JPWO2018180187A1 - カルバミン酸エチルの分解 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]配列番号1のアミノ酸配列と70%以上同一のアミノ酸配列からなるエステラーゼを、カルバミン酸エチルを含有する食品又は飲料に作用させることを特徴とする、食品又は飲料中のカルバミン酸エチルを分解する方法。
[2]前記エステラーゼのアミノ酸配列が、配列番号1〜18のいずれかのアミノ酸配列を含む、[1]に記載の分解方法。
[3]前記エステラーゼがアシネトバクター属微生物、シュードモナス属微生物、バークホルデリア属微生物又はパラバークホルデリア属微生物に由来する、[1]に記載の分解方法。
[4]前記アシネトバクター属微生物がアシネトバクター・カルコアセティカス(Acinetobacter calcoaceticus)、アシネトバクター・ギロイエ(Acinetobacter guillouiae)、アシネトバクター・バウマニ(Acinetobacter baumannii)又はアシネトバクター・セイフェルティ(Acinetobacter seifertii)であり、前記シュードモナス属微生物がシュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)又はシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)であり、前記バークホルデリアがバークホルデリア・ユボネンシス(Burkholderia ubonensis)又はバークホルデリア・シュードマルチボランス(Burkholderia pseudomultivorans)であり、前記パラバークホルデリアがパラバークホルデリア・フェラリエ(Paraburkholderia ferrariae)である、[3]に記載の分解方法。
[5]前記エステラーゼがアシネトバクター sp. NBRC 110496(Acinetobacter sp. NBRC 110496)、アシネトバクター sp. NIPH809(Acinetobacter sp. NIPH809)、シュードモナス・フルオレセンスA506(Pseudomonas fluorescens A506)、シュードモナス sp. ABAC61(Pseudomonas sp. ABAC61)、シュードモナス・プチダIFO12996(Pseudomonas putida IFO12996)又はシュードモナス・プチダMR2068(Pseudomonas putida MR2068)に由来する、[1]に記載の分解方法。
[6]前記エステラーゼが以下の特徴を備える、[1]に記載の分解方法:
(1)至適温度: 20〜30℃;
(2)至適pH: pH7;
(3)温度安定性: 70℃まで安定(pH7、1時間);
(4)pH安定性: pH5〜11で安定である;
(5)分子量: 約85kDa(ゲルろ過による)。
[7]前記エステラーゼが以下の特徴を更に備える、[6]に記載の分解方法:
(6)アルコール安定性:アルコール濃度が40%以下であれば、8日間、30℃で処理しても失活しない。
[8]前記飲料がアルコール飲料である、[1]〜[7]のいずれか一項に記載の分解方法。
[9]前記アルコール飲料が、紹興酒、核果を原料とした蒸留酒、ウイスキー、ブランデー、テキーラ、カシャッサ、焼酎、清酒、ワイン、酒精強化ワイン、梅酒、シェリー酒、又は混成酒である、[8]に記載の分解方法。
[10]配列番号1のアミノ酸配列と70%以上同一のアミノ酸配列からなるエステラーゼによる処理工程を含む、カルバミン酸エチルが除去又は低減された食品又は飲料の製造方法。
[11]前記エステラーゼが、[2]〜[7]のいずれか一項において定義されたエステラーゼである、[10]に記載の製造方法。
[12]前記飲料がアルコール飲料である、[10]又は[11]に記載の製造方法。
[13]前記アルコール飲料が、紹興酒、核果を原料とした蒸留酒、ウイスキー、ブランデー、テキーラ、カシャッサ、焼酎、清酒、ワイン、酒精強化ワイン、梅酒、シェリー酒又は混成酒である、[12]に記載の製造方法。
[14][10]〜[13]のいずれか一項に記載の製造方法で得られた、カルバミン酸エチルが除去又は低減された食品又は飲料。
本発明は食品又は飲料中のカルバミン酸エチルを分解する方法であり、カルバミン酸エチルを含有する食品又は飲料にエステラーゼを作用させることを特徴とする。本発明によれば、カルバミン酸エチルが除去又は低減された食品又は飲料が得られる。
本発明に用いるエステラーゼは、カルバミン酸エチルに対して分解活性を示すものである限り、特に限定されない。好ましいエステラーゼの1つは、配列番号1のアミノ酸配列を含むエステラーゼである。当該エステラーゼは、後述の実施例に示す通り、本発明者らの検討によって見出された、アシネバクター・カルコアセティカス(Acinetobacter calcoaceticus)由来のエステラーゼであり、アルコールに対する耐性が高く、しかも温度安定性に優れるという特徴を備える。一方、配列番号1のアミノ酸配列と70%以上の同一性を示すアミノ酸配列で特定される17種ものエステラーゼが、アシネトバクター・カルコアセティカス由来のエステラーゼと同様、カルバミン酸エチルに対して分解活性を示した事実(後述の実施例を参照)に鑑みれば、配列番号1のアミノ酸配列と70%以上同一のアミノ酸配列を有するエステラーゼも本発明に好適である。該当するエステラーゼの具体例は、アシネトバクター・ギロイエ(Acinetobacter guillouiae)に由来し、配列番号2のアミノ酸配列を有するエステラーゼ(アミノ酸配列の同一性98%)、アシネトバクター・バウマニABNIH3(Acinetobacter baumannii ABNIH3)に由来し、配列番号3のアミノ酸配列を有するエステラーゼ(アミノ酸配列の同一性97%)、アシネトバクター・セイフェルティ(Acinetobacter seifertii)に由来し、配列番号4のアミノ酸配列を有するエステラーゼ(アミノ酸配列の同一性90%)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)に由来し、配列番号5のアミノ酸配列を有するエステラーゼ(アミノ酸配列の同一性80%)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)に由来し、配列番号6のアミノ酸配列を有するエステラーゼ(アミノ酸配列の同一性80%)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)に由来し、配列番号7のアミノ酸配列を有するエステラーゼ(アミノ酸配列の同一性80%)、バークホルデリア・ユボネンシス(Burkholderia ubonensis)に由来し、配列番号8のアミノ酸配列を有するエステラーゼ(アミノ酸配列の同一性81%)、パラバークホルデリア・フェラリエ(Paraburkholderia ferrariae)に由来し、配列番号9のアミノ酸配列を有するエステラーゼ(アミノ酸配列の同一性81%)、バークホルデリア・シュードマルチボランス(Burkholderia pseudomultivorans)に由来し、配列番号10のアミノ酸配列を有するエステラーゼ(アミノ酸配列の同一性81%)、アシネトバクター sp. NBRC 110496(Acinetobacter sp. NBRC 110496)に由来し、配列番号11のアミノ酸配列を有するエステラーゼ(アミノ酸配列の同一性81%)、アシネトバクター・セイフェルティ(Acinetobacter seifertii)に由来し、配列番号12のアミノ酸配列を有するエステラーゼ(アミノ酸配列の同一性90%)、アシネトバクター sp. NIPH809(Acinetobacter sp. NIPH809)に由来し、配列番号13のアミノ酸配列を有するエステラーゼ(アミノ酸配列の同一性80%)、シュードモナス・フルオレセンスA506(A506Pseudomonas fluorescens A506)に由来し、配列番号14のアミノ酸配列を有するエステラーゼ(アミノ酸配列の同一性80%)、シュードモナス sp. ABAC61(Pseudomonas sp. ABAC61)に由来し、配列番号15のアミノ酸配列を有するエステラーゼ(アミノ酸配列の同一性79%)、シュードモナス・プチダIFO12996(Pseudomonas putida IFO12996)に由来し、配列番号16のアミノ酸配列を有するエステラーゼ(アミノ酸配列の同一性76%)、シュードモナス・プチダMR2068(Pseudomonas putida MR2068)に由来し、配列番号17のアミノ酸配列を有するエステラーゼ(アミノ酸配列の同一性76%)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)に由来し、配列番号18のアミノ酸配列を有するエステラーゼ(アミノ酸配列の同一性80%)、である。尚、カルバミン酸エチルに対する分解活性を示さなかったArthrobacter ramosus由来のエステラーゼ(実施例を参照)のアミノ酸配列の同一性は21%に留まる。
エステラーゼの由来も特に限定されない。例えば、アシネトバクター・カルコアセティカス(Acinetobacter calcoaceticus)、アシネトバクター・ギロイエ(Acinetobacter guillouiae)、アシネトバクター・バウマニ(Acinetobacter baumannii)、アシネトバクター・セイフェルティ(Acinetobacter seifertii)等のアシネトバクター属微生物、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属微生物、バークホルデリア・ユボネンシス(Burkholderia ubonensis)、バークホルデリア・シュードマルチボランス(Burkholderia pseudomultivorans)等のバークホルデリア属微生物、又はパラバークホルデリア・フェラリエ(Paraburkholderia ferrariae)等のパラバークホルデリア属微生物等、微生物に由来するエステラーゼを用いることができる。尚、アシネトバクター属微生物の具体例としてアシネトバクター・バウマニABNIH3(Acinetobacter baumannii ABNIH3)、アシネトバクター sp. NBRC 110496(Acinetobacter sp. NBRC 110496)及びアシネトバクター sp. NIPH809(Acinetobacter sp. NIPH809)を、シュードモナス属微生物の具体例としてシュードモナス・フルオレセンスA506(Pseudomonas fluorescens A506)、シュードモナス sp. ABAC61(Pseudomonas sp. ABAC61)、シュードモナス・プチダIFO12996(Pseudomonas putida IFO12996)及びシュードモナス・プチダMR2068(Pseudomonas putida MR2068)を挙げることができる。
配列番号1のアミノ酸配列で特定される、アシネトバクター・カルコアセティカス由来のエステラーゼは、本発明の分解方法において特に好適なエステラーゼである。本発明者らは、以下の通り、本エステラーゼの諸性質を特定することにも成功した。
本エステラーゼの至適温度は20℃〜30℃である。尚、至適温度は、pH7(例えば50mM リン酸緩衝液を用いる)の条件下での測定結果に基づき評価することができる。
本エステラーゼの至適pHは7である。至適pHは、例えば、pH3.0〜8.0のpH域では100 mM McIlvaine緩衝液中、pH8.0〜11.0のpH域では100 mM Atkins緩衝液中で測定した結果を基に判断される。
本エステラーゼの温度安定性については、50mM リン酸緩衝液(pH7)中、70℃以下の条件で1時間処理しても80%以上の活性が残存する。
本エステラーゼはpH5〜11で安定である。即ち、処理に供する酵素溶液のpHがこの範囲内にあれば、37℃、1時間の処理後、90%以上の活性が残存する。
本エステラーゼの分子量は約85kDa(ゲルろ過による)である。尚、ホモ三量体を形成している。
本エステラーゼはアルコール中で高い安定性を示す。アルコール濃度が40%以下であれば、8日間、30℃で処理しても失活しない(残存活性が90%以上)。
エステラーゼを作用させる対象(以下では「処理対象」と呼ぶことがある)、即ち、食品又は飲料は特に限定されない。処理対象になり得る食品及び飲料を例示すれば、各種発酵食品(例えばヨーグルト、チーズ、漬物、醤油、味噌)、パン、紹興酒、核果(さくらんぼ、もも、すもも、あんず等)を原料とした蒸留酒、ウイスキー、ブランデー、テキーラ、カシャッサ、焼酎、清酒、ワイン、酒精強化ワイン(シェリー酒、ポートワイン、マデイラワイン、マルサラワイン等)、梅酒、シェリー酒、混成酒(リキュール、ベルモット、薬酒等)である。好ましい一態様では、アルコール飲料、例えば紹興酒、シェリー酒、清酒を処理対象とする。
エステラーゼを食品又は飲料に作用させるためには、例えば、処理対象である食品又は飲料にエステラーゼを添加し、所定時間、反応させる。或いは、担体に固定したエステラーゼに処理対象である食品又は飲料を接触させ、酵素反応を生じさせる。使用する酵素量(酵素濃度)、温度条件、反応時間などは、予備実験を通して決定すればよい。
以上の説明から明らかなように、本発明の分解方法をその製造過程に取り込むことにより、カルバミン酸エチルが除去又は低減された食品又は飲料を得ることができる。そこで本発明の第2の局面は、本発明の分解方法を利用した食品又は飲料の製造方法を提供する。本発明の製造方法では、製造過程の中でエステラーゼによる処理工程(以下では、「酵素処理工程」と呼ぶことがある)が行われる。本発明に特有の効果、即ち、エステラーゼの作用によってカルバミン酸エチルが分解されること、が発揮される限り、全製造工程における酵素処理工程の位置(即ち、他の製造工程との順序)は特に限定されない。但し、例外的な場合を除き、製造過程の後期又は最終段階である、発酵工程ないし熟成・貯蔵工程でカルバミン酸エチルが生成するという点を考慮すれば、これらの工程の後に酵素処理工程を実施することが好ましい。従って、好ましい一態様では、発酵工程の後に酵素処理工程を実施するか、或いは熟成・貯蔵工程の後に酵素処理工程を実施する。
カルバミン酸エチル(EC)の分解が可能な酵素を見出すため、130種類の酵素(リパーゼ又はエステラーゼ23種類の他に、プロテアーゼ、アミラーゼなど各種加水分解酵素を含む)及び微生物を対象として大規模スクリーニングを実施した。スクリーニング方法を以下に示す。まず、スクリーニング対象の各酵素についてEC反応液(100mM リン酸緩衝液 pH7.0: 2mL, EC: 10mM, 酵素: 2mg)を調製し(微生物については酵素のかわりに培養液を用いた)、反応(30℃、スターラー攪拌、48時間)させた。反応終了後、反応液0.4mLに1N HCl 0.1mL及びクロロホルム0.6 mL(Wako)を添加した後、十分に混合した。混合液を遠心分離(15,000 rpm×5分, 4℃)した後、クロロホルム層をバイアル瓶に回収してGC分析サンプルとした。このようにして調製したサンプルを用い、GC分析にてECを検出した。尚、EC分解率は、カルバミン酸エチル(EC)のピーク面積(R.T = 8.9分)より算出した。
(GC分析条件)
Gas chromatography (GC7700, Agilent)を使用し、以下の条件で分析した。
カラム: DB-WAX(60m×0.25mm×0.25um)(Agilent J&W)
インジェクター: 250℃
検出器: FID, 250℃
オーブン: 100℃(0分) → 10℃/分で昇温 → 250℃で5分保持
流速: 2.0 mL/分
注入量: 5 μL
スクリーニングによって見出されたA. calcoaceticus由来エステラーゼの紹興酒中でのEC分解能力を検討した。EC反応液(紹興酒(pH5.0):60mL, EC:1.3 ppm, E-2酵素製剤:3g(終濃度800 U/mL))を調製して300mL三角フラスコにて反応(30℃, 100rpm, 9日)させた。反応後、EC反応液を遠心分離(7,000 g×10分, 4℃)し、膜ろ過(0.45μm又は0.2μm)後、ガスクロマトグラフ−質量分析法でEC濃度を分析した。
2.の検討によって、A. calcoaceticus 由来エステラーゼが紹興酒中のECを分解できることが確認された。A. calcoaceticus由来エステラーゼの類縁酵素にEC分解能力があるか、以下の検討を行った。
(1−1)エステラーゼ遺伝子の全合成(E.coli最適化)
E.coli発現系を構築するにあたり、A. calcoaseticus及び類縁菌株由来のエステラーゼ遺伝子をE.coli発現用にコドンの最適化をした後、全合成した。尚、A. calcoaseticus及び類縁菌株由来のエステラーゼのアミノ酸配列及び遺伝子配列(コドンの最適化後)を以下に示す。
<A. calcoaseticus由来のエステラーゼ>
アミノ酸配列:配列番号1
遺伝子配列:配列番号19
<類縁酵素No.1>
由来:アシネトバクター・ギロイエ(Acinetobacter guillouiae)
アミノ酸配列:配列番号2
遺伝子配列:配列番号20
<類縁酵素No.2>
由来:アシネトバクター・バウマニABNIH3(Acinetobacter baumannii ABNIH3)
アミノ酸配列:配列番号3
遺伝子配列:配列番号21
<類縁酵素No.3>
由来:アシネトバクター・セイフェルティ(Acinetobacter seifertii)
アミノ酸配列:配列番号4
遺伝子配列:配列番号22
<類縁酵素No.4>
由来:シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)
アミノ酸配列:配列番号5
遺伝子配列:配列番号23
<類縁酵素No.5>
由来:シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)
アミノ酸配列:配列番号6
遺伝子配列:配列番号24
<類縁酵素No.6>
由来:シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)
アミノ酸配列:配列番号7
遺伝子配列:配列番号25
<類縁酵素No.7>
由来:バークホルデリア・ユボネンシス(Burkholderia ubonensis)
アミノ酸配列:配列番号8
遺伝子配列:配列番号26
<類縁酵素No.8>
由来:パラバークホルデリア・フェラリエ(Paraburkholderia ferrariae)
アミノ酸配列:配列番号9
遺伝子配列:配列番号27
<類縁酵素No.9>
由来:バークホルデリア・シュードマルチボランス(Burkholderia pseudomultivorans)
アミノ酸配列:配列番号10
遺伝子配列:配列番号28
<類縁酵素No.10>
由来:アシネトバクター sp. NBRC 110496(Acinetobacter sp. NBRC 110496)
アミノ酸配列:配列番号11
遺伝子配列:配列番号29
<類縁酵素No.11>
由来:アシネトバクター・セイフェルティ(Acinetobacter seifertii)
アミノ酸配列:配列番号12
遺伝子配列:配列番号30
<類縁酵素No.12>
由来:アシネトバクター sp. NIPH809(Acinetobacter sp. NIPH809)
アミノ酸配列:配列番号13
遺伝子配列:配列番号31
<類縁酵素No.13>
由来:シュードモナス・フルオレセンスA506(Pseudomonas fluorescens A506)
アミノ酸配列:配列番号14
遺伝子配列:配列番号32
<類縁酵素No.14>
由来:シュードモナス sp. ABAC61(Pseudomonas sp. ABAC61)
アミノ酸配列:配列番号15
遺伝子配列:配列番号33
<類縁酵素No.15>
由来:シュードモナス・プチダIFO12996(Pseudomonas putida IFO12996)
アミノ酸配列:配列番号16
遺伝子配列:配列番号34
<類縁酵素No.16>
由来:シュードモナス・プチダMR2068(Pseudomonas putida MR2068)
アミノ酸配列:配列番号17
遺伝子配列:配列番号35
<類縁酵素No.17>
由来:シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)
アミノ酸配列:配列番号18
遺伝子配列:配列番号36
全合成したエステラーゼ遺伝子を鋳型とし、リンカー配列(Eco RI, Hind III)を付加するプライマーを用いてPCR(PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (Takara))を行った。PCR条件は以下の通りとした。
<PCR条件>
反応液の組成:5×PrimeSTAR GXL Bufferを10 μl、dNTP Mixture(各2.5 mM)を4 μl、フォワードプライマーを10 pmol、リバースプライマーを10 pmol、鋳型を10 ng、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(Takara)を1μl(滅菌蒸留水で全量50μlに調整)
反応条件:98℃で10秒、60℃で30秒、68℃で1.5分を30サイクル
構築した各エステラーゼ遺伝子組換えE.coli発現菌株(宿主:E.coli BL21(DE3))を用いて、培養液(培養菌体)の取得を試みた。各エステラーゼ遺伝子組換えE.coli発現菌株の培養液(培養菌体)の取得は、2段階の培養で行った。まず、各エステラーゼ遺伝子組換えE.coli発現菌株をL Broth(inbitrogen社)(Amp : 100 μg/mL) 5mLに接種し、振とう培養機にて16時間、培養(140rpm, 37℃)した後、Teriffic Broth(invitrogen社)(Amp : 100 μg/mL) 50mLに0.5 mLを植菌した。その後、200rpm、33℃の条件で48時間培養し、培養開始から24時間の時点で0.1 mM IPTGを培養液に添加することで酵素の発現を誘導した。培養液50mLを遠心分離(7,500g×10分, 4℃)した後、遠心上清を除去することで培養菌体を回収した。
取得した菌体抽出液を用いて、緩衝液中(pH7.0)でのEC分解能力を確認した。EC反応液(緩衝液(100mM リン酸緩衝液 pH7.0):1.3mL, EC:10mM, 各菌体抽出液:1.3mL)を調製して、反応(30℃, 100rpm, 9日間)させた。反応期間中、適宜、反応液をサンプリング(0.4mL)し、分析サンプルを調製した。分析サンプルをGCで分析した。分析の結果、活性の強弱はあるものの、いずれの類縁酵素もEC分解能力を有することが確認された(図1)。
優れたEC分解能力を示したA. calcoaceticus由来エステラーゼについて、アルコール安定性を検討した。まず、各濃度のアルコール溶液(エタノール-試薬特級(Wako))(0〜70%)9mLとA. calcoaceticus由来エステラーゼ 1gを混合することで処理液を調製した。各処理液を30℃で静置し、16時間後、4日後、8日後にサンプリング(1mL)した。以下の測定法で各サンプルの酵素活性を測定した。
(3,4-dihydrocoumarinを基質とした活性測定法)
50mM リン酸緩衝液(pH7.0) 2.1 mL、5 mM 3,4-dihydrocoumarin(Sigma-aldrich (コード:D104809))溶液(40% EtOH含) 0.3mL、酵素溶液 0.6mLを混合し、反応させた。本測定法では、反応により生じる生成物(3−(2−ヒドロキシフェニル)プロピオン酸)の吸光値変化をカイネティクス測定(Abs. 270nm, 30℃, 5分)することで、1分間に1nmolの生成物(3-(2-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸)を生成する酵素量を1単位(U)と定義している。尚、本測定において正確な測定値が得られるΔODは、ΔOD=0.01〜0.05/2分(Abs. 250nm)の範囲であり、必要に応じて酵素溶液を50mM リン酸緩衝液 pH7.0にて希釈する。
上記の「3,4-dihydrocoumarinを基質とした活性測定法」を用い(サンプルの前処理条件等は個別に記載する)、A. calcoaceticus由来エステラーゼの酵素学的性質を特定した。
吸光度計のサンプルブロックを所定の温度に設定して活性を測定し、至適温度を決定した。測定範囲に合わせるための酵素の希釈には50mM リン酸緩衝液(pH7.0)を用いた。測定の結果、至適温度は20〜30℃であった(図3)。
反応液中の「50mM リン酸緩衝液 pH7.0 2.1 mL」を所定のpHに調整した緩衝液に置き換えた測定系で活性を測定し、至適pHを決定した。所定のpHで測定する為、2種類の緩衝液(McIlvaine、Atkins)を各pHに調整したもの(McIlvaine緩衝液:pH3.0, pH4.0, pH5.0, pH6.0, pH7.0, pH8.0。Atkins緩衝液:pH8.0, pH9.0, pH10.0, pH11.0)を用意した。測定範囲に合わせるための酵素の希釈には50mM リン酸緩衝液(pH7.0)を用いた。測定の結果、至適pHはpH7であった(図4)。
酵素を各温度で処理した後に残存活性を測定することにより、温度安定性を評価した。まず、50mM リン酸緩衝液 pH7.0を用いて酵素希釈液を調製した後、所定の温度で1時間処理して、氷水にて5分間冷却した。この処理の後、50mM リン酸緩衝液 pH7.0を用いて測定範囲内に入るように希釈し、活性を測定した。結果、70℃まで安定(80%以上の残存活性)であった(図5)。
酵素を各pHで処理した後、残存活性を測定することにより、pH安定性を評価した。まず、各pHに調製した緩衝液を用いて酵素希釈液を調製した後、37℃で1時間処理した(pH処理)。酵素のpH処理に用いる緩衝液として、2種類の緩衝液(McIlvaine、Atkins)を各pHに調整したもの(McIlvaine緩衝液:pH3.0, pH4.0, pH5.0, pH6.0, pH7.0, pH8.0。Atkins緩衝液:pH8.0, pH9.0, pH10.0, pH11.0)を使用した。pH処理の後、酵素希釈液と等量の1M リン酸緩衝液 pH7.0を加えることでpH処理を停止した。50mM リン酸緩衝液 pH7.0 を用いて測定範囲内に入るように希釈した後、活性を測定した。測定の結果、pH5〜11で安定(90%以上の残存活性)であった(図6)。
以下の条件の下、ゲル濾過クロマトグラフィーによって非変性条件下での分子量を測定した。測定の結果、分子量は約85kDaと推定された。
(実験条件)
使用カラム:Amersham pharmacia (現GEヘルスケア)製 Superdex 200HR 10/30
使用緩衝液:50mmol/L NaCl リン酸緩衝液(pH 7.0)+0.15 mol/L NaCl
分子量マーカー:High Molecular Weight Gel Filtration Calibration Kit(Amersham社製) (Aldolase 158 k, Catalase 232 k, Ferritin 440 k, Thyroglobulin 669 k)を用いた。
配列番号38:人工配列の説明:プライマー
Claims (14)
- 配列番号1のアミノ酸配列と70%以上同一のアミノ酸配列からなるエステラーゼを、カルバミン酸エチルを含有する食品又は飲料に作用させることを特徴とする、食品又は飲料中のカルバミン酸エチルを分解する方法。
- 前記エステラーゼのアミノ酸配列が、配列番号1〜18のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の分解方法。
- 前記エステラーゼがアシネトバクター属微生物、シュードモナス属微生物、バークホルデリア属微生物又はパラバークホルデリア属微生物に由来する、請求項1に記載の分解方法。
- 前記アシネトバクター属微生物がアシネトバクター・カルコアセティカス(Acinetobacter calcoaceticus)、アシネトバクター・ギロイエ(Acinetobacter guillouiae)、アシネトバクター・バウマニ(Acinetobacter baumannii)又はアシネトバクター・セイフェルティ(Acinetobacter seifertii)であり、前記シュードモナス属微生物がシュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)又はシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)であり、前記バークホルデリアがバークホルデリア・ユボネンシス(Burkholderia ubonensis)又はバークホルデリア・シュードマルチボランス(Burkholderia pseudomultivorans)であり、前記パラバークホルデリアがパラバークホルデリア・フェラリエ(Paraburkholderia ferrariae)である、請求項3に記載の分解方法。
- 前記エステラーゼがアシネトバクター sp. NBRC 110496(Acinetobacter sp. NBRC 110496)、アシネトバクター sp. NIPH809(Acinetobacter sp. NIPH809)、シュードモナス・フルオレセンスA506(Pseudomonas fluorescens A506)、シュードモナス sp. ABAC61(Pseudomonas sp. ABAC61)、シュードモナス・プチダIFO12996(Pseudomonas putida IFO12996)又はシュードモナス・プチダMR2068(Pseudomonas putida MR2068)に由来する、請求項1に記載の分解方法。
- 前記エステラーゼが以下の特徴を備える、請求項1に記載の分解方法:
(1)至適温度: 20〜30℃;
(2)至適pH: pH7;
(3)温度安定性: 70℃まで安定(pH7、1時間);
(4)pH安定性: pH5〜11で安定である;
(5)分子量: 約85kDa(ゲルろ過による)。 - 前記エステラーゼが以下の特徴を更に備える、請求項6に記載の分解方法:
(6)アルコール安定性:アルコール濃度が40%以下であれば、8日間、30℃で処理しても失活しない。 - 前記飲料がアルコール飲料である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の分解方法。
- 前記アルコール飲料が、紹興酒、核果を原料とした蒸留酒、ウイスキー、ブランデー、テキーラ、カシャッサ、焼酎、清酒、ワイン、酒精強化ワイン、梅酒、シェリー酒又は混成酒である、請求項8に記載の分解方法。
- 配列番号1のアミノ酸配列と70%以上同一のアミノ酸配列からなるエステラーゼによる処理工程を含む、カルバミン酸エチルが除去又は低減された食品又は飲料の製造方法。
- 前記エステラーゼが、請求項2〜7のいずれか一項において定義されたエステラーゼである、請求項10に記載の製造方法。
- 前記飲料がアルコール飲料である、請求項10又は11に記載の製造方法。
- 前記アルコール飲料が、紹興酒、核果を原料とした蒸留酒、ウイスキー、ブランデー、テキーラ、カシャッサ、焼酎、清酒、ワイン、酒精強化ワイン、梅酒、シェリー酒又は混成酒である、請求項12に記載の製造方法。
- 請求項10〜13のいずれか一項に記載の製造方法で得られた、カルバミン酸エチルが除去又は低減された食品又は飲料。
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