CN102084813A - 金线莲无糖组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及金线莲无糖组织培养方法，它是先将无菌处理过的金线莲小段组织接种至无糖诱导培养基内，置于上开口敞开的培养箱中进行组织诱导培养丛生芽，无糖诱导培养基包含MS培养基、多孔无机材料4-10g/L、α-萘乙酸0.1-3.0mg/L和6-苄氨基嘌呤2-4mg/L，pH值为5-6；再将诱导出的丛生芽植入无糖壮苗培养基中，置于上开口敞开的培养箱中进行壮苗培养；无糖壮苗培养基包含B5培养基、多孔无机材料2-10g/L、蛋白胨1-5g/L、花宝1号0.1-3.0g/L、香蕉泥20-150g/L和活性炭0.1-3g/L，pH值为5.5-6.0。本发明可提高金线莲植株的生根率和成苗率，降低生产组培成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种金线莲无糖组织培养方法。
背景技术
金线莲（Anoectochilus roxburghii（wall.）lindl）为兰科开唇兰属多年生草本，别名金蚕、金线兰、金线虎头蕉等，是一种濒危珍稀药用植物，素有“金草”、“神药”、“乌人参”等美称，在民间应用范围较广，广泛应用于风湿性关节炎、高血压病、糖尿病、肾病等疑难杂症的治疗和强身健体、病后体虚恢复等方面，在浙江、福建、台湾等省和东南亚地区被视为珍稀名贵药材，特别在台湾省更是备受青睐，被称为“药中之王”。
金线莲种子微小，由未成熟的胚及数层种皮细胞构成，自然条件下，金线莲种子难以萌发（萌发率低于5%），近年来，随着对其药效学和临床应用研究的深入，对金线莲药用价值的认识进一步提高，其市场货源紧缺的状况更为严峻，野生资源也不断遭到破坏性采挖，以致于金线莲处于濒临灭绝之地。因此，只有解决金线莲种苗来源，加快人工栽培，才能保护金线莲野生资源、稳定市场供应，提高金线莲规模化组培种植经济效益，使金线莲这一珍稀植物种苗的生产实现集约化、规模化和专业化，促进地方特色资源向产业化发展，加快山区农民脱贫致富。
常规的金线莲组织培养技术主要包含丛生芽诱导培养和壮苗植株两个步骤，存在以下不足之处：
（1）传统的丛生芽诱导培养和壮苗植株的培养方式既靠培养基中的糖又靠人工光照，使植株同时进行异养和自养生长（兼养）。在异养和兼养的条件下，小植株主要依靠培养基中的糖作为碳源，极易引起微生物的污染；
（2）由于培养基中糖的存在，会导致叶片表层结构发育差，气孔开闭功能不强，叶片小，叶绿素含量降低，最终抑制和降低了小植株的光合作用能力；
（3）传统组培育苗成本高，组培时间最少达4个月以上，才能长成7公分高的壮苗，植株成活率低。
（4）传统人工组培金线莲主要成分含量均低于野生金线莲指标。
（5）传统金线莲组织培养技术成本高，糖的成本占培养基成本的12%-15%（按每瓶培养基加30g糖计）。
发明内容
为了解决现有技术所存在的上述问题，本发明提供了一种金线莲无糖组织培养方法，它不仅可提高金线莲植株的生根率和成苗率，而且可降低生产组培成本。
本发明的技术方案是这样构成的，一种金线莲无糖组织培养方法，其特征在于，它包括以下步骤：
①植物体的选择和无菌处理：选择6-8月份生长的金线莲为种源，除去根和叶并进行清洗和无菌处理后，剪成带茎节的金线莲小段组织；
②丛生芽诱导培养：将经过步骤①处理的金线莲小段组织接种至无糖诱导培养基内，置于上开口敞开的培养箱中进行组织诱导培养丛生芽；培养周期为20-60天，培养温度为20-30℃，光照时间为8-20小时/天，光照强度为50-100μmol/m2·s；所述无糖诱导培养基包含以下成分：MS培养基、多孔无机材料、α-萘乙酸和6-苄氨基嘌呤；所述多孔无机材料由蛭石或珍珠岩或砂中的一种或一种以上构成，多孔无机材料的含量为4-10g/L，α-萘乙酸的含量为0.1-3.0mg/L，6-苄氨基嘌呤的含量为2-4mg/L，pH值为5-6；
③壮苗培养：将步骤②诱导出的丛生芽植入无糖壮苗培养基中，置于上开口敞开的培养箱中进行壮苗培养；培养周期为20-60天，培养温度为20-35℃，光照时间为8-20小时/天，光照强度为50-100μmol/m2·s；所述无糖壮苗培养基包含以下成分：B5培养基、多孔无机材料、蛋白胨、花宝1号、香蕉泥和活性炭，所述多孔无机材料由蛭石或珍珠岩或砂中的一种或一种以上构成，多孔无机材料的含量为2-10g/L，蛋白胨的含量为1-5g/L、花宝1号的含量为0.1-3.0g/L、香蕉泥的含量为20-150 g/L，活性炭的含量为0.1-3 g/L，pH值为5.5-6.0。
本发明金线莲无糖组织培养方法的一个重要特征（同时也是本发明与常规植物组培技术最大的差异之处）是改变了培养基的成分，使培养基中不再含有糖，另一个重要特征是将培养容器由以往的在小玻璃瓶内几乎封闭式养殖改为在上开口敞开的培养箱内进行敞开式培养，使植株与空气中CO2的接触面积有效扩大，从而改变碳源的供给途径，使CO2代替糖作为植物体的碳源，这样只要适当控制培养环境因子，即可促进植株光合作用速率，使金线莲组培苗由异养型转变为自养型。由于培养基中不含糖，因此不仅可大幅度减少植物组培快繁生产过程中的微生物污染，提高植株的生根率、成苗率和种苗质量；而且可大大降低组培生产成本。
此外，本发明还有一个重要特征就是采用蛭石作为培养基的主要成分。在植物组织培养中，培养基质的种类是十分重要的，它直接影响植株根区的环境及植株的生根率。疑胶状的特质如琼脂、卡那胶通常被用作组培苗的培养基质。但植株的根系在琼脂中的发育一般瘦小且脆弱，当移植到过渡培养的土壤时容易被损坏。事实上，多孔的无机材料，例如塑料泡沫、蛭石、珍珠岩、岩棉、陶粒、纤维素等也能用作培养基质。通过试验表明，多孔的无机材料比凝胶状的物质的培养效果好，多孔的无机材料与价格昂贵的琼脂及其他凝胶状的物质相比，不仅生长量增加，而且生产成本降低。这主要是由于多孔（测量体积空气百分率），空气扩散系数高、植株的根区环境中有较高的氧浓度，从而有利于促进小植物的生长。在供试的无机材料基质中，蛭石比珍珠岩和砂好。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：不仅可大幅度减少植物组培快繁生产过程中的微生物污染，提高植株的生根率、成苗率和种苗质量；而且可使组培生产成本大大降低。通过实验证明：通过本发明方法培育的金线莲植株不仅长势良好，产量高，品质好，不污染环境，３个月后植株成活率达100％，大大缩短金线莲组培成苗时间，显著提高培养效率，而且生物量较有糖培养得到显著增加，改变了人工培育植物有效成功普遍低于野生植物性能指标的现状；因此本发明有利于金线莲快速繁殖 ,可实现规模化生产，其推广应用有利于缓解野生金线莲的自然资源匮乏与市场需求紧缺的现状。
具体实施方式
下面结合具体实施方式和实施例对本发明内容进行详细说明：
（一）具体实施方式
本发明提供了一种金线莲无糖组织培养方法的具体实施方式，它包括以下步骤：
①植物体的选择和无菌处理：选择6-8月份生长的金线莲为种源（所述的金线莲优选福建永安当地野生金线莲，当然也可选择在其它产地生长的金线莲作为种源），除去根和叶并进行清洗和无菌处理后，剪成带茎节的金线莲小段组织（约0.5-1.5cm长）；
②丛生芽诱导培养：将经过步骤①处理的金线莲小段组织接种至无糖诱导培养基内，置于上开口敞开的培养箱中进行组织诱导培养丛生芽；培养周期为20-60天，培养温度为20-30℃，光照时间为8-20小时/天，光照强度为50-100μmol/m2·s；所述无糖诱导培养基包含以下成分：MS培养基、多孔无机材料、α-萘乙酸和6-苄氨基嘌呤；所述多孔无机材料由蛭石或珍珠岩或砂中的一种或一种以上构成，多孔无机材料的含量为4-10g/L，α-萘乙酸的含量为0.1-3.0mg/L，6-苄氨基嘌呤的含量为2-4mg/L，pH值为5-6；
③壮苗培养：将步骤②诱导出的丛生芽植入无糖壮苗培养基中，置于上开口敞开的培养箱中进行壮苗培养；培养周期为20-60天，培养温度为20-35℃，光照时间为8-20小时/天，光照强度为50-100μmol/m2·s；所述无糖壮苗培养基包含以下成分：B5培养基、多孔无机材料、蛋白胨、花宝1号、香蕉泥和活性炭，所述多孔无机材料由蛭石或珍珠岩或砂中的一种或一种以上构成，多孔无机材料的含量为2-10g/L，蛋白胨的含量为1-5g/L、花宝1号的含量为0.1-3.0g/L、香蕉泥的含量为20-150 g/L，活性炭的含量为0.1-3 g/L，pH值为5.5-6.0。
在步骤②所述的丛生芽诱导培养中，多孔无机材料最好由蛭石构成。在所述无糖诱导培养基中，蛭石的优选含量为6-8g/L，α-萘乙酸的优选含量为0.1-0.2mg/L，6-苄氨基嘌呤的优选含量为2-3mg/L。在所述无糖诱导培养基中，蛭石的最佳含量为8g/L，α-萘乙酸的最佳含量为0.2mg/L、6-苄氨基嘌呤的最佳含量为2mg/L。此外，在步骤②所述的丛生芽诱导培养中，一种较优的培养条件如下：培养周期为30-45天，培养温度为25-28℃，光照时间为8-14小时/天，光照强度为50-80μmol/m2·s。
在步骤③所述的壮苗培养中，多孔无机材料最好由蛭石构成。在所述无糖壮苗培养基中，蛭石的含量优选为4-8g/L，蛋白胨的含量优选为2-3g/L，花宝1号的含量优选为2-3g/L，香蕉泥的含量优选为80-120g/L，活性炭的含量优选为2-3g/L。在所述无糖壮苗培养基中，蛭石的最佳含量为8g/L，蛋白胨的最佳含量为2g/L，花宝1号的最佳含量为3g/L，香蕉泥的最佳含量为100g/L，活性炭的最佳含量为2g/L。此外，在步骤③所述的壮苗培养中，一种较优的培养条件如下：培养周期为40-50天，培养温度为25-28℃，光照时间为10-16小时/天，光照强度为50-80μmol/m2·s。
为了进一步提高对植株的光照效果，从而促进植株的光合作用，所述培养箱的箱壁最好由透光材料制成。
（二）实施例
选择6-8月份福建永安当地生长的野生金线莲为种源，除去根和叶并进行清洗和无菌处理后，剪成约0.5-1.5cm长的带茎节的金线莲小段组织后按以下步骤培养：
首先进行丛生芽诱导培养：将经过步骤①处理的金线莲小段组织接种至无糖诱导培养基内，置于上开口敞开的培养箱中进行组织诱导培养丛生芽，培养过程中，按表1所示采用不同的无糖诱导培养基配比和培养条件分成6组进行培养：
表1
接着进行壮苗培养：将通过上述6组培养诱导出的丛生芽分别按表2所示的壮苗培养基配比和培养条件继续分成6组植入无糖壮苗培养基中，置于上开口敞开的培养箱中进行壮苗培养；
表2
通过上述实验结果显示：本发明6组实施例组培获得的金线莲基本上都能够在3个月左右的时间快速长成8公分高度的壮苗，每株苗重量平均1.4g，苗株直径达到3mm以上，每个外植体平均成苗数5.8株，每株平均叶净增3.8张、平均发根数3.5条。组培苗移栽至基质中生长良好，３个月后植株成活率达100％，不仅大大缩短了金线莲组培成苗时间，而且显著提高了培养效率。此外，经检测6组实施例组培获得的金线莲各项指标均优于野生金线莲指标，其中金线莲主要有效成分粗多糖的平均检测含量为2.09mg/g（优于野生金线莲粗多糖含量），总黄酮（以芦丁计）的平均检测含量为0.025g/100g，改变了人工培育植物有效成功普遍低于野生植物性能指标的现状。
Claims (8)
1. 一种金线莲无糖组织培养方法，其特征在于，它包括以下步骤：
①植物体的选择和无菌处理：选择6-8月份生长的金线莲为种源，除去根和叶并进行清洗和无菌处理后，剪成带茎节的金线莲小段组织；
②丛生芽诱导培养：将经过步骤①处理的金线莲小段组织接种至无糖诱导培养基内，置于上开口敞开的培养箱中进行组织诱导培养丛生芽；培养周期为20-60天，培养温度为20-30℃，光照时间为8-20小时/天，光照强度为50-100μmol/m2·s；所述无糖诱导培养基包含以下成分：MS培养基、多孔无机材料、α-萘乙酸和6-苄氨基嘌呤；所述多孔无机材料由蛭石或珍珠岩或砂中的一种或一种以上构成，多孔无机材料的含量为4-10g/L，α-萘乙酸的含量为0.1-3.0mg/L，6-苄氨基嘌呤的含量为2-4mg/L，pH值为5-6；
③壮苗培养：将步骤②诱导出的丛生芽植入无糖壮苗培养基中，置于上开口敞开的培养箱中进行壮苗培养；培养周期为20-60天，培养温度为20-35℃，光照时间为8-20小时/天，光照强度为50-100μmol/m2·s；所述无糖壮苗培养基包含以下成分：B5培养基、多孔无机材料、蛋白胨、花宝1号、香蕉泥和活性炭，所述多孔无机材料由蛭石或珍珠岩或砂中的一种或一种以上构成，多孔无机材料的含量为2-10g/L，蛋白胨的含量为1-5g/L、花宝1号的含量为0.1-3.0g/L、香蕉泥的含量为20-150 g/L，活性炭的含量为0.1-3 g/L，pH值为5.5-6.0。
2.根据权利要求1所述的金线莲无糖组织培养方法，其特征在于：所述无糖诱导培养基中，多孔无机材料由蛭石构成，蛭石的含量为6-8g/L，α-萘乙酸的含量为0.1-0.2mg/L，6-苄氨基嘌呤的含量为2-3mg/L。
3. 根据权利要求2所述的金线莲无糖组织培养方法，其特征在于：所述无糖诱导培养基中，蛭石的含量为8g/L，α-萘乙酸的含量为0.2mg/L、6-苄氨基嘌呤的含量为2mg/L。
4. 根据权利要求1所述的金线莲无糖组织培养方法，其特征在于：在步骤②所述的丛生芽诱导培养中，培养周期为30-45天，培养温度为25-28℃，光照时间为8-14小时/天，光照强度为50-80μmol/m2·s。
5. 根据权利要求1所述的金线莲无糖组织培养方法，其特征在于：所述无糖壮苗培养基中，多孔无机材料由蛭石构成，蛭石的含量为4-8g/L，蛋白胨的含量为2-3g/L，花宝1号的含量为2-3g/L，香蕉泥的含量为80-120g/L，活性炭的含量为2-3g/L。
6. 根据权利要求5所述的金线莲无糖组织培养方法，其特征在于：所述无糖壮苗培养基中，蛭石的含量为8g/L，蛋白胨的含量为2g/L，花宝1号的含量为3g/L，香蕉泥的含量为100g/L，活性炭的含量为2g/L。
7. 根据权利要求1所述的金线莲无糖组织培养方法，其特征在于：在步骤③所述的壮苗培养中，培养周期为40-50天，培养温度为25-28℃，光照时间为10-16小时/天，光照强度为50-80μmol/m2·s。
8. 根据权利要求1-7中任一项所述的金线莲无糖组织培养方法，其特征在于：所述培养箱的箱壁由透光材料制成。
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110608 |