KR101085866B1 - 인산가용화활성을 갖는 신규미생물 글루콘아세토박터 사카리 ｓｐ 131-2 - Google Patents

인산가용화활성을 갖는 신규미생물 글루콘아세토박터 사카리 ｓｐ 131-2 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인산가용화활성을 갖는 신규미생물 글루콘아세토박터 사카리 SP 131-2에 관한 것이다.
본 발명의 신규 미생물 글루콘아세토박터 사카리(Gluconacetobacter sacchari) SP 131-2 균주 KACC91652P는 서열번호 1로 표현되며 토양내 불용성 인산염을 가용화시키는 능력이 우수한 것이 특징이다.
본 발명에 의해, 토양내에 고정된 불용성 인산염을 가용화 시키는 능력이 우수한 신규 미생물인 글루콘아세토박터 사카리 SP 131-2를 제공함으로써 좀 더 효율적인 작물재배를 할 수 있도록 해준다.

Description

인산가용화활성을 갖는 신규미생물 글루콘아세토박터 사카리 ＳＰ 131-2{NEW MICROORGANISM GLUCONACETOBACTER SACCHARI SP 131-2 HAVING SOLUBLE PHOSPHATE ACTIVITY}
본 발명은 인산가용화활성을 갖는 신규미생물 글루콘아세토박터 사카리 SP 131-2에 관한 것으로서, 특히 불용성 인산염을 가용화 시키는 능력이 우수한 신규 미생물 글루콘아세토박터 사카리 SP 131-2에 관한 것이다.
인(phosphorus)은 식물의 생장과 발달을 위해 매우 중요한 필수 영양원소이다. 따라서 농업에 있어서 주요 작물의 수확량이 증가되기 위해서는 식물이 가용할 수 있는 인의 유무가 매우 중요한 조건이 된다.
그러나 토양 내에 존재하는 대부분의 인은 화학적으로 공고하게 결합된 불용성 복합체나 유기적으로 결합된 파이테이트(phytate)와 같은 상태로 존재하여 식물이 전혀 사용할 수 없는 불용성 인산염으로 존재한다
따라서 식물의 생장 저하를 방지하기 위해서는 무기인산비료의 공급이 필요하다. 그러나 무기인산비료를 공급하더라도 공급된 비료 중 75% 이상이 매우 빠르게 알칼리 및 산성 토양 내의 철, 알루미늄 및 칼슘이온 등과 결합하여 식물체가 이용할 수 없는 불용성 인산염의 형태로 전환된다.
이에 따라 농작물의 생산성을 향상시키기 위하여 과도한 무기인산비료를 농토에 공급하는 과도한 시비가 반복된다.
상기와 같은 인산의 과도한 공급은 환경오염을 비롯한 여러 가지 문제를 발생시킨다. 토양에 공급된 무기인산비료는 일부분만이 농작물에 흡수되고 나머지는 수분과 함께 토양 표층으로 이동하면서 수분은 증발하고 염류만 쌓이게 되어 농작물의 생장이 정상적으로 이루어지지 않는 염류장해 토양이 된다. 염류가 과도하게 집적된 토양은 식물의 영양분 흡수와 생육을 방해함으로써 각종 질병 감염 위험을 높이며, 지표수의 부영양화와 지하수의 오염을 초래한다.
이렇게 염류장해가 발생된 토양을 처리하는 방법으로는, 오랜 기간 담수하거나 재배지 토양의 상층부를 객토를 하는 방법이 알려져 있고, 최근에는 인산 가용화 미생물을 토양에 접종하여 토양내 난용성 인산염의 가용화를 촉진시켜 염류장해를 해결하고 작물 생육을 촉진하는 연구도 진행되고 있다.
이러한 목적으로 사용될 수 있는 인산 가용화능이 우수한 미생물로는 판토에아 에그로머란스(Pantoea agglomerans), 엔테로박터 에어로제네스(Enterobacter aerogenes), 크렙시엘라 속(Genus Klebsiella), 페니실리움 옥살리쿰(Penicillium oxalicum), 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) 등 많은 미생물이 알려져있다.
그러나 상기 판토에아 에그로머란스(Pantoea agglomerans), 엔테로박터 에어로제네스(Enterobacter aerogenes) 균주는 제형화가 어렵고 제형화하는 경우에도 외부환경 변화에 생존력이 급격히 저하되는 문제점을 갖고 있다.
또한, 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) 균주의 경우에는 최근 사람에게도 감염을 일으키는 것으로 알려지면서 농업용으로 사용하는데 문제가 있는 것으로 알려졌다
본 발명의 목적은 불용성 인산염을 가용화 시키는 능력이 우수한 신규 미생물 글루콘아세토박터 사카리 SP 131-2를 제공하는데 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한, 본 발명의 신규 미생물 글루콘아세토박터 사카리(Gluconacetobacter sacchari) SP 131-2 균주 KACC91652P는 서열번호 1로 표현되며 토양내 불용성 인산염을 가용화시키는 능력이 우수한 것이 특징이다.
상기 신규 미생물 글루콘아세토박터 사카리(Gluconacetobacter sacchari) SP 131-2 균주 KACC91652P는 토양으로부터 분리되며, 미생물 농약, 종자코팅제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제 중 어느 하나의 유효성분으로 이용된다.
본 발명은 서열번호1로 표현되는 신규 미생물 글루콘아세토박터 사카리(Gluconacetobacter sacchari) SP 131-2 균주 KACC91652P를 사용하여 토양에 고정된 불용성 인산염을 가용화시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 의해, 불용성 인산염을 가용화 시키는 능력이 우수한 신규 미생물인 글루콘아세토박터 사카리 SP 131-2를 제공함으로써 좀 더 효율적인 작물재배를 할 수 있도록 해준다.
도 1은 선발균주의 투명대를 확인한 도면이다.
도 2는 인산가용화능이 있는 균주의 탐색결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 선발균주의 일별 pH, 가용성인산량, 포스파타아제(phosphatase) 변화를 나타낸 그래프이다.
S.P.: 가용성인산량(Soluble Phosphate)
PME : 포스파타아제(phosphatase)
도 4는 염기서열 유사도가 가장 높은 표준균주와 염기서열을 정렬한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 선발균주의 계통분류학적 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸 도면이다.
도 6은 선발균주의 위상차현미경(×1000)사진 및 전자현미경 사진을 나타낸 도면이다.
본 발명자들은 인산염 가용화능이 높은 균주를 선발하기 위하여, 토양으로부터 분리한 미생물을 삼인산칼슘(Ca3(PO4)2)이 포함된 고체배지에 접종하여 배양하였을 때 나타나는 고체배지의 투명환 크기를 분석하여 불용성 인산염의 가용화능이 높은 균주를 선발하였다.
선발된 균주에서 수득한 16S 라이보좀 RNA의 상동성을 비교분석한 바, 글루콘아세토박터 사카리(Gluconacetobacter sacchari)의 신규한 균주로 밝혀져, 이를 글루콘아세토박터 사카리(Gluconacetobacter sacchari SP 131-2)로 명명하고, 이 균주를 국립농업과학원 농업유전지원센터에 기탁하여 2011년 05월 06일 수탁번호 KACC91652P를 부여받았다.
본 발명의 신규미생물 글루콘아세토박터 사카리(Gluconacetobacter sacchari SP 131-2)는 그램음성균으로 간균이다.
상기 글루콘아세토박터 사카리(Gluconacetobacter sacchari) SP 131-2 균주 KACC91652P는 서열번호 1로 기재되는 염기서열 전체 또는 그것의 일부로 이루어지며, 693bp의 오픈 리딩 프레임(ORF)으로 구성된다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
실시예1 : 인산염 가용화균주의 탐색 및 분리
사과 및 복숭아 과원의 토양을 채취하여 다음과 같은 방법으로 분리하였다.
일단, 토양 10g을 90㎖ 멸균수가 들어있는 삼각플라스크에 넣어 20분간 진탕(120rpm)한 후 상층액을 Ca3(PO4)2가 함유된 PVK 평판배지에 도말하여 30℃에서 7일 동안 배양 한 후 도 1에 도시된 바와같이, 균주주위에 투명대를 형성하는 균체를 불용성 인산의 가용화능이 있는 균주로 결정하고, 그 중에서 상대적으로 투명대가 큰 균주를 선발하여 단일균주로 확보하였다(도 2).
실시예 2: 불용성 인산의 가용화능 측정
도 2의 분리균주 131-2를 대상으로 불용성 인산의 가용화능을 조사하였다.
분리균주는 0.5% 불용성인산(tricalcium phosphate)이 포함된 PVK배지 25㎖에 단일균주 선배양액 0.5㎖을 접종하여 120rpm으로 30℃에서 7일간 배양하였다.
배양 중 24시간 간격으로 배양액으로부터 유리된 인산을 ICP로 측정하였다.
그 결과, 하기 표 1과 같이 나타났다.
처리별(일)
조사항목 0 1 2 3 4 5 6 7
pH 6.07 3.91 3.79 3.59 3.37 3.35 3.31 3.13
인산가용화량
(Soluble P, mg/ℓ)		 21 256 528 1,112 1,514 1,548 1,541 1,616
일별 변화량 △235 △272 △584 △402 △34 △7 △75
상기 표 1에 나타나 있듯이, 분리균주 131-2의 일별 인산가용화능 조사에서는 배양후 5일까지 가용성인산 총량이 꾸준히 증가하는 것을 볼 수 있었으며, 일별변화량을 보면 배양 후 3일째가 가장 많은 가용성인산이 검출된 것으로 나타났다. pH의 변화는 배양 1일째부터 급격히 떨어져 배양일수가 증가할수록 서서히 감소하는 것으로 나타났다.
실시예 3: 포스파타아제( Phosphatase ) 활성의 측정
분리균주를 24시간 간격으로 7일동안 phosphatase 활성을 측정하였다.
포스파타아제(phosphatase)는 폴리인산을 가수분해하는 효소로, 탈인산가수분해효소라고도 한다.
배양 상등액 1㎖을 25mM의 p-nitrophenyl phosphate(pNP) 1㎖와 universal buffer(pH 6.5) 4㎖를 각각 혼합하여 37℃에서 1시간동안 반응시킨 뒤 0.5M CaCl2 1㎖와 0.5M NaOH 1㎖을 첨가한 후 반응액을 0.45㎛ 공극의 여과막으로 여과한 다음, 400 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 또한 각각의 가용성인산량과 pH를 조사하였다.
그 결과, 도 3에 나타나 있듯이, 시간이 경과될수록 가용성 인산량은 증가하였고 pH는 낮게 나타났으며, 포스파타아제는 점점 증가함을 알 수 있었다.
실시예 4: 선발균주의 기능탐색
선발균주의 기능을 분석하기 위해 전분, 단백질, 지질 분해능을 조사하였다.
선발균주의 전분 분해효소(amylase), 단백질분해효소(protease), 지방분해효소(lipase) 능 생성유무를 YM배지(soluble starch, skim milk, tributylin 포함)를 통해 조사하였다.
그 결과, 하기 표 2와 같이 나타났다.
Amylase Protease Lipase Ability phosphate solubilizing
- - - ++
+: 보통(normol), ++: 좋음(good). +++: 매우 좋음(very good),
-: 없음(none)
상기 표 2에 나타나 있듯이 선발균주는 인산염 가용화능을 갖음을 확인하였다.
실시예 5: 선발균주의 동정
선발균주 131-2의 동정을 위하여 염기서열 유사도가 가장 높은 표준균주와 염기서열을 정렬한 결과는 도 4와 같다.
염기서열을 분석하여 NCBI의 유전자 은행에 등록된 균주들과 비교하여 계통수(phylogenetic tree)를 조사하여 계통분류학적 염기서열 유사도가 높은 표준균주와의 유연관계를 확인한 결과, 도 5에 나타나 있듯이 Gluconacetobacter sp. Rh1-MS-CO 16s ribosomal RNA gene(99%), Gluconacetobacter sacchari SRI1794AF127407(99%) 등으로 나타나 Gluconactobacter sp.로 동정하였다.
상기 선발균주는 도 6에 나타나 있듯이 형태학적 특성으로 그람음성균 간균이며, 첨부된 기탁증명서에 기재되어 있듯이, 토양 신규미생물인 글루콘아세토박터 사카리(Gluconacetobacter sacchari SP 131-2)로 명명하였으며, 이 균주를 국립농업과학원 농업유전지원센터에 기탁하여 2011년 05월 06일 수탁번호 KACC91652P를 부여받았다.
이에, 본 발명에서 불용성 인산염을 가용화 시키는 능력이 우수한 신규 미생물인 글루콘아세토박터 사카리 SP 131-2를 제공함으로써 좀 더 효율적인 작물재배를 할 수 있게 된다.
또한, 상기 본 발명의 신규 미생물 글루콘아세토박터 사카리(Gluconacetobacter sacchari) SP 131-2 균주 KACC91652P는 토양내 고정된 불용성 인산염을 가용화시켜 식물생육에 도움을 줌으로써 토양의 개량을 위한 미생물제제로서의 이용가능성도 포함한다.
상기의 본 발명은 바람직한 실시예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC91652P 20110516
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Claims (5)

  1. 서열번호 1로 표현되는,
    신규 미생물 글루콘아세토박터 사카리(Gluconacetobacter sacchari) SP 131-2 균주 KACC91652P.
  2. 제1항에 있어서,
    토양으로부터 분리되는,
    신규 미생물 글루콘아세토박터 사카리(Gluconacetobacter sacchari) SP 131-2 균주 KACC91652P.
  3. 제1항에 있어서,
    미생물 농약, 종자코팅제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제 중 어느 하나의 유효성분으로 이용되는,
    신규 미생물 글루콘아세토박터 사카리(Gluconacetobacter sacchari) SP 131-2 균주 KACC91652P.
  4. 제1항에 있어서,
    토양내 고정된 불용성 인산염을 가용화 시키는 능력이 우수한,
    신규 미생물 글루콘아세토박터 사카리(Gluconacetobacter sacchari) SP 131-2 균주 KACC91652P.
  5. 제1항의 서열번호1로 표현되는 신규 미생물 글루콘아세토박터 사카리(Gluconacetobacter sacchari) SP 131-2 균주 KACC91652P를 사용하여 토양에 고정된 불용성 인산염을 가용화시키는 방법.
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