CN108524927A - 一种草鱼出血症灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种草鱼出血症灭活疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种草鱼出血病灭活疫苗，包括由含草鱼出血症病毒GCHV‑892的灭活病毒液和蜂胶佐剂组成，本发明还提供该草鱼出血症灭活疫苗的制备方法，将草鱼出血症毒株GCHV‑892经复苏增殖后接种于经草鱼吻端成纤维细胞(PSF)，制备成制苗用病毒液，然后灭活并稀释，加入蜂胶佐剂配置成草鱼出血症灭活疫苗。本发明制备的草鱼出血症灭活疫苗质量稳定、安全，且免疫效率高。

Description

一种草鱼出血症灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种草鱼出血症灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
目前，草鱼养殖出现的疾病多种多样，尤其是草鱼出血症疾病的流行，造成巨大经济损失，严重阻碍水产养殖业的发展。病毒性出血症被称为艾特伟病，该病为发生在全世界的淡水和海水鱼类中并引发大量毙死的疾病。草鱼一旦染上出血症并发病，就会迅速传染，因而预防疾病非常重要，但仅通过改善饲养环境及饲养管理来抑制病毒的发生时受限的，因此，作为更根本的预防对策，急需开发一种疫苗。
至今为止，所开发的用于预防由细菌引起的疾病的疫苗很多，但几乎没有为预防鱼类病毒引起的疾病而常用化的疫苗，因此，开发出一种质量稳定、安全，且免疫保护率高的草鱼出血症灭活疫苗具有重大意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种草鱼出血症灭活疫苗，该疫苗由含草鱼出血症病毒GCHV-892的灭活病毒液和蜂胶佐剂组成，本发明还提供该草鱼出血症灭活疫苗的制备方法，将草鱼出血症毒株GCHV-892经复苏增殖后接种于经草鱼吻端成纤维细胞(PSF)，制备成制苗用病毒液，然后灭活并稀释，加入蜂胶佐剂配置成草鱼出血症灭活疫苗。本发明制备的草鱼出血症灭活疫苗质量稳定、安全，且免疫效率高。
本发明的技术方案为：
一种草鱼出血症灭活疫苗，由灭活病毒液和蜂胶佐剂组成。
所述灭活病毒液为含草鱼出血症病毒GCHV-892的灭活病毒液。
该草鱼出血症灭活疫苗中蜂胶含量为10mg/mL。
上述草鱼出血症灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：将蜂胶佐剂慢慢加入草鱼出血症病毒GCHV-892的灭活病毒液中，边加边震摇，使蜂胶与灭活病毒液充分混合成灭活疫苗，最终蜂胶含量为10mg/mL。
上述草鱼出血症病毒GCHV-892的灭活病毒液的制备方法包括以下步骤：
(1)草鱼吻端成纤维种子细胞培养：从液氮中取出草鱼吻端成纤维种子细胞，采用容量为250ml的细胞培养瓶，加入细胞培养液静止培养，细胞浓度为1×105-2×105个细胞/ml，细胞培养温度为28±1℃，培养3～4天即可长成致密单层；
(2)制苗用细胞制备：从液氮中取出草鱼吻端成纤维种子细胞，采用15L大细胞瓶增殖传代，加入细胞培养液，细胞接种浓度为1.5×105～2.0×105个细胞/ml，将15L大细胞瓶置于转瓶机上旋转培养，转速12转/小时，28℃下2～3天长成单层细胞；
(3)生产用毒种制备：将步骤(1)中的长成单层致密细胞的细胞培养瓶倒去细胞培养液，按病毒:细胞＝1:100的质量浓度接种冻干GCHV-892毒种，置28℃恒温吸附1小时后，倒掉病毒液，加入细胞维持液，置28℃恒温培养，培养5～6天，细胞病变程度达75％以上，每毫升病毒毒价≥108.7TCID50时，即得到细胞病毒培养液，保存于-70℃备用；
(4)制苗用病毒液的制备：按步骤(2)的方法培养草鱼吻端成纤维细胞，待其长成单层后，倒掉细胞培养液，换以步骤(3)中制备得到的细胞病毒培养液和细胞维持液，细胞病毒培养液与细胞维持液的体积比为1：50，置于28±1℃下恒温培养，培养5～6天后，当病变细胞达75％以上，每毫升病毒毒价≥108.7TCID50时，即可收获制苗用病毒液，置于-20℃保存；
(5)灭活及稀释：将步骤(3)所得制苗用病毒液冻融混合，加入体积比为0.1％的甲醛，置35℃恒温72小时灭活病毒，用0.65wt.％灭菌生理盐水稀释100倍，制备得到草鱼出血症病毒GCHV-892的灭活病毒液。
上述细胞培养液由199培养基和RPMI 1640培养基混合配制而成，并加入青霉素钾和硫酸链霉素使其浓度分别为100IU/ml和100μg/ml，采用不锈钢圆筒式过滤器装入孔径0.2μm的滤膜正压过滤除菌，-20℃保存，使用时加入10wt.％犊牛血清，再用NaHCO3调pH至7.0～7.2。
上述细胞维持液由199培养基和RPMI 1640培养基混合配制而成，并加入青霉素钾和硫酸链霉素使其浓度分别为100IU/ml和100μg/ml，采用不锈钢圆筒式过滤器装入孔径0.2μm的滤膜正压过滤除菌，-20℃保存，使用时加入2wt.％犊牛血清，再用NaHCO3调pH至7.2～7.5。
上述细胞消化液由胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠混合配制而成：用无钙镁磷酸缓冲液配制配置胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠混合溶液，使其胰蛋白酶浓度为0.25wt.％，乙二胺四乙酸二钠浓度为0.02wt.％，加入青霉素钾和硫酸链霉素使其浓度分别为100IU/ml和100μg/ml，采用不锈钢圆筒式过滤器装入孔径0.2μm的滤膜正压过滤除菌，-20℃保存。
上述蜂胶佐剂的制备方法为：将蜂胶在4～8℃下粉碎、过筛，按1:4(W/V)g/mL加入95wt.％的乙醇，放室温浸泡24～48小时，冷却，过滤取上清液。
本发明的有益效果如下：
本发明将草鱼出血症病毒GCHV-892接种于草鱼吻端成纤维细胞，经培养制备成制苗用病毒液，再经过灭活和稀释，然后加入蜂胶佐剂，制备成草鱼出血症灭活疫苗。经本发明方法制备的草鱼出血症灭活疫苗经检验无细菌和霉菌生长，支原体检验、甲醛含量合格，经本发明疫苗注射的250尾草鱼全部存活，因此本疫苗质量稳定、安全性高，经过免疫效力检验，本发明疫苗的免疫效力高达87％以上。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
以下实施例中的草鱼吻端成纤维细胞(PSF)使用代数范围为90～110代。保存条件为15℃一个月或液氮内五年以上。PSF材料出处见草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗的制备及其免疫效果，水产学报，1994，18(2)，110-117。
草鱼出血症病毒GCHV-892毒种是从野毒样品通过细胞传代纯化的毒种(代号为GCHV-892)。使用代数范围为5～12代，保存条件为：湿毒种-70℃一年、冻干毒种-70℃五年。
蜂胶佐剂购置于广东昆虫研究所。
细胞培养液由美国GIBCO公司的199和RPMI 1640干粉状培养基混合配制而成，按说明书的要求配制：加入青霉素钾和硫酸链霉素使其浓度分别为100IU/ml和100μg/ml，采用不锈钢圆筒式过滤器装入孔径0.2μm的滤膜正压过滤除菌，-20℃保存，使用时加入10wt.％犊牛血清，再用NaHCO3调pH至7.0～7.2。
细胞维持液由美国GIBCO公司的199和RPMI 1640干粉状培养基混合配制而成，按说明书的要求配制：加入青霉素钾和硫酸链霉素使其浓度分别为100IU/ml和100μg/ml，采用不锈钢圆筒式过滤器装入孔径0.2μm的滤膜正压过滤除菌，-20℃保存，使用时加入2wt.％犊牛血清，再用NaHCO3调pH至7.2～7.5。
细胞消化液由美国DIFCO公司的胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠混合配制而成：用无钙镁磷酸缓冲液配制配置胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠混合溶液，使其胰蛋白酶浓度为0.25wt.％，乙二胺四乙酸二钠浓度为0.02wt.％，加入青霉素钾和硫酸链霉素使其浓度分别为100IU/ml和100μg/ml，采用不锈钢圆筒式过滤器装入孔径0.2μm的滤膜正压过滤除菌，-20℃保存。细胞传代过程中，必须使用细胞消化液才可以进行传代。
实施例1
疫苗批号：020710
草鱼出血症灭活疫苗的制备方法：
1、草鱼吻端成纤维种子细胞培养：从液氮中取出草鱼吻端成纤维种子细胞，采用容量为250ml的细胞培养瓶，加入细胞培养液静止培养，细胞浓度为1×105个细胞/ml，细胞培养温度为28℃，培养3天即长成致密单层，置15℃保存，经细菌检验、霉菌、支原体检验、病毒检验合格均合格。
2、制苗用细胞制备：从液氮中取出草鱼吻端成纤维种子细胞，采用15L大细胞瓶增殖传代，加入细胞培养液，细胞接种浓度为1.5～2.0×105个细胞/ml，将15L大细胞瓶置于转瓶机上旋转培养，转速12转/小时，28℃下2～3天长成单层细胞，经细菌检验、霉菌、支原体检验、病毒检验合格均合格。
3、生产用毒种制备：将步骤(1)中的长成单层致密细胞的细胞培养瓶倒去细胞培养液，按病毒:细胞＝1:100的质量浓度接种冻干GCHV-892毒种，置28℃恒温吸附1小时后，加入细胞维持液，置28℃恒温培养，培养6天，细胞病变程度达75％，每毫升病毒毒价达到109TCID50，得到生产用毒种，保存于-70℃备用，经病毒含量测定、纯粹检验均合格。
4、制苗用病毒液的制备：按步骤(2)的方法培养草鱼吻端成纤维细胞，待其长成单层后，倒掉细胞培养液，换以步骤(3)中制备得到的细胞病毒培养液和细胞维持液，细胞病毒培养液与细胞维持液的体积比为1：50，置于28±1℃下恒温培养，培养5天后，病变细胞达80％，每毫升病毒毒价达到108.7TCID50，收获制苗用细胞病毒液，置于-20℃保存，经病毒含量测定、纯粹检验均合格。
5、灭活及稀释：将步骤(3)检验合格的制苗用病毒液冻融混合，加入体积比为0.1％的甲醛，置35℃恒温72小时灭活病毒，用0.65wt.％灭菌生理盐水稀释100倍，制备得到草鱼出血症病毒GCHV-892的灭活病毒液。
6、半成品检验：从灭活病毒液中逐瓶取样，按《中华人民共和国兽药典》2005年版三部附录15页进行，结果无菌生长；从每瓶病毒液中取样，用体重10g左右的草鱼50尾，每尾腹腔注射0.3ml，饲养在独立的水族箱中观察15天，结果均存活。
7、蜂胶佐剂的制备：将蜂胶在8℃下粉碎、过筛，按1:4(W/V)g/ml加入95wt.％的乙醇，放室温浸泡48小时，冷却，过滤取上清液。
8、配苗：将蜂胶佐剂慢慢加入草鱼出血症病毒GCHV-892的灭活病毒液中，边加边震摇，使蜂胶与灭活病毒液充分混合成灭活疫苗，最终蜂胶含量为10mg/mL。
9、分装：室温分装，加盖密封，贴标签，4℃保存。
实施例2
疫苗批号：020805
该批草鱼出血症灭活疫苗的制备方法与实施例1不同的是：步骤1中细胞浓度为1.2×105个/ml。
实施例3
疫苗批号：020828
该批草鱼出血症灭活疫苗的制备方法与实施例1不同的是：步骤1中细胞浓度为1.5×105个/ml。
实施例4
疫苗批号：020919
该批草鱼出血症灭活疫苗的制备方法与实施例1不同的是：步骤1中细胞浓度为1.8×105个/ml。
实施例5
疫苗批号：021025
该批草鱼出血症灭活疫苗的制备方法与实施例1不同的是：步骤1中细胞浓度为2×105个/ml。
一、细菌霉菌及甲醛检验
实施例1、2、3、4、5得到的每批草鱼出血症灭活疫苗均为黄褐色液体，放置时间长后，瓶底部有少许沉淀，摇动即分散；每批随机取5瓶灭活疫苗，分别接种50ml硫乙醇酸盐培养基(T.G),置35～37℃培养，3日后吸取培养物，接种硫乙醇酸盐培养基(T.G)小管2支，每支0.2ml，1支置35～37℃培养，1支置23～25℃培养，另取0.2ml，接种1支胰酪大豆胨液体培养基(TSB)小管，置23～25℃培养，均培养7日，都无菌生长；每批随机取5瓶灭活疫苗，按《中华人民共和国兽药典》2015年版三部附录10页进行甲醛含量检验，都符合规定。具体检验结果如下表1。
表1、草鱼出血症灭活疫苗细菌霉菌及甲醛含量检验
二、安全及免疫效力检验
实施例1、2、3、4、5得到的每批草鱼出血症灭活疫苗每批随机取5瓶灭活疫苗混合，不作任何稀释腹腔注射体长12cm、体重10g左右的草鱼，每尾0.6ml(含2个使用剂量)，每组50尾，饲养在独立的水池中20天，同时设空白对照组，免疫鱼全部存活；每批随机取5瓶灭活疫苗混合后使用，按照疫苗推荐的使用剂量，腹腔注射体重12g左右的草鱼50尾，每尾0.3ml，饲养在独立的水族箱中，饲养20天，连同条件相同的对照非免疫草鱼50尾，分别注射毒价为100LD50/ml的强毒0.2ml/尾，观察20天，免疫保护率为87.5～100％，对照鱼死亡率在92～100％。具体检验结果如下表2。
表2、草鱼出血症灭活疫苗安全及免疫效力检验
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种草鱼出血症灭活疫苗，其特征在于，由灭活病毒液和蜂胶佐剂组成，所述灭活病毒液为含草鱼出血症病毒GCHV-892的灭活病毒液。
2.根据权利要求1所述的一种草鱼出血症灭活疫苗，其特征在于，所述草鱼出血症灭活疫苗中蜂胶含量为10mg/mL。
3.权利要求1或2中所述草鱼出血症灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将蜂胶佐剂加入草鱼出血症病毒GCHV-892的灭活病毒液中，边加边震摇，使蜂胶与灭活病毒液充分混合成灭活疫苗，最终蜂胶含量为10mg/mL。
4.根据权利要求3所述的一种草鱼出血症灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述草鱼出血症病毒GCHV-892的灭活病毒液的制备方法包括以下步骤：
(1)草鱼吻端成纤维种子细胞培养：从液氮中取出草鱼吻端成纤维种子细胞，采用容量为250ml的细胞培养瓶，加入细胞培养液静止培养，细胞浓度为1×105～2×105个细胞/ml，细胞培养温度为28±1℃，培养3～4天即可长成致密单层；
(2)制苗用细胞制备：从液氮中取出草鱼吻端成纤维种子细胞，采用15L大细胞瓶增殖传代，加入细胞培养液，细胞接种浓度为1.5×105～2.0×105个细胞/ml，将15L大细胞瓶置于转瓶机上旋转培养，转速12转/小时，28℃下2～3天长成单层细胞；
(3)生产用毒种制备：将步骤(1)中的长成单层致密细胞的细胞培养瓶倒掉细胞培养液，按病毒:细胞＝1:100的质量浓度接种冻干GCHV-892毒种，置28℃恒温吸附1小时后，倒掉病毒液，加入细胞维持液，置28℃恒温培养，培养5～6天，细胞病变程度达75％以上，每毫升病毒毒价≥108.7TCID50时，即得到细胞病毒培养液，保存于-70℃备用；
(4)制苗用病毒液的制备：按步骤(2)的方法培养草鱼吻端成纤维细胞，待其长成单层后，倒掉细胞培养液，换以步骤(3)中制备得到的细胞病毒培养液和细胞维持液，细胞病毒培养液与细胞维持液的体积比为1：50，置于28±1℃下恒温培养，培养5～6天后，当病变细胞达75％以上，每毫升病毒毒价≥108.7TCID50时，即可收获制苗用病毒液，置于-20℃保存；
(5)灭活及稀释：将步骤(3)所得制苗用病毒液冻融混合，加入体积比为0.1％的甲醛，置35℃恒温72小时灭活病毒，用0.65wt.％灭菌生理盐水稀释100倍，制备得到草鱼出血症病毒GCHV-892的灭活病毒液。
5.根据权利要求4所述的一种草鱼出血症灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述细胞培养液由199培养基配制而成，加入青霉素钾和硫酸链霉素使其浓度分别为100IU/ml和100μg/ml，采用不锈钢圆筒式过滤器装入孔径0.2μm的滤膜正压过滤除菌，-20℃保存，使用时加入10wt.％犊牛血清，再用NaHCO3调pH至7.0～7.2。
6.根据权利要求4所述的一种草鱼出血症灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述细胞维持液由199培养基配制而成，加入青霉素钾和硫酸链霉素使其浓度分别为100IU/ml和100μg/ml，采用不锈钢圆筒式过滤器装入孔径0.2μm的滤膜正压过滤除菌，-20℃保存，使用时加入2wt.％犊牛血清，再用NaHCO3调pH至7.2～7.5。
7.根据权利要求4所述的一种草鱼出血症灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述细胞消化液由胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠混合配制而成：用无钙镁磷酸缓冲液配制胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠混合溶液，使其胰蛋白酶浓度为0.25wt.％，乙二胺四乙酸二钠浓度为0.02wt.％，加入青霉素钾和硫酸链霉素使其浓度分别为100IU/ml和100μg/ml，采用不锈钢圆筒式过滤器装入孔径0.2μm的滤膜正压过滤除菌，-20℃保存。
8.根据权利要求3所述的一种草鱼出血症灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述蜂胶佐剂的制备方法为：将蜂胶在4-8℃下粉碎、过筛，按质量体积比为1:4g/ml的比例加入95wt.％的乙醇，放室温浸泡24-48小时，冷却，过滤取上清液。
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