CN102370975A - 斑点叉尾鮰爱德华氏病疫苗的制备方法 - Google Patents

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黄婷
李莉萍
陈福艳
张彬
雷爱莹
王瑞
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Abstract

本发明提供了一种鮰爱德华氏菌灭活疫苗的制备方法，包括从病鱼体内分离的鮰爱德华氏菌的分离纯化，小体积活化培养，生物反应器的扩大培养，鮰爱德华氏菌的灭活、离心收集，提取毕赤酵母的基因组DNA，在灭活完全的菌体中加入毕赤酵母基因组DNA混合，制成鮰爱德华氏菌灭活疫苗。本发明的疫苗使用安全，无药物残留，免疫防治效果显著，能够有效预防斑点叉尾鮰爱德华氏菌病的发生，免疫保护率可达80％。使用可调连续注射器进行免疫接种方便，大大提高了免疫效率和接种疫苗剂量准确性。本发明的疫苗其制备方法操作简单，成本低廉，且疫苗可用于斑点叉尾鮰疾病的防治，具有很高的商业价值。

Description

斑点叉尾鮰爱德华氏病疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及一种鱼的疾病的预防和防治方法，具体说是涉及斑点叉尾鮰爱德华氏病灭活疫苗的制备方法。
背景技术
斑点叉尾鮰原产于美洲，该鱼具有适应广、食性杂、生长快、肉质鲜嫩、出肉率高、无肌间刺、加工简单等特点，1984年从美国引入我国养殖，是当前水产养殖业的重要养殖品种之一。随着全球性海洋捕捞渔业资源的衰退，国际市场对水产养殖产品的需求越来越大。据不完全统计，我国斑点叉尾鮰年产量为10万吨左右，2009年出口量1.9万吨，出口额0.7亿美元，是我国水产品出口创汇主要品种之一。
近年来随着片面地重视规模化发展和高产，造成斑点叉尾鮰养殖病害频频暴发，其中由鮰爱德华氏菌引起的斑点叉尾鮰肠道败血症成了鮰鱼养殖业危害最大的传染病，并且有逐年递增的趋势。病害的暴发与随之带来的产品安全问题已成为制约我国斑点叉尾鮰产业继续向前发展的瓶颈。然而，目前缺乏一套行之有效的方案预防和治疗该病，药物只能在早期起到控制病情的辅助性作用，但随着耐药和抗药性的产生和积累，该病的现状几乎是“无药可治可防”。疫苗免疫是预防和控制斑点叉尾鮰爱德华氏菌病最具前景、安全和环保的方法之一，必需及早研制。研究发现，斑点叉尾鮰爱德华氏菌病的流行菌种主要为Edwardsiella ictaluri。
发明内容
本发明的目的是为了控制斑点叉尾鮰爱德华氏菌病的传播与爆发，提供一种鮰爱德华氏菌灭活疫苗的制备方法，该方法能有效地预防鮰爱德华氏菌引发的鮰爱德华氏菌病，对养殖斑点叉尾鮰具有保护作用。
本发明采取的技术方案是：
本发明斑点叉尾鮰爱德华氏菌病灭活疫苗的制备方法主要包括鮰爱德华氏菌的分离纯化、小体积活化培养、生物反应器的扩大培养、鮰爱德华氏菌的灭活、离心收集、提取毕赤酵母的基因组DNA、在灭活完全的菌体中加入一定量毕赤酵母基因组DNA混合等步骤。
申请人已将所述鮰爱德华氏菌菌种送到中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期为2010年7月30日，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2010191，分类命名为鮰爱德华氏菌CME001，Edwardsiella ictaluri CME001。
该方法利用分离到的高免疫原性强毒力鮰爱德华氏菌菌株，通过培养基和培养条件的优化培养提高主要保护性抗原的产量，以及采用的灭活方法可以减少灭活制备过程抗原的损失，加入毕赤酵母基因组DNA作为佐剂，组分的配伍设计科学合理，对目前养殖斑点叉尾鮰具有保护作用，有效地预防鮰爱德华氏菌引发的鮰爱德华氏菌病。
本发明的有益效果：
1.本发明的斑点叉尾鮰爱德华氏菌灭活疫苗使用安全，无药物残留，免疫防治效果显著，能够有效预防斑点叉尾鮰爱德华氏菌病的发生，免疫保护率可达80％。
2.加入佐剂设计科学合理，免疫效果好于单一鮰爱德华氏菌灭活疫苗。
3.使用可调连续注射器进行免疫接种方便，大大提高了免疫效率和接种疫苗剂量准确性。
4.本发明的疫苗其制备方法操作简单，成本低廉，且疫苗可用于斑点叉尾鮰疾病的防治，具有很高的商业价值。
具体实施方式
1.将从病鱼体内分离的鮰爱德华氏菌接种到胰蛋白胨大豆琼脂培养基，28±0.5℃培养48小时。
2.将步骤(1)固体培养基上培养好的菌体，接种到已经高压灭菌并盛有1000ml的胰蛋白胨大豆液体培养基的锥形瓶中，在振荡摇床中进行小体积的液体活化培养，培养温度28±0.5℃，摇床转速120-150转/分，培养时间为20-24小时。
3.按2％或3％的比例将步骤(2)中培养好的菌体接种到生物反应器中已经高压灭菌的胰蛋白胨大豆液体培养基中，培养温度28±0.5℃，培养时间24-48小时，当鮰爱德华氏菌生长到高峰，停止反应。
4.取出步骤(3)培养的菌液，加入0.2％福尔马林溶液，灭活24-48小时。
5.离心后用磷酸盐缓冲溶液将所得菌体稀释成浓度为5.0×107-5.0×108CFU/ml。
6.将购买的毕赤酵母接种到YPD培养基，30±0.5℃培养24小时。
7.将步骤(6)固体培养基上培养好的菌体，接种到已经高压灭菌并盛有100ml的YPD液体培养基的锥形瓶中，在振荡摇床中进行液体活化培养，培养温度30±0.5℃，摇床转速120-150转/分，培养时间为30小时。
8.按酵母基因组DNA提取试剂盒说明书提取毕赤酵母基因组DNA，用水将DNA稀释到一定浓度。
9.最后根据斑点叉尾鮰的发病规律及程度，使用前在灭活菌中加入一定量的毕赤酵母基因组DNA(2.5μg/尾)制成鮰爱德华氏菌灭活疫苗。该疫苗的保存方法是灭活菌保存于-20℃，毕赤酵母基因组DNA保存于-20℃。
疫苗的安全性检查方法有三种：一是将灭活的菌体接种到胰蛋白胨大豆液体培养基中振荡培养，培养温度28±0.5℃，摇床转速120-150转/分，培养时间为24-48小时，如培养液无混浊情况出现，即无细菌生长表明灭活完全；二是将灭活的菌体接种到胰蛋白胨大豆固体培养基培养，培养温度28±0.5℃，培养时间为24-48小时，无菌落出现表明灭活完全；三是将成品疫苗腹腔注射50-100克的斑点叉尾鮰，注射剂量0.4-0.6毫升/尾，养殖观察15-20天，如鱼无发病症状和死亡，表明该疫苗灭活完全且安全。
斑点叉尾鮰爱德华氏菌灭活疫苗的使用方法：将制备好的鮰爱德华氏菌灭活疫苗，用可调连续注射器胸腔或腹腔注射0.2-0.4毫升/尾，实施注射免疫。鱼体大小在25克以上均可以进行注射，鱼体体重为25-150克时注射0.2-0.3毫升/尾，体重150克以上时注射0.3-0.4毫升/尾，注射疫苗浓度为5.0×107-5.0×108CFU/ml。

Claims (1)

1.一种斑点叉尾鮰爱德华氏菌病灭活疫苗的制备方法，其特征是：包括从病鱼体内分离的鮰爱德华氏菌的分离纯化，小体积活化培养，生物反应器的扩大培养，鮰爱德华氏菌的灭活、离心收集，提取毕赤酵母的基因组DNA，在灭活完全的菌体中加入毕赤酵母基因组DNA混合，制成鮰爱德华氏菌灭活疫苗。
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CN105056220A (zh) * 2015-07-14 2015-11-18 霍邱县绿波水产科技服务有限公司 一种斑点叉尾鮰爱德华氏菌病疫苗的制备方法

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CN101705198A (zh) * 2009-01-23 2010-05-12 中国科学院海洋研究所 迟缓爱德华菌弱毒菌株及应用

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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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