CN113528353A

CN113528353A - 蓝状菌株、生防剂及应用

Info

Publication number: CN113528353A
Application number: CN202110692875.2A
Authority: CN
Inventors: 尹燕妮; 王宁; 商庆华; 陈云; 马忠华
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-06-22
Filing date: 2021-06-22
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2041-06-22
Also published as: CN113528353B

Abstract

本发明公开了一种蓝状菌株、生防剂及应用。所述蓝状菌株的分类命名为蓝状菌(Talaromyces purpureogenus)TP18，保藏号为CGMCC No.22403。该菌株与禾谷镰刀菌具有良好的拮抗作用，可应用于小麦赤霉病的防治；利用该菌株发酵液制备的生防剂对禾谷镰刀菌孢子萌发、菌丝生长以及呕吐毒素产量均有较强的抑制作用，具有很好的应用前景。

Description

蓝状菌株、生防剂及应用

技术领域

本发明涉及植物病害防治领域，特别是涉及蓝状菌株、生防剂及应用。

背景技术

小麦赤霉病又称麦穗枯，是小麦的主要病害之一。在我国小麦赤霉病主要是由禾谷镰刀菌和亚洲镰刀菌引起的。小麦被病菌侵染后会还会产生多种真菌毒素，如脱氧雪腐镰刀菌烯和玉米赤霉烯酮等，这些真菌毒素具有致畸致癌作用以及会损害人和动物的免疫系统等，从而严重威胁人畜的健康。

目前小麦赤霉病的防控主要依赖于四个方面：培育抗病品种、加强田间管理、化学防治以及生物防治等。其中，抗赤霉病小麦育种面临的最大问题为抗源的缺乏，由于外源抗病材料性状欠佳，且环境对赤霉病抗性影响较大，导致育种难度大且效果差；加强田间管理费时费例，收效甚微；化学防治是目前防治小麦赤霉病的主要手段，但长期大量使用化学药剂会产生一系列的问题，例如环境污染、病原菌产生抗药性、土质退化等；生物防治具有不易产生抗性、持效期长、对环境污染小、对农作物和人畜安全等优点，目前，小麦赤霉病的生防研究主要集中于芽孢杆菌(Bacillus spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、木霉菌(Trichoderma spp.)等微生物。

发明内容

本发明提供了一株蓝状菌(Talaromyces purpureogenus)TP18、生防剂及应用，以解决小麦赤霉病的防治困难问题。

本发明的蓝状菌株，分类命名为蓝状菌(Talaromyces purpureogenus)TP18，保藏号为CGMCC No.22403，2021年4月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰1号院3号中国科学院微生物研究所。

可选的，所述蓝状菌株在防治小麦赤霉病中的应用。

可选的，所述蓝状菌株在抑制禾谷镰刀菌、禾谷丝核菌、禾顶囊壳菌、核盘菌、藤仓镰刀菌、尖孢镰刀菌菌丝生长中的应用以及在抑制禾谷镰刀菌和孢子萌发中的应用。

可选的，所述尖孢镰刀菌包括尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporumf.sp.niveum)和尖孢镰刀菌甜瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.melonis)。

可选的，所述蓝状菌株在减少禾谷镰刀菌呕吐毒素中的应用。

本发明还提供了一种生防剂，包含所述蓝状菌株的发酵液粗提物。

可选的，所述发酵液粗提物通过以下方法制得：

提供所述蓝状菌株的发酵液；

将所述发酵液过滤，取滤液进行萃取和蒸发，得到发酵液粗提物。

可选的，所述发酵液的制备方法包括：将活化的蓝状菌株接种于发酵培养液中培养10～14天，得到所述发酵液。

可选的，所述发酵培养液为PDB培养液。

可选的，活化的方法为将保存于冻存管中的蓝状菌株接种于PDA平板上，25℃培养7天。

可选的，所述生防剂还包括溶剂，所述溶剂为甲醇、乙酸乙酯、水中的一种或多种。

本发明还提供了防治小麦赤霉病的方法，在小麦抽穗阶段，将所述的生防剂稀释后喷施于小麦穗部。

可选的，所述生防剂稀释后的浓度为0.2～0.25g/L。

本发明提供的蓝状菌TP18有效抑制禾谷镰刀菌的生长，且利用其发酵液制备的生防剂能够高效抑制禾谷镰刀菌孢子萌发、菌丝生长以及呕吐毒素产生，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为菌株TP18的菌落形态观察图；

图2为蓝状菌TP18的系统发育树；

图3为蓝状菌TP18与禾谷镰刀菌的平板对峙试验的结果图，A：禾谷镰刀菌，B：B1为禾谷镰刀菌，B2为蓝状菌TP18；

图4为生防剂对禾谷镰刀菌孢子萌发的影响结果图，a：未加甲醇和生防剂，b：甲醇，c：实施例4制备的生防剂；d：a放大图，e：b放大图，f：c放大图。

图5为生防剂对禾谷镰刀菌菌丝生长的影响结果图，A：未加生防剂，B：实施例4制备的生防剂；

图6为生防剂对禾谷镰刀菌产呕吐毒素的影响结果图，A：不加生防剂和甲醇，B：甲醇，C：实施例4制备的生防剂；

图7为生防剂对小麦赤霉病的防治效果图，A：无菌水，B：实施例4制备的生防剂；

图8为蓝状菌TP18与其他六种病原菌的平板对峙试验的结果图，A为六种病原菌，其中A1为禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)，A2为禾顶囊壳菌(Gaeumannomycesgraminis)，A3为核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)，A4为藤仓镰刀菌(Fusariumfujikuroi)，A5为尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)，A6为尖孢镰刀菌甜瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.melonis)；B：蓝状菌TP18与六种病原菌的对峙。

图9为生防剂对其他六种病原菌的抑制效果图，A：不加生防剂的培养基中单独培养的六种病原菌，其中其中A1为禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)，A2为禾顶囊壳菌(Gaeumannomyces graminis)，A3为核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)，A4为藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)，A5为尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporumf.sp.niveum)，A6为尖孢镰刀菌甜瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.melonis)；B：在六种病原菌的培养基中加入实施例4制备的生防剂。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但本发明不仅限于此。

以下实施例涉及的培养基和试剂组分包括：

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂粉12g，去离子水1L，121℃灭菌20min，自然pH。

马铃薯葡萄糖培养液(PDB培养液)：马铃薯200g,葡萄糖20g，去离子水1L，121℃灭菌20min，自然pH。

0.7mol/L NaCl培养液：40.908g NaCl，去离子水1L，121℃灭菌20min，自然pH。

YEPD培养液：蛋白胨10g，酵母提取物3g，葡萄糖20g，去离子水定容至1L，121℃灭菌20min，pH 6.7。

CMC培养液：CMC-Na 15g，酵母膏1g，NH₄NO₃ 1g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，121℃灭菌20min，去离子水定容至1L。

4％蔗糖水溶液：称取4g蔗糖溶于100mL去离子水中，121℃灭菌20min，自然pH。

TBI培养液：蔗糖30g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO₄·7H₂O0.01g，腐胺酸盐1.47g，Trace element 200μL，去离子水定容至1L，121℃灭菌20min，pH＝4。

实施例1菌株的分离、纯化和筛选

称取1g浙江省农科院田间土壤加入装有10mL 0.7mol/L NaCl培养基的塑料试管中，震荡混匀，将混匀的液体逐级稀释为10-1，10-2，10-3，混匀后取100uL的液体，涂布于加了抗生素的PDA上，每个梯度三个重复，25℃倒置培养，每天观察平板，对平板上长出的菌株进行纯化，将纯化出的菌株与禾谷镰刀菌PH-1进行对峙培养，具体步骤为：用内径为6mm的打孔器在已活化好的菌株外圈打孔，并接种至直径为9cm PDA平板的一侧，在平板另一侧接种直径为6mm禾谷镰刀菌PH-1菌碟。两菌之间的间隔约为6cm。以PDA平板一侧接种禾谷镰刀菌PH-1菌碟另一侧不做处理为阴性对照，重复3次。菌株放置在25℃，光周期12h的培养箱中进行培养，7d后观察其抑菌带宽度。筛选出一株编号为TP18、对禾谷镰刀菌生长有抑制效果作用的菌株。

实施例2菌株TP18的形态学观察和鉴定

将菌株接种于PDA平板上，25℃培养7天，菌落中间呈青色，边缘为黄色，产生大量的分生孢子，参见图1。

提取菌株的DNA，通过真菌通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)(SEQ IDNO：1)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)(SEQ ID NO：2)对其进行扩增。PCR反应体系为25μL：上下游引物(10μmol/L)ITSl和ITS4各1μL，DNA模板2.5μL，mix 12.5μL，ddH2O 8μL。94℃ 5min；94℃ 30s，53℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min。PCR扩增产物送至杭州擎科生物科技公司进行序列分析，测序结果如下：

GAGGCCCGGTGGAGGGGGGGCGCGAGGGGGCCTCACTCGGTAATGATTCCTCCGCCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAACTCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTTGTATTAAAAAAAAATGTGGTGGTGACCAACCCCCGCAGGTCCTTCCCGAGCGAGTGACAGAGCCCCATACGCTCGAGGACCAGACGGACGTCGCCGCTGCCTTTCGGGCAGGTCCCCGGGGGGGACCACACCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATGCCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTGACAATTTTCATATCACTCAGACAGCCCATCTTCATCAGGGTTCACAGAGCGCCTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGACGGATGTCCCCCGGCGACCGGGTGGCCCCGGTGGGCCCGCCGAAGCAACAGGTGTTGGAGACACGGGTGGGAGGTTGGGCCGCGAGGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTCCCCCTAACGGAAGGGCATTACCGAC(SEQ ID NO：3)

在NCBI上进行Blast比对分析并建立系统发育进化树，参见图2，可知其与蓝状菌(Talaromyces purpureogenus)高度同源，鉴定该菌株为蓝状菌(Talaromycespurpureogenus)，分类命名为蓝状菌(Talaromyces purpureogenus)TP18，并将其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.22403。

实施例3蓝状菌TP18与禾谷镰刀菌平板对峙试验

用内径为6mm的打孔器在已活化好的蓝状菌(Talaromyces purpureogenus)TP18外圈打孔，并接种至直径为9cm PDA平板的一侧，在平板另一侧接种直径为6mm禾谷镰刀菌PH-1菌碟。蓝状菌与禾谷镰刀菌之间的间隔约为6cm。以PDA平板一侧接种禾谷镰刀菌PH-1菌碟另一侧不做处理为阴性对照，重复3次。菌株放置在25℃，光周期12h的培养箱中进行培养，7d后观察其抑菌带宽度，并计算蓝状菌对禾谷镰刀菌PH-1菌丝生长抑制率的大小。菌丝生长抑制率(％)＝(对照组PH-1菌落直径-处理组PH-1菌落直径)/对照组PH-1菌落直径×100％。

如图3所示，与对照组A相比，处理组B中禾谷镰刀菌PH-1(B1)受到蓝状菌TP18(B2)明显的抑制，禾谷镰刀菌PH-1的菌丝生长抑制率为25.1％。

实施例4生防剂的制备

将保存管中蓝状菌TP18接种至PDA固体培养基上，25℃培养7天，用直径6mm打孔器在平板上打菌碟，并将其接种至装有500mL PDB培养液的锥形瓶中，25℃发酵14天，之后用2层纱布进行过滤，将得到的过滤液用乙酸乙酯按照1：1的体积比进行萃取，将乙酸乙酯层在旋转蒸发仪中蒸发，得到的发酵液粗提物用甲醇进行溶解，得到浓度为0.24g/mL的生防剂，并储存于-20℃的冰箱中备用。

实施例5生防剂对禾谷镰刀菌菌丝生长的影响

将实施例4制备的生防剂按照1：200的体积比加到冷却至50℃以下的PDA培养基中，充分混匀之后倒板，以加入等体积甲醇为对照，并设置不加生防剂以及只加甲醇的对照平板，等凝固后，将禾谷镰刀菌PH-1菌碟接种至平板中央，25℃培养3天，每个平板设置3个重复，3天后观察禾谷镰刀菌的生长是否受到了抑制，拍照记录以及测量培养三天后菌丝的生长直径，并计算抑制率，抑制率(％)＝(对照组平均直径－实验组平均直径)/对照组平均直径。

如图4所示，生防剂对禾谷镰刀菌PH-1的菌丝抑制率达到了79.3％，显著抑制了禾谷镰刀菌菌丝的生长。

实施例6生防剂对禾谷镰刀菌孢子萌发的影响

在禾谷镰刀菌PH-1平板上的边缘部位打三个菌碟，将其放入装有100mLCMC培养基的锥形瓶中，25℃，180rpm摇培3天，3天后，用3层滤纸过滤孢子，5000rpm，离心10分钟，将得到的孢子用4％的蔗糖水稀释到5x10⁵CFU/mL，吸取100μL于1.5mL离心管中，向其中加入0.5μL实施例4制备的生防剂，混匀，之后吸取20μL到载玻片上，载玻片放于湿盒中，以不加生防剂的孢子悬液为对照，每个实验3次重复，4-6h后在显微镜下观察孢子的萌发情况。

如图5所示，禾谷镰刀菌孢子的抑制率达到了100％，显著抑制了禾谷镰刀菌孢子的萌发，而溶剂甲醇对禾谷镰刀菌的孢子没有抑制作用。

实施例7生防剂对禾谷镰刀菌产DON毒素的影响

用灭过菌的牙签在禾谷镰刀菌PH-1平板的边缘位置戳小菌球，将这些小菌球移到装有30mL的YEPD培养基中，25℃，180rpm摇培21-24h；将小菌球移到灭过菌的2mL离心管中，加入1颗钢珠，用样品研磨机进行研磨，45Hz，90s；

吸取30μL样品加入到含有30mL TBI培养基的锥形瓶中，并且向其中加入50μL实施例4制备的生防剂，28℃摇培7天；以等体积甲醇作为阴性对照，CK代表不加生防剂；使用从江苏维赛科技生物发展有限公司购买的呕吐毒素(DON)酶联免疫检测试剂盒进行DON毒素含量的测定。

如图6所示，相比于对照组(A)，在甲醇处理后，禾谷镰刀菌DON毒素的产量并没有降低，说明生防剂的溶剂甲醇没有降低DON毒素产生的作用，而在实施例4制备的生防剂处理后，禾谷镰刀菌PH-1产生的DON毒素下降了88％，显著降低了DON毒素的产生。

实施例8小麦防效实验

选取田间扬花初期的小麦，收集麦穗并将麦穗裁剪成相同高度，去除所有叶片；在麦穗上喷洒稀释1000倍的实施例4制备的生防剂，并自然晾干，以喷洒无菌水为对照，然后将麦穗的茎部置于无菌水中、室温保养一夜后，向穗部单花内注射10μL的禾谷镰刀菌PH-1的孢子悬浮液(浓度为4×10⁵/mL)，并在颖壳上标记接种病原菌的小穗，放在人工气候箱中，人工气候箱设置温度25℃，湿度80％，光照12h，黑暗12h交替培养4-6d，观察、记录小麦穗部赤霉病发病情况，并计算病害指数。病害严重度的分级标准：1级，病穗占全穗的1/4以下；2级，病穗占全穗的1/4-l/2；3级，病穗占全穗的1/2-3/4；4级，病穗占全穗的3/4以上。病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100％。

参见图7，对照组(A)中小麦病情指数为82.1％，而试验组(B)中小麦病情指数为28.6％，表明生防剂可以有效防治小麦赤霉病的发生，防治效果达到71.4％。

实施例9蓝状菌TP18对其他病原菌的抑制效果

用内径为6mm的打孔器在已活化好的蓝状菌TP18外圈打孔，接种至直径为9cm PDA平板的一侧，在平板另一侧接种直径为5.5mm小麦纹枯病菌—禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)，小麦全蚀病菌—禾顶囊壳菌(Gaeumannomyces graminis)，核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)，水稻恶苗病菌—藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)，西瓜枯萎病菌—尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)以及甜瓜枯萎病菌—尖孢镰刀菌甜瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.melonis)六种病原菌菌碟。两菌之间的间隔约为6cm。以PDA平板一侧接种病原菌菌碟另一侧不做处理为阴性对照，重复3次。将平板放置在25℃，光周期12h的培养箱中进行培养，7d后观察其抑菌效果。菌丝生长抑制率＝(对照组PH-1菌落直径-处理组PH-1菌落直径)/对照组PH-1菌落直径×100％。

参见图8，酒色青霉PV401对小麦纹枯病菌(A1)，小麦全蚀病菌(A2)，核盘病菌(A3)，水稻恶苗病菌(A4)，西瓜枯萎病菌(A5)以及甜瓜枯萎病菌(A6)六种病原菌菌丝的抑制率分别为20.8％，19.7％，39.5％，15.6％，17.7％以及20.1％，发现蓝状菌TP18对水稻恶苗病病菌的抑制率最低，对核盘病菌的抑制率最高。

然后将实施例4制备的生防剂按照1：200的体积比加到冷却至50以下的PDA培养基中，充分混匀之后倒板，并设置不加生防剂对照平板，等凝固后，将小麦纹枯病菌，小麦全蚀病菌，核盘病菌，水稻恶苗病菌，西瓜枯萎病菌以及甜瓜枯萎病菌菌碟接种至平板中央，25℃培养3天，每个平板设置3个重复，3天后观察小麦纹枯病菌，小麦全蚀病菌，核盘病菌，水稻恶苗病菌，西瓜枯萎病菌以及甜瓜枯萎病菌生长是否受到了抑制，拍照记录以及测量培养三天后菌丝的生长直径，并计算抑制率，

抑制率(％)＝(对照组平均直径－实验组平均直径)/对照组平均直径

如图9所示，生防剂对西瓜枯萎病菌(A5)，甜瓜枯萎病菌(A6)的抑制率分别为31％，67.2％，而对小麦纹枯病菌(A1)，小麦全蚀病菌(A2)，核盘病菌(A3)，水稻恶苗病菌(A4)菌丝抑制率基本达到100％，显著抑制了菌丝的生长。

本发明针对小麦赤霉病防治困难的现状，筛选出一株与禾谷镰刀菌具有良好的拮抗作用的蓝状菌TP18；利用该菌株发酵液制备的生防剂能够有效抑制禾谷镰刀菌、禾谷丝核菌、禾顶囊壳菌、核盘菌、藤仓镰刀菌、尖孢镰刀菌菌丝生长，以及对禾谷镰刀菌孢子萌发和呕吐毒素产生均有较强的抑制作用，具有很好的应用前景。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 蓝状菌株、生防剂及应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

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<211> 20

<212> DNA

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tcctccgctt attgatatgc 20

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<211> 650

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

gaggcccggt ggaggggggg cgcgaggggg cctcactcgg taatgattcc tccgccttat 60

tgatatgctt aagttcagcg ggtaactcct acctgatccg aggtcaacct tgtattaaaa 120

aaaaatgtgg tggtgaccaa cccccgcagg tccttcccga gcgagtgaca gagccccata 180

cgctcgagga ccagacggac gtcgccgctg cctttcgggc aggtccccgg gggggaccac 240

acccaacaca caagccgtgc ttgagggcag aaatgacgct cggacaggca tgccccccgg 300

aatgccaggg ggcgcaatgt gcgttcaaag attcgatgat tcacggaatt ctgcaattca 360

cattacttat cgcatttcgc tgcgttcttc atcgatgccg gaaccaagag atccattgtt 420

gaaagttttg acaattttca tatcactcag acagcccatc ttcatcaggg ttcacagagc 480

gcctcggcgg gcgcgggccc ggggacggat gtcccccggc gaccgggtgg ccccggtggg 540

cccgccgaag caacaggtgt tggagacacg ggtgggaggt tgggccgcga ggggccctca 600

ctcggtaatg atccttccgc aggtccccct aacggaaggg cattaccgac 650

Claims

1.蓝状菌株，其特征在于，分类命名为蓝状菌(Talaromyces purpureogenus)TP18，保藏号为CGMCC No.22403。

2.根据权利要求1所述的蓝状菌株在防治小麦赤霉病中的应用。

3.根据权利要求1所述的蓝状菌株在抑制禾谷镰刀菌、禾谷丝核菌、禾顶囊壳菌、核盘菌、藤仓镰刀菌、尖孢镰刀菌菌丝生长中的应用以及在抑制禾谷镰刀菌孢子萌发中的应用。

4.根据权利要求1所述的蓝状菌株在减少禾谷镰刀菌呕吐毒素中的应用。

5.生防剂，其特征在于，包含如权利要求1所述蓝状菌株的发酵液粗提物。

6.根据权利要求5所述的生防剂，其特征在于，所述发酵液粗提物通过以下方法制得：

提供所述蓝状菌株的发酵液；

7.根据权利要求6所述的生防剂，其特征在于，还包括溶剂，所述溶剂为甲醇、乙酸乙酯、水中的一种或多种。

8.防治小麦赤霉病的方法，其特征在于，在小麦抽穗阶段，将权利要求5所述生防剂稀释后喷施于小麦穗部。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述生防剂稀释后的浓度为0.2～0.25g/L。