CN113549572A - 一种用于海水鱼的链球菌联合疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物疫苗技术领域，公开了一种用于海水鱼的链球菌联合疫苗及其制备方法，所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗按质量份数计，由灭活链球菌浓缩液65～80份、佐剂15～30份和辅剂3～5份组成；所述灭活链球菌浓缩液的细菌浓度＞50×108cfu/mL；所述链球菌包括海豚链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和格氏乳球菌中的任意两种或两种以上。本发明链球菌联合疫苗的组分配伍设计科学合理，使用安全，接种方便，无药物残留，免疫预防效果显著，大大提高了免疫效率和接种疫苗剂量准确性。同时，本发明提供的用于海水鱼的链球菌联合疫苗的制备方法操作简单，成本低廉，可广泛用于海水鱼链球菌病的预防，具有良好的市场应用前景。

Description

一种用于海水鱼的链球菌联合疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于生物疫苗技术领域，更具体地，本发明尤其涉及一种用于海水鱼的链球菌联合疫苗及其制备方法。
背景技术
目前，随着海水鱼规模化、集约化养殖的快速发展和养殖环境的日益恶化，病害频繁暴发，尤其是细菌性疾病流行范围广、传染性强、发病率和死亡率高，其中，以链球菌感染最为流行，在全球的主要鱼类养殖国家均有发生，危及各种海淡水养殖鱼类，并且有逐年递增的趋势，其危害日益凸显，据统计，全球每年渔业因链球菌病所造成的经济损失至少超过1.5亿美元，造成了巨大的经济损失。病害的暴发与随之带来的食品安全问题已成为制约我国海水鱼产业健康持续发展的瓶颈。然而，目前缺乏一套行之有效的防治手段，化学药物只能在疾病的早期起到控制病情的辅助性作用，而且药物的使用容易导致耐药的产生和环境污染及食品的药物残留。经长期对海水鱼类病害的研究发现，海豚链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和格氏乳球菌是是引起海水鱼类链球菌病的主要病原菌，而且常多种病原混合感染。然而目前所研究开发的链球菌疫苗存在免疫原种类和作用对象单一、抗链球菌种类专一、免疫保护率低下及免疫持续期短等多方面的问题，使其在生产上的应用受到了极大的限制。疫苗免疫是预防和控制海水鱼链球菌病流行与传播最为有效、安全和环保的方法之一，故亟需一种新的能够用于海水鱼的链球菌联合疫苗及其制备方法。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前缺乏一套行之有效的方案预防和治疗该病，药物只能在早期起到控制病情的辅助性作用，但随着耐药和抗药性的产生和积累，该病的现状几乎是“无药可治可防”。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于海水鱼的链球菌联合疫苗及其制备方法。
本发明是这样实现的，一种用于海水鱼的链球菌联合疫苗的制备方法，所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗的制备方法包括以下步骤：
步骤一，按照质量份数称取牛脑浸粉3～5份、牛心浸粉3～5份、酪蛋白胨6～8份、蛋白胨4～6份、酵母粉1-2份、葡萄糖2～3份、氯化钠4～5份、磷酸氢二钠2～3份、琼脂12～15份、无菌蒸馏水1000份，混合后搅拌均匀得到混合物料；将混合物料进行加热直至充分溶解，高温灭菌后进行静置、冷却，得到脑心浸液琼脂培养基；将分离自发病海水鱼体内并具有强毒力和良好免疫原性的海豚链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和格氏乳球菌分别接种至脑心浸液琼脂培养基中进行培养；
步骤二，将步骤一所述脑心浸液琼脂培养基上培养好的菌苔接种于高压灭菌且盛有500mL脑心浸液培养基的锥形瓶中，在振荡摇床中进行小体积的液体活化培养；所述在振荡摇床中进行小体积的液体活化培养的条件为：设置小体积的液体活化培养的温度为28±0.5℃，摇床转速为120～180r/min，活化培养时间为20～24h；
步骤三，将步骤二得到的活化培养好的菌体按照2～4％的比例接种于生物反应器中已经高压灭菌的30L发酵培养基中通气搅拌培养，当链球菌生长到108或109CFU/mL时，停止发酵反应；所述将活化培养好的菌体接种于生物反应器中已经高压灭菌的发酵培养基中通气搅拌培养的条件为：于温度为28±0.5℃、通气量为100～150L/min的条件下搅拌培养12～14h；
步骤四，将得到的链球菌接种于300L发酵培养基，于28±0.5℃、180～200r/min、通气量为250～300L/min的条件下培养12～14h后，取样，测定菌液A600值，直到菌液A600开始下降，停止发酵反应；
步骤五，将经步骤四发酵反应得到的链球菌发酵菌液转入灭活罐中进行灭活，收集灭活液体进行过滤或是离心浓缩，收集菌体，重悬，制成灭活链球菌浓缩液；将制备得到的灭活链球菌浓缩液使用无菌磷酸盐缓冲溶液进行稀释，于配苗罐中依次加入佐剂和辅剂，搅拌均匀，即得所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗成品。
进一步，步骤一中，所述分别接种至脑心浸液琼脂培养基中进行培养的条件为：于28±0.5℃条件下培养20～24h。
进一步，步骤五中，所述将链球菌发酵菌液转入灭活罐中进行灭活，收集灭活液体进行过滤或是离心浓缩，收集菌体，重悬，包括：
(1)将发酵反应得到的链球菌发酵菌液转入灭活罐中，添加至浓度体积分数0.1～0.5％的福尔马林溶液，于28±0.5℃、50～100r/min的条件下灭活24～48h；
(2)使用0.45μm滤膜进行超滤，或是利用离心机离心收集菌体；
(3)用磷酸盐缓冲溶液将收集菌体稀释成浓度为5.0×108～10.0×109CFU/mL灭活上述链球菌浓缩液。
进一步，步骤五中，所述将制备得到的灭活链球菌浓缩液使用无菌磷酸盐缓冲溶液进行稀释，于配苗罐中依次加入佐剂和辅剂，搅拌均匀，包括：
(1)在灭活链球菌浓缩液中加入无菌磷酸盐缓冲溶液的比例进行稀释；
(2)将稀释后的灭活链球菌浓缩液65～80份置于配苗罐中，以50～100r/min的速度搅拌，边搅拌边依次加入15～30份的佐剂和3～5份的辅剂；
(3)搅拌混合10～40min后，在无菌条件下，灌装，即得所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗成品。
进一步，步骤五中，所述佐剂包括氢氧化铝胶、矿物油、蜂胶、MONTANIDETM ISA763A VG、MONTANIDETM IMS 1312VG、MONTANIDETM GEL 01PR中的任意一种或一种以上。
进一步，步骤五中，所述辅剂包括防腐剂和稀释剂，所述防腐剂包括硫柳汞，所述稀释剂包括磷酸盐缓冲溶液。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗的制备方法制备的用于海水鱼的链球菌联合疫苗，其特征在于，所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗按照体积份数计，由灭活链球菌浓缩液65～80份、佐剂15～30份和辅剂3～5份组成。
进一步，所述灭活链球菌浓缩液的细菌浓度＞50×108cfu/mL。
进一步，所述链球菌包括海豚链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和格氏乳球菌中的任意两种或两种以上按(1～3):1:1:1浓度比例配伍而成。
本发明的另一目的在于提供一种所述的用于海水鱼的链球菌联合疫苗在预防海水鱼链球菌病的疫苗接种中的应用，所述海水鱼包括石斑鱼、卵形鲳鲹、海鲈、高体鰤、军曹鱼。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的用于海水鱼的链球菌联合疫苗组分的配伍设计科学合理，使用安全，接种方便，无药物残留，免疫预防效果显著，大大提高了免疫效率和接种疫苗剂量准确性。本发明提供的用于海水鱼的链球菌联合疫苗在制备中，将分离自发病海水鱼体内并具有强毒力和良好免疫原性的海豚链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和格氏乳球菌分别接种至脑心浸液琼脂培养基中进行培养，其中，脑心浸液(琼脂)培养基中的牛脑浸粉、牛心浸粉、蛋白胨、酪蛋白胨、酵母粉和小牛血清提供氮源、维生素和生长因子，葡萄糖可为多种细菌提供能源，氯化钠维持均衡的渗透压，磷酸氢二钠为缓冲剂，(琼脂为凝固剂)，制备的培养基可以实现对链球菌的培养效果的提升，可获得大量含有免疫保护性抗原的菌体；本发明的的制备方法操作简单，成本低廉，可广泛用于海水鱼链球菌病的防治，具有良好的市场应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的用于海水鱼的链球菌联合疫苗的制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的制备脑心浸液琼脂培养基流程图。
图3是本发明实施例提供的将链球菌发酵菌液转入灭活罐中进行灭活，收集灭活液体进行过滤或是离心浓缩，收集菌体，重悬流程图。
图4是本发明实施例提供的将制备得到的灭活链球菌浓缩液使用无菌磷酸盐缓冲溶液进行稀释，于配苗罐中依次加入佐剂和辅剂，搅拌均匀流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于海水鱼的链球菌联合疫苗及其制备方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的用于海水鱼的链球菌联合疫苗的制备方法包括以下步骤：
S101，制备脑心浸液琼脂培养基；将分离自发病海水鱼体内并具有强毒力和良好免疫原性的海豚链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和格氏乳球菌分别接种至脑心浸液琼脂培养基中进行培养；
S102，将脑心浸液琼脂培养基上培养好的菌苔接种于高压灭菌且盛有500mL脑心浸液培养基的锥形瓶中，在振荡摇床中进行小体积的液体活化培养；所述在振荡摇床中进行小体积的液体活化培养的条件为：设置小体积的液体活化培养的温度为28±0.5℃，摇床转速为120～180r/min，活化培养时间为20～24h；
S103，将活化培养好的菌体按照2～4％的比例接种于生物反应器中已经高压灭菌的30L发酵培养基中通气搅拌培养，当链球菌生长到108或109CFU/mL时，停止发酵反应；所述将活化培养好的菌体接种于生物反应器中已经高压灭菌的发酵培养基中通气搅拌培养的条件为：于温度为28±0.5℃、180～200r/min、通气量为100～150L/min的条件下搅拌培养12～14h；
S104，将得到的链球菌接种于300L发酵培养基，于28±0.5℃、180～200r/min、通气量为250～300L/min的条件下培养12～14h后，取样，测定菌液A600值，直到菌液A600开始下降，停止发酵反应；
S105，将经发酵反应得到的链球菌发酵菌液转入灭活罐中进行灭活，收集灭活液体进行过滤或离心浓缩，收集菌体，重悬，制成灭活链球菌浓缩液；将制备得到的灭活链球菌浓缩液使用无菌磷酸盐缓冲溶液进行稀释，于配苗罐中依次加入佐剂和辅剂，搅拌均匀，即得所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗成品。
如图2所示，步骤S101中，本发明实施例提供的制备脑心浸液琼脂培养基，包括：
S201，按照质量份数称取牛脑浸粉3～5份、牛心浸粉3～5份、酪蛋白胨6～8份、蛋白胨4～6份、酵母粉1-2份、葡萄糖2～3份、氯化钠4～5份、磷酸氢二钠2～3份、琼脂4～8份、无菌蒸馏水1000份；
S202，将称取物料混合后搅拌均匀得到混合物料；将混合物料进行加热直至充分溶解；
S203，进行高温灭菌后静置、冷却，得到脑心浸液琼脂培养基。
步骤S101中，本发明实施例提供的分别接种至脑心浸液琼脂培养基中进行培养的条件为：于28±0.5℃条件下培养20～24h。
如图3所示，步骤S105中，本发明实施例提供的将链球菌发酵菌液转入灭活罐中进行灭活，收集灭活液体进行过滤或离心浓缩，收集菌体，重悬，包括：
S301，将发酵反应得到的链球菌发酵菌液转入灭活罐中，添加至终浓度体积分数0.1～0.5％的福尔马林溶液，于28±0.5℃、50～100r/min的条件下灭活24～48h；
S302，使用0.45μm滤膜进行超滤，或利用离心机离心收集菌体；
S303，用磷酸盐缓冲溶液将收集菌体稀释成浓度为5.0×108～10.0×109CFU/mL灭活无乳链球菌浓缩液。
如图4所示，步骤S105中，本发明实施例提供的将制备得到的灭活链球菌浓缩液使用无菌磷酸盐缓冲溶液进行稀释，于配苗罐中依次加入佐剂和辅剂，搅拌均匀，包括：
S401，在灭活链球菌浓缩液中加入无菌磷酸盐缓冲溶液进行稀释；
S402，将稀释后的灭活链球菌浓缩液65～80份置于配苗罐中，以50～100r/min的速度搅拌，边搅拌边依次加入15～30份的佐剂和3～5份的辅剂；
S403，搅拌混合10～40min后，在无菌条件下，灌装，即得所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗成品。
步骤S105中，本发明实施例提供的佐剂包括氢氧化铝胶、矿物油、蜂胶、MONTANIDETM ISA763 A VG、MONTANIDETM IMS 1312VG、MONTANIDETM GEL 01PR中的任意一种或一种以上。
步骤S105中，本发明实施例提供的辅剂包括防腐剂和稀释剂，所述防腐剂包括硫柳汞，所述稀释剂包括磷酸盐缓冲溶液。
本发明实施例提供的用于海水鱼的链球菌联合疫苗按照体积份数计，由灭活链球菌浓缩液65～80份、佐剂15～30份和辅剂3～5份组成。
本发明实施例提供的灭活链球菌浓缩液的细菌浓度＞50×108cfu/mL。
本发明实施例提供的链球菌包括海豚链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和格氏乳球菌中的任意两种或两种以上按(1～3):1:1:1浓度比例配伍而成。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于海水鱼的链球菌联合疫苗的制备方法，其特征在于，所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗的制备方法包括以下步骤：
步骤一，按照质量份数称取牛脑浸粉3～5份、牛心浸粉3～5份、酪蛋白胨6～8份、蛋白胨4～6份、酵母粉1-2份、葡萄糖2～3份、氯化钠4～5份、磷酸氢二钠2～3份、琼脂12～15份、无菌蒸馏水1000份，混合后搅拌均匀得到混合物料；将混合物料进行加热直至充分溶解，高温灭菌后进行静置、冷却，得到脑心浸液琼脂培养基；将分离自发病海水鱼体内并具有强毒力和良好免疫原性的海豚链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和格氏乳球菌分别接种至脑心浸液琼脂培养基中进行培养；脑心浸液培养基成分1000份中包括：牛脑浸粉4.0份、牛心浸粉4.0份、蛋白胨5.0份、酪蛋白胨16.0份、氯化钠5.0份、葡萄糖2.0份、磷酸氢二钠2.5份、酵母粉1份、小牛血清1份；
步骤二，将步骤一所述脑心浸液琼脂培养基上培养好的菌苔接种于高压灭菌且盛有500mL脑心浸液培养基的锥形瓶中，在振荡摇床中进行小体积的液体活化培养；所述在振荡摇床中进行小体积的液体活化培养的条件为：设置小体积的液体活化培养的温度为28±0.5℃，摇床转速为120～180r/min，活化培养时间为18～h；
步骤三，将步骤二得到的活化培养好的菌体按照2～4％的比例接种于生物反应器中已经高压灭菌的30L发酵培养基中通气搅拌培养，当链球菌生长到108或109CFU/mL时，停止发酵反应；所述将活化培养好的菌体接种于生物反应器中已经高压灭菌的发酵培养基中通气搅拌培养的条件为：于温度为28±0.5℃、通气量为100～150L/min的条件下搅拌培养12～14h；步骤四，将得到的链球菌接种于300L发酵培养基，于28±0.5℃、180～200r/min、通气量为250～300L/min的条件下培养12～14h后，取样，测定菌液A600值，直到菌液A600开始下降，停止发酵反应；
步骤五，将经步骤四发酵反应得到的链球菌发酵菌液转入灭活罐中进行灭活，收集灭活液体进行过滤或是离心浓缩，收集菌体，重悬，制成灭活链球菌浓缩液；将制备得到的灭活链球菌浓缩液使用无菌磷酸盐缓冲溶液进行稀释，于配苗罐中依次加入佐剂和辅剂，搅拌均匀，即得所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗成品。
2.如权利要求1所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述分别接种至脑心浸液琼脂培养基中进行培养的条件为：于28±0.5℃条件下培养20～24h。
3.如权利要求1所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述将链球菌发酵菌液转入灭活罐中进行灭活，收集灭活液体进行过滤或是离心浓缩，收集菌体，重悬，包括：
(1)将发酵反应得到的链球菌发酵菌液转入灭活罐中，添加终浓度体积分数0.1～0.5％的福尔马林溶液，于28±0.5℃、50～100r/min的条件下灭活24～48h；
(2)使用0.45μm滤膜进行超滤，或是利用离心机离心收集菌体；
(3)用磷酸盐缓冲溶液将收集菌体稀释成浓度为5.0×108～10.0×109CFU/mL灭活上述链球菌浓缩液。
4.如权利要求1所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述将制备得到的灭活链球菌浓缩液使用无菌磷酸盐缓冲溶液进行稀释，于配苗罐中依次加入佐剂和辅剂，搅拌均匀，包括：
(1)在灭活链球菌浓缩液中加入无菌磷酸盐缓冲溶液进行稀释；
(2)将稀释后的灭活链球菌浓缩液65～80份置于配苗罐中，以50～100r/min的速度搅拌，边搅拌边依次加入15～30份的佐剂和3～5份的辅剂；
(3)搅拌混合10～40min后，在无菌条件下，灌装，即得所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗成品。
5.如权利要求1所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述佐剂包括氢氧化铝胶、矿物油、蜂胶、MONTANIDETM ISA763A VG、MONTANIDETM IMS1312VG、MONTANIDETM GEL 01PR中的任意一种或一种以上。
6.如权利要求1所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述辅剂包括防腐剂和稀释剂，所述防腐剂包括硫柳汞，所述稀释剂包括磷酸盐缓冲溶液。
7.一种应用如权利要求1～6任意一项所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗的制备方法制备的用于海水鱼的链球菌联合疫苗，其特征在于，所述用于海水鱼的链球菌联合疫苗按照体积份数计，由灭活链球菌浓缩液65～80份、佐剂15～30份和辅剂3～5份组成。
8.如权利要求7所述的用于海水鱼的链球菌联合疫苗，其特征在于，所述灭活链球菌浓缩液的细菌浓度＞50×108cfu/mL。
9.如权利要求7所述的用于海水鱼的链球菌联合疫苗，其特征在于，所述链球菌包括海豚链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和格氏乳球菌中的任意两种或两种以上按1～3:1:1:1浓度比例配伍而成。
10.一种如权利要求7～9任意一项所述的用于海水鱼的链球菌联合疫苗在预防海水鱼链球菌病的疫苗接种中的应用，其特征在于，所述海水鱼包括石斑鱼、卵形鲳鲹、海鲈、高体鰤、军曹鱼。
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