttaccgaa gatctgaaga aaattagcgt gccggttctg 660

gtgatgcatg gcgatgatga tcaggtggtt ccgtatgaaa acagcggtgt tctgagcgcc 720

aaactggtga aaaatggcac cctgaaaacc tataaaggtt ttagccatgg catgctgacc 780

gttaatgcgg atgttatcaa cccggacctg ctggcgttta ttcgtgcgta a 831

<210> 30

<211> 831

<212> DNA

<213> 塞氏不动杆菌

<400> 30

atgggttatg tcaccaccaa agacaatgtt gaaatcttct acaaagactg gggtccgaaa 60

gacgctccgg tcatcttctt ccaccacggt tggccgctga gcagcgatga ttgggatgcg 120

cagctgctgt ttttcctgaa agaaggcttt cgtgtggttg cccatgatcg tcgcggtcat 180

ggccgcagca gccaagtgtg ggatggtcat gatatggatc attatgcgag cgatgtggcg 240

gccgtggttg atcatctggg tgttcatggc gccgtgcatg ttggtcacag caccggcggt 300

ggcgaagtgg cccattatgt tgccaactat cagaatgatc cggtggcgaa agccgttctg 360

attagcgcgg tgccgccgct gatggttaaa accgaaaaca atccgaacgg tctgccgaaa 420

gaagtgtttg atgatctgca gaaccagctg ttcaaaaacc gtagccagtt ctactacgat 480

gttccggcgg gtccgtttta tggctataac cgtccgggcg ccaaagtgag cgaaccggtt 540

attctgaatt ggtggcgcca gggtatgatg ggtggcgcga aagcccatta tgatggcatc 600

gtggcgttta gccagaccga tttcaccgaa gatctgaaga aaattaaaat cccggtgctg 660

gttatgcatg gtgaagatga tcagattgtg ccgattgaaa tcagcggtaa actgagcgcc 720

gaactggttc agaatggcaa actgatcacc tatccgggtt ttccgcatgg catgccgacg 780

accgaagccg aaaccatcaa caaagacctg ctggaattta tccgctccta a 831

<210> 31

<211> 831

<212> DNA

<213> 不动杆菌属NIPH809

<400> 31

atggcttacg ttacgaccaa agacggtgtt gacattttct acaaagactg gggtccgcgt 60

gatgcacaag ttctgttttt ccaccacggt tggccgctga gcagcgatga ttgggatgcg 120

cagctgctgt ttttcctgaa cgaaggcttt cgtgtggttg cccatgatcg tcgcggtcat 180

ggccgcagca gccaggtttg ggatggtcat gatatggatc attatgcgga tgatgtggcg 240

gccgtggttc agcatctggg tattaaaagc gccattcata tcggccatag caccggcggt 300

ggcgaagttg cgcattatat cgcccgtcat ggtgaagcga atgtggcgaa agccgtgctg 360

gttagcgcgg ttccgccgat tatggtgaaa accgccaaca atccggatgg cctgccgaaa 420

gaagtttttg atgatctgca gaaccagctg ttcaaaaacc gcagcaaatt ctactacgat 480

ctgccggcgg gtccgtttta tggctttaac cgtccggatg cgaatgccag cgaaccggtt 540

atctggaact ggtggcgcca gggtatgatg ggtggcgcga aagcccatta tgatggcatt 600

gtggccttta gccagaccga ttttaccgaa gatctgaaga aaattagcgt gccggttctg 660

gtgatgcatg gcgatgatga tcaggtggtt ccgtatgaaa acagcggtgc gctgagcgcc 720

aaactggtgc agaatggcac cctgaaaacc tataaaggtt ttagccatgg catgctgacc 780

gttaatgcgg atgttatcaa cccggacctg ctggcgttta ttcgtgcgta a 831

<210> 32

<211> 831

<212> DNA

<213> 荧光假单胞菌 A506

<400> 32

atgggctacg ttaccacccg tgatggcgtc gaaatcttct acaaagactg gggtccgcgt 60

gatgctcaag ttatcttctt ccaccacggt tggccgctga gcgcggatga ttgggatgcc 120

cagatgctgt ttttcctggg tgaaggctat cgtgtggttg cgcatgatcg tcgcggtcat 180

ggccgcagca gccaagtgtg ggatggccat gatatggatc attatgcgga tgatgtggcg 240

gccgtggttg aacatctggg tgttcagacc gccgtgcatg ttggccatag caccggcggt 300

ggcgaagtgg ttcattatat tgcgcgtcat ggtgaagatc gcgttagcaa agccgcaatt 360

atcagcgcgg tgccgccgct gatggttcag accccgagca acccgggtgg cctgccgaaa 420

agcgtgtttg atgatctgca ggcgcagctg aaagcgaatc gtgcccagtt ttatcatgat 480

gttccggcgg gtccgtttta tggctataat cgcccgggtg caaccccgag cgaaggtatt 540

atcctgaatt ggtggcgcca gggtatgatg ggctgcgcga aagcccatta tgatggcatc 600

gtggccttta gccagaccga ttttaccgaa gatctgaaac gcattcagat cccggtgctg 660

gttatgcatg gtgatgatga tcagattgtg ccgcatgaaa acgcgggcgt tctgagcgcc 720

aaactgctga aaaatagcac cctgaaaatc tatccgggtt ttccgcatgg catgccgacc 780

acgcacgctg acaccatcaa cgccgacctg ctggccttca tccgctcgta a 831

<210> 33

<211> 831

<212> DNA

<213> 假单胞菌属ABAC61

<400> 33

atgggttacg tgacgacgca agacggtgtt gacattttct acaaagattg gggtccgcgc 60

gacgctcaga ttatttattt tcatcatggt tggccgctga gcagcgatga ttgggatgcg 120

cagatgctgt ttttcctgaa acagggcttt cgtgtggttg cccatgatcg tcgcggtcat 180

ggccgcagca gccaagtgtg ggatggtcat gatatggatc attatgcgga tgatgttgcg 240

gccgtggtta aacatctggg tgtggaaaaa gccattcatg ttggccatag caccggcggt 300

ggcgaagtgg ttcgttatat tgcgcgctat ccggaagata gcgtgccgaa agccgttctg 360

atcagcagcg tgccgccgct gatggttaaa accgataaaa acccggatgg cctgccgaaa 420

agcgtgtttg atgatctgca ggttcagctg gaagcgaatc gtgcccagtt ttatcaggat 480

atcccggcgg gtccgtttta tggctataac cgtccgggtg ccaaaccgag ccagggcatt 540

atcctgaatt ggtggcgcca gggtatgatg ggcagcgcga aagcccatta tgatggtatt 600

gtggcgttta gccagaccga ttttagcgaa aacctggcca gcattaaaat cccggtgctg 660

gttatgcatg gcgatgatga tcagatcgtg ccgtatgaaa acagcggtgt gctgagcgcg 720

aaactggttg ccaatggcac cctgaaactg tatccgggtt ttagccatgg catgccgacc 780

atcaatgcgg ataccatcaa tgctgacctg ctggcgttcg tgcgttccta a 831

<210> 34

<211> 831

<212> DNA

<213> 恶臭假单胞菌IFO12996

<400> 34

atgagctatg taaccacgaa ggacggcgtg cagatcttct acaaggactg gggcccgcgc 60

gatgcaccgg ttatccactt ccatcacggc tggccgctca gcgccgacga ctgggatgcc 120

cagttgctgt tcttcctcgc ccatggttac cgcgtggtcg cccacgaccg ccgcggccat 180

ggccgctcca gtcaggtatg ggacggccac gacatggacc attacgccga cgatgtggcg 240

gcggtcgtcg ctcacctggg catccagggc gccgtgcatg tcggccactc gaccggtggc 300

ggtgaagtgg tgcgctacat ggcccggcac cctgaagaca aggtggccaa ggccgtgctg 360

atcgccgccg taccgccact gatggtgcag acccccggta atcccggcgg cttgcccaaa 420

tcagtgttcg acggcttcca ggcccaggtc gccagcaacc gcgcgcagtt ctaccgggat 480

gtgccagccg ggccgttcta cggctacaac cgccctggtg tagaagcgag tgagggcatc 540

attggtaact ggtggcgcca gggcatgatc ggcagcgcca aggcccatta cgatggcatc 600

gtggcatttt cccagaccga ttttaccgag gacctgaagg gcatccagca acctgtgctg 660

gtgatgcacg gcgatgatga ccagatcgtg ccgtatgaga actccggagt gctgtcggcg 720

aagctgctgc ccaatggcgc gttgaagact tacaaaggct acccgcatgg catgccgacc 780

acccatgccg atgtgatcaa tgcggatttg ctggcgttta tccgtagctg a 831

<210> 35

<211> 831

<212> DNA

<213> 恶臭假单胞菌MR2068

<400> 35

atgtcgtatg ttaccaccaa agacggcgtt cagattttct acaaagactg gggtccgcgt 60

gacgctccgg ttatccactt ccatcatggt tggccgctga gcgcggatga ttgggatgcc 120

cagatgctgt ttttcctggc gcatggctat cgtgtggttg cccatgatcg tcgcggtcat 180

ggccgcagca gccaagtgtg ggatggtcat gatatggatc attatgcgga tgatgttgcg 240

gccgtggttg cgcatctggg tattcagggc gccgtgcatg ttggccatag caccggcggt 300

ggcgaagtgg ttcgttatat ggcgcgccat ccggccgata aagtggcgaa agcggttctg 360

attgccgcgg tgccgccgct gatggttcag accccggata acccgggtgg cctgccgaaa 420

agcgtgtttg atggttttca ggcgcaggtt gccagcaatc gtgcgcagtt ttatcgcgat 480

gtgccggccg gtccgtttta tggctataac cgtccgggtg ttgatgcgag cgaaggtatt 540

atcggcaatt ggtggcgcca gggtatgatt ggcagcgcga aagcccatta tgatggcatc 600

gtggccttta gccagaccga ttttaccgaa gatctgaaag gtattaccca gccggtgctg 660

gttatgcatg gcgatgatga tcagatcgtg ccgtatgaaa acagcggtct gctgagcgcg 720

aaactgctgc cgaatggcac cctgaaaacc tatcagggtt atccgcatgg catgccgacc 780

acgcacgccg atgttatcaa cgccgacctg ctggccttca ttcgctccta a 831

<210> 36

<211> 831

<212> DNA

<213> 绿脓假单胞菌

<400> 36

atgggctacg ttaccaccaa agacggcgtt gaaatcttct acaaagactg gggtccgcgt 60

gatgcacaag ttatctgctt ccaccacggt tggccgctga gcgcggatga ttgggatgcc 120

cagatgctgt ttttcctggc ggaaggcttt cgtgtggttg cccatgatcg tcgcggtcat 180

ggccgcagca gccaagtgtg ggatggtcat gatatggatc attatgcgga tgatgttgcg 240

gccgtggttg aacatctggg tgtgcgtggc gccattcatg ttggccatag caccggcggt 300

ggcgaagtgg ttcattatat cgcgcgctat ccggatgatc cggtgccgaa agccgcaatt 360

atcagcgcgg tgccgccgct gatggttaaa accgaaggta acccgggtgg cctgccgaaa 420

agcgtttttg atgatctgca ggcccagctg gccgcaaatc gtgcacagtt ttatcaggat 480

attccggcgg gtccgtttta tggctataac cgcccgggtg ccaaaccgag cgaaggcatt 540

atccgtaatt ggtggcgcca gggtatgatg ggtggcgcga aagcccatta tgatggcatt 600

gtggcgttta gccagaccga ttttagcgaa gatctgaaac gtattgatat cccggtgctg 660

gttatgcatg gcgatgatga tcagatcgtg ccgtatgaaa acagcggtgt tcgtagcgcg 720

aaactgctgc gcaatggcac cctgaaaacc tatccgggtt atccgcatgg catgccgacg 780

acccaagcgg aagttatcaa tgctgacctg ctggcgttca tccgtggcta a 831

<210> 37

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

gttttcccag tcacgac 17

<210> 38

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

caggaaacag ctatgac 17

Claims (14)

1.一种将食品或饮料中的氨基甲酸乙酯分解的方法，其特征在于，使酯酶与含有氨基甲酸乙酯的食品或饮料作用，所述酯酶由与序列号1的氨基酸序列70％以上相同的氨基酸序列构成。

2.根据权利要求1所述的分解方法，其中，所述酯酶的氨基酸序列包含序列号1～18中的任一氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的分解方法，其中，所述酯酶来自不动杆菌属微生物、假单胞菌属微生物、伯克氏菌属微生物或副伯克氏菌属微生物。

4.根据权利要求3所述的分解方法，其中，所述不动杆菌属微生物为乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、吉洛氏不动杆菌(Acin etobacter guillouiae)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)或塞氏不动杆菌(Acinetobacter seifertii)，所述假单胞菌属微生物为绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，所述伯克氏菌属微生物为乌汶伯克氏菌(Burkholderia ubonensis)或假多噬伯克氏菌(Burkholderiapseudom ultivorans)，所述副伯克氏菌属微生物为铁矿副伯克氏菌(Paraburkholder iaferrariae)。

5.根据权利要求1所述的分解方法，其中，所述酯酶来自不动杆菌属NBRC 110496(Acinetobacter sp.NBRC 110496)、不动杆菌属NIPH809(Acinetobacter sp.NIPH809)、荧光假单胞菌A506(Pseudomonas fluores cens A506)、假单胞菌属ABAC61(Pseudomonassp.ABAC61)、恶臭假单胞菌IFO12996(Pseudomonas putidaIFO12996)或恶臭假单胞菌MR2068(Pseudomonas putida MR2068)。

6.根据权利要求1所述的分解方法，其中，所述酯酶具备以下的特征：

(1)最适温度：20～30℃，

(2)最适pH：pH7，

(3)温度稳定性：到70℃为止稳定，条件为pH7、1小时，

(4)pH稳定性：在pH5～11的范围内稳定，

(5)分子量：约85kDa，所述分子量是利用凝胶渗透色谱测得的。

7.根据权利要求6所述的分解方法，其中，所述酯酶进一步具备以下的特征：

(6)酒精稳定性：如果酒精浓度为40％以下，则即使在30℃处理8天也不会失活。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的分解方法，其中，所述饮料为酒精饮料。

9.根据权利要求8所述的分解方法，其中，所述酒精饮料为绍兴酒、以核果为原料的蒸馏酒、威士忌、白兰地、龙舌兰酒、巴西甘蔗酒、烧酒、清酒、葡萄酒、酒精强化葡萄酒、梅酒、雪利酒或混合酒。

10.一种除去或减少了氨基甲酸乙酯的食品或饮料的制造方法，包括利用酯酶进行的处理工序，所述酯酶由与序列号1的氨基酸序列70％以上相同的氨基酸序列构成。

11.根据权利要求10所述的制造方法，其中，所述酯酶为权利要求2～7中任一项中所定义的酯酶。

12.根据权利要求10或11所述的制造方法，其中，所述饮料为酒精饮料。

13.根据权利要求12所述的制造方法，其中，所述酒精饮料为绍兴酒、以核果为原料的蒸馏酒、威士忌、白兰地、龙舌兰酒、巴西甘蔗酒、烧酒、清酒、葡萄酒、酒精强化葡萄酒、梅酒、雪利酒或混合酒。

14.一种除去或减少了氨基甲酸乙酯的食品或饮料，是通过权利要求10～13中任一项所述的制造方法而得到的。

Images