CN115885900B - 一种提高长牡蛎及其幼虫弧菌抗性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于病原菌防治技术领域，公开了一种提高长牡蛎及其幼虫弧菌抗性的方法。本发明方法包含：将长牡蛎浸泡于含有浓度为5x104～5x105CFU/mL的经过灭活的溶藻弧菌的海水中进行免疫启动，并用免疫启动后的长牡蛎生产幼虫。本发明通过灭活的溶藻弧菌引发长牡蛎的先天免疫记忆，在被福尔马林灭活的溶藻弧菌引发免疫反应后，长牡蛎的DNA甲基化等表观遗传也随之发生变化，一方面为长牡蛎提供了二次接触溶藻弧菌后产生更快更强的免疫反应；另一方面将增强的弧菌抗性遗传给子代，并为子代提供广谱性的弧菌抗性。
Description
技术领域
本发明涉及病原菌防治技术领域，具体涉及一种提高长牡蛎及其幼虫弧菌抗性的方法。
背景技术
弧菌是一类广泛存在于海洋和河口流域的革兰氏阴性细菌，许多种类的弧菌已经被证实是水产养殖动物的重要病原菌。溶藻弧菌、哈维氏弧菌等严重威胁我国水产养殖行业，对鱼类、甲壳类、贝类等行业的发展造成了严重的危害。传统防治弧菌病的方法主要包括抗生素治疗、减活或者灭活疫苗、基因工程等。但是通过基因工程，例如中国专利CN102296044A，这一方法耗时耗力，成本高。抗生素治疗则可能造成严重的环境问题。因此减活或者灭活疫苗是一种比较简单理想的防治水产动物弧菌病的手段。
传统上的疫苗都是为具有适应性免疫的有颌鱼类制备的，例如：CN 114099657 A、CN 102283143 B。因此贝类、甲壳类等无脊椎动物不存在经典的适应性免疫，无法通过疫苗等方法提高对同一病原的抗性。而且，适用于有颌鱼类的疫苗往往只能针对单一弧菌进行预防，但由于海洋环境中致病性弧菌的多样应，这些疫苗很可能无法有效保护水产动物在海洋环境中免受其他种类弧菌的危害。除此之外，由于无脊椎动物相比于有颌鱼类有更小的体型，通过注射疫苗这一方式会及其繁琐，浪费大量的人力物力。
长牡蛎（Crassostrea gigas）是我国北方重要的贝类养植物种，但是近年来，长牡蛎夏季大规模死亡的报道时有出现，这对长牡蛎养殖行业造成了严重的威胁，导致了严重的经济损失。研究指出，弧菌是导致长牡蛎大规模死亡的重要因素，且存在多种对长牡蛎具有高毒力的弧菌。由于长牡蛎不存在经典的适应性免疫，因此被认为无法通过口服或注射疫苗的方式提高对弧菌的抗性。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为解决背景技术中的问题，本发明提供了一种提高长牡蛎及其幼虫弧菌抗性的方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种提高长牡蛎及其幼虫弧菌抗性的方法，包含：
将长牡蛎浸泡于含有浓度为5x104～5x105CFU/mL的经过灭活的溶藻弧菌的海水中进行免疫启动，并用免疫启动后的长牡蛎生产幼虫。
优选的，使用福尔马林对溶藻弧菌进行灭活处理。
优选的，将长牡蛎浸泡于含有经过灭活的溶藻弧菌的海水中24～25小时，在生产幼虫前转移到过滤的海水中保持7天。
优选的，所述溶藻弧菌的灭活方法包含：
将TCBS琼脂培养基上的溶藻弧菌挑到2216E培养基中进行扩增培养，除去多余的培养基后，使用无菌海水重悬弧菌，重复3次，得到重悬菌液；
向重悬菌液中加入福尔马林在4℃下培养24小时，得到细菌悬浮液，并离心、洗涤。
优选的，所述向重悬菌液中加入福尔马林前，将重悬菌液浓度调整为4x108～5x108CFU/mL，加入的福尔马林的终浓度为1% （v/v）。
优选的，所述扩增培养温度为25℃、时间为6小时，转速为150 rpm。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次将灭活的弧菌作用于长牡蛎上，通过较低浓度（5x104～5x105CFU/mL）灭活的溶藻弧菌引发了长牡蛎的先天免疫记忆，在被福尔马林灭活的溶藻弧菌引发免疫反应后，长牡蛎的DNA甲基化等表观遗传也随之发生变化，一方面为长牡蛎提供了二次接触溶藻弧菌后产生更快更强的免疫反应，降低了长牡蛎被溶藻弧菌感染后的死亡率；另一方面将增强的弧菌抗性遗传给子代，并为子代提供广谱性的弧菌抗性。
附图说明
图1为实施例1中不同浓度的灭活溶藻弧菌对长牡蛎二次感染后长牡蛎的存活率；
图2为实施例1中浓度为5x104 CFU/mL灭活的溶藻弧菌对长牡蛎子代弧菌抗性的影响。
具体实施方式
下面通过实施例及测试例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例和测试例只用于对本发明进行进一步说明，但本发明的内容不仅限于实施例中所涉及的内容，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。
本发明实施方式提供了一种提高长牡蛎及其幼虫弧菌抗性的方法，包含：
将长牡蛎浸泡于含有浓度为5x104～5x105CFU/mL的经过灭活的溶藻弧菌的海水中进行免疫启动，并用免疫启动后的长牡蛎生产幼虫。
本发明区别于现有技术的关键在于从动物中普遍存在的先天免疫记忆出发，提出了一种保护长牡蛎等无脊椎动物免受弧菌威胁的新方法。这一关键点为不存在经典的适应性免疫的长牡蛎提供了一种可行提高长牡蛎及其子代弧菌抗性的方法。
本发明首次将灭活的弧菌作用于长牡蛎上，通过较低浓度（5x104～5x105CFU/mL）灭活的溶藻弧菌引发了长牡蛎的先天免疫记忆，在被灭活的溶藻弧菌引发免疫反应后，长牡蛎的DNA甲基化等表观遗传也随之发生变化。在长牡蛎二次接触溶藻弧菌后产生更快更强的免疫反应，降低了长牡蛎被溶藻弧菌感染后的死亡率；另一方面将增强的弧菌抗性遗传给子代，并为子代提供广谱性的弧菌抗性。
本申请中只能使用福尔马林对溶藻弧菌进行灭活处理。这是因为：常见的灭活或者减毒疫苗的制备方法包括使用天然无致病性菌株或者福尔马林灭活、热灭活。但目前尚未有无致病性溶藻弧菌的报道，因此无法使用天然无致病性溶藻弧菌作为疫苗。现有研究称热灭活会破坏溶藻弧菌抗原构象，降低其抗原性，并破坏细菌细胞膜，导致膜结合多糖的释放，不利于宿主特异性和持久性免疫的产生。但福尔马林灭活则不会出现上述问题。
本申请灭活处理的方法包含：将TCBS琼脂培养基上的溶藻弧菌挑到2216E培养基中进行扩增培养，除去多余的培养基后，使用无菌海水重悬弧菌，重复3次，得到重悬菌液；向重悬菌液中加入福尔马林在4℃下培养24小时，得到细菌悬浮液，并离心、洗涤。
其中，所述向重悬菌液中加入福尔马林前，将重悬菌液浓度调整为4x108～5x108CFU/mL，加入的福尔马林的终浓度为1% （v/v）。所述扩增培养温度为25℃、时间为6小时，转速为150 rpm。
将长牡蛎浸泡于含有经过灭活的溶藻弧菌的海水中24～25小时进行免疫启动，在生产幼虫前转移到过滤的海水中保持7天。
对于能够保护长牡蛎免受溶藻弧菌二次感染的适宜的免疫启动浓度的确定，是通过不同浓度灭活溶藻弧菌预处理长牡蛎，通过比较不同处理长牡蛎的在20天内的存活率确定适宜的免疫启动方法，存活率显著高于对照组（未经灭活溶藻弧菌预处理的长牡蛎）的被认为是适宜的浓度。
作为一些具体实施方式，本发明提高长牡蛎及其幼虫弧菌抗性的具体方法包含以下步骤：
（1）制备灭活溶藻弧菌：用接种环将TCBS琼脂培养基上的溶藻弧菌挑到2216E培养基中进行扩增培养（25℃，150 rpm，6小时）。离心（4500g, 25℃, 5分钟）除去多余的培养基后，使用无菌海水重悬弧菌，重复3次。将溶藻弧菌的浓度调整为4x108～5x108 CFU/mL，并向其中加入终浓度为1%（v/v）的福尔马林。将含有福尔马林的细菌悬浮液在4℃下培养24小时。将细菌悬浮液在4℃下以4500 g离心10分钟，并用无菌海水洗涤两次以去除福尔马林。
（2）长牡蛎免疫启动：使用无菌海水调节福尔马林灭活的溶藻弧菌浓度，两种浓度的福尔马林灭活的溶藻弧菌，包括5x104、5x105 CFU/mL，被用来处理两组浸泡的牡蛎以进行免疫启动，这个过程持续24小时。24小时后，牡蛎被转移到过滤的海水中并保持7天。
（3）长牡蛎死亡率监测：将两组经过免疫启动的长牡蛎浸泡在含有5x106 CFU/mL溶藻弧菌的海水中，每天统计牡蛎的死亡率。为了保持海水中溶藻弧菌的浓度恒定，每天更换海水，并重新向海水中添加新的溶藻弧菌。每天三次监测牡蛎的死亡情况，将死亡的牡蛎从水族箱中取出并进行计数，连续监测20天。
（4）亲本免疫启动及幼虫培养：用来作为亲本产生子代家庭的长牡蛎在5x104CFU/mL福尔马林灭活的溶藻弧菌中浸泡24小时，然后在产生配子前在海水中培养7天。用刀片挑取长牡蛎的性腺，并在显微镜下观察以区分雌雄。分别收集精子和卵子后，将成对的精子和卵子混合在一起，总共产生了8个免疫启动后的幼虫家系。相应地，8个对照家系也是分别用一对没有经过免疫启动的长牡蛎亲本产生的。所有家系的幼虫被培养在100L的水箱中，定期维护，用金藻喂养，每天更换一次过滤的海水。
（5）幼虫弧菌抗性检测：在受精后的第12天，分别选择3个免疫启动后家系和3个对照家系的幼虫被用于挑战。简而言之，将3个初选家庭和3个对照家庭的约100只幼虫分别转移到含有100mL过滤海水的烧杯中。将幼虫分别浸泡在5x106 CFU/mL的溶藻弧菌、哈维氏弧菌、巴西弧菌或副溶血弧菌中，持续24小时。24小时后向每个烧杯中滴加一滴中性红溶液，3小时后向每个烧杯中加入一滴甲醛。在显微镜下统计幼虫的死亡情况，存活的幼虫被中性红染成红色，死亡幼虫未被染色。
以下提供多个具体实施例对本发明提高长牡蛎及其幼虫弧菌抗性的方法及效果。
实施例1
用接种环将TCBS琼脂培养基上的溶藻弧菌挑到2216E培养基中进行扩增培养（25℃，150 rpm，6小时）。离心（4500g, 25℃, 5分钟）除去多余的培养基后，使用无菌海水重悬弧菌，重复3次。将溶藻弧菌的浓度调整为5x108 CFU/mL，并向其中加入终浓度为1%（v/v）的福尔马林。将含有福尔马林的细菌悬浮液在4℃下培养24小时。将细菌悬浮液在4℃下以4500 g离心10分钟，并用无菌海水洗涤两次以去除福尔马林。
三种浓度的福尔马林灭活的溶藻弧菌，包括5x104、5x105和5x106 CFU/mL，被用来处理三组浸泡的牡蛎，持续24小时。24小时后，牡蛎被转移到过滤的海水中并保持7天。
将牡蛎浸泡在含有5x106CFU/mL溶藻弧菌的海水中，每天统计牡蛎的死亡率。为了保持海水中溶藻弧菌的浓度恒定，每天更换海水，并重新向海水中添加新的溶藻弧菌。每天三次监测牡蛎的死亡情况，将死亡的牡蛎从水族箱中取出并进行计数，连续监测20天。
灭活溶藻弧菌对长牡蛎二次感染溶藻弧菌的影响。经过5x104和5x105预先处理的长牡蛎在第二次感染溶藻弧菌后的存活率显著上升，而5x106预先处理的长牡蛎在第二次感染溶藻弧菌后不会表现出存活优势（图1）。
用来作为亲本产生子代家庭的长牡蛎在5x104 CFU/mL福尔马林灭活的溶藻弧菌中浸泡24小时，然后在产生配子前在海水中培养七天。用刀片挑取长牡蛎的性腺，并在显微镜下观察以区分雌雄。分别收集精子和卵子后，将成对的精子和卵子混合在一起，总共产生了8个免疫启动后的幼虫家系。相应地，八个对照家系也是分别用一对没有经过免疫启动的长牡蛎亲本产生的。所有家系的幼虫被培养在100L的水箱中，定期维护，用金藻喂养，每天更换一次过滤的海水。在受精后的第12天，分别选择3个免疫启动后家系和3个对照家系的幼虫被用于挑战。简而言之，将三个初选家庭和三个对照家庭的约100只幼虫分别转移到含有过滤海水的100mL烧杯中。将幼虫分别浸泡在5x106 CFU/mL的溶藻弧菌、哈维氏弧菌、巴西弧菌或副溶血弧菌中，持续24小时。
5x104灭活的溶藻弧菌预先处理对长牡蛎子代弧菌抗性的影响。5x104预先处理的长牡蛎产生的子代表现出对多种致病性弧菌的抗性增强（图2）。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种提高长牡蛎及其幼虫弧菌抗性的方法，其特征在于，包含：
将长牡蛎浸泡于含有浓度为5×104～5×105CFU/mL的经过灭活的溶藻弧菌的海水中24～25小时，在生产幼虫前转移到过滤的海水中保持7天，进行免疫启动，并用免疫启动后的长牡蛎生产幼虫；
其中，使用福尔马林对溶藻弧菌进行灭活处理，灭活方法包含：
将TCBS琼脂培养基上的溶藻弧菌挑到2216E培养基中进行扩增培养，除去多余的培养基后，使用无菌海水重悬弧菌，重复3次，得到重悬菌液，将重悬菌液浓度调整为4×108～5×108 CFU/mL；
向重悬菌液中加入福尔马林，福尔马林的体积终浓度为1%，在4℃下培养24小时，得到细菌悬浮液，并离心、洗涤。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增培养温度为25℃、时间为6小时，转速为150 rpm。
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