CN113999796B - 一种提高海洋玫瑰杆菌的通用分离培养基及其应用 - Google Patents

一种提高海洋玫瑰杆菌的通用分离培养基及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113999796B
CN113999796B CN202111376170.6A CN202111376170A CN113999796B CN 113999796 B CN113999796 B CN 113999796B CN 202111376170 A CN202111376170 A CN 202111376170A CN 113999796 B CN113999796 B CN 113999796B
Authority
CN
China
Prior art keywords
marine
rose
culture medium
bacilli
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111376170.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113999796A (zh
Inventor
俞晶
邵欧文
吴哲毅
黄孝君
杨丽雯
刘俊江
张晓玲
杨桥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Ocean University ZJOU
Original Assignee
Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Ocean University ZJOU filed Critical Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority to CN202111376170.6A priority Critical patent/CN113999796B/zh
Publication of CN113999796A publication Critical patent/CN113999796A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113999796B publication Critical patent/CN113999796B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种提高海洋玫瑰杆菌可培养性的通用型分离培养基，属于海洋微生物技术领域。具体的培养基配方为：苹果酸0.15g，β‑羟基‑丁酸0.1g，乙酸钠0.15g，甲酸铵0.1g，丙酸铵0.2g，酵母粉0.1g，维生素B12 0.001g，NaCl 5g，天然海水1 L，pH7.0‑7.2。本发明所设计的培养基（RM）配方可提高海洋玫瑰杆菌的可培养性，适合于海洋玫瑰杆菌细菌的分离培养，也可用于划线纯化。本发明丰富了海洋玫瑰杆菌分离筛选的方法和途径的多样性，一定程度上提高了海洋稀有玫瑰杆菌的可培养性，同时在实践操作过程中可行性强，培养基成分易得，其价格低。

Description

一种提高海洋玫瑰杆菌的通用分离培养基及其应用
技术领域
本发明提供了一种提高海洋玫瑰杆菌可培养性的通用分离培养基，属于海洋微生物技术领域。
背景技术
海洋玫瑰杆菌属于α-变形菌纲，在海洋中丰度较高（约占整个浮游细菌群落15%-25%）。分布极为广泛，从近海到外海、从海水表层到海底、从热带到极地海洋，几乎无处不在。常常与海洋浮游植物、藻、动物等形成共生体。具有多样化的生理代谢功能(如好氧不产氧光合作用、一氧化碳氧化、硫化物降解等)，在海洋碳、硫循环和全球气候调节中发挥重要功能。是研究海洋细菌生理生态功能的重要模式生物。可高效降解芘、萘和荧蒽等多环芳烃类化合物。可产生多种生物活性物质，是开发海洋天然活性产物的重要微生物资源。
尽管已开发了一系列不依赖于微生物纯培养的分子生物学方法，用于微生物多样性研究。但是，微生物的生理特征和代谢功能研究的首要前提是必须分离获得其微生物的纯培养物。
目前，通常用于海洋细菌分离培养的海洋2216培养基，虽然长期应用于海洋细菌分离实践，但已很难再分离出稀有玫瑰杆菌新物种，其分离效果有待于进一步提高。研发特殊的细菌培养基配方，对于提高海洋玫瑰杆菌的可培养性至关重要。
发明内容
本发明提供了一种提高海洋玫瑰杆菌可培养性的通用分离培养基，本发明所设计的培养基配方可提高海洋玫瑰杆菌的可培养性，适合于海洋玫瑰杆菌细菌的分离培养，也可用于划线纯化。本发明丰富了海洋玫瑰杆菌分离筛选的方法和途径的多样性，一定程度上提高了海洋稀有玫瑰杆菌的可培养性，同时在实践操作过程中可行性强；本发明培养基成分易得，其价格低。
一方面，本发明提供了一种提高海洋玫瑰杆菌的通用分离培养基，具体的培养基配方为 ：苹果酸 0.15g、β-羟基-丁酸 0.1g、乙酸钠0.15g、甲酸铵 0.1g、丙酸铵 0.2g、酵母粉0.1g、维生素B12 0.001g、NaCl 5g，天然海水1L，pH为7.0-7.2。
另一方面，本发明提供了一种提高海洋玫瑰杆菌的通用分离培养基的制备，其包括以下步骤：准确称取以下试剂：苹果酸0.15g、β-羟基-丁酸0.1g、乙酸钠0.15g、甲酸铵0.1g、丙酸铵0.2g、酵母粉0.1g、维生素B12 0.001g、NaCl 5g，加入到1L天然海水中，用1MNaOH或HCl溶液调节pH为7.0±0.2，配制固体培养基时加入15-20 g琼脂，121℃高温蒸汽灭菌25min，备用。
另一方面，本发明提供一种提高海洋玫瑰杆菌的通用分离培养基在海洋玫瑰杆菌分离筛选中的应用。
与现有通用培养基2216培养基相比，本发明具有以下优点：
（1）本发明所设计的培养基配方可提高海洋玫瑰杆菌的可培养性，适合于海洋玫瑰杆菌细菌的分离培养，也可用于划线纯化。该发明丰富了海洋玫瑰杆菌分离筛选的方法和途径的多样性，一定程度上提高了海洋稀有玫瑰杆菌的可培养性，同时在实践操作过程中可行性强。
（2）本发明培养基成分易得，其价格低，具有较好的市场应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明培养基（RM培养基）的制备：准确称取以下试剂：苹果酸0.15g、β-羟基-丁酸0.1g、乙酸钠0.15g、甲酸铵0.1g、丙酸铵0.2g、酵母粉0.1g、维生素B12 0.001g、NaCl 5g，加入到1L天然海水中，用1M NaOH或HCl溶液调节pH为7.0±0.2。配制固体培养基时加入15-20g琼脂。121℃高温蒸汽灭菌25min，备用。
2216培养基的制备：准确称取以下试剂：蛋白胨5.0g、酵母粉1.0g、柠檬酸铁0.1g、氯化钠19.45g、氯化镁5.98g、硫酸钠3.24g、氯化钙1.8g、氯化钾0.55g、碳酸钠0.16g、溴化钾0.08g、氯化锶0.034、硼酸0.022g、硅酸钠0.004g、氟化钠0.0024g、硝酸铵0.0016g、磷酸氢二钠0.008g，溶解于1L天然海水中，调节pH值7.6±0.2。配制固体培养基时加入15-20 g琼脂。121℃高温蒸汽灭菌25min，备用。
F2液体培养基制备：准确称取以下试剂：NaNO3 0.075g、NaH2PO4.2H2O 0.00565g加入到溶解于1L天然海水中，121℃高温蒸汽灭菌25min后。加入1 mL无菌微量元素溶液及1mL无菌复合维生素溶液，调节pH值8.0。
1/2 RM培养基的制备：1/2 RM：所有培养基成分含量为RM培养基的1/2。
1.5RM培养基的制备：所有培养基成分含量为RM培养基的1.5倍。
实施例1
一种提高海洋玫瑰杆菌可培养性的通用型分离培养基RM，所述的测试样品为链状亚历山大藻藻际细菌的分离。所用链状亚历山大藻，编号为GY-H25，购买自上海光语生物科技有限公司，所述的方法包括以下步骤：
（1）藻株的培养：将链状亚历山大藻GY-H25接种于F2培养基，盐度为33‰，培养环境温度设置为23℃，光照/黑暗时间为14/10h，连续培养，按时摇晃。
（2）细菌的分离：取200 mL处于对数生长期的GY-H25藻液于6000 rbp转速下离心收集藻细胞，获得的藻细胞用无菌海水悬浮后，超声波破碎仪破碎海水悬浮后的细胞，用无菌海水依次稀释至10-1、10-2、10-3、10-4 4个浓度梯度，每个浓度梯度吸取100 μL均匀涂布下列四种培养基中：对照培养基2216E、1/2RM、1.5RM及RM固体平板培养基，25℃培养1-2周，从中挑取单菌落，转接于固体斜面，于4℃保存。
（3）分离细菌的分子鉴定：细菌基因组DNA的制备：取待测细菌，分别接种到5 mL下列四种液体培养基中：对照培养基2216E、1/2RM、1.5RM及RM培养基中，接种完成后转入28℃恒温摇床培养3～5 d，细菌DNA提取按照Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒说明书步骤进行操作。PCR通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3’。 PCR扩增体系为50 μL:２×Taq PCR MasterMix 25 μL，引物各1 μL，模板DNA 3 μL，重蒸水20 μL。扩增程序：94℃预变性6 min，94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，共35个循环，最后72℃延伸8 min。PCR产物送测序公司进行测序。所获得的16S rRNA基因序列与Ezbiocloud网站内的细菌模式种数据进行同源性比对，其中16S rRNA基因序列同源性小于分类学规定的细菌新种的阈值98.65%的分离菌株，为细菌新种。
通过表1数据的比较，可明显看出，本发明的RM培养基，在所分离的玫瑰杆菌种类及新种的数量，均显著高于对照2216培养基。
表1
2216培养基 RM培养基 1/2 RM培养基 1.5RM培养基
分离的玫瑰杆菌种类 27±5 42±8 34±7 38±7
分离的玫瑰杆菌新种数量 3±1 10±2 5±3 7±3
备注：细菌种类基于16S rRNA基因测序及同源性比对，数据基于6次平行试验结果；1/2 RM：所有培养基成分浓度为RM的1/2；1.5RM：所有培养基成分浓度为RM的1.5倍。
实施例2
测试样品为南极海水样品，海水样品取自南极地区普里兹湾地区表层海水。
具体方法包括以下步骤：
（1）细菌的分离：取200 mL海水样品，用无菌海水依次稀释至10-1、10-2、10-3、10-4共4个浓度梯度，每个浓度梯度吸取100 μL均匀涂布下列四种培养基中：对照培养基2216E、1/2RM、1.5RM及RM固体平板培养基，20℃培养3-4周，从中挑取单菌落，转接于固体斜面，于4℃保存。
（2）分离细菌的分子鉴定：细菌基因组DNA的制备：取待测细菌，分别接种到5 mL下列四种液体培养基中：对照培养基2216E、1/2RM、1.5RM及RM液体培养基中，接种完成后转入28℃恒温摇床培养3～5 d，细菌DNA提取按照Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒说明书步骤进行操作。PCR通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR扩增体系为50 μL:２×Taq PCR MasterMix 25 μL，引物各1 μL，模板DNA 3μL，重蒸水20 μL。扩增程序：94℃预变性6 min，94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1.5min，共35个循环，最后72℃延伸8 min。PCR产物送测序公司测序。所获16S rRNA基因序列与Ezbiocloud网站数据库中模式细菌的16S数据进行同源性比对，其中16S rRNA基因序列同源性小于分类学规定的细菌新种的阈值98.65%的分离菌株，为细菌新种。
通过表2数据的比较，可明显看出，本发明的RM培养基，在所分离的玫瑰杆菌种类及新种的数量，均显著高于对照2216培养基。
表2
2216培养基 RM培养基 1/2 RM培养基 1.5RM培养基
分离的玫瑰杆菌种类 15±3 27±5 18±6 23±6
分离的玫瑰杆菌新种数量 3±2 8±3 4±1 6±2
备注：细菌种类基于16S rRNA基因测序及同源性比对，数据基于6次平行试验结果；
1/2 RM：所有培养基成分浓度为RM的1/2；1.5RM：所有培养基成分浓度为RM的1.5倍。

Claims (3)

1.一种提高海洋玫瑰杆菌的通用分离培养基，其特征在于所述的培养基配方为 ：苹果酸 0.15g、β-羟基-丁酸 0.1g、乙酸钠0.15g、甲酸铵 0.1g、丙酸铵 0.2g、酵母粉0.1g、维生素B12 0.001g、NaCl 5g，天然海水1L，pH为7.0-7.2。
2.一种提高海洋玫瑰杆菌的通用分离培养基的制备，其特征在于包括以下步骤：准确称取以下试剂：苹果酸0.15g、β-羟基-丁酸0.1g、乙酸钠0.15g、甲酸铵0.1g、丙酸铵0.2g、酵母粉0.1g、维生素B12 0.001g、NaCl 5g，加入到1L天然海水中，用1M NaOH或HCl溶液调节pH为7.0±0.2，配制固体培养基时加入15-20 g琼脂，121℃高温蒸汽灭菌25min，备用。
3.如权利要求1所述一种提高海洋玫瑰杆菌的通用分离培养基在海洋玫瑰杆菌分离筛选中的应用。
CN202111376170.6A 2021-11-19 2021-11-19 一种提高海洋玫瑰杆菌的通用分离培养基及其应用 Active CN113999796B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111376170.6A CN113999796B (zh) 2021-11-19 2021-11-19 一种提高海洋玫瑰杆菌的通用分离培养基及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111376170.6A CN113999796B (zh) 2021-11-19 2021-11-19 一种提高海洋玫瑰杆菌的通用分离培养基及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113999796A CN113999796A (zh) 2022-02-01
CN113999796B true CN113999796B (zh) 2023-08-22

Family

ID=79929600

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111376170.6A Active CN113999796B (zh) 2021-11-19 2021-11-19 一种提高海洋玫瑰杆菌的通用分离培养基及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113999796B (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005185164A (ja) * 2003-12-25 2005-07-14 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 海洋性微生物の培養法
CN101735968A (zh) * 2009-12-29 2010-06-16 中国科学院南海海洋研究所 一种海洋细菌显色分离培养基及其应用
KR20100087496A (ko) * 2009-01-28 2010-08-05 한국과학기술연구원 신규 박테리아 균주 ｋｍｅ―００２ 및 이의 용도
CN101955895A (zh) * 2010-02-09 2011-01-26 浙江工业大学 玫瑰杆菌及其在制备琼胶寡糖中的应用
CN109722388A (zh) * 2019-03-13 2019-05-07 厦门大学 微藻共栖细菌分离培养基、分离方法以及影响微藻生长的关键细菌高通量筛选方法
CN110283741A (zh) * 2019-06-14 2019-09-27 中国科学院南海海洋研究所 一株具有高效降解多环芳烃功能的玫瑰杆菌及其应用
CN113502241A (zh) * 2021-06-26 2021-10-15 北京大学深圳研究院 一种玫瑰菌及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005185164A (ja) * 2003-12-25 2005-07-14 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 海洋性微生物の培養法
KR20100087496A (ko) * 2009-01-28 2010-08-05 한국과학기술연구원 신규 박테리아 균주 ｋｍｅ―００２ 및 이의 용도
CN101735968A (zh) * 2009-12-29 2010-06-16 中国科学院南海海洋研究所 一种海洋细菌显色分离培养基及其应用
CN101955895A (zh) * 2010-02-09 2011-01-26 浙江工业大学 玫瑰杆菌及其在制备琼胶寡糖中的应用
CN109722388A (zh) * 2019-03-13 2019-05-07 厦门大学 微藻共栖细菌分离培养基、分离方法以及影响微藻生长的关键细菌高通量筛选方法
CN110283741A (zh) * 2019-06-14 2019-09-27 中国科学院南海海洋研究所 一株具有高效降解多环芳烃功能的玫瑰杆菌及其应用
CN113502241A (zh) * 2021-06-26 2021-10-15 北京大学深圳研究院 一种玫瑰菌及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113999796A (zh) 2022-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yadav et al. Culturable diversity and functional annotation of psychrotrophic bacteria from cold desert of Leh Ladakh (India)
Guo et al. Application potential of a newly isolated indigenous aerobic denitrifier for nitrate and ammonium removal of eutrophic lake water
Behera et al. Isolation and characterization of Sulphur oxidizing bacteria from mangrove soil of Mahanadi river delta and their Sulphur oxidizing ability
CN109355223B (zh) 一株具有氨氮降解功能的枯草芽孢杆菌n2及其应用
WO2020134728A1 (zh) 嗜盐反硝化菌yl5-2及其应用
CN110452837B (zh) 一株降解氨氮的漳州芽孢杆菌及其应用
Boujelben et al. Diversity of cultivable halophilic archaea and bacteria from superficial hypersaline sediments of Tunisian solar salterns
CN106635904B (zh) 一种具有降解苯胺能力的鞘氨醇杆菌及其应用
CN110283741A (zh) 一株具有高效降解多环芳烃功能的玫瑰杆菌及其应用
Hong et al. Geosporobacter ferrireducens sp. nov., an anaerobic iron-reducing bacterium isolated from an oil-contaminated site
Kamako et al. Establishment of axenic endosymbiotic strains of Japanese Paramecium bursaria and the utilization of carbohydrate and nitrogen compounds by the isolated algae
Irgens et al. Gas vacuolate bacteria obtained from marine waters of Antarctica
Thabet et al. Desulfovibrio legallis sp. nov.: a moderately halophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from a wastewater digestor in Tunisia
CN113999796B (zh) 一种提高海洋玫瑰杆菌的通用分离培养基及其应用
CN103387947B (zh) 假单胞菌jy-q菌株及其用于降解再造烟叶浓缩液中尼古丁的应用
CN109423456B (zh) 一种圆褐固氮菌及其鉴定方法和应用
Rfaki et al. Phosphate-solubilizing bacteria in the rhizosphere of some cultivated legumes from Meknes region, Morocco
CN104974969B (zh) 一种降解pfoa菌株yab‑1及其应用
Podgorsek et al. Cultured and genetic diversity, and activities of sulfur-oxidizing bacteria in low-temperature hydrothermal fluids of the North Fiji Basin
Kim et al. Abyssisolibacter fermentans gen. nov. sp. nov., isolated from deep sub-seafloor sediment
Scuvée et al. Consortia cultivation of the Desulfobacterota from macrophyte periphyton: tool for increasing the cultivation of microorganisms involved in mercury methylation
JP2019509757A (ja) 環境試料から培養された微生物の増加した効率及び多様性
Van Le et al. Panacibacter microcysteis sp. nov., isolated from a eutrophic reservoir during the Microcystis bloom period
Baek et al. Paenibacillus arenosi sp. nov., a siderophore-producing bacterium isolated from coastal sediment
Sahin et al. Taxonomy of oxalotrophic Methylobacterium strains

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant