NO179360B - Fremgangsmåte for fremstilling av en fiskevaksine samt en ikke-virulent, inntrengende mutant bakteriestamme inneholdt i vaksinen - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av en levende vaksine som gir kryssimmunitet for immunisering av fisk mot sykdommer forårsaket av fiskepatogene mikroorganismer, samt en ikke-virulent, inntrengende, immunogen mutant stamme av en opprinnelig virulent fiskepatogen bakterie valgt fra Vlbrlo anguillarum og Reromonas salmoniclda inneholdt i vaksinen.

Teknisk bakgrunn

Infeksjoner som forekommer blant oppdrettsfisk, først

og fremst laksefisk, er en hovedkilde for økonomisk tap i fiskeoppdrettsindustrien over hele verden. Det har hittil vært forsøkt å redusere eller eliminere tap som er forårsaket av visse infeksjoner av bakteriell etiologi (f.eks. furunkulose forårsaket av Aeromonas salmonicida, "enteric redmouth" forårsaket av Yersinia ruckerii og vibriose forårsaket av Vibrio anguillarum) ved hjelp av kjemoterapeutiske midler

som sulfapreparater eller oxytetracyklin. Anvendelse av antibakterielle midler er imidlertid temmelig kostbar, og det er videre kjent at det utvikles medikamentresistente stammer av de forskjellige patogene bakterier. Anvendelse av antibakterielle midler gir dessuten ingen beskyttelse

mot sykdommer av en virusetiologi.

Av denne grunn er det derfor utført forsøk for å utvikle en vaksine mot utvalgte fiskepatogener. Det er således utviklet en vaksine mot Y. ruckerii (Tebbit et al. i: Developments in Biological Standardization, vol. 49, International Symposium on Fish Biologics: Serodiagnostics and Vaccines, W. Heunessen og D.P. Anderson (red.), 1981,

s. 395-402), og V. anguillarum (Amend og Johnson i: Developments in Biological Standardization, vol. 49, International Symposium on Fish Biologics: Serodiagnostics and Vaccines,

W. Heunessen og D.P. Anderson (red.), 1981, s. 403-418;

Agius et al., J. Fish Dis. 6, 1983, s. 129-134). Disse vaksiner er basert på formalin-drepte, virulente bakterier. Virkningsfullheten av disse vaksiner er testet, og det er

vist at administrasjonsruten av vaksinene spiller en viktig rolle for styrken av den resulterende immunrespons (Kawano et al., Bull. Jpn. Soc. Sei. Fish. 50, 1984, s. 771-774;

Ward et al., i Fish Immunology, M.J. Manning og M.R. Tatner (red.), 1985, s. 221-229). Eksperimenter har vist at injeksjon av et vaksinepreparat gir det langt beste svar med den lengste varighet av immuniseringen, mens nedsenkning og oral administrering gir en mindre effektiv beskyttelse mot de aktuelle infeksjoner.

En vaksine omfattende kloroform-inaktiverte hele celler, oppløselig antigen og kombinert hel celleantigen og oppløselig antigen av en ikke-virulent stamme av Aeromonas salmonicida er vist å beskytte fisk mot furunkulose (Cipriano et al., J. World Maricul. Soc., 1983, 14, 201-211).

En forbedret forståelse av de patogene egenskaper av fiskepatogenene mot hvilke det er ønsket å utvikle en anvende-lig immunrespons, er viktig for oppbygningen av en effektiv vaksine. Til tross for den omfattende forekomst av epi-demier av fiskeoppdrettsanlegg forårsaket av et stort antall forskjellige patogene mikroorganismer, både bakterier og virus, har studier av de egenskaper som bidrar til virulens, hittil vært begrenset i antall. I tilfelle av V. anguillarum har et antall studier fastslått tilstedeværelsen av et virulent plasmid med 65 kb (kilobasepar) i denne bakterie, som koder for et komplekst system som er viktig for bakteriens evne til å oppta Fe 3+ (Crosa, Nature 284, 1980,

s. 566-568). For mange patogene mikroorganismer er det vist at evnen til å oppta Fe + er viktig for bakterier under infeksjonsprosessen. Dersom det virulente plasmid er fjernet fra V. anguillarum, blir det ikke virulent overfor fisk (Crosa et al., Infect. Immun. 27, 1980, s. 897-902).

Et antall publikasjoner beskriver videre mulige virulente determinanter som serumresistens (Trust et al., Infect. Immun. 34, 1981, s. 702-707), hemolysin (Munn, FEMS Microbiol. Lett. 3, 1978, s. 265-268), ekstracellulær protease (Inamura et al., Bull. Jap. Soc. Sei. Fish. 51, 1985, s. 1915-1920) og andre ekstracellulære faktorer (Kodama et al., Am. J. Vet. Res. 45, 1984, s. 2203-2207). På en eller annen måte har det vært mulig å korrelere disse virulente determinanter med utbrudd av sykdom. Det er imidlertid ikke avgjørende bevist at disse bakterielle produkter er virulente determinanter som er viktige for bakteriens patogenetiske egenskaper.

I de senere år har interessen økt for utvikling av levende vaksiner basert på levende, svekkede bakteriestammer for anvendelse ved forebyggelse av humane sykdommer, spesielt mot tarmvirkende midler (Hone et al., J. Inf. Dis. 156, 1987, s. 167-174; Wahdan et al., J. Inf. Dis. 145, 1982, s. 292-295). Levende vaksiner har generelt den fordel overfor vaksiner basert på drepte, patogene mikroorganismer eller bakterielle komponenter, ved at de gir en høyere grad av immunitet såvel som en mer forlenget effekt og er mer fullstendig enn når enkle komponenter slik som antigener, administreres. De kan videre fordre en mindre dose av effektfullt middel enn drepte, patogene mikroorganismer eller enkle komponenter. Levende vaksiner kan også være mindre kostbare å produsere

enn de vaksiner basert på en renset, enkel komponent, ved at det ikke fordres noe rensningstrinn. Det ville derfor være en fordel å utvikle en levende vaksine for administrering til fisk som krevde en lavere immuniseringsdose enn de eksis-terende fiskevaksiner basert på drepte, patogene mikroorganismer eller membrankomponenter.

Det eksisterer et tydelig behov for å utvikle en vaksine mot fiskepatogene mikroorganismer som kan forårsake en langvarig og effektiv immunologisk beskyttelse mot et bredt spektrum av fiskepatogene mikroorganismer etter nedsenkning av fisken i vaksinen. En slik vaksine bør ideelt omfatte en bakteriestamme som besitter så mange av de patogene mikroorganismers karakteristiske egenskaper som mulig, men uten deres evne til å forårsake sykdom. Det er av spesiell betydning å utvelge vaksinestammer som kan trenge inn i og formere seg i fiskekroppen og derved utløse en sterk immunrespons.

Sammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av en levende vaksine som gir kryssimmunitet for immunisering av fisk mot sykdommer forårsaket av fiskepatogene mikroorganismer, kjennetegnet ved at den omfatter (1) isolering av en moderstamme fra en virulent, inntrengende, immunogen fiskepatogen bakterie valgt fra Vibrlo anguillarum og Aeromonas salmonicida, (2) tilveiebringelse gjennom utvelgelse fra denne moderstamme av en ikke-virulent, inntrengende, immunogen, mutant stamme som oppviser en LD50-verdi som overstiger 2 x IO<7> bakterier/ml ved nedsenking av fisk i en suspensjon av denne stamme, som inneholder minst én antibiotisk utvelgbar markør, samt, når bakterien er en Vxibrio angruillarum, oppviser evne til å vokse i nærvær av et jern-chelaterende middel, (3) dyrkning av den utvalgte stamme i et kulturmedium for å frembringe vaksinen og (4) innhøsting av de resulterende celler og fremstilling av en vaksine innbefattende de innhøstede celler.

Betegnelsen "patogen" angir en mikroorganismes evne

til å forårsake sykdom. Patogenitet er et taksonomisk signifikant kjennetegn ved at det representerer en artsegenskap; bakteriearten Vibrio anguillarum er således betegnet å være patogen overfor fisk. Den individuelle stamme av en bakterieart kan imidlertid i stor utstrekning variere i sin evne til å skade vertarten, og denne relative patogenitet er betegnet "virulens". Virulens er følgelig en egenskap for en stamme, ikke en art; man kan snakke om en sterkt virulent,

en svakt virulent, eller til og med en ikke-virulent stamme av en spesiell mikrobeart, f.eks. Vibrio anguillarum. Virulensen av en stamme av en patogen art betegnes generelt ved hjelp av to faktorer: dens "inntrengelighet", eller evne til å trenge inn i og formere seg i vertlegemet, og dens "toksigenitet", eller evne til å produsere kjemiske stoffer som skader vevene hos verten. En virulent stamme av en bakterieart kan miste sin virulens, men fremdeles opprett-holde sin evne til å trenge inn i verten, imidlertid uten å forårsake sykdom.

I denne sammenheng er betegnelsen "ikke-virulent" underforstått å bety at en virulent bakteriestamme har mistet sin evne til å forårsake sykdom hos fisk infisert med stammen, selv om dens evne til å trenge inn i fisken gjennom den van-lige rute for bakterier og å formere seg i fiskekroppen forblir vesentlig intakt, hvorved det er en avgjort fordel at bakteriene er i stand til selv å trenge inn i fisken for deri å fremkalle en relevant immunrespons istedenfor å måtte være avhengig av utenforliggende metoder som injeksjon (denne er en for kostbar, selv om den er effektiv, adminis-treringsrute for fisk) for å nå et sted i fisken hvor deres tilstedeværelse vil produsere en relevant immunrespons. Ikke-virulente mutanter av de patogene bakterier kan utvelges ved å utsette fisken for eksperimentelle infeksjoner ved nedsenkning i en suspensjon kontaminert med hver mutant-stamme og bestemmelse av LD^q (den påkrevde dose for å drepe 50% av fisken i badet), f.eks. som beskrevet i detalj i eksempel 1 nedenfor. En mutant stamme med en LD5Q høyere enn 2x10^ bakterier/ml ved nedsenkning er definert som ikke-virulent innen rammen av foreliggende oppfinnelse. For andre stammer som kan anvendes i den levende vaksine ifølge foreliggende oppfinnelse, kan LD^Q imidlertid være lavere, idet stammene likevel betraktes å være ikke-virulente.

Graden av virulens av en spesiell bakteriestamme kan også avhenge av mottakeligheten av forskjellige fiskearter for bakteriene.

I foreliggende sammenheng defineres betegnelsen "mutant stamme" som en stamme som er isolert i form av en spontan mutant (et hyppig fenomen i naturen) eller hvori en mutasjon er forsettlig indusert ved å utsette en opphavelig bakteriestamme for behandling med et mutagen, slik som ultrafiolett stråling, ioniserende stråling eller et kjemisk mutagen som mitomycin C, 5-bromuracil, methylmethansulfonat, nitrogen-sennepsgass eller et nitrofuran, eller ved anvendelse av rekombinant DNA-teknikker.

Betegnelsen "immunogen" er underforstått å bety at stammen er i stand til å fremkalle en relevant immunrespons i fisken som vaksinen er administrert til. Det foreligger bevis som antyder at levende, svekkede stammer faktisk kan fremkalle en sterkere immunreaksjon enn svekkede, patogene mikroorganismer, da de antigene determinanter av en levende stamme ikke er svekket av kjemisk behandling. Foretrukne stammer ifølge foreliggende oppfinnelse er slike som gir immunitet mot både homologe og heterologe stammer av den samme patogene mikroorganisme, dvs. både den opphavelige stamme fra hvilken mutanten er avledet, og andre patogene stammer av den samme art, for å gi en bredspektret beskyttelse mot den aktuelle patogene mikroorganisme. Det er endog på-vist (se eksempel 2 i foreliggende patentbeskrivelse) at visse mutante stammer kan forårsake kryss-beskyttelse mot en annen bakterieart enn den som den mutante stamme hører til uten at noe DNA fra den andre art som koder for en antigen determinant derav, er forsettlig innføyet i mutanten. Det foreligger også indikasjon på (se eksempel 1 i foreliggende patentbeskrivelse) at mutanter utvalgt eller forsettlig indusert fra virulente stammer som er i stand til å infisere fisk ved nedsenkning, oppviser en spesielt høy beskyttelse ved hjelp av den nedsenkede vaksinasjon hvor årsaken muligens er at den høye virulens av den opphavelige stamme gjenspeiler en høy grad av inntrengelighet, hvilken egenskap bevares i mutanten avledet derfra.

I et annet aspekt angår foreliggende oppfinnelse en ikke-virulent, inntrengende, immunogen mutant stamme av en opprinnelig virulent fiskepatogen bakterie valgt fra Vibrio anguillarum og Reromonas salmonicida, kjennetegnet ved at den mutante stamme oppviser en LD50-verdi som overstiger 2 x IO<7 >bakterier/ml ved nedsenking av fisk i en suspensjon av denne stamme, samt at den, når bakterien er en Vibrio anguillarum, oppviser evne til å vokse i nærvær av et jern-chelaterende middel, inneholder minst én antibiotisk utvelgbar markør og oppviser evne til å gi beskyttelse til fisk som er immunisert med en levende vaksine inneholdende stammen, i det minste mot sykdommer forårsaket av homologe og heterologe Vibrio anguillarum og Reromonas salmonicida.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foruten å isoleres som en spontan mutant av en patogen bakterie, eller produseres ved behandling av en virulent, patogen bakterie med et mutagen som angitt ovenfor, kan den ikke-virulente, mutante stamme også fremstilles ved å fjerne et virulent plasmid fra en virulent stamme, fordi dette gjør bakterien ikke-virulent overfor fisk, i tilfelle av V. anguillarum er dette et 65 kb plasmid; jf. Crosa et al., Infect. Immun. 27, 1980, s. 897-902). Den mutante stamme kan videre være en stamme hvori et gen hvis produkt er påkrevet for bakteriell virulens, er defekt eller fraværende, dvs. en stamme fremstilt ved hjelp av rekombinant DNA-teknikker (dette innbefatter en defekt i en promotor eller et regulatorisk system for genet). Genet kan være et som koder for en av de postulerte, virulente determinanter som serumrésistens, hemolysin, ekstracellulær protease og mulig-vis andre ekstracellulære, toksiske produkter som angitt ovenfor, men kan også kode for andre funksjoner eller produkter av viktighet for bakteriens virulens.

Defekten i genet kan forårsakes av en DNA-innføyelse som gjør genets avlesningsramme ute av fase. DNA-innføyelsen kan være av en hvilken som helst lengde fra et enkelt basepar til et fullstendig gen. Kortere innføyelser kan utføres ved setespesifikk mutagenese ved hjelp av syntetiske oligo-nukleotider på en per se kjent måte, f.eks. som beskrevet i G. Winter et al., Nature 299, 1982, s. 756-758, eller Zoller og Smith, Nucl. Acids Res. 10, 1982, s. 6487-6500. Innføy-else av større DNA-fragmenter kan utføres ved hjelp av gen-blokk-innføyelser (Forsberg og Wolf-Watz, Mol. Microbiol. 2, 1988, s. 121-137); slike innføyelser kan enten være innenfor rammen (f.eks. antibiotiske markører) eller utenfor rammen.

Bortsett fra dette kan DNA-innføyelsen foreligge i form av en transposon-innføyelse. Et transposon kan innføres vilkårlig i en virulent stamme ved konjugasjon av denne stamme med en bakterie som bærer et transposon på en per se kjent måte (Ely, B., Mol. Gen. Genet. 200, 1985, s. 302-304). Ikke-virulente stammer som følger som et resultat av konju-gasjonseksperimentet, kan isoleres ved screening for unike transposon-inneholdende stammer og testing av disse for ikke-virulens, f.eks. i LD^Q-testen beskrevet i eksempel 1 nedenfor.

Når ikke-virulente stammer produseres ved hjelp av transposon-innføyelse, er det liten risiko for at slike stammer kan vende tilbake til villtypen, dvs. fjerne transposon-DNA og igjen bli virulent. Det bør imidlertid anmerkes at stammer ifølge foreliggende oppfinnelse som er fremstilt ved transposon-mutagenese, er testet for tilbakevending ved dyrking i 500 generasjoner, og noen slik tilbakevending har ikke forekommet. Stammer som ikke kan vende tilbake til villtypen, kan fremstilles ved delvis eller fullstendig ut-slettelse av et gen som danner et produkt som er vesentlig for bakteriell virulens eller et promotorsystem eller regulatorisk system for dette gen. For å utføre en slik utslett-else kan det være nødvendig først å identifisere genet av interesse. Dette kan f.eks. utføres ved å identifisere transposon-setet i en vellykket omdannet mutant ved hybridisering i overensstemmelse med konvensjonelle fremgangsmåter (Maniatis et al., i Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982) innbefattet isolering av et DNA-fragment som bærer en del av transposonet og en del av genet ved hjelp av en syntetisk homolog oligomer sekvens, og anvendelse av dette fragment som en probe for å screene for villtypen ved hjelp av konvensjonelle hybridiseringsfrem-gangsmåter (jf. Southern, Methods in Enzymology 68, 1980,

s. 151-176). Når først det relevante gen er identifisert,

er det mulig å utslette dette delvis eller fullstendig, f.eks. ved anvendelse av egnede restriksjonsenzymer, sete-styrt mutagenese ved homolog rekombinasjon med et syntetisk oligonukleotid som inneholder færre basepar enn DNA-frag-mentet på genet med hvilket det er homologt (f.eks. som beskrevet av Chan og Smith, Nucl. Acids Res. 12, 1984,

s. 2407-2419, eller G. Winter et al., Biochem. Soc. Trans.

12, 1984, s. 224-225) eller ved direkte å innføre gjentatte nukleotidsekvenser på hver ende av genet og utvelgelse av mutanter i hvilke genet er fjernet ved hjelp av rekombina-sjonsutskjæring. Når slike defekte gener er fremstilt, kan de innføyes i setet til intakte gener i virulente stammer ved hjelp av homolog rekombinasjon for å produsere ytter-ligere ikke-virulente stammer.

Det betraktes at ikke-virulente, inntrengende, mutante stammer kan fremstilles på denne måte fra enhver av de kjente fiskepatogene bakterier, og eksempler på dette er stammer av Vibrio anguillarum, Vibrio salmonicida, Vibrio ordalii, Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida eller acromogenes, Aeromonas hydrophila, Flexibacter columnaris, Cytophaga spp., Flavobacterium spp., Renibacterium salmoninarum, Lactobacillus spp., Edwardsiella tarda, Pseudomonas spp., Pasteurella spp., Sporocytophaga spp., Mycobacterium spp., Nocardia asteroides, Streptomyces spp., Streptococcus spp., Eubacterium tarentellus og Yersinia ruckerii. En for tiden foretrukket fiskepatogen bakterie er V. anguillarum.

Prøver av spesifikke, isolerte, ikke-virulente stammer av V. anguillarum ifølge foreliggende oppfinnelse ble depon-ert i overensstemmelse med bestemmelsene ifølge Budapest-avtalen for den internasjonale anerkjennelse av deponering av mikroorganismer for patentprosedyreformål, den 31. mars 1988, i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg IB, Braunschweig, BRD, med følgende aksesjons-nummere:

Det betraktes videre at den mutante stamme ifølge foreliggende oppfinnelse kan være en stamme som bærer en DNA-sekvens som koder for en antigen determinant fra en annen fiskepatogen mikroorganisme, slik som en bakterie eller et virus, og som er i stand til å uttrykke denne DNA-sekvens. DNA-sekvensen kan ha en hvilken som helst egnet lengde, innbefattet en sekvens som koder for en enkel epitop og opp til en sekvens som koder for det totale antigen. Den antigene determinant uttrykt fra sekvensen, behøver ikke å være en virulent determinant, men kan være enhver determinant som fremkaller en relevant immunrespons i fisken som vaksinen er administrert til. Determinanten kan således f.eks. være utvalgt fra bakterielle endo- eller eksotoksiner, adhesiner eller virus-env-proteiner eller fragmenter derav.

Patogene mikroorganismer fra hvilke den antigene determinant kan avledes, kan utvelges fra

A. Bakterielle fiskepatogener og sykdommene forbundet med disse. B. Virus hos fisk

(Begge tabeller er vist i Jorge H. Crosa (red.), Bacterial and Viral Diseases of Fish: Molecular Studies, University of Washington, Seattle, 1983).

En mutant stamme som bærer en antigen determinant fra en annen fiskepatogen mikroorganisme, kan fremstilles ifølge teknikker som er veletablerte på området humanmedisin hvor flere eksempler på levende, orale vaksiner som omfatter en antigen determinant uttrykt av en annen organisme, er utviklet, f.eks. en hybrid Salmonella/Shigella-vaksine (Formal et al., Infect. Immun. 34, 1981, s. 746-750). To forskjellige prod-uksjonsveier kan antydes for produksjon av en levende vaksine av denne type: enten kan et gen fra den fiskepatogene mikroorganisme isoleres, karakteriseres og testes for antigene egenskaper etterfulgt av innføyelse i en vertbakterie, eller genomisk DNA fra den fiskepatogene mikroorganisme kan "shotgun"-klones i en vertbakterie, og én eller flere stammer med en egnet antigenitet kan deretter utvelges. I det siste tilfelle kan stammene konstrueres ved å anvende som klonings-vektor et bredt vertområde-plasmid som er i stand til å replikere i f.eks. E. coli og den ønskede vertstamme, f.eks. V. anguillarum. Kloningsvektoren bør videre bære en klonings-kassett (dvs. en DNA-sekvens som omfatter flere restriksjons-seter og som er i stand til å mobiliseres fra E. coli til V. anguillarum). Når et genbibliotek av den aktuelle patogene mikroorganisme oppbygges, klones først den patogene mikroorganismes genomiske DNA i E. coli, og vektoren som bærer dette genomiske DNA, overføres deretter til f.eks. V. anguillarum. Den hybride bakterie kan deretter anvendes for å infisere fisk i overensstemmelse med fremgangsmåten beskrevet ovenfor, og 2-4 uker senere testes den infiserte fisk for immunitet overfor den aktuelle patogene mikroorganisme.

Selv om genet eller etterfølgelsen derav som koder for den antigene determinant i teorien kan innføyes i og uttrykkes ved en bakterie som ikke er patogen overfor fisk, er det foretrukket å innføye genet i en mutant stamme ifølge foreliggende oppfinnelse for å sikre en høy grad av infektivitet og for å erholde immunitet mot to eller flere patogene mikroorganismer ved hjelp av den samme vaksine. Det anses å være spesielt fordelaktig å konstruere en ikke-virulent, inntrengende mutant stamme ifølge foreliggende oppfinnelse ved inn-føyelse av genet eller etterfølgelsen derav som koder for den antigene determinant, i et gen av en patogen vertbakterie hvis produkt er påkrevet for bakteriell patogenitet, for således å erholde i én operasjon en ikke-virulent, mutant stamme som gir immunitet ikke bare til vertbakterien, men også til den andre fiskepatogene mikroorganisme. I en spesiell utførelsesform av vaksinen er det innføyet ikke bare én, men to eller flere DNA-sekvenser som koder for antigene determinanter av forskjellige fiskepatogene mikroorganismer, slik at det erholdes en vaksine som gir bredspektret beskyttelse mot en rekke fiskepatogene mikroorganismer.

Når en egnet mutant stamme er isolert, kan den for-meres ved aerobisk dyrkning av den utvalgte stamme i et egnet dyrkningsmedium under betingelser som er egnede for former-ing av hver bakterieart i en tidsperiode tilstrekkelig til å tilveiebringe minst 10 g bakterier pr. ml medium, og innhøst-ing av de resulterende bakterier fra mediet. Et egnet medium er et rikt medium som trypticase-soya-næringsløsning, Luria-næringsløsning, Nutrient-næringsløsning, hjerne-hjerte-infusjonsnæringsløsning eller lignende, inneholdende de på-krevede carbonkilder og nitrogenkilder og mineralnærings-midler. For dyrkning av patogene saltvannsmikroorganismer bør mediet i tillegg suppleres med NaCl i en mengde tilsvarende, eller litt høyere enn, NaCl-innholdet i saltvann, vanligvis tilnærmet 1,5-2%. Dyrkningtemperaturen er vanligvis i området 18-25°C, og pH i området 6,8-7,8.

Selv om det teoretisk er mulig å tilsette bakteriene

i den form de dyrkes, dvs. dyrkningsmediet inneholdende bakteriene, til suspensjonen hvori fisken skal nedsenkes, fore-trekkes det vanligvis å produsere et konsentrat for å erholde et høyere antall bakterier for administrering. Konsen-tratet kan f.eks. fremstilles ved sentrifugering eller fil-trering, og bakteriene kan videre vaskes før tilsetning til badet. Bakteriekonsentratet kan deretter tilsettes i våt tilstand eller kan, for å lette transport og langtidslagring, frysetørkes eller spraytørkes på en måte som er kjent per se. Det resulterende pulver kan deretter tilsettes direkte til nedsenkningsbadet eller kan blandes med fiskefor og doseres oralt til fisken.

Som angitt ovenfor, er det funnet fordelaktig å immunisere fisken ved tilsetning av bakteriepreparatet (enten det er vått eller tørt) til en suspensjon som fisken som skal immuniseres overføres til, fordi immunisering ved injeksjon, selv om den er effektiv i eksperimenter, ikke er en kommersi-j elt levedyktig metode. Administrering av de mutante bakterier utføres således fortrinnsvis ved nedsenkning av en fisk i en egnet suspensjon av de ikke-virulente, mutante bakterier i en tidsperiode tilstrekkelig for å fremkalle en tilstrekkelig immunisering. Det er generelt funnet at en lengre immuniseringstid gir en forbedret immunitet. Ved foreliggende oppfinnelse å anvende immuniseringstidsrom på 15 minutter eller mer, er 30 minutter funnet å gi en tilfredsstillende immunitet i eksperimentet beskrevet i eksempel 1. Suspensjonen av ikke-virulente, inntrengende mutante bakterier inneholder 1x10 2 - 1x10 8 bakterier/ml, fortrinnsvis 1x10 fi - 8 7 7

1x10 bakterier/ml, idet et antall på 1x10 /ml - 2x10 /ml er funnet å gi en tilstrekkelig immunitet ved nedsenkning av fisken i 30 minutter.

Under forskningen som førte til foreliggende oppfinnelse, er det funnet at fisk mest sannsynlig utsettes for infeksjoner forårsaket av virulente, patogene mikroorganismer når vanntemperaturen øker til 18°C eller høyere (dette er i det minste tilfelle for V. anguillarum). Dette infektivitets-mønster gjør det fordelaktig å administrere vaksinen fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse minst én gang pr. år til en tid på året når risikoen for infeksjon av fiskepatogene mikroorganismer er spesielt høy, eller fortrinnsvis umiddelbart før denne periode. Den administrerte dose kan deretter gi en tilstrekkelig beskyttende immunitet mot den aktuelle infeksjon i hele den perioden hvor risikoen for infeksjon er høy (vanligvis sommermånedene) eller, hvis ikke, kan den opp-følges på et egnet tidspunkt med én eller flere booster-immuniseringer. Immuniseringen av fisk ved nedsenkning ut-føres fortrinnsvis ved anvendelse av en suspensjon av den ikke-virulente, inntrengende mutante stamme som har en temperatur på 0-25°C, fortrinnsvis 0-18°C, i hvilken suspensjon kon-sentrasjonen av NaCl er minst 0,3% (vekt/vekt.) . Effektivi-teten av immuniseringen kan underkastes en egnet testing ved hjelp av LD5Q-testen beskrevet ovenfor.

Det kan være spesielt fordelaktig å immunisere fiske-yngel, dvs. fisk med en vekt fra tilnærmet 3-5 g til tilnærmet 20 g, med vaksinen fremstilt ifølge oppfinnelsen, fordi fiske-yngel synes mer mottakelig for fiskepatogene mikroorganismer

enn voksen fisk.

Oppfinnelsen beskrives mer detaljert i de følgende eksempler.

Eksempel 1

Fremstilling av en ikke- virulent, inntrengende mutant av V. anguillarum og dens anvendelse som en levende vaksine

Materialer og fremgangsmåter

Bakteriestammer: De anvendte stammer i denne undersøk-else og deres kilder er oppført i tabell 1.

Isolering og karakterisering av stamme 775: Stammen

ble isolert fra en syk fisk (Onchorhynchus kisutsch). Pens-linger ble inokulert på blodagarplater som ble inkubert i 48 timer ved 25°C. Typiske bakteriekolonier lignende V. anguillarum, dvs. lavkonvekse, semi-gjennomskinnelige, og hemolytiske, ble isolert for primær identifisering i overensstemmelse med de følgende karakteristika: gramnegative, bevegelige stenger som var følsomme overfor det vibriostatiske middel 0/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropylpteridin, 10 ug/plate); katalase- og oxydase-positive; positive i nitratreduksjons-testen og arginindecarboxylattesten; negative overfor lysin-og ornithin-decarboxylater; fermentative i oxydasjons-fermenteringstesten og i stand til å vokse i 6% NaCl, men ikke i 7% NaCl. Stammen tilhører serotypen 01 i overensstemmelse med systemet beskrevet av Sørensen og Larsen, supra.

Konjugasjons- og transposisjonseksperimenter: Plasmid pRK2013 ble overført fra E. coli K 12 C600/pRK2013:Tn5-132

ved konjugasjon på filtere (Walter et al. 1975). Donoren

(E. coli) og mottageren (V. anguillarum) ble dyrket over natten i Luria-næringsløsning (E. coli) eller hjerne-hjerte-infusjonsnæringsløsning supplert med 2% NaCl (V. anguillarum). Stammene ble inokulert i friskt medium og dyrket til 1x10<g >bakterier pr. ml. En blanding inneholdende hhv. 1,5 ml donor og mottager, ble passert gjennom et 0,45 m membranfilter. Filteret ble plassert på trypticase-soya-agar (TSA)-plater supplert med 2% NaCl i 3 timer ved 18°C. Etter inkubering ble filterne overført til TSA-plater supplert med 2% NaCl inneholdende tetracyklin (15 ug/ml) rifampicin (200 ug/ml) og streptomycin (100 ug/ml) for å utvelge V. anguillarum-ekskonjuganter. Kolonier som kom til syne på platene, ble

overført til nye TSA-plater pluss 2% NaCl pluss tetracyklin, rifampicin og streptomycin. Etter inkubering ble ekskonjugantene frosset ved -70°C før anvendelse i eksperimentelle infeksjoner av fisk.

Proteasebestemmelse: Påvisning av proteaseaktivitet ble utført ved utstrykning av bakteriene på Frazier-gelatin-plater (Rodina, 1972) supplert med 2% NaCl. Etter inkubering ved 18°C i 24 timer ble platene fylt med 12,5% HgCl2 i IM HC1. En transparent sone rundt kolonien indikerte proteolytisk aktivitet.

Hemolysin-bestemmelse: Tilstedeværelse av hemolytisk aktivitet ble bestemt ved utstrykning av bakteriene på Nutrient-næringsløsning (oxoid) supplert med 5% hesteblod og 2% NaCl.

Fremgangsmåter for blotting og hybridisering: Kromosomalt DNA, oppsluttet med EcoRl og fraksjonert på agarose-geler, ble overført til nitrocellulosefiltere, hybridisert med en <32>P-merket probe fremstilt ved 5'-ende-merking, og vasket (Maniatis et al., 1982). Den anvendte probe var et 30-mer syntetisk oligonukleotid, komplementært med deler av ISL av Tn5 (Symbicom, Umeå, Sverige).

Jernbehov: Ekskonjuganter ble testet for evnen til å utskille jern ved å utstryke dem på M9-plater supplert med 2% NaCl og 25M EDDA (ethylendiamin-di(o-hydroxyfenyl)-eddik-syre).

Eksperimentelle fiskeinfeksjoner: Virulenstester ble utført på regnbueørret (Salmo gairdneri) med en vekt på

5-15 g. Bakteriene ble administrert enten ved intraperitoneal injeksjon (i.p.) eller ved nedsenkning (im.)

For hver testet bakteriefortynning ble det anvendt

5 fisk. Bakteriene var 24-timers kulturer dyrket i trypticase soya-næringsløsning (TSB) supplert med 2% NaCl ved 18°C. I de intraperitoneale eksperimenter ble fiskene bédøvet med tricain-methansulfonat (100 mg/liter) og inokulert subkutant i bukhulen. Nedsenkningsinfeksjonene ble utført ved tilsetning av bakterier til akvariet som fiskene svømte i. Etter 30 minutter ble det tilsatt friskt brakkvann, og fiskene oppholdt seg deretter i brakkvannet i 7 dager. Død fisk ble innsamlet hver dag, og nyreprøver ble testet for tilstedeværelse av bakterier. Virulens ble uttrykt som den 50% letale dose (LD5Q) (Reed og Muench, 1938).

Immuniseringséksperimenter: Fisk ble nedsenket i 2x10^ bakterier/ml av V. anguillarum ekskonjuganter, VAN 20 eller VAN 70, i 30 minutter ved 18°C. Fisken ble overført til tanker hvor de oppholdt seg. Infeksjonsutfordringer ble ut-ført 1, 2, 4, 10 og 17 uker etter den opprinnelige immunisering. De anvendte bakteriestammer for infeksjonsutfordring var 775.17B og NB 10. Infeksjonsutfordringen ble utført som beskrevet i de foregående avsnitt ved nedsenkning i tre på-følgende 10-gangers oppløsninger av bakteriene. Booster-immuniseringer ble utført etter 12 uker på den samme måte som de opprinnelige immuniseringer.

Resultater

LD5 Q- målinger av forskjellige isolater av vibrio anguillarum

Den 50% letale dose av forskjellige isolater av Vibrio anguillarum ble testet både ved injeksjon av bakteriene intraperitonealt (i.p.) eller ved nedsenkning .{im*) av fisken i det bakterieinneholdende vann. En stamme av Escherichia coli ble anvendt som en negativ kontroll.

Ett isolat (775) var vesentlig mer virulent etter nedsenkning enn de andre testede isolater. Stamme 775 ble derfor utvalgt for videre studier fordi et mål ved foreliggende undersøkelse var å skape levende vaksinestammer som kunne fordeles ved nedsenkning.

Oppbygning av mutanter

Vibrio anguillarum 775.17B ble paret med E. coli C600/pRK2013:Tn5-132 som inneholdt transposonet Tn5-132 (tetracyklinresistens). Tn5-132 bæres på en transposon-leveringsvektor avledet fra pRK2013. Fordi pRK2013 er basert på ColEl-replikonet og har et bredt vertområde-overførings-system, kan det overføres til, men er ikke i stand til å replikere i, mange ikke-tarm gramnegative bakterier (Ely, 1985) . Konjugasjoner ble utført på filtere som ga en omflytt-ingsfrekvens på tilnærmet 10 _7. Donoren og mottageren ble blandet på et filter og plassert på ikke-selektive medier i 3 timer. Filteret ble overført til en selektiv plate og inkubert ved 18°C. Fordi filterne ble inkubert på de selektive medier, var hver koloni som kom til syne, med sikkerhet en unik ekskonjugant. Ekskonjugantene ble utplukket og ut-strøket på en ny, selektiv plate. Parallelt med dette ble mottagerstammen, 775-17B, også overflyttet det samme antall ganger på plater, for å sikre at en eventuell endring i patogeniteten inne i ekskonjugantene ikke var et resultat av for mange omflytninger. Plasmidpreparat av ekskonjugantene viste at utleveringsplasmid-vektoren pRK2013 ikke replikerte i stamme 775-17B (data ikke vist).

Screening for ikke- virulente ekskonjuganter

Ekskonjuganter ble screenet for virulens ved infeksjon av regnbueørret som beskrevet ovenfor. Infiseringen ble utført ved nedsenkning av fisk i vann inneholdende 5x10^ bakterier pr. ml i 30 minutter. Dødelighet ble kontrollert daglig, og eksperimentene ble utført i 7 dager.

To av de testede mutanter ble funnet å være ikke-virulente. Disse to mutanter, VAN 20 og VAN 70, ble videre testet for deres virulens ved infeksjon av fisk både intraperitonealt og ved nedsenkning.

LD5Q (i.p.) overskred lxlO6 bakterier, og LD5Q (im.) overskred 2x10^ bakterier pr. ml for begge stammer. De tilsvarende LD^^-verdier for den opphavelige stamme var <lxl0<2 >og 2xl0<5> (tabell 2).

Karakterisering av ekskonjuganter

Produksjon av proteaser og hemolytisk aktivitet er foreslått å være involvert i patogeniteten av bakterier. V. anguillarum utviser både en proteolytisk og en hemolytisk aktivitet. Evnen til alle isolerte ekskonjuganter til å produsere proteolytisk aktivitet ble testet ved utstrykning av bakteriene på en gelatinplate. Ingen av de isolerte ekskonjuganter manglet proteaseaktivitet.

Undersøkelse av den hemolytiske aktivitet på blodplater ga også positive resultater i alle tilfeller.

Evnen til å utskille lave mengder jern fra verten har også vært en faktor som er foreslått å være involvert i virulens. Ekskonjugantene ble derfor testet på minimalplater inneholdende det jernchelaterende middel EDDA. Alle ekskonjuganter var i stand til å vokse på platene, noe som viste at transposonet ikke var inkorporert i 65 kb-plasmidet kjent for å kode for et jernutskillende system. Plasmidet ble isolert fra ekskonjugantene, hvoretter plasmidet ble oppsluttet med BamHl. Ingen forskjell ble observert når oppslut-ningsmønsteret av plasmidet til stamme 775.17B ble sammenlignet med det tilsvarende plasmid for ekskonjugantene.

Ikke i noe tilfelle ble transposonet inkorporert i 65 kb-plasmidet.

Veksthastighetene av bakteriene er en faktor som kan påvirke virulensen. For å undersøke hvorvidt inkorporeringen av transposonet endret veksthastigheten av ekskonjugantene, ble de to ikke-virulente ekskonjuganter pluss fire virulente ekskonjuganter og villtypestammen dyrket i MOPS minimalt medium (Neidhardt et al., 1974) ved 20°C. Villtypestammen, 775.17B, vokste hurtigere enn mutantene, men ingen sammenheng kunne observeres mellom veksthastighet og grad av virulens blant ekskonjugantene (tabell 3).

For å undersøke hvorvidt transposonet var inkorporert tilfeldig i kromosomet, ble kromosomalt DNA fra seks forskjellige ekskonjuganter isolert, oppsluttet med EcoRl, og adskilt på en agarosegel. DNA ble deretter overført til et nitrocellulosefilter. Filterhybridisering ble utført ved anvendelse av et 3 2P-merket oligonukleotid som var fullstendig homologt med nukleotider 49 til 78 i den inverterte gjentag-else av Tn5-132. Alle seks ekskonjuganter viste forskjellige hybridiseringsmønstre (fig- 1). Tn5-132 har et EcoRl-sete i midten av transposonet, noe som forklarer tilsynekomsten av to bånd i hvert felt. Den opphavelige stamme 775 ble også oppsluttet og blottet, men ingen hybridisering ble observert. Det kan således konkluderes med at transposonet var vilkårlig inkorporert i de forskjellige ekskonjuganters kromosom.

Anvendelse av ikke- virulente ekskonjuganter som vaksiner

De to ikke-virulenteekskonjuganter, VAN 20 og VAN 70, ble testet for deres potensielle evne som levende vaksiner mot vibriose. Fisk ble senket ned i en bakteriell suspensjon inneholdende enten VAN 20 eller VAN 70, ved en konsentrasjon på 2xl0<7> bakterier pr. ml i 30 minutter ved 18°C. Forsøk på infeksjon ble utført 1, 2, 4, 10 og 17 uker etter vaksin-ering. To forskjellige stammer ble anvendt som infiserende organismer, den homologe 775.17B og en heterolog stamme NB 10. Den sistnevnte stamme utviser en meget lav LD^Q-verdi når fisken infiseres ved nedsenkning. Infiseringen ble utført ved å bade fisken i vann inneholdende tre forskjellige kon-sentrasjoner av teststammene. Dette gjorde det mulig å be-stemme LDj-0~verdiene av den vaksinerte fisk sammenlignet med ikke-vaksinert fisk. To uker etter immunisering viste den vaksinerte fisk en økt resistens mot den homologe stamme, observert som en 10-til 30-gangers økning i LD5Q-verdien (tabell 4).

Etter 4 uker var beskyttelsen ennå signifikant, og selv etter 10 uker var beskyttelsen opprettholdt på det samme nivå. Når den immuniserte fisk ble infisert med den heterologe stamme NB 10, ble en svak positiv effekt også observert. 12 uker etter immuniseringen ble en booster-dose administrert. Etter 17 uker var fisken som ikke hadde fått booster-dose, ikke lenger beskyttet. Fisken som hadde fått booster-dose, viste imidlertid høye beskyttelsesnivåer. Det bør anmerkes at beskyttelse mot NB 10 (dvs. den heterologe stamme) ble observert hos fisk som hadde fått en booster-dose av VAN 70.

Basert på disse resultater kan de følgende konklu-sjoner trekkes: 1) Det var mulig å produsere ikke-virulente mutanter ved å overføres transposonet Tn5-132 til Vibrio anguillarum ved anvendelse av den bred vertområde-utleveringsvektor pRK2013. Vektoren kunne ikke replikere i V. anguillarum. 2) Transposonet ble inkorporert vilkårlig i mottager-kromosomet. 3) Det var mulig å isolere ekskonjuganter som var ikke-virulente overfor regnbueørret i infeksjonseksperimenter i laboratoriet. 4) De ikke-virulente mutanter ble ikke påvirket i noen av de testede, potensielle virulensegenskaper. 5) Anvendelsen av de ikke-virulente ekskonjuganter som levende vaksiner ga en økt resistens overfor både homologe og heterologe patogene midler.

Eksempel 2

Stammen VAN 1000 ble isolert som en streptomycin-resistent og rifampicinresistent, spontan mutant av V. anguillarum 775.17B ved utvelgelse på TSA-plater supplert med 200 ug/ml rifampicin, etterfulgt av utvelgelse på TSA-plater suppliert med 100 ug/ml streptomycin i det vesentlige som beskrevet i eksempel 1.

Den isolerte stamme ble underkastet LD^0-målinger som beskrevet i eksempel 1. LD50 var nØYere enn lxlO^/ml.

Immuniseringseksperimenter ble utført som beskrevet i eksempel 1 ved nedsenkning av fisken i vann inneholdende 1x10 7/ml VAN 1000. Resultatene som ble målt ved bestemmelse av økningen i LD^Q-verdien, er vist i tabell 5.

Det fremgår fra tabell 5 at VAN 1000 ikke bare gir beskyttelse mot en homolog og heterolog stamme av V. anguillarum, men også kryss-beskyttelse mot A. salmonicida.

Eksempel 3

Et feltimmuniseringsforsøk ble utført ved anvendelse av stammen VAN 1000. I januar 1988 ble 200 regnbueørret (Salmo gairdneri) vaksinert som beskrevet i eksempel 1 og 2 ved nedsenkning av fisken i vann inneholdende 1x10 7/ml av den ovenfor angitte stamme i 30 minutter ved en temperatur på 18°C. Den vaksinerte fisk ble holdt i 1 m<3> kar fra tiden for vaksinasjon inntil september 1988. Uvaksinert fisk som ble holdt i to andre kar (hhv. 2000 og 1000 fisk) tjente som kontroller.

Innløpsvannet var urenset brakkvann fra Østersjøen,

og vannet var den eneste infeksjonskilde. Vanninnløpet var felles for alle tre kar.

Utbrudd av vibriose ble kontrollert i karene ved å registrere antall fisk som døde i hvert individuelt krav. Sykdommen ble bekreftet ved isolasjon av Vibrio anguillarum fra et representativt antall død fisk. Utbrudd av dødbring-ende vibriose forekom i løpet av juli ved to forskjellige anledninger i de to kar med uvaksinert fisk. Ingen vesentlig fiskedød ble observert etter juli måned i kontroll-gruppene. I den vaksinerte fiskegruppe døde imidlertid kun 1 fisk i begynnelsen av måneden i løpet av hvilken periode det ikke ble observert sykdomsutbrudd i kontrollkarene.

Under sykdomsutbruddene i de uvaksinerte fiskegrupper forekom ingen dødsfall blant den vaksinerte fisk.

Resultatene er illustrert i fig. 2 hvori antall død fisk er gitt som en prosentdel av det totale antall levende fisk i karene. I figuren angir a uvaksinert fisk i kar nr. 1; b angir uvaksinert fisk i kar nr. 2 og c angir vaksinert fisk.

Dette eksempel gir som konklusjon at VAN 1000-stammen har gitt en vesentlig beskyttelse mot en naturlig infeksjonsutfordring i mottagelig regnbueørret under feltbetingelser.

Litteratur

Agius, C, M.T. Horne og P.D. Ward, 1983. Immunisation of rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson, against vibriosis: comparison of an extract antigen with whole cell bacterins by oral and intraperitoneal routes. J. Fish Dis. 6: s. 129-134.

Crosa, J.H. 1980. A plasmid associated with virulence in

the marine fish pathogen Vibrio anguillarum specifies an iron-sequestering system. Nature 284, s. 566-568.

Ely, B. 1985. Vectors for transposon mutagenesis of non-enteric bacteria. Mol. Gen. Genet. 200, s. 302-304.

Hone, D., R. Morona, S. Attridge og J. Hackett, 1987. Construction of defined galE mutant of Salmonella for use

as vaccines. J. Inf. Dis. 156, s. 167-174.

Inamura, H., K. Muroga og T. Nakai, 1984. Toxicity of extracellular products of Vibrio anguillarum, Fish Pathol.,

s. 89-96.

Inamura, H., T. Nakai og K. Muroga, 1985. An extracellular protease produced by Vibrio anguillarum. Bull. Jap. Soc.

Sei. Fish. 51, s. 1915-1920.

Kawano, K., T. Aoki og T. Kitao, 1984. Duration of protection against vibriosis in ayu, Plecoglossus altivelis, vaccinated by immersion and oral administration with Vibrio anguillarum. Bull. Jpn. Soc. Sei. Fish. 50, s. 771-774.

Kodama, H., M. Moustafa, S. Ishiguro, T. Mikami og H. Izawa, 1984. Extracellular virulence factors of fish Vibrio: Relationships between toxic material, haemolysin and proteo-lytic enzyme. Am J. Vet. Res. 45, s. 2203-2207.

Maniatis, T., E.F. Fritsch og J. Sambrook, 1982. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York.

Munn, C.B., 1978. Haemolysin production by Vibrio anguillarum. FEMS Microbiol. Lett. 3, s. 265-268.

Neidhardt, P.C., P.L. Bloch og D.F. Smith, 1974. Culture medium for enterobacteria. J. Bacteriol. 119, s. 736-747.

Reed, L.J. og H. Muench, 1938. A simple method on estimating fifty per cent endpoints. Am. J. Hyg. 27, s. 493-497.

Rodina, A.G., 1972. Methods in aquatic microbiology,

s. 254-255.

Trust, T.J., I.D. Courtice, A.G. Khouri, J.H. Crosa og

M.H. Schiewe, 1981. Serum resistance and haemagglutination ability of marine vibrios pathogenic to fish. Infect. Immun. 34, s. 702-707.

Wahden, M.H., C- Se'rie', Y. Cerisier, S. Sallam og

R. Germanier, 1982. A controlled field trial of live Salmonella typhy strain Ty 21a oral vaccine against typhoid: three-year results. J. Inf. Dis. 145, s. 292-295.

Walter, M.A., S.A. Potter og J.H. Cross, 1983. Iron uptake system mediated by Vibrio anguillarum plasmid pJMl.

J. Bacteriol. 156, s. 880-887.

Ward, P.D., M.F. Tatner og M.T. Horne, 1985. Factors influencing the efficacy of vaccines against vibriosis caused by Vibrio anguillarum. I "Fish Immunology". M.J. Manning og M.F. Tatner (red.), s. 221-229.

Wolf, M.K. og J.H. Crosa, 1986. Evidence for the role of a siderophore in promoting Vibrio anguillarum infections.

J. Gen. Microbiol. 132, s. 2949-2952.

Claims (26)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en levende vaksine som gir kryssimmunitet for immunisering av fisk mot sykdommer forårsaket av fiskepatogene mikroorganismer, karakterisert ved at den omfatter (1) isolering av en moderstamme fra en virulent, inntrengende, immunogen fiskepatogen bakterie valgt fra Vibrio anguillarum og Aeromonas salmonicida, (2) tilveiebringelse gjennom utvelgelse fra denne moderstamme av en ikke-virulent, inntrengende, immunogen, mutant stamme som oppviser en LD50-verdi som overstiger 2 x IO<7> bakterier/ml ved nedsenking av fisk i en suspensjon av denne stamme, som inneholder minst én antibiotisk utvelgbar markør, samt, når bakterien er en Vibrio anguillarum, oppviser evne til å vokse i nærvær av et jern-chelaterende middel, (3) dyrkning av den utvalgte stamme i et kulturmedium for å frembringe vaksinen og (4) innhøsting av de resulterende celler og fremstilling av en vaksine innbefattende de innhøs-tede celler.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den mutante stamme til-veiebringes gjennom utvelgelse av en spontan mutant.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den mutante stamme til-veiebringes ved at moderstammen utsettes for behandling med et mutagen som ultrafiolett stråling, ioniserende stråling eller et kjemisk mutagen.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den mutante stamme til-veiebringes ved hjelp av rekombinant DNA-innføyelse som resul-terer i et gen hvis produkt er påkrevet for at bakteriell virulens skal bli defekt eller fraværende.

5. Fremgangsmåte ifølge krav v 4, karakterisert ved at det anvendes en DNA- innføyelse, hvorved genet som blir defekt eller fraværende koder for en virulent determinant.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det anvendes en DNA-innføyelse som forårsaker defekt og som er en transposon-inn-føyelse.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 4 eller 5, karakterisert ved at det anvendes en DNA-innf øyelse, hvorved genet hvis produkt er påkrevet for bakteriell virulens er delvis eller fullstendig utslettet.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det fremstilles en mutant stamme som er en stamme fra V. anguillarum.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at det fremstilles en mutant stamme som er utvalgt fra VAN 1000 (aksesjonsnr. DSM 4508), VAN 20 (aksesjonsnr. DSM 4506) og VAN 70 (aksesjonsnr. DSM 4507).

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den dessuten innbefatter innføyelse av en DNA-sekvens i den mutante stamme som koder for en antigen determinant fra en annen fiskepatogen mikroorganisme, slik som en bakterie eller et virus, og som er i stand til å uttrykke denne DNA-sekvens.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at det anvendes en DNA-sekvens som koder for en antigen determinant som stammer fra Vibrio anguillarum, Vibrio salmonicida, Vibrio ordalii, Reromonas salmonicida ssp. salmonicida eller acromogenes, Reromonas hydrophila, Flexibacter columnaris, Cytophaga spp., Flavobacterium spp., Renibacterium salmoninarum, Lactobacillus spp., Edwardsiella tarda, Pseudomonas spp., Pasteurella spp., Sporocytophaga spp., Mycobacterium spp., Nocardia asteroides, Streptomyces spp., Streptococcus spp., Eubacterium tarentellus og Yersinia ruckerii.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 10 eller 11, karakterisert ved at DNA-sekvensen som koder for den antigene determinant innføyes i et gen som koder for et produkt som er påkrevet for bakteriell virulens.

13. Fremgangsmåte ifølge kravene 10-12, karakterisert ved at den omfatter innføyelse av to eller flere DNA-sekvenser som koder for antigene determinanter fra forskjellige fiskepatogene mikroorganismer.

14. Ikke-virulent, inntrengende, immunogen mutant stamme av en opprinnelig virulent fiskepatogen bakterie valgt fra Vibrio anguillarum og Aeromonas salmonicida, karakterisert ved at den mutante stamme oppviser en LD50-verdi som overstiger 2 x 10<7> bakterier/ml ved nedsenking av fisk i en suspensjon av denne stamme, samt at den, når bakterien er en Vibrio anguillarum, oppviser evne til å vokse i nærvær av et jern-chelaterende middel, inneholder minst én antibiotisk utvelgbar markør og oppviser evne til å gi beskyttelse til fisk som er immunisert med en levende vaksine inneholdende stammen, i det minste mot sykdommer forårsaket av homologe og heterologe Vibrio anguillarum og Aeromonas salmonicida.

15. Ikke-virulent, inntrengende, immunogen mutant stamme ifølge krav 14, karakterisert ved at den er en isolert, spontan mutant.

16. Ikke-virulent, inntrengende, immunogen mutant stamme følge krav 14, karakterisert ved at den er behandlet med et mutagen som ultrafiolett stråling, ioniserende stråling eller et kjemisk mutagen.

17. Ikke-virulent, inntrengende, immunogen mutant stamme ifølge krav 14, karakterisert ved at et kromosomalt gen i den mutante stamme hvis produkt er påkrevet for bakteriell virulens, er defekt eller fraværende.

18. Ikke-virulent, inntrengende, immunogen mutant stamme ifølge krav 17, karakterisert ved at genet koder for en virulent determinant.

19. Ikke-virulent, inntrengende, immunogen mutant stamme ifølge krav 17 eller 18, karakterisert ved at genet inneholder en DNA-innføyelse.

20. Ikke-virulent, inntrengende, immunogen mutant stamme ifølge krav 19, karakterisert ved at DNA-innføyelsen er en transposon-innføyelse.

21. Ikke-virulent, inntrengende, immunogen mutant stamme ifølge krav 17 eller 18, karakterisert ved at genet er delvis eller fullstendig utslettet.

22. Ikke-virulent, inntrengende, immunogen mutant stamme ifølge krav 14, karakterisert ved at den er utvalgt fra VAN 1000 (aksesjonsnr. DSM 4508), VAN 20 (aksesjonsnr. DSM 4506) og VAN 70 (aksesjonsnr. DSM 4507).

23. Ikke-virulent, inntrengende, immunogen mutant stamme ifølge krav 14, karakterisert ved at den mutante stamme av den fiskepatogene bakterie inneholder en DNA-sekvens som koder for en antigen determinant av en annen fiskepatogen mikroorganisme, slik som en bakterie eller et virus, og som er i stand til å uttrykke denne DNA-sekvens.

24. Ikke-virulent, inntrengende, immunogen mutant stamme ifølge krav 23, karakterisert ved at DNA-sekvensen som koder for den antigene determinant er innføyet i et gen som koder for et produkt som er påkrevet for bakteriell virulens.

25. Ikke-virulent, inntrengende, immunogen mutant stamme ifølge krav 24, karakterisert ved at den inneholder to eller flere DNA-sekvenser som koder for antigene determinanter fra forskjellige fiskepatogene mikroorganismer.

26. Ikke-virulent, inntrengende, immunogen mutant stamme ifølge kravene 23-25, karakterisert ved at DNA-sekvensen som koder for antigendeterminanten stammer fra Vibrio anguillarum, Vibrio salmonicida, Vibrio ordalii, Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida eller acromogrenes, Aeromonas hydrophila, Flexibacter columnaris, Cytophaga spp., Flavobacterium spp., Renibacterium salmoninarum, Lactobacillus spp., Edwardsiella tarda.