CN101028513B - 海水鱼弧菌高效疫苗的制备 - Google Patents
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Abstract
一种海水鱼弧菌高效疫苗的制备，该弧菌高效疫苗是溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌中的两种或两种以上灭活细菌科学配伍构成。它们是从各类发病海水鱼体内分离纯化而来，并筛选出毒力强、免疫原性强的菌株，以生物反应器优化培养后，再进行科学控制灭活处理，最后按等比例混合后得到相应的弧菌高效疫苗：现场使用推荐采用连续注射免疫方式。本发明所制备的弧菌高效疫苗，能有效抵抗各种鱼类致病弧菌的侵染。其制备和使用方便，安全可靠，且免疫效果好，免疫保护率可达80-95％，生产易于产业化，在海水鱼养殖中应用前景非常广阔。
Description
技术领域：
本发明属于微生物学、免疫学和水产动物病害防治领域，特别是涉及到一种海水鱼弧菌高效疫苗的制备和使用方法。
背景技术：
海水鱼弧菌病是海水养殖过程中最常见、危害最严重的病害之一，给海水鱼养殖业造成巨大的经济损失。长期以来，使用化学药物防治弧菌病带来的多重耐药性、药物残留和在环境中的扩散已经引起了食品安全和环境公共卫生方面的严重问题。另外目前所使用的弧菌疫苗存在着作用对象单一，抗弧菌种类专一，主要保护性抗原的抗原性不强、产量不高、抗原灭活过程损失过大及免疫保护率低下等多方面的问题，使其在生产上的应用受到了极大的限制。经长期对海水鱼类病害的研究发现，溶藻弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌是引起海水鱼类弧菌病的主要病原菌。但是由于弧菌的种类众多、株型毒力差异较大，免疫原性强弱不同，因此强免疫原性的强毒株的选择，优化的培养基和培养条件以及科学配伍对高效的疫苗制备具有重要的意义。
发明内容：
本发明的目的是为了弥补上述现有技术存在的不足，提供一种弧菌高效疫苗的制备方法，该方法利用分离到的高免疫原性强毒力弧菌菌株，通过培养基和培养条件的优化培养提高主要保护性抗原的产量，以及采用的灭活方法可以减少灭活制备过程抗原的损失，组分的配伍设计科学合理，对目前养殖中常见的海水养殖鱼类均能起到保护作用，有效地预防多种致病弧菌引发的弧菌病。
本发明的另一目的是提供一种快速方便、现场可行、机械损伤小的疫苗的使用方法。
本发明海水鱼弧菌高效疫苗的制备方法主要包括各种病原弧菌的分离纯化、小体积活化培养、生物反应器的扩大培养、弧菌的灭活、洗涤收集、将灭活完全的菌体按等比例混合等步骤：
(1)将分离纯化于各种海水鱼体内共有的强毒力和强免疫原性的溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌分别接种到胰蛋白胨大豆琼脂培养基TSA(含1.5-2％Nacl)，28±0.5℃培养24小时；
(2)分别将步骤(1)培养好的菌体，分别接种到已经高压灭菌并盛有胰蛋白胨大豆肉汤培养基TSB(含1.5-2％Nacl)的锥形瓶中，在振荡摇床中进行小体积的液体培养，培养温度28±0.5℃，摇床转速100-200转/分，培养时间为12-24小时；
(3)将按1％的比例将步骤(2)中培养好的菌体分别接种到生物反应器中已经高压灭菌的胰蛋白胨大豆肉汤培养基TSB(含1.5-2％Nacl)中，培养温度为28±0.5℃，搅拌速度为400-600转/分，培养时间为18-24小时，当弧菌生长到高峰，停止反应；
(4)取出步骤(3)培养的菌液，加入0.5-1％(V/V)福尔马林溶液，4℃搅拌灭活24-48小时；
(5)取出灭活的菌液在冷冻离心机中(4℃)，6000-8000转/分离心10-20分钟，收集沉淀；
(6)沉淀用无菌磷酸盐缓冲液PBS(0.01mol/L，pH7.2)或含0.85％Nacl的生理盐水悬浮，再用6000-8000转/分离心10-20分钟，如此重复3次以去除福尔马林；
(7)将最后的离心所得的沉淀用无菌磷酸盐缓冲液(0.01mol/LPBS，pH7.2)或含0.85％Nacl的盐水悬浮，稀释成浓度为1×109-5×109个/毫升；
(8)最后根据海水鱼发病规律，选择以上各种灭活菌其中的2种或2种以上，以等比例混合制成弧菌高效疫苗。
该疫苗的安全性检查方法有三种：一是将灭活的菌体接种到TSB(含1.5-2％Nacl)中振荡培养，培养温度28±0.5℃，摇床转速100-200转/分，培养时间为24-48小时，如培养液无混浊情况出现，即无细菌生长表明灭活完全；将灭活的菌体接种到含TSA(含1.5-2％Nacl)中培养，培养温度28±0.5℃，培养时间为24-48小时，无菌落出现表明灭活完全；将灭活好的疫苗腹腔注射30-100克的鲫鱼或海水鱼，注射剂量0.2-0.3毫升，养殖观察10-15天，如鱼无发病症状和死亡，表明该疫苗灭活完全且是安全的。
该疫苗的保存方法是将其置于4℃冰箱中保存；或者冷冻干燥后4℃保存。
弧菌高效疫苗的使用方法是：
将制备好的弧菌高效疫苗，用1毫升连续注射器腹腔或肌肉注射0.1-0.3ml，以实施注射免疫。鱼体大小在25克以上均可以进行注射，鱼体体重为25-250克时每尾鱼注射0.1-0.2ml，体重250克以上时每尾鱼注射0.2-0.3ml，注射疫苗浓度在5×108-5×109个/毫升。
本发明的优点和效果在于：运用弧菌高效疫苗，可以解决本领域的几个主要的问题：
1.主要保护性抗原产量最高，抗原性强，保护性抗原损失小，免疫保护效果最佳，免疫保护率可达80-95％。
2.各组分的配伍设计科学合理，免疫效果好于单一组分弧菌灭活疫苗，最大程度地提高了免疫效率。
3.高效安全，无药物残留污染。
4.广谱抵御各种海水鱼致病弧菌的侵袭感染，其适用对象为各种海水养殖鱼类，应用市场广阔，并易于产业化。
5.用连续注射器进行免疫接种使用方便，不仅提高了免疫的效率，也减少了常规注射器可能引起的污染。
具体实施方式：
本发明用下列实施例来进一步说明。
实施例1
分别将溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌进行小体积活化培养后，取50毫升分别接种于装有5000ml TSB(含1.5-2％Nacl)液体培养基的生物反应器中，在28±0.5℃下，400-600转/分，培养24小时，停止反应，取出培养物，加入25ml福尔马林，4℃搅拌灭活48小时，取出灭活菌液，8000转/分冷冻离心20分钟，弃培养液留沉淀用25倍无菌磷酸盐缓冲液悬浮，8000转/分离心，如此反复3次，最后加入无菌磷酸盐缓冲液悬浮，稀释成浓度为3×109个/毫升的菌液，最后三种灭活菌液等比例混合，得到各灭活弧菌终浓度1×109个/毫升的弧菌高效疫苗。
实施例2
分别将溶藻弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌进行小体积活化培养后，取50毫升接种于装有5000ml TSB(含1.5-2％Nacl)液体培养基的生物反应器中，在28±0.5℃下，400-600转/分，培养时间，培养24小时，停止反应，取出培养物，加入25ml福尔马林，4℃搅拌灭活48小时，取出灭活培养菌液，8000转/分冷冻离心20分钟，弃培养液留沉淀用25倍无菌磷酸盐缓冲液悬浮，8000转/分离心，如此反复3次，最后加入无菌磷酸盐缓冲液悬浮，稀释成浓度为3×109个/毫升的菌液，最后三种灭活菌液等比例混合，得到各灭活弧菌终浓度1×109个/毫升的弧菌高效疫苗。
实施例3
分别将溶藻弧菌、鳗弧菌和副溶血弧菌进行小体积活化培养后，取50毫升接种于装有5000ml TSB(含1.5-2％Nacl)液体培养基的生物反应器中，在28±0.5℃下，400-600转/分，培养24小时，停止反应，取出培养物，加入25ml福尔马林，4℃搅拌灭活48小时，取出灭活培养菌液，8000转/分冷冻离心20分钟，弃培养液留沉淀用25倍无菌磷酸盐缓冲液悬浮，8000转/分离心，如此反复3次，最后加入无菌磷酸盐缓冲液悬浮，稀释成浓度为3×109个/毫升的菌液，最后三种灭活菌液等比例混合，得到各种灭活弧菌终浓度1×109个/毫升的弧菌高效疫苗。
实施例4
分别将溶藻弧菌、哈氏弧菌、副溶血弧菌和鳗弧菌进行小体积活化培养后，取50毫升接种于装有5000ml TSB(含1.5-2％Nacl)液体培养基的生物反应器中，在28±0.5℃下，400-600转/分，培养24小时，停止反应，取出培养物，加入25ml福尔马林，4℃搅拌灭活48小时，取出灭活培养菌液，8000转/分冷冻离心20分钟，弃培养液留沉淀用25倍无菌磷酸盐缓冲液悬浮，8000转/分离心，如此反复3次，最后加入无菌磷酸盐缓冲液悬浮，稀释成浓度为4×109个/毫升的菌液，最后四种灭活菌液等比例混合，得到各种灭活弧菌终浓度1×109个/毫升的弧菌高效疫苗。
实施例5
分别将溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌和副溶血弧菌进行小体积活化培养后，取50毫升分别接种于装有5000ml TSB(含1.5-2％Nacl)液体培养基的生物反应器中，在28±0.5℃下，400-600转/分，培养时间，培养24小时，停止反应，取出培养物，加入25ml福尔马林，4℃搅拌灭活48小时，取出灭活培养菌液，8000转/分冷冻离心20分钟，弃培养液留沉淀用25倍无菌磷酸盐缓冲液悬浮，8000转/分离心，如此反复3次，最后加入无菌磷酸盐缓冲液悬浮，稀释成浓度为4×109个//毫升的菌液，最后四种灭活菌液等比例混合，得到各种灭活弧菌终浓度1×109个/毫升的弧菌高效疫苗。
实施例6
分别将溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鳗弧菌进行小体积活化培养后，取50毫升分别接种于盛有5000ml TSB(含1.5-2％Nacl)液体培养基的生物反应器中，在28±0.5℃下，400-600转/分，培养24小时，停止反应，取出培养物，加入25ml福尔马林，4℃搅拌灭活48小时，取出灭活培养菌液，8000转/分冷冻离心20分钟，弃培养液留沉淀用25倍无菌磷酸盐缓冲液悬浮，8000转/分离心，如此反复3次，最后加入无菌磷酸盐缓冲液悬浮，稀释成浓度为5×109个/毫升的菌液，最后五种灭活菌液等比例混合，得到各种灭活弧菌终浓度1×109个/毫升的弧菌高效疫苗。
Claims (1)
1.一种海水鱼弧菌高效疫苗的制备方法，其中弧菌菌种包括：溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌，其特征在于：该制备方法主要是弧菌菌株的分离纯化、液体的活化培养、生物反应器的扩大培养、培养物的灭活和洗涤及疫苗的混合；
所述海水鱼弧菌高效疫苗的制备方法按以下步骤：
(1)将分离纯化于各种发病海水鱼的强毒力和强免疫原性的溶藻弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌分别接种到含1.5-2％Nacl的胰蛋白胨大豆琼脂培养基，28±0.5℃培养24小时；
(2)分别将步骤(1)固体培养基上培养好的菌体，接种到已经高压灭菌并盛有含1.5-2％Nacl的胰蛋白胨大豆肉汤培养基的锥形瓶中，在振荡摇床中进行小体积的液体活化培养，培养温度28±0.5℃，摇床转速100-200转/分，培养时间为12-24小时；
(3)按1％的比例将步骤(2)中培养好的菌体接种到生物反应器中已经高压灭菌的含1.5-2％Nacl的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，培养温度为28±0.5℃，搅拌速度为400-600转/分，培养时间为18-24小时，当弧菌生长到高峰，停止反应；
(4)取出步骤(3)培养的菌液，加入0.5-1％福尔马林溶液，4℃搅拌灭活24-48小时；
(5)取出灭活的菌液在冷冻离心机中，于4℃下6000-8000转/分离心10-20分钟，收集沉淀；
(6)沉淀用浓度0.01mol/L，pH7.2的无菌磷酸盐缓冲液PBS或含0.85％Nacl的盐水悬浮，再用6000-8000转/分离心10-20分钟，如此重复3次以去除福尔马林；
(7)将最后的离心所得的沉淀用浓度0.01mol/L，pH7.2的无菌磷酸盐缓冲液PBS或含0.85％Nacl的盐水悬浮，稀释成浓度为1×109-5×109个/毫升；
(8)最后根据海水鱼发病规律，选择以上各种灭活菌其中的2种或2种以上，以等比例混合制成弧菌高效疫苗。
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| CN101816784B (zh) * | 2009-02-27 | 2012-08-01 | 中国科学院海洋研究所 | 一种免疫保护性亚单位疫苗及其制备和应用方法 |
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