CN116064275A - 一种用于防治香蕉枯萎病的芽孢菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于防治香蕉枯萎病的芽孢菌，该芽孢菌使用LB液体培养基培育成OD600值为0.7‑0.9的芽孢菌种子液，将芽孢菌种子液接种至发酵培养基中培养，制得的芽孢菌菌液具有抑制镰刀菌生长的作用，将芽孢菌菌液与法尼醇复配对香蕉枯萎病的防治效果具有协同增效的作用。
Description
技术领域
本发明涉及防治香蕉枯萎病领域，特别涉及一种用于防治香蕉枯萎病的芽孢菌。
背景技术
香(大)蕉是单子叶植物纲、姜目、芭蕉科、芭蕉属的植物，在世界范围内广为分布，主要分布于南北纬20°之间的热带亚热带地区，共有130多个国家和地区种植香蕉。香蕉既是重要的经济作物也是重要的粮食作物，是全球仅次于柑橘的第二大水果；也是位于水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物。由尖孢镰刀菌古巴专化型真菌引起的枯萎病在全球的大面积爆发和流行，已严重威胁香蕉产业并成为制约其可持续发展的主要因素。目前该病在南太平洋、亚洲、非洲、澳洲、美洲热带、亚热带地区的香蕉种植园中普遍发生。在中国广东、广西、福建、云南、台湾和海南等省(区)等香蕉主产区发生日趋严重。香蕉枯萎病在蕉园的发病率为10％-40％，严重的可达90％以上，以致蕉园丢荒。
为了解决香蕉枯萎病的问题，本发明提出一种应用生防菌进行防治香蕉枯萎病的菌液及其应用方法。
发明内容
鉴以此，本发明提出一种用于防治香蕉枯萎病的芽孢菌及其应用方法，解决上述问题本发明的技术方案是这样实现的：
一种芽孢菌，所述芽孢菌为HNU24芽孢菌(Bacillus sp)保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC61231。
进一步的，所述HNU24芽孢菌的菌液制备方法包括以下步骤：
(1)用接种环取一环HNU24芽孢菌接种至的LB液体培养基中，于振荡摇床中培育，获得HNU24芽孢菌种子液；
(2)将HNU24芽孢菌种子液接种至发酵培养基中培养，制得HUN24芽孢菌菌液。
进一步的，所述菌液制备方法包括以下步骤：
(2)用接种环取一环HNU24芽孢菌接种至90-100ml的LB液体培养基中，于振荡摇床中培育，获得HNU24芽孢菌种子液；
(3)将HNU24芽孢菌种子液接种至发酵培养基中培养，制得HNU24芽孢菌菌液。
进一步的，步骤(1)中，所述振荡摇床温度为28-32℃，转速为150-170rmp，所述HUN24芽孢菌种子液OD600值为0.7-0.9。
进一步的，步骤(2)中，所述发酵培养基按重量份计包括葡萄糖3-7份、L-谷氨酸钠5-7份、硫酸镁1-2份、玉米浆9-10份、麸皮13-15份和水30-40份。
进一步的，步骤(2)中，所述HUN24芽孢菌种子液接种量为5-8％，所述发酵培养基培养温度为30-35℃，培养时间为8-12h。
进一步的，所述芽孢菌或HUN24芽孢菌菌液应用于防治香蕉枯萎病。
进一步的，所述菌液中还包括法尼醇。
进一步的，所述HUN24芽孢菌菌液和法尼醇质量比为4-6。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明HUN24芽孢菌对镰刀菌具有高效拮抗作用，进一步可以应用到防治香蕉枯萎病中。本发明中通过控制HUN24芽孢菌种子液OD600值为0.7-0.9，能够促进菌种的生长，提高菌种活力，调控菌种代谢途径，提高次级代谢产物的含量，进一步提高HUN24芽孢菌对镰刀菌的抑制效果。本发明以葡萄糖3-7份、L-谷氨酸钠5-7份、硫酸镁1-2份、玉米浆9-10份、麸皮13-15份和水30-40份制备发酵培养基，不仅能够保证发酵培养基中碳源等营养成分的供给，而且提高代谢产物的抑菌活性，进一步提高HUN24芽孢菌对镰刀菌的抑制效果。
附图说明
图1实施例1平板效果图
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供的孢杆菌(Bacillus sp)HNU24，保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC61231，保藏日期为2020年10月15日，保藏单位地址广东省广州市先烈中路100号。
实施例1
(1)用接种环取一环HUN24芽孢菌接种至100ml的LB液体培养基中，于振荡摇床中培育，所述振荡摇床温度为30℃，转速为160rmp，获得HUN24芽孢菌种子液，所述HUN24芽孢菌种子液OD600值为0.8；
(2)将HUN24芽孢菌种子液接种至发酵培养基中培养，接种量为6％，所述发酵培养基培养温度为33℃，培养时间为10h，所述发酵培养基按重量份计包括葡萄糖5份、L-谷氨酸钠6份、硫酸镁1.5份、玉米浆9.5份、麸皮14份和水35份，制得HUN24芽孢菌菌液。
实施例2
(1)用接种环取一环HUN24芽孢菌接种至100ml的LB液体培养基中，于振荡摇床中培育，所述振荡摇床温度为32℃，转速为170rmp，获得HUN24芽孢菌种子液，所述HUN24芽孢菌种子液OD600值为0.9；
(2)将HUN24芽孢菌种子液接种至发酵培养基中培养，接种量为8％，所述发酵培养基培养温度为35℃，培养时间为12h，所述发酵培养基按重量份计包括葡萄糖7份、L-谷氨酸钠7份、硫酸镁2份、玉米浆10份、麸皮15份和水40份，制得HUN24芽孢菌菌液。
实施例3
(1)用接种环取一环HUN24芽孢菌接种至100ml的LB液体培养基中，于振荡摇床中培育，所述振荡摇床温度为28℃，转速为150rmp，获得HUN24芽孢菌种子液，所述HUN24芽孢菌种子液OD600值为0.7；
(2)将HUN24芽孢菌种子液接种至发酵培养基中培养，接种量为5-8％，所述发酵培养基培养温度为30℃，培养时间为8h，所述发酵培养基按重量份计包括葡萄糖3份、L-谷氨酸钠5份、硫酸镁1份、玉米浆9份、麸皮13份和水30份，制得HUN24芽孢菌菌液。
对比例1
在实施例1的基础上调整HUN24芽孢菌种子液OD600值，具体为，用接种环取一环HUN24芽孢菌接种至100ml的LB液体培养基中，于振荡摇床中培育，所述振荡摇床温度为30℃，转速为160rmp，获得HUN24芽孢菌种子液，所述HUN24芽孢菌种子液OD600值为1.2。
对比例2
在实施例1的基础上调整发酵培养基的组分，具体为：将HUN24芽孢菌种子液接种至发酵培养基中培养，接种量为6％，所述发酵培养基培养温度为33℃，培养时间为10h，所述发酵培养基按重量份计包括蔗糖5份、L-谷氨酸钠6份、硫酸镁1.5份、淀粉9.5份、豆粕粉14份和水35份，制得HUN24芽孢菌菌液。
对比例3
在实施例1的基础上调整发酵培养基原料配比，具体为：将HUN24芽孢菌种子液接种至发酵培养基中培养，接种量为6％，所述发酵培养基培养温度为33℃，培养时间为10h，所述发酵培养基按重量份计包括葡萄糖7份、L-谷氨酸钠7份、硫酸镁5份、玉米浆7份、麸皮7份和水35份，制得HUN24芽孢菌菌液。
对比例4
在实施例1的基础上使用纯净水代替发酵培养基，制得HUN24芽孢菌菌液。
试验例1
(1)将PDA培养基和镰刀菌按质量比为15：1混合，制得镰刀菌混合培养基，将实施例1-3和对比例1-4制得的HUN24芽孢菌菌液分别接种至镰刀菌混合培养基中，置于28℃恒温箱中培养7天。使用十字交叉法测定抑菌圈直径。
表1试验组1-7实验结果
| 组别 | 抑菌半径(cm) |
| 实施例1 | 2.27 |
| 实施例2 | 2.22 |
| 实施例3 | 2.19 |
| 对比例1 | 1.96 |
| 对比例2 | 1.88 |
| 对比例3 | 1.92 |
| 对比例4 | 1.43 |
结合图1和表1实验结果表明，HUN24芽孢菌对镰刀菌具有抑制作用，HUN24芽孢菌可以用于香蕉枯萎病的防治中。对比例1改变HUN24芽孢菌的OD600值，导致抑菌效果下降，HUN24芽孢菌的OD600值升高导致代谢途径发生改变，大量消耗发酵培养基中的营养成分，次级代谢产物转化率降低，本发明中控制HUN24芽孢菌OD600值为0.7-0.9能够提高HUN24芽孢菌对镰刀菌的拮抗作用，对比例2和对比例3分别改变发酵培养基的组分和配比，本发明中发酵培养基组分合理搭配，保证菌种氮源、碳源等供给，有利于菌种生长，提高菌液中有效成分和次级代谢产物含量，提高HUN24芽孢菌对镰刀菌的抑制效果。对比例4实验结果表明，本发明HUN24芽孢菌经过发酵培养基培育制得HUN24芽孢菌菌液能够提高对镰刀菌的拮抗作用。
试验例2
试验地点为海南省陵水县，在香蕉种植区中，以每株20ml芽孢杆菌菌剂用量对槟榔苗根部进行浇灌，浇灌芽孢杆菌菌剂30天后，以每株60ml镰刀菌孢子液用量对槟榔苗根部进行浇灌。对照组香蕉苗处理方法为，不进行芽孢杆菌菌剂浇灌，同期采用60ml镰刀菌孢子液用量对槟榔苗根部进行浇灌。每株试验苗株数为100株。
抑制率％＝(对照组黄化病发病数-实验组黄化病发病数)/对照组黄化病发病数*100％
根据Colby法(1966)公式计算抑制率并与实测的抑制率比较，简便、有效地评价混剂的联合作用效果。计算公式为：
E＝X1×X2…×Xn/100(n-1)
E为混剂的理论抑制率；n为混用药剂的数量；X1表示施用第1种药剂后的抑制率；X2表示施用第2种药剂药剂后的抑制率；Xn表示施用第n种药剂后的抑制率。当混剂实际抑制率大于理论抑制率时，表示增效；当混剂实际抑制率小于理论抑制率时，表示拮抗。
| 名称 | HUN24芽孢菌菌液(ml/株) | 法尼醇(ml/株) | 抑制率(％) | 增效(％) |
| 1 | 16 | 4 | 96 | 73.4 |
| 2 | 17 | 3 | 94 | 68.2 |
| 3 | 20 | - | 80 | - |
| 4 | - | 20 | 14 | - |
| 5 | 10 | 10 | 76 | - |
实验结果表明，本发明采用HUN24芽孢菌菌液和法尼醇复配能够提高HUN24芽孢菌菌液对香蕉枯萎病的防治效果。法尼醇具有抑制真菌生长的作用，实验组4结果表明单一使用法尼醇进行防治香蕉枯萎病并没有起到很好的防治作用.实验组1和2结果表明，本发明使用HUN24芽孢菌菌液和法尼醇复配进行防治香蕉枯萎病起到协同增效的作用，实验组5的实验结果表明等量使用HUN24芽孢菌菌液和法尼醇导致抑制率降低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种芽孢菌，其特征在于，所述芽孢菌为HNU24芽孢菌(Bacillus sp)保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC61231。
2.一种含有权利要求1所述的HNU24芽孢菌的菌液。
3.如权利要求2所述的菌液，其特征在于，所述菌液制备方法包括以下步骤：
(1)用接种环取一环HNU24芽孢菌接种至的LB液体培养基中，于振荡摇床中培育，获得HNU24芽孢菌种子液；
(2)将HNU24芽孢菌种子液接种至发酵培养基中培养，制得HUN24芽孢菌菌液。
4.如权利要求3所述的菌液，其特征在于，所述菌液制备方法包括以下步骤：
(2)用接种环取一环HNU24芽孢菌接种至90-100ml的LB液体培养基中，于振荡摇床中培育，获得HNU24芽孢菌种子液；
(3)将HNU24芽孢菌种子液接种至发酵培养基中培养，制得HNU24芽孢菌菌液。
5.如权利要求4所述的菌液，其特征在于，步骤(1)中，所述振荡摇床温度为28-32℃，转速为150-170rmp，所述HUN24芽孢菌种子液OD600值为0.7-0.9。
6.如权利要求4所述的菌液，其特征在于，步骤(2)中，所述发酵培养基按重量份计包括葡萄糖3-7份、L-谷氨酸钠5-7份、硫酸镁1-2份、玉米浆9-10份、麸皮13-15份和水30-40份。
7.如权利要求4所述的菌液，其特征在于，步骤(2)中，所述HUN24芽孢菌种子液接种量为5-8％，所述发酵培养基培养温度为30-35℃，培养时间为8-12h。
8.权利要求1所述的芽孢菌或权利要求2-7任一项所述的菌液应用于防治香蕉枯萎病。
9.如权利要求2所述的菌液，其特征在于，所述菌液中还包括法尼醇。
10.如权利要求9所述的菌液，其特征在于，所述HUN24芽孢菌菌液和法尼醇质量比为4-6:1。
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