CN107318890A

CN107318890A - 苹果树腐烂病生物化学协同控制药剂及其应用

Info

Publication number: CN107318890A
Application number: CN201710599379.6A
Authority: CN
Inventors: 李健强; 杜晓哲; 高淑梅; 宋素琴; 曲田丽; 罗来鑫; 蒋娜
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2017-07-21
Filing date: 2017-07-21
Publication date: 2017-11-07

Abstract

本发明公开了苹果树腐烂病生物化学协同控制药剂及其应用。本发明所提供的预防和/或治疗苹果腐烂病的药剂，含有氟啶胺和枯草芽孢杆菌。实验证明，本发明的预防和/或治疗苹果腐烂病的药剂对苹果树腐烂病治疗效果与当地常规药剂噻霉酮的效果相当，对苹果树腐烂病的预防效果显著。本发明的预防和/或治疗苹果腐烂病的药剂(JM‑3与氟啶胺菌药合剂)在治疗和预防苹果腐烂病方面有减少化学药剂使用量保证果实安全品质的优点。

Description

苹果树腐烂病生物化学协同控制药剂及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中苹果树腐烂病的防治药剂，特别涉及苹果树腐烂病生物化学协同控制药剂及其应用。

背景技术

苹果树腐烂病(valsa canker of apple tree)是由黑腐皮壳属(Valsa，无性世代为囊胞菌属Cytospora)真菌侵染引起的枝干腐烂病害，因其发生面积广、危害重、防治难而被称为苹果树的“癌症”。该病害的病菌主要以侵染成龄果树为主；果园内病害侵染较轻时，会导致苹果树树皮腐烂、果实产量和品质降低；发生严重时则会导致树体枝干枯死，发生面积扩大甚至造成毁园。目前，苹果树腐烂病在我国、日本和朝鲜分布较多，在美国、英国、加拿大等国有零星分布。苹果树腐烂病菌主要侵染树干和枝条，特别是树体分叉处和树干最易受害；病害主要发生在多年生的苹果树上，其危害症状可分为“溃疡型”和“枯枝型”两种，一般以“溃疡型”为主。病菌一旦侵染树干，则造成皮层溃疡腐烂至枝条枯死。苹果树腐烂病菌侵染树木症状一般发生在树势衰弱的主干及侧枝枝条。病菌首先从伤口处侵入并扩展形成病疤，形状一般不规则，扩展极其迅速，树干很快被病斑包围，致使树干枝条枯萎死亡，后期在枝干上会出现黑色小斑点，为病菌的子实体。果实被侵染后，表面会产生暗红褐色的圆形或不规则病斑，边缘有清晰的轮纹，病疤组织腐烂软化并伴有酒糟味。

目前我国对于苹果树腐烂病的防治以化学防治为主，在一定程度上抑制病原菌扩展和控制病害具有效果，但如果长期使用化学农药，将造成土壤环境污染，给果实品质及安全带来隐患。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何降低预防和/或治疗苹果腐烂病中的化学杀菌剂的使用量。

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种预防和/或治疗苹果腐烂病的药剂(菌药合剂)。

本发明所提供的预防和/或治疗苹果腐烂病的药剂，含有氟啶胺和枯草芽孢杆菌。

上述预防和/或治疗苹果腐烂病的药剂的活性成分可为氟啶胺和枯草芽孢杆菌，上述预防和/或治疗苹果腐烂病的药剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述预防和/或治疗苹果腐烂病的药剂的其他活性成分本领域技术人员可根据预防和/或治疗苹果腐烂病的药剂对苹果腐烂病的预防和/或治疗效果确定。上述预防和/或治疗苹果腐烂病的药剂还可包括载体。所述载体可为微粉CaCO₃、草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石、硅藻土和水中的至少一种。上述预防和/或治疗苹果腐烂病的药剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

上述预防和/或治疗苹果腐烂病的药剂中，所述枯草芽孢杆菌可为枯草芽孢杆菌JM-3。

上述预防和/或治疗苹果腐烂病的药剂中，所述枯草芽孢杆菌的含量可为10⁷-10¹⁰cfu/g(如5×10⁸cfu/g),氟啶胺的质量百分含量可为25％。

本发明还提供了上述预防和/或治疗苹果腐烂病的药剂的制备方法。

本发明所提供的预防和/或治疗苹果腐烂病的药剂的制备方法，包括将所述枯草芽孢杆菌和氟啶胺混合的步骤。

下述任一种应用均属于本发明的保护范围：

1)氟啶胺和枯草芽孢杆菌在预防和/或治疗苹果腐烂病中的应用。

2)氟啶胺和枯草芽孢杆菌在抑制苹果腐烂病菌中的应用。

3)氟啶胺和枯草芽孢杆菌在制备预防和/或治疗苹果腐烂病药剂中的应用。

4)氟啶胺和枯草芽孢杆菌在制备苹果腐烂病菌抑制剂中的应用。

上述应用中，所述枯草芽孢杆菌可为枯草芽孢杆菌JM-3。

实验证明，本发明的预防和/或治疗苹果腐烂病的药剂(菌药合剂CFJ)在稀释500倍时对苹果腐烂病病疤的愈合率达4.01％(表5中的3C)，显著优于JM-3含量相似的JM-3菌剂对苹果腐烂病病疤的愈合率(2.00％)(表5中的1C)和氟啶胺含量相同的氟啶胺稀释液对苹果腐烂病病疤的愈合率(2.98％)(表5中的2B)，并且显著优于生物制剂寡雄腐霉(在相同稀释倍数下对苹果腐烂病病疤的愈合率3.48％)(表5中的4C)，与当地常规防治药剂噻霉酮无显著性差异；菌药合剂CFJ施用后,苹果腐烂病新病斑的增长率为0％(无菌水对照新斑的增长率为14.2％)。本发明的预防和/或治疗苹果腐烂病的药剂在治疗和预防苹果腐烂病方面有减少化学药剂使用量保证果实安全品质的优点。

附图说明

图1为不同生防菌对苹果树腐烂病菌丝生长抑制影响。

图2为氟啶胺对苹果树腐烂病菌080901菌丝生长的抑制作用。

图3为氟啶胺对JM-3菌落存活的影响。

其中ab分别代表经Duncan多重极差检验在0.05水平上差异显著。对数的底为10。

图4为图3-2氟啶胺对JM-3生长速率的影响。

图中，对数的底为10。

图5为氟啶胺标样的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的JM-3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(张淑颖，曲田丽，孙阳，董向丽，王彩霞，李保华，肖春，剑麻内生细菌JM-3对苹果腐烂病抑制作用的研究.华北农学报，2013，28(4)：208-213)，由青岛农业大学曲田丽博士提供；H6为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，由青岛农业大学曲田丽博士提供；HL29为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis(卢志军,云晓敏,刘西莉.生防菌株HL29的鉴定及其抑菌活性研究.植物病理学报,2005.35(6)(ZK):79-85.)；完2K为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，由新疆农业科学院微生物应用研究所宋素琴副研究员提供；SFJ-1为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，由河北省科学院生物所张丽萍研究员提供)；LG-D为撕裂蜡孔菌Ceriporia lacerata，由青岛农业大学曲田丽博士提供；乌桕内生菌UL-B为拟茎点霉Phomopsis sp，为青岛农业大学曲田丽博士提供；短穗鱼尾葵内生菌D-2为寡养单胞菌Stenotrophomonas sp,为青岛农业大学曲田丽博士提供。

下述实施例中的苹果树腐烂病菌(Valsa ceratosperma)：苹080901(2009年采集自陕西白水，由青岛农业大学王彩霞教授提供)、苹080601(2009年采集自山东栖霞，由青岛农业大学王彩霞教授提供)、苹140512(2014年采集自新疆阿克苏果园，由新疆农业科学院微生物应用研究所宋素琴副研究员提供)、香梨2(采集自新疆阿克苏市依干其乡10大队5小队，由新疆农科院宋素琴副研究员提供)。这4个菌株为供试病原菌。

3)供试培养基

LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母5g，氯化钠10g，琼脂12g，用蒸馏水定容至1L，121℃条件下灭菌20分钟。

LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母5g，氯化钠10g，用蒸馏水定容至1L，121℃条件下灭菌20分钟。

PDA培养基：马铃薯200g，葡糖糖20g，琼脂15g，蒸馏水1L。

实施例1、预防和/或治疗苹果腐烂病的药剂的制备

本实施例的预防和/或治疗苹果腐烂病的药剂，名称为JM-3与氟啶胺菌药合剂，简称为CFJ，是由载体和活性成分组成的粉剂。CFJ的活性成分是氟啶胺和JM-3，JM-3的含量为5×10⁸cfu/g，氟啶胺的质量百分含量为25％，CFJ的载体是微粉CaCO₃。CFJ是将JM-3菌剂(简称CJ)与氟啶胺(99.9％氟啶胺原药，北京市中国人民共和国农业部农药检定所)均匀混合并自然条件下风干得到的产品。

其中，JM-3菌剂CJ是由载体和活性成分组成的粉剂。CJ的活性成分是JM-3,载体是微粉CaCO₃。CJ的制备方法如下：将JM-3含量为5×10⁹cfu/mL的菌悬液(用LB液体培养基悬浮JM-3得到菌悬液)与微粉CaCO₃按0.1mL菌悬液:0.75g CaCO₃的比例进行吸附，在自然条件下风干并碾碎成粉末状，得到JM-3菌剂，简称CJ。该JM-3菌剂中，JM-3的含量为6.7×10⁸cfuJM-3/g。

一、控制苹果树腐烂病生防菌与化学药剂的筛选

1、控制苹果树腐烂病生防菌的筛选

1.1、生防菌对苹果树腐烂病菌的抑菌活性测定

采用室内平板对峙方法，筛选对病原菌具有较高活性的拮抗菌株。在培养72h的苹果树腐烂病菌菌落边缘取5mm菌饼接种于PDA平板中央，距离中心3cm处对称点接候选生防菌，每个菌株重复3次，以点接琼脂块的平板为对照(CK)置于25℃培养箱培养72h，观察各处理菌株的生长情况，采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率。

抑制率＝({对照菌落直径－生防菌处理菌落直径)/对照菌落直径}×100％。

通过平板对峙培养测定8株候选生防菌对病原菌菌丝生长的抑制作用，H6、HL29、JM-3对供试苹果树腐烂病菌生长的抑菌效果较高，平均抑制率分别达到54.7％、48.6％和56.6％(表1)，显著高于D-2等其它供试候选菌株的抑制率(2.7％-39.0％)。电镜观察候选生防菌对苹080901菌株的抑制效果，表明JM-3菌株在培养基上产生的活性物质对病原菌菌丝的生长产生明显的抑制作用，致使病原菌菌丝生长受阻发生褐变和异常(图1)。

表1、不同生防菌对苹果树腐烂病菌的抑制率(％)

生防菌	香梨2	苹080601	苹080901	苹140512	平均值
						H6	30.8a	58.7a	60.6a	62.6b	54.7
HL29	13.1b	57.6a	55.1c	67.8a	48.6
						D-2	1.0d	4.6d	1.5e	1.6e	2.7
JM-3	34.7a	59.6a	60.4a	69.7a	56.6
						SFJ1	12.0bc	46.4c	50.7c	55.7cd	39.0
完2K	8.6c	46.2c	45.4d	54.5d	36.7
						LG-D	10.9bc	52.7b	54.6bc	57.0c	38.1
UL-B	90c	540b	588ab	543d	390

注：表中数据均为3次重复的平均值，按Duncan’s新复极差检测(P＝0.05)，比较不同拮抗菌对腐烂病菌菌抑制影响的差异，相同小写字母表示差异不显著。

1.2、生防菌代谢液对苹果树腐烂病菌的抑菌活性测定

将筛选出的对苹果树腐烂病菌抑制效果较好的候选生防菌接入装有50mL LB液体培养基的三角瓶中，25℃，220r/min震荡培养48h，用细菌滤膜过滤，得到候选生防菌代谢液。将候选生防菌代谢液保存在EP管中置于4℃冰箱备用。用直径为5mm的打孔器在PDA培养基中央打孔，用移液器向孔内加入50μl候选生防菌代谢液，每浓度3个重复，以添加无菌水为对照。放置4℃冰箱24h，使候选生防菌代谢液在培养基中充分扩散；在距培养基平板中央2cm处，接种已活化的苹果树腐烂病菌菌饼，置于25℃培养箱培养3d后，测量菌落的宽度，按照如下公式计算抑制率。

抑制率＝({对照菌落宽度－代谢液处理抑制带宽度)/对照菌落宽度}×100％。

结果表明筛选出的H6、HL29、JM-3的无菌代谢液对苹果树腐烂病菌菌丝的抑制效果不同(表2)。3株拮抗菌代谢液对病原菌的抑制率达60.7％、62.3％、64.9％。其中JM-3代谢液在三株生防菌中的抑菌活性最高，并且JM-3代谢液对三株苹果树腐烂病菌的抑菌效果分别为68.4％、59.6％、64.9％要高于其它拮抗菌株。数据分析显示，JM-3代谢液抑菌活性与前期活菌的抑菌效果一致，均对V.ceratosperma具有显著的抑菌活性(表2)。

表2、不同生防菌代谢液对苹果腐烂病菌菌丝生长抑制影响

注：表中数据均为3次重复的平均值，按Duncan’s新复极差检测(P＝0.05)，比较三株拮抗菌无菌滤液对腐烂病菌菌丝抑制影响的差异，相同小写字母表示差异不显著。

2、控制苹果树腐烂病化学药剂的筛选

2.1供试材料

供试药剂：98.0％氟啶胺(陕西康泽化工科技有限公司)，96.0％丁香菌酯(吉林八达农药有限公司)，96.0％甲基硫菌灵(海南力智生物有限公司)，94.0％戊唑醇(山东华阳科技股份有限公司)，96％苯醚甲环唑(浙江禾本科技有限公司)。

供试培养基：PDA培养基:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂12g，蒸馏水1L。

2.2研究方法

采用含药介质平板法进行不同药剂对靶标菌的毒力测定。将丁香菌酯、甲基硫菌灵、戊唑醇、苯醚甲环唑、氟啶胺设置为5个浓度梯度，用移液器吸取60μl药液加入60mL灭菌后冷却至55℃左右的PDA培养基中，充分摇匀，倒入培养皿制成含药平板(每皿20mL)。每个药剂的每个浓度均设3次重复，以无菌水为空白对照(CK)。在培养3d的病原菌菌落边缘打取直径为5mm的菌饼，接种到含药平板中央，放置25℃恒温培养箱中培养3d后，采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率，以浓度对数为横坐标、以抑制率转化的抑制几率值为纵坐标进行回归分析，用DPS软件计算EC₅₀值。

戊唑醇浓度梯度为：0.01、0.02、0.04、0.08、0.5μg/mL；

苯醚甲环唑浓度梯度为：0.01、0.02、0.04、0.08、0.5μg/mL；

丁香菌酯浓度梯度为：0.5、1、2、4、8μg/mL；

氟啶胺的浓度梯度为：0.005、0.01、0.02、0.04、0.08μg/mL；

甲基硫菌灵的浓度梯度为：1、5、10、20、40μg/mL。

菌丝抑制率＝{(对照菌落直径－菌饼直径)—(药剂处理菌落直径—菌饼直径)/(对照菌落直径—菌饼直径)}×100％。

2.3结果与分析

通过室内测定不同浓度杀菌剂对V.ceratosperma菌丝生长的影响，并进行数据统计分析，结果表明：5种杀菌剂对苹果树腐烂病菌菌丝生长均表现出抑制作用，而氟啶胺对4株靶标菌的离体抑制活性EC₅₀值为0.0148-0.0481μg/mL，明显优于其它供试杀菌剂，而苯醚甲环唑、戊唑醇、丁香菌酯及甲基硫菌灵对苹果树腐烂病菌的EC₅₀值分别为0.0331-0.3581μg/mL，0.0336-0.2864μg/mL，1.8563-2.5454μg/mL，0.0457-7.8698μg/mL见表3。氟啶胺对苹080109的抑制作用见图2。

表3、苹果树腐烂病菌对不同杀菌剂的敏感性测定结果

本步骤通过室内平板对峙法测定了8株不同生防菌对靶标菌的抑制活性影响。其中菌株JM-3及代谢液，对病原菌均表现出较好的抑制效果。经扫描电镜观察发现，JM-3作用于靶标菌菌丝后，其产生的活性物质导致病原菌菌丝发生形态变化，菌丝褶皱畸形、分枝较多、顶端膨大变粗。由此可知，JM-3对病原菌具有显著的抑制活性，因此确定JM-3作为生物-化学协同防治苹果树腐烂病的目标生防菌。

通过不同药剂不同浓度对苹果树腐烂病菌菌株室内毒力测定结果表明，5种供试药剂均有抑制活性，而氟啶胺对V.ceratosperma抑制活性较强，其效果显著优于供试的三唑类杀菌剂苯醚甲环唑及戊唑醇，因此确定氟啶胺作为生物—化学协同防治苹果树腐烂病目标化学药剂。氟啶胺(Fluazinam)是一种吡啶胺类新型保护性杀菌剂，杀菌谱广、持效期长、耐雨水冲刷。而且2001年美国批准氟啶胺为低环境风险产品。目前，还未见氟啶胺对苹果树腐烂病菌抑菌活性的相关报道。

二、JM-3和氟啶胺构建菌药合剂的互作

为了实现苹果树腐烂病生物-化学协同控制，拟在前期试验基础上将枯草芽孢杆菌JM-3和杀菌剂氟啶胺构建菌药合剂。生物-化学协同控制药剂在生产、储运以及应用阶段，都需要科学配伍，需要明确生防菌对化学杀菌剂的稳定性影响，化学杀菌剂对生防菌的存活安全性影响。因而生防菌与化学药剂相结合达到较好的防治效果，二者必须兼容。因此对于菌药兼容性的检测成为菌药合剂成功的关键。

1、氟啶胺对JM-3生长的影响

1.1供试材料

枯草芽孢杆菌JM-3；

99.9％氟啶胺原药：北京市中国人民共和国农业部农药检定所。

1.2研究方法

1)氟啶胺对JM-3菌落存活测定：根据氟啶胺对V.ceratosperma的抑制作用，设计5个系列梯度浓度。首先定量称取氟啶胺原药于1mL的离心管中，用二甲基亚砜配制氟啶胺母液，然后用二甲基亚砜稀释成以上5个不同浓度的药液。用移液器吸取各系列浓度的氟啶胺药液60μl加入到灭菌后60mL LB液体培养基内，充分摇匀，配制成终浓度为2.5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、80μg/mL、100μg/mL浓度药液的LB平板，以添加等体积的二甲基亚砜的培养基作对照。将JM-3菌株接种到LB液体培养基中，28℃160rpm条件下摇培24h,吸取少量菌液，将其稀释10⁵cfu/mL，用移液器吸取100μl稀释后的菌液加入到含药LB培养基表面，涂抹均匀，每个浓度3次重复。放置28℃的恒温培养箱内培养，24h后观察并统计平板菌落数，计算抑制生长率。

2)氟啶胺对JM-3生长速率测定：将JM-3菌株转接到LB液体培养基中，于28℃160rpm摇培。用0.85％的生理盐水稀释菌悬液至10⁸cfu/mL。用二甲基亚砜将氟啶胺原药配制成10⁴μg/mL的母液，然后稀释成系列浓度的药液。分别取100μl不同浓度药液加到100mLLB液体培养基中，阴性对照(CK)为加入等体积的二甲基亚砜的LB液体培养基，阳性对照为加入100μl青霉素(0.1g/mL)的LB液体培养基。取菌悬液1mL接种于含系列浓度氟啶胺的LB液体培养基中，于28℃，160rpm的摇床上培养。每隔4h取500μl样品，第一次取样在摇培15min时，共取样9次。取出样品的菌量利用稀释涂板的方法进行测定，用无菌0.8％NaClO溶液稀释样品10倍，再制成稀释度为10^-8、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4稀释菌液，用移液枪吸取0.1mL置于LB平板上，用涂布器涂抹均匀，每个浓度重复三次，以添加等量的无菌NaClO为对照，28℃培养48h，记录平板菌落数计算各处理的母液菌量。将取样的时间定为横坐标，取母液菌量的对数作为纵坐标作出不同浓度氟啶胺的LB液体培养基中JM-3菌落的生长曲线，以此分析氟啶胺对生防菌生长速度的影响。

母液菌量＝(菌落数×稀释倍数×10)/0.1。

1.3结果与分析

1.3.1氟啶胺对JM-3菌落存活影响

数据统计分析如图3所示。结果表明，氟啶胺在设计浓度范围(2.5-100μg/mL)内与添加二甲基亚砜阴性对照相比，不同浓度处理对JM-3的菌落存活没有显著差异，因而表明氟啶胺在检测范围浓度内对JM-3菌落存活没有抑制作用，而青霉素(100μg/mL)则显著影响了JM-3存活，抑制率为88.6％。

1.3.2氟啶胺对JM-3生长速率的影响

不同浓度下氟啶胺对JM-3的生长速率的影响如图4所示。通过测定32h内JM-3菌落数量，表明氟啶胺在10μg/mL、80μg/mL时对JM-3的生长速度同阴性对照相比没有明显的抑制作用，而当氟啶胺的浓度达到800μg/mL时，JM-3的生长速度同阴性对照相比明显降低了。结果表明，JM-3在氟啶胺测定浓度80μg/mL以下时，其生长速度不会受到抑制影响。

2、JM-3与氟啶胺菌药合剂的制备及热贮对稳定性的影响

2.1供试材料

1)供试菌株药剂：

枯草芽孢杆菌JM-3；

99.9％氟啶胺原药：北京市中国人民共和国农业部农药检定所；

2)实验仪器：HP1100高效液相色谱仪：UV200紫外可变波长检测器，P200高压泵；色谱数据处理机；超声波清洗器；色谱纯：甲醇；水：二次重蒸水。

2.2试验方法

1)JM-3与氟啶胺菌药合剂的制备

将活化的JM-3菌株用0.85％的生理盐水稀释制备成10⁸cfu/mL菌悬液，按照1:100的比例接种菌悬液于LB液体培养基中，置于28℃、160rpm摇床上培养。24h后将发酵液于10000rpm下离心，弃去上清液，用LB液体培养基悬浮离心管底部的菌体，获得菌悬液，浓度为5×10⁹cfu/mL。将该菌悬液与微粉CaCO₃按0.1mL菌悬液:0.75g CaCO₃的比例进行吸附，在自然条件下风干并碾碎成粉末状，得到JM-3菌剂，简称CJ。该JM-3菌剂中，JM-3的含量为6.7×10⁸cfu JM-3/g。

将该JM-3菌剂与氟啶胺(99.9％氟啶胺原药，北京市中国人民共和国农业部农药检定所)均匀混合并自然条件下风干得到预防和/或治疗苹果腐烂病的药剂，其名称为JM-3与氟啶胺菌药合剂，简称为CFJ。CFJ，是由载体和活性成分组成的粉剂。CFJ的活性成分是氟啶胺和JM-3，JM-3的含量为5×10⁸cfu/g，氟啶胺的质量百分含量为25％，CFJ的载体是微粉CaCO₃。将CFJ分装在安瓿瓶中封闭瓶口，放置在4℃冰箱和54℃恒温培养箱中贮存。

2)标准溶液的配制：准确称取氟啶胺(99.9％)标样25mg，置于50mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度并定容，摇匀使氟啶胺充分溶解，配制成浓度为500μg/mL的母液，用甲醇逐级稀释母液，配制成系列浓度分别为200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL的溶液。

3)样品溶液的配制：准确称取待测样品CFJ 25mg，置于50mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度定容，摇匀使混配制剂CFJ充分溶解，用滤纸对溶液进行过滤，滤液放置在4℃冰箱备用。

4)色谱条件及含量检测：在姜宜飞(2005)测定氟啶胺含量的色谱条件基础上进行了修改。采用Spuril^TMC₁₈ 5(μm)250mm×4.6mm(i.d)不锈钢色谱柱；流动相为甲醇-水(85:15，V/V)；流速1.0mL/min；检测波长240nm；柱温：室温；进样量5μl；保留时间：9min。氟啶胺高效液相色谱图为图5，氟啶胺的峰面积即为最高峰的面积。

氟啶胺的百分含量公式：X％＝{(C×50)/25×10³}×100。

C：由标准曲线求得的样品中氟啶胺的浓度(μg/mL)。

5)JM-3与氟啶胺菌药合剂中各组分的热贮稳定性检测：测定样品中JM-3菌落浓度及氟啶胺含量，测定结果以3次重复的平均值表示。将贮藏于54℃的恒温箱中混配制剂CFJ，贮藏14d后取样测定样品中JM-3菌落浓度和氟啶胺含量。

6)JM-3与氟啶胺菌药合剂药剂中JM-3含量的影响：取0.5g CFJ混配制剂用4.5mL灭菌0.85％生理盐水混匀，制成稀释度为10^-8、10^-7、10^-6、10^-5稀释混合液，吸取各处理混合液0.1mL分别置于LB平板上，每个梯度设4个重复，涂布均匀，并设生理盐水为对照，28℃恒温箱中培养48h后，观察菌落生长情况。样品中JM-3菌落浓度的计算公式：

每克CFJ样品中JM-3菌量(cfu/g)＝(平板菌落数×稀释倍数)/(0.1×0.5)。

2.3结果与分析

1)线性相关性试验结果：将标样溶液配制的5个梯度浓度分别进样5μl，测出的峰面积(A，mv.min)与浓度(C，μg/mL)做标准曲线，得到线性方程Y＝7.240X+96.58，相关系数R²＝0.996。表明氟啶胺浓度12.5-200μg/mL范围内能够有效检测结果。

2)精密度测定结果：吸取100μg/mL氟啶胺标准溶液5μl，重复测样5次，统计5次所得峰的面积及平均值，得出氟啶胺的相对标准偏差即变异系数为0.18％。

3)准确度测定结果：取已知混配制剂样品5份，加入定量的氟啶胺标准样品，按照上述样品溶液制备方法配成溶液，在色谱及操作相同条件下进行测定，计算回收率，结果表明氟啶胺回收率为98.79％，相对标准偏差为0.89％。

4)JM-3与氟啶胺菌药合剂中氟啶胺含量及JM-3浓度测定结果：

经过54℃处理14d后，JM-3与氟啶胺菌药合剂中JM-3的含量和氟啶胺的含量在贮存前后并无显著性差异。

本实施例通过测定不同浓度的氟啶胺对JM-3菌落存活及生长速率的影响，表明氟啶胺在浓度80μg/mL以下对JM-3的生长与阴性对照相比基本一致，没有产生抑制作用。但是浓度达到800μg/mL时会抑制生防菌JM-3的生长。由此推断氟啶胺在一定浓度范围内不会对JM-3产生抑制作用，但只是在超出浓度范围到高浓度时，才会对JM-3产生抑制作用。在前期室内氟啶胺对苹果树腐烂病菌毒力测定试验中，氟啶胺对苹果树腐烂病菌的致死浓度很低，在0.08μg/mL时病菌菌丝则会被完全抑制生长，因此，氟啶胺在本试验设计的适用浓度范围内只会抑制V.ceratosperma的生长而不会对枯草芽孢杆菌JM-3的生长产生抑制作用。

本部分还利用高效液相色谱仪检测了菌药合剂在高温贮存后氟啶胺的含量变化，及运用稀释涂平板法计算B.subtilis JM-3浓度影响，结果表明，在本试验的色谱操作条件下对氟啶胺含量测定具有准确的检测结果，因此，通过检测贮存前后混配制剂中氟啶胺的含量变化，结果表明了氟啶胺在贮存前后含量并无显著性差异。通过涂板计数比较菌药合剂贮存前后枯草芽孢杆菌JM-3菌浓度，表明枯草芽孢杆菌JM-3在贮存前后含量并无显著性差异。综合分析认为，由生防菌JM-3与化学药剂氟啶胺构建的菌药合剂经54℃贮藏14d后成分含量没有显著变化，成分之间没有产生抑制或代谢作用，因此表明该药剂在运输或贮藏过程中有效成分具有较好的兼容性及稳定性。

实施例2、JM-3与氟啶胺菌药合剂防治苹果树腐烂病田间试验

在新疆阿克苏开展了田间药效试验，具体如下。

1、供试药剂

寡雄腐霉(生物菌剂)为北京比奥生物科技有限公司产品。

噻霉酮(1,2苯并异噻唑林-3-酮)由陕西西大华特实业有限公司生产。

实施例1中的JM-3与氟啶胺菌药合剂，简称CFJ。

实施例1中的JM-3菌剂，简称CJ。

2、试验田概况

本试验设在新疆阿克苏库克什林管站的阿克苏红旗坡6队白武章苹果园内，该园内苹果树腐烂病发生严重。苹果园的面积5000m²，品种为冰糖心红富士，16年树龄，行距3m，株距3m，共计500多株，每株均有苹果树腐烂病发病，发病率达100％。

3、试验设计和方法

病疤愈合试验及预防病疤产生试验分别设计14个处理，都以无菌水为对照，每个处理4棵树。病疤愈合试验及预防病疤产生试验均重复三次。按照以下方法进行处理隔月施药，供施3次。具体药剂处理见表4。各个处理所用的药剂如下：

1A将CJ用无菌水稀释10倍后施药，即JM-3的施药浓度为6.7×10⁷cfu/mL。

1B将CJ用无菌水稀释100倍后施药，即JM-3的施药浓度为6.7×10⁶cfu/mL。

1C将CJ用无菌水稀释500倍后施药，即JM-3的施药浓度为1.3×10⁶cfu/mL。

2A将99.9％氟啶胺原药用无菌水稀释4000倍后施药，即氟啶胺的施药浓度为0.250mg/mL。

2B将99.9％氟啶胺原药用无菌水稀释2000倍后施药，即氟啶胺的施药浓度为0.500mg/mL。

2C将99.9％氟啶胺原药用无菌水稀释1000倍后施药，即氟啶胺的施药浓度为1.000mg/mL。

CK用无菌水施药。

3A将CFJ用无菌水稀释2000倍后施药，即氟啶胺的施药浓度为0.125mg/mL，JM-3的施药浓度为2.5×10⁵cfu/mL。

3B将CFJ用无菌水稀释1000倍后施药，即氟啶胺的施药浓度为0.250mg/mL，JM-3的施药浓度为5.0×10⁵cfu/mL。

3C将CFJ用无菌水稀释500倍后施药，即氟啶胺的施药浓度为0.500mg/mL，JM-3的施药浓度为1.0×10⁶cfu/mL。

4A将寡雄腐霉用无菌水稀释2000倍后施药。

4B将寡雄腐霉用无菌水稀释1000倍后施药。

4C将寡雄腐霉用无菌水稀释500倍后施药。

5A将1.6％噻霉酮用无菌水稀释50倍后施药。

病疤划线后涂抹药剂法：选取主干苹果树腐烂病病疤，用毛笔蘸红漆紧沿苹果树腐烂病病疤边缘画线，测量施药前后苹果树腐烂病病疤的长径和宽经并在苹果树腐烂病病疤处涂抹药剂。

整棵树干涂抹药剂法：选取苹果树腐烂病病疤较少的树干，用毛刷将药剂涂抹整棵树的主干部分，即从主干底部到主干分杈处，统计施药前后苹果树腐烂病病疤的个数(树干新增苹果树腐烂病病疤的个数以及苹果树腐烂病病疤面积有扩展的苹果树腐烂病病疤个数之和)。

第一次施药在2014年5月份，第二、三次施药分别在2014年7月及10月份。共施药3次，在最后施药后一个月对苹果树腐烂病病疤愈合面积、及新增苹果树腐烂病病疤数进行调查，计算施药后苹果树腐烂病病疤愈合率及新增病疤率，统计防效。

苹果树腐烂病病疤愈合率(％)＝(药前苹果树腐烂病病疤面积－药后苹果树腐烂病病疤面积)/药前苹果树腐烂病病疤面积×100％

新增苹果树腐烂病病疤率(％)＝(药后苹果树腐烂病病疤数-药前苹果树腐烂病病疤数)/药前苹果树腐烂病病疤总数×100％

苹果树腐烂病病疤面积＝1/4×π×长径×宽径

表4、田间试验不同药剂处理表

4、不同药剂处理对病疤的治疗效果

通过调查计算不同药剂处理苹果树腐烂病病疤伤口的愈合面积，比较各个药剂对病疤的治疗效果。如表5所示，所用处理与对照相比对苹果树腐烂病病疤均有愈合作用，但是愈合效果存在差异。对照化学药剂1.6％噻霉酮50倍稀释处理后苹果树腐烂病病疤愈合率为4.13％(5A)，CFJ 500倍稀释处理后苹果树腐烂病病疤愈合率4.01％(3C)，在该稀释度下二者对于苹果树腐烂病病疤面积的愈合效果差异性不显著。而且CFJ处理苹果树腐烂病病疤愈合效果比单剂施用生防菌JM-3及化学药剂氟啶胺均较好，可见菌药混配对防治苹果树腐烂病具有加和作用。另外防治多种病害效果较成熟的生物制剂寡雄腐霉在稀释500倍浓度下对苹果树腐烂病病疤的愈合率达3.48％(4C)，而本试验筛选的生防菌株JM-3在稀释500倍时对苹果树腐烂病病疤愈合面积为2.00％(1C)，二者具有明显的差异性，但是由生防菌构建的菌药合剂要高于寡雄腐霉的治疗效果。

表5、不同药剂对苹果树腐烂病病疤愈合的影响

注：表中数据均为3次重复的平均值，按Duncan’s新复极差检测(P＝0.05)，比较不同药剂处理树干后对病疤愈合率影响的差异，相同小写字母表示差异不显著。

5、不同药剂施用后新病斑的增长率

将不同药剂按照设计施用量涂抹整棵树干，即施药3次后统计不同药剂处理苹果树干新增苹果树腐烂病病疤的个数，计算新增苹果树腐烂病病疤增长率。结果表明除生防菌JM-3菌剂CJ与无菌水对照施用后产生新的苹果树腐烂病病疤，苹果树腐烂病病斑增长率分别为9％和14.2％，菌药合剂CFJ与当地化学药剂噻霉酮均没有产生新的苹果树腐烂病病疤，苹果树腐烂病病斑增长率均为0％(表6)。说明菌药合剂CFJ对苹果腐烂病菌有较好的抑制效果，没有新的病疤产生。

表6、不同药剂施用后苹果腐烂病病斑统计

田间不同药剂对苹果树腐烂病病疤愈合率及新增病疤率的统计结果表明，菌药合剂CFJ在稀释500倍时对苹果树腐烂病病疤的愈合率达4.01％(处理3C)比单独施用JM-3含量相似的生防菌剂CJ的处理1C(愈合率为2.00％)和单独施用含量相同的氟啶胺的处理2B(愈合率为2.98％)愈合率高，且呈显著性差异。菌药合剂CFJ的苹果树腐烂病病疤愈合率略低于当地应用较广泛的化学药剂噻霉酮(4.13％)，但差异性不显著。因而本发明的JM-3与氟啶胺菌药合剂在治疗苹果树腐烂病方面有减少化学药剂使用量保证果实安全品质的优点，本发明的JM-3与氟啶胺菌药合剂对苹果腐烂病病菌的抑制作用较好，在本实验施药期间无新病斑发生。

Claims

1.预防和/或治疗苹果腐烂病的药剂，其特征在于：所述药剂含有氟啶胺和枯草芽孢杆菌。

2.根据权利要求1所述的药剂，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌JM-3。

3.根据权利要求1或2所述的药剂，其特征在于：所述预防和/或治疗苹果腐烂病的药剂的活性成分是氟啶胺和所述枯草芽孢杆菌。

4.根据权利要求1或2所述的药剂，其特征在于：所述药剂液的剂型为粉剂、液剂、乳剂、悬浮剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

5.权利要求1-4中任一所述的药剂的制备方法，包括将权利要求1-4中任一所述药剂中的所述枯草芽孢杆菌和氟啶胺混合的步骤。

6.氟啶胺和枯草芽孢杆菌在预防和/或治疗苹果腐烂病中的应用。

7.氟啶胺和枯草芽孢杆菌在抑制苹果腐烂病菌中的应用。

8.氟啶胺和枯草芽孢杆菌在制备预防和/或治疗苹果腐烂病药剂中的应用。

9.氟啶胺和枯草芽孢杆菌在制备苹果腐烂病菌抑制剂中的应用。

10.根据权利要求6-9中任一所述的应用，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌JM-3。