CN110172421A - 一株枯草芽孢杆菌sl-3a、烟草秸秆降解菌剂及制备方法和应用 - Google Patents

一株枯草芽孢杆菌sl-3a、烟草秸秆降解菌剂及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SL‑3A及其应用，属于微生物技术领域。本发明所述枯草芽孢杆菌SL‑3A，保藏编号为GDMCC NO:60629。本发明所述枯草芽孢杆菌SL‑3A不仅降解纤维素功能强大，还具有解磷解钾的功能。

Description

一株枯草芽孢杆菌SL-3A、烟草秸秆降解菌剂及制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌SL-3A、烟草秸秆降解菌剂及制备方法和应用。
背景技术
农作物废弃物数量大、分布广，若不加以合理处置、利用，不仅是一种资源浪费，还会对环境产生严重的污染。合理开发利用农业废弃物资源有利于人与自然和谐发展，既可减少农业面源污染，又可改善农村环境条件，提高农民生活质量。
随着人们环保意识的增强和国家大力倡导环境保护，人们在农业生产方面逐步减少化肥的使用，开始探索有机农业的发展，建立绿色环保型食品安全工程体系。现有的纤维素降解菌剂只能降解秸秆中的纤维素，制作堆肥完成后，细菌还没有完全杀死，如若后期处理不当，会造成细菌污染，所述筛选的枯草芽孢杆菌不能具有强大的纤维素降解能力，还能在后期释放出土壤中的钾与磷元素，具有很好的应用前景。但是，目前还未有从烟草秸秆废弃物中发现生物功能全面的纤维素降解菌的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一株枯草芽孢杆菌SL-3A、烟草秸秆降解菌剂及制备方法和应用。本发明所述枯草芽孢杆菌SL-3A不仅降解纤维素功能强大，还能解磷解钾的功能。
本发明提供了一株枯草芽孢杆菌SL-3A，保藏编号为GDMCC NO: 60629。
优选的是，所述枯草芽孢杆菌SL-3A的16S基因序列如SEQ ID NO.1 所示。
本发明还提供了上述技术方案所述枯草芽孢杆菌SL-3A在降解纤维素中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述枯草芽孢杆菌SL-3A在解磷中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述枯草芽孢杆菌SL-3A在解钾中的应用。
本发明还提供了一种烟草秸秆降解菌剂，所述烟草秸秆降解菌剂包括上述技术方案所述枯草芽孢杆菌SL-3A。
本发明还提供了上述技术方案所述烟草秸秆降解菌剂的制备方法，包括以下步骤：将所述枯草芽孢杆菌SL-3A接种于羧甲基纤维素钠发酵培养基中进行发酵培养2～4d，得到降解烟草秸秆菌剂。
优选的是，所述羧甲基纤维素钠发酵培养基以蛋白胨为唯一氮源、羧甲基纤维素钠为唯一碳源，所述唯一碳源与唯一氮源的C/N比为2:1。
优选的是，所述枯草芽孢杆菌SL-3A的接种体积分数为6～10％；所述发酵培养的温度为25～45℃，pH值为6.0～8.0，所述发酵培养还包括搅拌，所述搅拌的转速为180～200rpm。
本发明还提供了上述技术方案所述枯草芽孢杆菌SL-3A或上述技术方案所述烟草秸秆降解菌剂或上述技术方案所述制备方法得到的烟草秸秆降解菌剂在制备烟草秸秆堆肥中的应用。
本发明提供了一株枯草芽孢杆菌SL-3A及其和应用。本发明所述枯草芽孢杆菌SL-3A不仅降解纤维素功能强大，还能解磷解钾的功能，本发明所述枯草芽孢杆菌SL-3A制备得到的烟草秸秆降解菌剂能够降解秸秆，所述烟草秸秆降解菌剂制备的烟草秸秆堆肥能够提高土壤中的磷元素与钾元素含量。试验结果表明，本发明所述枯草芽孢杆菌SL-3A在纤维素降解试验中， CMCase在第3d达到最高为96.98U/mL，FPase在第3d达到最高为 70.43U/mL；在解磷试验中，菌株SL-3A在无机磷和有机磷培养基平板上都呈现出明显的解磷圈；在解钾试验中，SL-3A株解钾能力良好。
附图说明
图1为本发明提供的系统发育树结果图；
图2为本发明提供的SL-3A菌株在刚果红培养基上的水解效果图；
图3为本发明提供的SL-3A纤维素酶活的测定结果图；
图4为本发明提供的培养转速对酶活力的影响结果图；
图5为本发明提供的培养温度对酶活力的影响结果图；
图6为本发明提供的接种量对酶活力的影响结果图；
图7为本发明提供的pH值对酶活力的影响结果图；
图8为本发明提供的氮源处理组对酶活力的影响结果图；
图9为本发明提供的碳源处理组对酶活力的影响结果图；
图10为本发明提供的碳氮比对酶活力的影响结果图。
生物保藏信息
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，菌株编号为SL-3A，保藏地点为广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏时间为2019年4月11日，保藏编号为GDMCC NO:60629。
具体实施方式
本发明提供了一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis SL-3A，保藏编号为 GDMCCNO:60629。在本发明中，所述枯草芽孢杆菌SL-3A的16S基因序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述枯草芽孢杆菌SL-3A筛选自烟草秸秆废弃物。本发明采用 BLASTN软件和EZbiocloud网站对SL-3A菌株的16S rDNA部分序列进行同源性比对，并用Mega 5.0构建系统发育树，如图1所示。结果显示：在数据库中，这株细菌能找到同源性很高的序列，基于比对所得的基因序列构建系统发育树，综合所得结果，SL-3A菌株为枯草芽孢杆菌。
本发明还提供了上述技术方案所述枯草芽孢杆菌SL-3A在降解纤维素中的应用。纤维素的资源化有助于解决能源危机，利用枯草芽孢杆菌SL-3A 来处理纤维素可减轻环境污染和实现资源再利用。
本发明还提供了上述技术方案所述枯草芽孢杆菌SL-3A在解磷中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述枯草芽孢杆菌SL-3A在解钾中的应用。
本发明还提供了一种烟草秸秆降解菌剂，所述烟草秸秆降解菌剂包括上述技术方案所述枯草芽孢杆菌SL-3A。
本发明还提供了上述技术方案所述烟草秸秆降解菌剂的制备方法，包括以下步骤：将所述枯草芽孢杆菌SL-3A接种于羧甲基纤维素钠发酵培养基中进行发酵培养2～4d，得到降解烟草秸秆菌剂。在本发明中，所述羧甲基纤维素钠发酵培养基优选以蛋白胨为唯一氮源、羧甲基纤维素钠为唯一碳源，所述唯一碳源与唯一氮源的C/N比为2:1。在本发明中，所述枯草芽孢杆菌 SL-3A的接种体积分数优选为6～10％，更优选为8％；所述发酵培养的温度优选为25～45℃，更优选为37℃，pH值优选为6.0～8.0，更优选为7，所述发酵培养还包括振荡，所述振荡的转速为180～220rpm，更优选为200rpm。
本发明还提供了上述技术方案所述枯草芽孢杆菌SL-3A或上述技术方案所述烟草秸秆降解菌剂或上述技术方案所述制备方法得到的烟草秸秆降解菌剂在制备烟草秸秆堆肥中的应用。在本发明中，所述应用优选包括以下步骤：将烟草秸秆降解菌剂施于烟草秸秆上，调节含水量为50～60％，开始堆肥；所述堆肥条件为：自然通风，待堆体温度升至70℃时，4-5天翻堆一次；堆体温度降至50℃及以下时，每隔2天翻堆一次；当堆体温度降至40℃以下并不再上升时，停止翻堆，当碳元素和氢元素的质量比小于20时，完成堆肥。
下面结合具体实施例对本发明所述的一株枯草芽孢杆菌SL-3A、烟草秸秆降解菌剂及制备方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
SL-3A降解纤维素能力测定
1.1实验材料
1.1供试菌株
将从烟草秸秆废弃物中筛选的菌株：SL-3A作为实验材料。
1.2培养基
(1)菌株纯化常用培养基
LB培养基、LB液体培养基；
(2)降解纤维素酶筛选培养基
羧甲基纤维素钠培养基(g/L)：MgSO4·7H2O 0.1，KH2PO4 0.5，CaCl2 0.1， K2HPO42，羧甲基纤维素钠10，(NH4)2SO4 2，琼脂18，pH 7.0～7.4；
羧甲基纤维素酶活(CMCase)检测培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉浸粉10，氯化钠1.5，羧甲基纤维素钠10，KH2PO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.3，pH 7.0；
滤纸酶活(FPase)检测培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，氯化钠 1.5，滤纸0.05，KH2PO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.3，pH 7.0。
1.3主要试剂
(1)纤维素酶活测定所需试剂
刚果红溶液(1mg/mL)：称取1g刚果红定容至1000mL，4℃冰箱保存备用。
氯化钠溶液(1mol/L)：称取58.5g氯化钠定容至1000mL，4℃冰箱保存备用。
缓冲溶液：配取50mL缓冲溶液以0.2mol/L醋酸钠溶液与0.2mol/L 醋酸溶液分别量取35.2mL和14.8mL。
DNS试剂：称取6.3g 3,5—二硝基水杨酸，21.0g NaOH于500mL烧杯中，用少量蒸馏水溶解,以及500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液，再加入5g苯酚和5g无水亚硫酸钠，最后定容至1000mL，装入棕色试剂瓶中，保存一星期稳定后备用。
羧甲基纤维素钠底物溶液(0.5％)：5g羧甲基纤维素钠溶于1000mL 缓冲溶液中，备用。
滤纸底物溶液：在2mL缓冲溶液中加入0.03g滤纸。
1.4试验方法
(1)平板定性测定
将单菌落分别点种在羧甲基纤维素钠培养基上，细菌27℃培养3d。用1mg/mL刚果红染色15min，倾去染液，再加入lmol/L的氯化钠溶液漂洗，15min后倒掉氯化钠溶液，测透明圈的直径与菌落直径，通过透明圈直径与菌落直径比值的大小比较菌株纤维素降解能力的强弱。
(2)纤维素酶活的测定
DNS法测定葡萄糖吸光值，以OD530为横坐标、葡萄糖量(mg/mL) 为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线，得回归方程y＝0.452x+0.016，R2＝0.9916。将抑菌率较高的菌株接种CMCase检测培养基及FPase检测培养基，于 28℃、160r/min分别振荡培养1、2、3、4、5、6、7d，5000r/min离心10 min，取上清液分别检测羧甲基纤维素钠酶活及FPase酶活。酶活力单位的定义：以每毫升发酵上清液酶促反应30min释放1μg葡萄糖的量为一个酶活单位(U)。
CMCase测定：将1mL发酵上清液加入1mL 1％羧甲基纤维素钠溶液 (以0.2mol/LpH4.8的乙酸缓冲液配制)中，以沸水灭活10min的发酵上清液为对照，充分混匀后50℃酶促反应30min，取出后迅速加入DNS试剂3mL，置于沸水浴显色10min，流水冷却至室温，再用去离子水定容至 25mL，摇匀，用对照管调零，测定530nm吸光值，根据葡萄糖标准曲线计算还原糖的量。
FPase测定：将1mL发酵上清液加入1mL 0.2mol/LpH4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液中，并加入新华滤纸条(6cm×1cm)，滤纸条浸泡于液体中混匀， 50℃酶促反应30min，以沸水灭活10min的发酵上清液为对照，DNS法测定还原糖生成量。
1.5结果与分析
(1)平板定性测定结果如表1所示，SL-3A菌株在刚果红培养基上的水解效果如图2所示。
表1纤维素降解菌透明圈直径与菌落直径比值
该株细菌可在羧甲基纤维素钠培养基上生长，经刚果红染色后产生明显的纤维素降解圈，结果见图2，培养4d后降解圈直径与菌落直径的比值较大的细菌SL-3A(7.52±0.35)。再以SL-3A去测定纤维素酶活。
(2)以SL-3A纤维素酶活的测定结果如图3所示。
该株细菌在CMCase和FPase培养基培养中，菌株SL-3A发酵液上清液的CMCase和FPase均随着时间的增加呈先升后降的趋势，CMCase在第 3d达到最高为96.98U/mL，FPase在第3d达到最高为70.43U/mL。
实施例2
SL-3A菌株促生功能研究
本实施例通过SL-3A溶磷、解钾实验进行研究。
2.1材料
2.1.1供试菌株
细菌SL-3A由阜阳师范学院微生物实验室提供。
2.1.2培养基
(1)菌株纯化常用培养基
LB培养基、LB液体培养基；
(2)解磷效果测定培养基
有机磷固体培养基(g/L)：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5，NaCl 0.3，KCl 0.3，MgSO4·7H2O 0.3，FeSO4·7H2O 0.03，MnSO4·4H2O 0.03，CaCO3 5，卵磷脂2，琼脂20，pH为7.0～7.5。
有机磷液体培养基(g/L)：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g， KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.03g， CaCO35g，卵磷脂2g，pH为7.0～7.5。(实验时用新鲜蛋黄液代替卵磷脂，每50mL加入新鲜蛋黄液3mL，蛋黄液与0.9％的生理盐水等比例配制。)
无机磷固体(液体)培养基(g/L)：葡萄糖10，(NH4)2SO4 0.5，NaCl 0.3，KCl 0.3，MgSO4·7H2O 0.3，FeSO4·7H2O 0.03，MnSO4·4H2O 0.03， Ca3(PO4)25，琼脂20，pH为7.0～7.5，不加琼脂即为液体培养基。
(3)解钾效果测定培养基
解钾菌分离培养基(g/L)：蔗糖0.75，(NH4)2S04 0.15，Na2HP04 O.30， MgS040.075，钾长石粉10，琼脂20，pH为7.0～7.5。
解钾液体发酵培养基(g/L)：蔗糖10，MgSO4·7H2O 0.5，CaCO3 1.0， (NH4)2SO41.0，NaCl 0.1，酵母膏0.5，Na2HPO4 2.0，钾长石粉10，pH为7.4。
2.1.3主要试剂
(1)解磷效果测定所需试剂
酒石酸锑钾溶液(0.5％)：称取0.5g酒石酸锑钾固体加入到100mL蒸馏水中，搅拌，混匀即可。
钼锑抗贮存液：浓硫酸153mL缓慢地倒入置有约400mL蒸馏水的烧杯中，搅拌，冷却。10g钼酸铵溶解于约60℃的300mL蒸馏水中，冷却。然后将浓硫酸溶液倒入钼酸铵溶液中，再加入100mL0.5％酒石酸锑钾(KSB， C4H4O6·1/2H2O)溶液，最后用蒸馏水定容至1L，避光保存。
钼锑抗显色剂：1.5g抗坏血酸(C6H8O6，左旋)溶于100mL钼锑抗贮存液中。
(2)解钾效果测定所需试剂
四苯硼酸钠溶液：取15g溶于960mL水中，加4mL NaOH溶液(400g/L) 和20mL MgCl2溶液(100g/L)，搅拌15min，静置24小时后过滤。
2.2方法
2.2.1 SL-3A解磷能力测定
(1)平板定性测定
将单菌落分别点种在解磷菌分离培养基上，37℃培养3d。观察透明圈产生的情况，测量并记录解磷透明圈直径(D)。
(2)定量测定可溶性磷的含量
采用钼锑抗比色法，测定SL-3A培养液中水溶性磷含量。用可见光分光光度计在波长720nm处测定吸光值，以定量分析可溶性磷的含量。
磷标准曲线绘制：在容量瓶中分别加入相应体积的100mg/L的标准磷溶液，加2滴2，6一二硝基苯酚作指示剂，用稀硫酸和10％的NaOH溶液调节pH值，加铝锑抗显色剂5mL，定容至刻度，使标准磷浓度分别为0、 0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mg/L，摇匀，在室温下(25℃左右)反应30min后用紫外分光光度计在720nm处比色，根据结果绘制标准曲线。
培养液中可溶磷含量的测定：将SL-3A接种到50mL有机磷(或无机磷) 液体培养基中，以不接菌作对照，摇床转速为150r/min，28℃培养3d。培养液转移至无菌的50mL离心管中，采用数控超声波清洗器进行超声波细胞破碎，破碎20min，使之释放出细胞内的有效磷，以4000r/min的转速离心20min 后取2.5mL上清液于50mL容量瓶中加2滴2，6-二硝基苯酚作指示剂，加一滴稀硫酸至反应液为无色，加钼锑抗显色剂5mL，定容，反应。用紫外分光光度计测定上清液于720nm处的OD值。根据标准曲线得出上清液中的有效磷含量。
2.2.2 SL-3A解钾能力测定
(1)平板定性测定
将SL-3A菌株接种到以钾长石为唯一钾源的解钾菌分离培养基上，放置于37℃恒温培养箱中培养数天，且每天观察。能生长视为有解钾活性，称其相应的菌株为解钾菌。
(2)定量测定可溶性钾的含量
采用四苯硼钠法，进行供试菌株培养液中水溶性钾含量的测定，确定供试菌株的解钾能力。
钾标准曲线的绘制：分别吸取氯化钾标准溶液0、1、2、4、6、8、10mL 于25mL容量瓶中，加入1mL甲醛-EDTA掩蔽剂，摇匀，用移液管快速准确加入1mL四苯硼钠溶液，立即摇匀，放置15min后再次摇匀，于420nm 波长进行比色，相应的标准溶液浓度为0、5、10、15、20、25、30mg/L氯化钾。以透光度为横坐标，钾浓度为纵坐标，绘成标准曲线。
对SL-3A进行液体培养：在250mL三角瓶中装50mLLB液体培养液，用接种环将KSB从斜面接种至培养液中过夜摇床培养作为种子液，将种子液按4％接种量接种到解钾液体发酵培养基，每菌株接种3瓶，设置一个 E.coli作为阴性对照，每个处理设3次重复，设加等量灭活种子液的对照处理，于28℃、160r/min培养7d。10000×g离心20min，取上清液，用四苯硼钠法测定钾含量，以高于对照钾含量为标准菌株进行复筛。
2.3结果与分析
2.3.1 SL-3A解磷能力测定结果如表2所示。
表2 SL-3A解磷能力测定
测定SL-3A培养液中水溶性磷含量。用紫外分光光度计在波长720nm 处测定的吸光值，以定量分析可溶性磷的含量。从解磷培养基平板来看，菌株SL-3A在无机磷和有机磷培养基平板上都呈现出明显的解磷圈，菌株 SL-3A具有解磷能力。
2.3.2 SL-3A解钾能力测定结果如表3所示。
表3 SL-3A解钾能力测定
菌株编号 平均OD值 钾含量mg/L
SL-3A 1.969 28.93
CK 0.683 6.76
将SL-3A接种到发酵培养基上，测定释钾效能，发现对照组大肠杆菌未见其生长，而所SL-3A菌株具有一定的分解钾长石的能力，说明具有解钾菌的特性，从表3中有效钾含量的数据看出SL-3A株解钾能力良好，而接种大肠杆菌的对照组为6.76mg/L；结果见表3。
2.4小结与讨论
本实施例发现SL-3A菌株还具有解磷、解钾等功能特性。该菌不仅能降解纤维素，还可以活化作物根际土壤中被固定的磷素和钾素。
实施例3
SL-3A培养条件的优化
3.1.1培养转速
为测定氧气含量对菌株产酶的影响，分别设定摇床转速为140rpm、 160rpm、180rpm、200rpm和220rpm，按照4％接种量(每100mL羧甲基纤维素钠发酵产酶培养基中接入4mL菌悬液)接种于100mL发酵产酶培养基中。在37℃件下摇床振荡培养，并在第3天测定CMCase、FPase。
3.1.2培养温度
为测定温度对菌株产酶的影响，分别设定摇床温度为28℃、37℃、46℃、 55℃和60℃，按照4％接种量(每100mL羧甲基纤维素钠发酵产酶培养基中接入4mL菌悬液)，接种于100mL发酵产酶培养基中。在转速为200转条件下摇床振荡培养，并在第3天测定CMCase、FPase。
3.1.3接种量
分别设定接种量为2％、4％、6％、8％、10％和12％(每100mL羧甲基纤维素钠发酵产酶培养基中分别接入2mL、4mL、6mL、8mL、10mL、12mL 菌悬液)接种于100mL羧甲基纤维素钠发酵产酶培养基中。在37℃、200rpm 条件下摇床振荡培养，并在第3天分别测定CMCase、FPase。
3.1.4培养基初始pH
将菌悬液按8％接种量接种于l00mL发酵产酶培养基中，调节发酵产酶培养基初始pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0。在37℃、200rpm条件下摇床振荡培养，并在第3天和测定CMCase、FPase。
测定结果如图4～7所示，图4为培养转速对酶活力的影响结果图；图5 为培养温度对酶活力的影响结果图；图6为接种量对酶活力的影响结果图；图7为pH值对酶活力的影响结果图。由图可以看出，随着发酵液转速的增加，菌株产酶活性呈现先上升后趋于平衡的变化趋势,发酵液转速为200时 FPase与CMCase最高，为126.48U/mL和40.19U/ml，综上，该菌的最适产酶转速为180r/min，最佳产酶转速范围为180r/min～200r/min。其次由图看出，随着发酵液温度增加，菌株产酶活性呈现先上升后下降并最终趋于平衡的变化趋势。发酵液温度为37℃时CMCase与FPase最高，为39.85U/mL 与133.85U/mL，温度为60℃时出现产酶最低值，为1.48U/mL和2.95U/mL；综上，该菌的最适产酶温度为37℃，最佳产酶温度范围为25℃-45℃。接种体积为8％时，出现最高值为87.76U/mL和149.34U/mL，接种体积为2％时出现产酶最低值，为44.62U/mL和92.92U/mL；综上，该菌的最适产酶接种体积为8％，最佳产酶接种体积范围为6％～10％。由图看出，随着发酵液温度增加，菌株产酶活性呈现先上升后下降并最终趋于平衡的变化趋势。由图看出，随着发酵液PH增加，菌株产酶活性呈现先上升后下降并最终趋于平衡的变化趋势。发酵液PH为7时CMCase与FPase最高，为79.65U/mL 和85.28U/mL，PH为9时出现产酶最低值，为15.11U/mL和60.47U/mL；综上，该菌的最适产酶PH为7，最佳产酶PH范围为6～8。
结合不同培养条件pH、接种体积、转速和温度对SL-3A产酶的影响，可知，该菌的最适产酶培养环境条件为：pH7.0、接种体积8％、转速200r/min 和温度37℃。
培养基质的优化
3.2.1氮源
为测定不同氮源对菌株产酶的影响，分别设定氮源为0.4％蛋白胨、0.4％硫酸铵和0.4％尿素，并将菌悬液按8％接种量接种于100mL羧甲基纤维素钠发酵产酶培养基中。在37℃，200rpm条件下摇床振荡培养，并在第3 天分别测定CMCase、FPase。
3.2.2碳源
为测定不同碳源对菌株产酶的影响，分别设定碳源为0.5％葡萄糖、0.5％羧甲基纤维素钠和1％烟草秸秆粉末(0.5％可溶性碳源或l％不可溶性碳源)，并将菌悬液按8％接种量接种于100mL羧甲基纤维素钠发酵产酶培养基中。在37℃，200rpm条件下摇床振荡培养，并在第3天分别测定CMCase、 FPase。
3.2.3碳氮比
为测定不同碳氮比对菌株产酶的影响，选取上述实验中优化出的最适碳源和最适氮源，分别设定碳氮比为2:1、1:1和1:2，并将菌悬液按8％接种量接种于100mL发酵产酶培养基中。在37℃、200rpm条件下摇床振荡培养，并在第3天测定CMCase、FPase。
氮源处理组对酶活力的影响结果如图8所示。蛋白胨处理中，CMCase 和FPase可分别达到150.44U/mL、89.97U/mL：硫酸铵处理中，CMCase和 FPase可分别达到93.66U/mL、27.65U/mL：尿素处理中，CMCase和FPase 可分别达到43.51U/mL、23.23U/mL。蛋白胨处理中的CMCase和FPase相较于尿素和硫酸铵都要高，由此可见蛋白胨可促进菌株产酶，而尿素和硫酸铵均对菌株产酶产生了不同程度的抑制作用，故选取蛋白胨作为培养基质中唯一氮源时更有利于SL-3A产酶。
碳源处理组对酶活力的影响结果如图9所示。在羧甲基纤维素钠处理中， CMCase和FPase可分别达到154.50U/mL和93.66U/mL；烟草秸秆粉末处理中.CMCase和FPase可分别达到123.90U/mL与60.10U/mL；葡萄糖处理中，CMCase和FPase可分别达到100.65U/mL、52.65U/mL。羧甲基纤维素钠处理中的CMCase和FPase相较于烟草秸秆粉末和葡萄糖都要高，由此可见羧甲基纤维素钠可促进菌株产酶.而烟草秸秆粉末和葡萄糖均对菌株产酶产生不同程度的抑制作用，故选取羧甲基纤维素钠作为培养基质中唯一碳源时更有利于SL-3A产酶。
碳氮比对酶活力的影响结果如图10所示。在C/N为2:1处理中，CMCase 和FPase可分别达到169.25U/mL、44.99U/mL：C/N为1:1处理中，CMCase 和FPase可分别达到148.97U/mL、97.35U/mL：C/N为1:2处理中，CMCase 和FPase可分别达到133.48U/mL、112.83U/mL。C/N为2:1处理中的CMCase 相较于C/N为1:1和C/N为1:2都要高，由此可见C/N为2:1可促进菌株产酶，而C/N为1:1和C/N为1:2均对菌株产酶产生了不同程度的抑制作用，故选取C/N为2:1时更有利于SL-3A产酶。
实施例4
菌剂的构建及其在堆肥中的应用
1、烟草秸秆高效菌剂的构建
将SL-3A接种于蛋白胨作为培养基质中唯一氮源、羧甲基纤维素钠作为培养基质中唯一碳源和C/N为2:1羧甲基纤维素钠发酵培养基中，在最适产酶培养环境条件为：pH7.0、接种体积8％、转速200r/min、温度37℃培养 3d，构建烟草秸秆高效降解菌剂。
2、堆制烟草秸秆堆肥
2.1菌剂的添加
将菌剂添加到喷壶中。然后把烟草秸秆堆肥原料摊开，再用喷壶把菌剂按照与烟草秸秆堆肥原料5：100的质量配比均匀喷洒在摊开的烟草秸秆堆肥原料表面。喷洒完毕后.再搅拌均匀，并调节混合物含水率为50％—60％，开始堆肥。
2.2堆体堆制
将投加完菌剂的堆肥原料填充到简易堆肥装置中，堆制成高约0.56m、体积约60L的堆体。在堆制过程中。每日定时监测堆体温度，测温点位于堆体中部。自然通风，待堆体温度升至70℃左右时.进入前腐熟阶段，4-5天翻堆一次。至堆体温度降至50℃及以下，每隔2天翻堆一次，至堆体温度降至40’C以下并不再上升时，停止翻堆。待堆体进入后腐熟阶段，每日定时监测堆体中碳元素和氨元素的质量比，当碳元素和氢元素的质量比小于20 时，则表明后腐熟阶段完成，整个堆制过程也随之结束。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 阜阳师范学院
<120> 一株枯草芽孢杆菌SL-3A、烟草秸秆降解菌剂及制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 873
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgagcggac agatgggagc ttgctccctg atgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt 60
gggtaacctg cctgtaagac tgggataact ccgggaaacc ggggctaata ccggatggtt 120
gtttgaaccg catggttcaa acataaaagg tggcttcggc taccacttac agatggaccc 180
gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag gcaacgatgc gtagccgacc 240
tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc 300
agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa 360
ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag ggaagaacaa gtaccgttcg aatagggcgg 420
taccttgacg gtacctaacc agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat 480
acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa gggctcgcag gcggtttctt 540
aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc ggggagggtc attggaaact ggggaacttg 600
agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg 660
aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc tgtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg 720
ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt 780
agggggtttc cgccccttag tgctgcagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac 840
ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga cgg 873

Claims (10)

1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SL-3A，保藏编号为GDMCC NO:60629。
2.根据权利要求1所述枯草芽孢杆菌SL-3A，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌SL-3A的16S基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1或2所述枯草芽孢杆菌SL-3A在降解纤维素中的应用。
4.权利要求1或2所述枯草芽孢杆菌SL-3A在解磷中的应用。
5.权利要求1或2所述枯草芽孢杆菌SL-3A在解钾中的应用。
6.一种烟草秸秆降解菌剂，其特征在于，所述烟草秸秆降解菌剂包括权利要求1或2所述枯草芽孢杆菌SL-3A。
7.权利要求6所述烟草秸秆降解菌剂的制备方法，包括以下步骤：将所述枯草芽孢杆菌SL-3A接种于羧甲基纤维素钠发酵培养基中进行发酵培养2～4d，得到降解烟草秸秆菌剂。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述羧甲基纤维素钠发酵培养基以蛋白胨为唯一氮源、羧甲基纤维素钠为唯一碳源，所述唯一碳源与唯一氮源的C/N比为2:1。
9.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌SL-3A的接种体积分数为6～10％；所述发酵培养的温度为25～45℃，pH值为6.0～8.0，所述发酵培养还包括搅拌，所述搅拌的转速为180～200rpm。
10.权利要求1～5任一项所述枯草芽孢杆菌SL-3A或权利要求6所述烟草秸秆降解菌剂或权利要求7～9任一项所述制备方法得到的烟草秸秆降解菌剂在制备烟草秸秆堆肥中的应用。
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