CN105770888A - 一种渔用浸泡疫苗免疫佐剂及鱼类浸泡免疫方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于水生生物疾病免疫防治领域，尤其涉及一种渔用浸泡疫苗免疫佐剂及鱼类浸泡免疫方法。所述佐剂包括水，还包括薄荷醇、左旋咪唑、乙醇酸以及甘油。本发明还提供了一种鱼类浸泡免疫方法，其包括以下步骤：A)先将待免疫鱼类放入上述佐剂中浸泡15‑30min后捞起，用水清洗1‑3min；B)取上述佐剂与疫苗溶液按照1∶100‑150的体积比混合均匀，得浸泡免疫溶液；将经上述步骤A)处理后的待免疫鱼类放入上述浸泡免疫溶液中充气浸泡30‑60min，即完成免疫。本发明佐剂能有效提高浸泡免疫过程中进入鱼体的疫苗量，显著提高草鱼出血病活疫苗(GCHV‑892株)的免疫效果，其具有操作方便，成本低，对鱼类安全等优点。

Description

一种渔用浸泡疫苗免疫佐剂及鱼类浸泡免疫方法

技术领域

本发明属于水生生物疾病免疫防治领域，尤其涉及一种渔用浸泡疫苗免疫佐剂及鱼类浸泡免疫方法。

背景技术

草鱼出血病是一种流行面广，发病快，发病率和死亡率高，危害性和防治难度大的病毒性传染病。发病的主要表现是病鱼全身充血和出血，特别是肌肉、肠和鳃充血、出血。一旦感染此病，若不及时加以治疗控制，即有可能导致全池覆灭，造成不可估量的损失。病鱼体色发暗，微带红色。病症主要由有三种类型：“红肌肉”型，撕开病鱼的皮肤或对准阳光或灯光透视鱼体，可见皮下肌肉充血，有全身充血和点状充血；“红鳍红鳃盖”型，病鱼鳍基、鳍盖充血，常伴有口腔充血；“肠炎”型，病鱼肠道充血，常伴随有松鳞、肌肉充血。

草鱼出血病毒是中国分离的第一种鱼类病毒，隶属呼肠孤病毒科，水生动物呼肠孤病毒属，直径70～80nm，二十面体球形颗粒，含有11个片段的双链RNA。不同地区存在不同的毒株。目前已报道了10个分离株，该病毒主要引起中国淡水养殖主要品种草鱼在鱼种阶段发生出血病，死亡率高达90％以上，给水产养殖业造成巨大损失。该病毒寄生在鱼体组织细胞中，具有很强的抗药性，所以难用药物治疗。

目前，草鱼出血病的预防方法已普遍采用疫苗免疫的方法，包括注射用疫苗、浸泡疫苗及口服疫苗等。国内的鱼用疫苗产品制剂种类不多，在鱼类疫苗研究方面多侧重于注射用疫苗。注射疫苗对草鱼出血病防治效果明显，但注射免疫工作量大、工作效率低，且会对鱼体造成伤害；而在浸泡免疫过程中，抗原需要克服鱼类体表黏液、鳞片及皮肤的障碍，才能进入机体，免疫效果差。针对浸泡免疫效果差等问题，国内已开发的鱼类浸泡疫苗佐剂有莨菪碱、葡聚糖、IMS1312、脂肪醇聚氧乙烯醚、皂角苷等，试验证实，其使用后均有一定效果。

基于上述现状，提供新型浸泡疫苗佐剂，进一步改善鱼类疫苗浸泡方法，提高鱼类疫苗免疫效果，是水产养殖快速发展所必须的。

发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种渔用浸泡疫苗免疫佐剂及鱼类浸泡免疫方法。其能够增加疫苗在鱼类角质层中的溶解度，提高疫苗对皮肤的渗透性，刺激鱼类免疫反应，从而显著提高疫苗免疫效果，且使用方法简单，成本低，对鱼类安全。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种渔用浸泡疫苗免疫佐剂，包括水，还包括以下组分及其浓度：薄荷醇1-10μg/mL、左旋咪唑0.5-5μg/mL、乙醇酸0.04-0.08mg/mL以及甘油0.01-0.02mg/mL。

优选地，包括水，还包括以下组分及其浓度：薄荷醇3-8μg/mL、左旋咪唑2-4μg/mL、乙醇酸0.04-0.06mg/mL以及甘油0.01-0.02mg/mL。

优选地，包括水，还包括以下组分及其浓度：薄荷醇3μg/mL、左旋咪唑2μg/mL、乙醇酸0.04mg/mL以及甘油0.01mg/mL。

优选地，包括水，还包括以下组分及其浓度：薄荷醇5μg/mL、左旋咪唑3μg/mL、乙醇酸0.05mg/mL以及甘油0.01mg/mL。

优选地，包括水，还包括以下组分及其浓度：薄荷醇8μg/mL、左旋咪唑4μg/mL、乙醇酸0.06mg/mL以及甘油0.02mg/mL。

优选地，所述佐剂还包括β-1，6葡聚糖1-3μg/mL。

优选地，所述佐剂还包括β-1，6葡聚糖2μg/mL。

本发明还提供了一种鱼类浸泡免疫方法，包括以下步骤：

A)取上述佐剂，将待免疫鱼类放入上述佐剂中浸泡15-30min后捞起，用水清洗1-3min；

B)取上述佐剂与疫苗溶液按照1∶100-150的体积比混合均匀，得浸泡免疫溶液；将经上述步骤A)处理后的待免疫鱼类放入上述浸泡免疫溶液中充气浸泡30-60min，即完成免疫。

优选地，所述步骤B)中佐剂与疫苗溶液按照1∶110体积比混合均匀。

与现有技术相比，本发明具有如下技术优势：

本发明佐剂可提高鱼体表面的通透性，增加鱼体对疫苗的吸收效率，显著提高进入鱼体内的疫苗量；经佐剂和疫苗的混合液处理后，能有效刺激鱼类的免疫反应，从而提高疫苗的免疫效果。其使用方法简单，成本低，对鱼类安全，有利于大规模生产。

具体实施方式

本领域技术人员应理解，以下实施例中所公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术。然而，在所公开的具体实施方案中可以做出许多改变，并仍然获得相同或相似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。

实施例1：一种渔用浸泡疫苗免疫佐剂

所述佐剂由以下组分及其浓度组成：薄荷醇3μg/mL、左旋咪唑2μg/mL、乙醇酸0.04mg/mL以及甘油0.01mg/Ml以及余量水。

实施例2：一种渔用浸泡疫苗免疫佐剂

所述佐剂由以下组分及其浓度组成：薄荷醇5μg/mL、左旋咪唑3μg/mL、乙醇酸0.05mg/mL以及甘油0.01mg/mL以及余量水。

实施例3：一种渔用浸泡疫苗免疫佐剂

所述佐剂包括水，还包括以下组分及其浓度：薄荷醇8μg/mL、左旋咪唑2μg/mL、乙醇酸0.06mg/mL以及甘油0.02mg/mL以及余量水。

实施例4：一种渔用浸泡疫苗免疫佐剂

所述佐剂包括水，还包括以下组分及其浓度：薄荷醇3μg/mL、左旋咪唑2μg/mL、乙醇酸0.04mg/mL、β-1，6葡聚糖1μg/mL以及甘油0.01mg/mL以及余量水。

实施例5：一种渔用浸泡疫苗免疫佐剂

所述佐剂包括水，还包括以下组分及其浓度：薄荷醇5μg/mL、左旋咪唑3μg/mL、乙醇酸0.05mg/mL、β-1，6葡聚糖2μg/mL以及甘油0.01mg/mL以及余量水。

实施例6：一种渔用浸泡疫苗免疫佐剂

所述佐剂包括水，还包括以下组分及其浓度：薄荷醇8μg/mL、左旋咪唑1μg/mL、乙醇酸0.06mg/mL、β-1，6葡聚糖3μg/mL以及甘油0.02mg/mL以及余量水。

对比例1：一种渔用浸泡疫苗免疫佐剂

乙醇酸的浓度为0.02mg/mL，其他成分及其浓度如实施例5。

本发明浸泡免疫方法：

A)取上述佐剂，将待免疫鱼类放入上述佐剂中浸泡20min后捞起，用水清洗2min；

B)取上述佐剂与疫苗溶液按照1∶110的体积比混合均匀，得浸泡免疫溶液；将经上述步骤A)处理后的待免疫鱼类放入上述浸泡免疫溶液中充气浸泡60min，即完成免疫。

毒性试验

(一)试验鱼：9-12g草鱼苗30尾/组，共7组。

(二)试验分组：

将本发明实施例1-6以及对比例1所得佐剂分别命名为实施例1组、实施例2组、实施例3组、实施例4组、实施例5组、实施例6组以及对比例1组。

(三)处理方法：取7组草鱼苗分别在实施例1-6组、对比例1组中浸泡半小时，观察记录各组草鱼苗浸泡后7天的状态及死亡情况。

(四)试验结果。

试验过程中各组草鱼苗未出现不正常状态，也未出现死亡的情况。

本发明佐剂对草鱼出血病灭活疫苗免疫效果的影响试验

1材料

1.1试验鱼：9-12g草鱼苗240尾，试验前暂养2周，观察摄食活动状态，确认健康后用于试验，试验期间水温(26±1)℃。

1.2病毒株：草鱼出血病活疫苗GCHV-892株，购自肇庆大华农生物药品有限公司。

1.3佐剂：本发明实施例1-6以及对比例1所得佐剂。

1.4疫苗溶液的制备：草鱼吻端成纤维细胞(PSF)按常规方法传代，传代后细胞汇合度达到80％-90％时接种GCHV-892病毒株，28℃培养5-6天，待转瓶内细胞病变完全，收集细胞液进行无菌检验和支原体检验，并取样检测其病毒含量(TCID₅₀)，病毒含量(TCID₅₀)等于或大于1×10⁸时，留样备用。

2试验方法

将上述240尾草鱼苗平均分为8组，每组30尾。取本发明实施例1-6以及对比例1所得佐剂分别与疫苗溶液按照1∶110的体积比混合均匀得浸泡免疫溶液，标记好，备用。取其中7组草鱼苗先分别放入本发明实施例1-6以及对比例1所得佐剂中浸泡20min后捞起，用水清洗2min，然后将经上述处理后的7组草鱼苗对应放入上述各组浸泡免疫溶液中充气浸泡；取剩下1组草鱼苗先放入养殖用水中浸泡20min，后移入疫苗溶液中浸泡作为对照组。

2.1免疫后采样

于浸泡10min、20min、40min、50min、60min、1.5h、2h、3h时分别对各组浸泡鱼苗取样，每个取样点取3-5尾鱼的肾脏混为一个样品，样品收集在RNA保存液中，待样品全部取完后测定鱼体内疫苗的含量，记录并分析。

2.3试验结果如表1

表1不同条件处理后鱼体内草鱼出血病灭活疫苗的相对含量

注：疫苗相对含量的计算方法：以GCHV的特异性基因VP6在鱼体肾脏中的表达量为测定指标，采用Roche Lightcycle480 PCR仪测定各样品中VP6基因的表达量。具体步骤如下：将采集好的样品分别提取RNA，随即用试剂盒反转录成cDNA，设计VP6基因和草鱼18S基因的实时定量PCR引物，18S作为内参基因。使用TOYOBO公司实时定量PCR试剂盒进行分析，每孔PCR体系如下：Mix 5μL、上游引物0.4μL、下游引物0.4μL，模板cDNA 1μL，加灭菌水至10μL，每个样品做四个重复。

由表1可知，草鱼苗经各组佐剂浸泡后，草鱼体内疫苗的相对含量皆远远高于对照组，这说明本发明佐剂能促进疫苗的透过率；其中，经实施例6组浸泡相同的时间后，草鱼体内草鱼出血病灭活疫苗的相对含量最高，故实施例6为本发明最佳实施例；综合考虑，浸泡时间为60min最佳。

不同左旋咪唑、薄荷醇与β-1，6葡聚糖配比对草鱼出血病疫苗免疫保护效果的影响

1.材料：

1.1试验鱼：8-10g草鱼苗6组，每组30尾，试验前暂养2周，观察摄食活动状态，确认健康后用于试验，试验期间水温(26±1)℃。

1.2病毒株：草鱼出血病病毒GCHV-892株，购自肇庆大华农生物药品有限公司。

1.3疫苗溶液与草鱼出血病病毒强毒液的制备：草鱼出血病病毒GCHV接种草鱼肾细胞(CIK)，28℃培养6-8天，收集细胞与上清液即得疫苗溶液；健康草鱼注射含有草鱼出血病病毒的组织液，4-7天后鱼体出现症状，收集患典型草鱼出血病的病鱼组织，取病鱼脾、肾等内脏组织研磨，组织液经离心、过滤除菌后得强毒液，备用。

2.试验方法

2.1试验分组：在本发明实施例5的基础上设置5种不同左旋咪唑、薄荷醇与β-1，6葡聚糖配比，考察其对对草鱼出血病疫苗免疫保护效果的影响。

①左旋咪唑3μg/mL、薄荷醇5μg/mL、β-1，6葡聚糖2μg/mL，其余组分及其浓度如实施例5；

②左旋咪唑6μg/mL、薄荷醇3μg/mL与β-1，6葡聚糖2μg/mL，其余组分及其浓度如实施例5；

③左旋咪唑3μg/mL、薄荷醇0.5μg/mL与β-1，6葡聚糖2μg/mL，其余组分及其浓度如实施例5；

④左旋咪唑3μg/mL、薄荷醇5μg/mL与β-1，6葡聚糖4μg/mL，其余组分及其浓度如实施例5；

⑤左旋咪唑3μg/mL、薄荷醇5μg/mL与β-1，6葡聚糖0.5μg/mL，其余组分及其浓度如实施例5。

2.2浸泡免疫

取其中5组草鱼苗分别放入上述①-⑤组佐剂中浸泡20min后捞起，用水清洗2min；取上述①-⑤组佐剂分别与1.3所得疫苗溶液按照1∶110的体积比混合均匀，得浸泡免疫溶液，标记为①-⑤组浸泡免疫溶液，备用；将经上述步骤处理后的5组草鱼苗分别对应放入各组浸泡免疫溶液中充气浸泡；取剩下1组草鱼苗先放入养殖用水中浸泡20min，后移入疫苗溶液中浸泡作为对照组。

2.2免疫后攻毒：免疫后15天各组用1.3所得草鱼出血病病毒强毒液攻毒，攻毒采用注射感染方式。

2.3试验结果：攻毒15天后，统计各组存活率，结果见表2。

表2试验结果

注：相对免疫保护率计算方法：RPS＝(1-试验组死亡率/对照组死亡率)×100％

由上表可知，各组疫苗相对保护率从高到低排序为①＞④＞⑤＞②＞③＞对照组，其中①组的相对保护率高达56.7％，说明左旋咪唑3μg/mL、薄荷醇5μg/mL、β-1，6葡聚糖2μg/mL复配形成的佐剂能显著提高疫苗的相对保护效率，对草鱼出血病具有显著的免疫效果。

由于已经通过以上较佳实施例描述了本发明，在本发明的精神和/或范围内，任何针对本发明的替换/或组合来实施本发明，对于本领域的技术人员来说都是显而易见的，且包含在本发明之中。

Claims (9)

1.一种渔用浸泡疫苗免疫佐剂，其特征在于，包括水，还包括以下组分及其浓度：薄荷醇1-10μg/mL、左旋咪唑0.5-5μg/mL、乙醇酸0.04-0.08mg/mL以及甘油0.01-0.02mg/mL。

2.如权利要求1所述的渔用浸泡疫苗免疫佐剂，其特征在于，包括水，还包括以下组分及其浓度：薄荷醇3-8μg/mL、左旋咪唑2-4μg/mL、乙醇酸0.04-0.06mg/mL以及甘油0.01-0.02mg/mL。

3.如权利要求2所述的渔用浸泡疫苗免疫佐剂，其特征在于，包括水，还包括以下组分及其浓度：薄荷醇3μg/mL、左旋咪唑2μg/mL、乙醇酸0.04mg/mL以及甘油0.01mg/mL。

4.如权利要求2所述的渔用浸泡疫苗免疫佐剂，其特征在于，包括水，还包括以下组分及其浓度：薄荷醇5μg/mL、左旋咪唑3μg/mL、乙醇酸0.05mg/mL以及甘油0.01mg/mL。

5.如权利要求2所述的渔用浸泡疫苗免疫佐剂，其特征在于，包括水，还包括以下组分及其浓度：薄荷醇8μg/mL、左旋咪唑4μg/mL、乙醇酸0.06mg/mL以及甘油0.02mg/mL。

6.如权利要求1-5任一所述的渔用浸泡疫苗免疫佐剂，其特征在于，所述佐剂还包括β-1，6葡聚糖1-3μg/mL。

7.如权利要求6所述的渔用浸泡疫苗免疫佐剂，其特征在于，所述佐剂还包括β-1，6葡聚糖2μg/mL。

8.一种鱼类浸泡免疫方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)取上述权利要求1-7任一所述佐剂，将待免疫鱼类放入上述佐剂中浸泡15-30min后捞起，用水清洗1-3min；

B)取上述权利要求1-7任一所述佐剂与疫苗溶液按照1∶100-150的体积比混合均匀，得浸泡免疫溶液；将经上述步骤A)处理后的待免疫鱼类放入上述浸泡免疫溶液中充气浸泡30-60min，即完成免疫。

9.如权利要求8所述的鱼类浸泡免疫方法，其特征在于，所述步骤B)所述佐剂与疫苗溶液按照1∶110体积比混合均匀。