CN115010825A - 一种富含rg-i结构的西葫芦果胶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种富含RG‑I结构的西葫芦果胶的制备方法，所述方法包括步骤：原料预处理，酸法提取，碱法提取。本发明提出的酸碱联合处理制备西葫芦果胶的方法，因为碱液会破坏细胞壁的结构，使果胶更易提出。同时，碱溶液可以破坏果胶、半纤维素和纤维素之间的交联，溶出更多结构多样的西葫芦果胶。酸碱联合处理制备的果胶含有更多RG‑I活性成分，提取果胶的得率是传统酸提法的2.45倍。

Description

一种富含RG-I结构的西葫芦果胶的制备方法
技术领域
本发明属于食品技术领域，具体涉及一种果胶的制备方法及所得产物。
背景技术
果胶是一种天然植物多糖，广泛存在于高等植物根、茎、叶、果的细胞壁中,具有黏合细胞的作用。其主要成分是半乳糖醛酸，结构异常复杂，功能多种多样。果胶具有良好的增稠性、稳定性、凝胶性、吸附性等特性[1]，具有抗癌、降血糖、预防心脑血管疾病等功效，被广泛应用于食品，保健品等行业。在食品领域中，果胶常作为天然食品添加剂；在医药行业中，果胶常用于用于改善血糖血脂，降低抗癌药物对肠粘膜的损害，抑制癌细胞扩散，吸附有毒的金属离子等；在精细化工等其他方面，果胶也有广泛的应用。目前我国对于果胶的需求量非常大，每年消费果胶在4000t以上。
天然果胶结构复杂，常见的结构域有同型半乳糖醛酸聚糖(HGA)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I(RG-I)和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖II(RG-II)等[2]。同聚半乳糖醛酸(HG)主链由α-l,4-糖苷键连接。RG-I果胶侧链是短的呈毛发状的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I型[3]。商品果胶通常由同型半乳糖醛酸聚糖(HG)和少量鼠李糖半乳糖醛酸-I(RG-I)组成[4]。因为在工业生产中，我们通常利用传统酸法提取果胶。在提取过程中，RG-I结构域中的中性糖侧链有很大一部分会被水解掉。然而，最近的研究表明，富含RG-I的果胶具有更为良好的生物活性，包括预防癌症、治疗心血管疾病等[5]。目前，商品果胶主要从柑橘皮中提取[6]，然而这类原料在我国回收比较困难，且缺少RG-I活性成分。因此，人们正在探索更多优化果胶生产工艺的可能。有研究显示，从南瓜中提取的多糖富含更多RG-I活性成分。而西葫芦相比于南瓜其淀粉含量更少，果胶物质的含量约占鲜果实重量的10％左右，用西葫芦提取果胶的效率更高。
参考文献
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发明内容
针对现有技术存在的不足之处，本发明的第一个目的是提出一种富含RG-I结构的西葫芦果胶的制备方法，采用酸碱联合处理，获得更高产率。
本发明的第二个目的是提出所述方法得到的西葫芦果胶。
本发明的第三个目的是提出所述西葫芦果胶的应用。
实现本发明上述目的的技术方案为：
一种富含RG-I结构的西葫芦果胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：将西葫芦制成干粉；
(2)酸法提取：步骤(1)所得冻干粉加入酸溶液，料液比为1：(25～35)(g/mL)，在搅拌的条件下进行提取30～50min；固液分离，分离出沉淀；
(此步骤分离出的清液可通过精制纯化得到酸提的产物)
(3)碱法提取：步骤(2)中固液分离所得沉淀用碱溶液重悬提取，然后固液分离，取清液，调节所述清液的pH至6-7；浓缩后再用无水乙醇调节体积，静置沉淀；
再次固液分离，将分离得到的沉淀进行透析。
新鲜的西葫芦原料不易保存，本方法优选在预处理阶段将西葫芦制成干粉，是具有工业实用性的原料处理方式，可规模化地生产果胶。
进一步地，步骤(1)中，所述西葫芦用冻干的方法制成干粉，具体为：西葫芦切片，放入冻干机冻干，取出后磨粉。
其中，步骤(2)中，所述酸溶液为盐酸或硫酸的溶液，质量浓度为0.1～1％，所述提取的条件为25～30℃，30～50min。
其中，步骤(2)和(3)中，所述的静置沉淀的条件为：在4℃下沉淀10～15h。
优选地，步骤(3)中，所述碱溶液为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠中的一种或多种的溶液，碱的质量浓度为0.5～1％，沉淀与所述碱溶液的料液比为1：(25～35)(g/mL)。
调节pH值的酸或碱宜采用和步骤(2)和(3)一样的酸或碱，配制成0.5～2mol/L的溶液。
进一步优选地，步骤(3)中，所述浓缩为：使用旋蒸仪将所述清液浓缩至原体积的15～30％，然后加入所得浓缩液体积3～6倍的无水乙醇。。
其中，步骤(2)和(3)中，所述固液分离的方式为离心分离，离心分离的条件为：10000～15000转/min，常温，离心10～20分钟。
纯化操作中，透析方法操作简单，成本较低，且较离子交换树脂等方法原料损失更少。
本发明的一种优选技术方案为，步骤(2)和(3)中，进行透析的透析膜孔径为3000～4000Da，所述透析的操作为：用少量纯水溶解沉淀后进行28～36h透析，每7～9h换一次水。
本发明所述制备方法制得的西葫芦果胶。
所述的西葫芦果胶在制备降血糖营养补充剂中的应用。
现有技术的果胶生产中较为常用的热酸法提取。部分果胶质可溶于热水中，在原料预处理阶段溶出，用热的稀酸液处理，提高了果胶溶出量。然而，在高温和较强酸性的作用下，果胶中的RG-I活性成分将被水解。
相比于现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明提出的酸碱联合处理制备西葫芦果胶的方法，因为碱液会破坏细胞壁的结构，使果胶更易提出。同时，碱溶液可以破坏果胶、半纤维素和纤维素之间的交联，溶出更多结构多样的西葫芦果胶。酸碱联合处理制备的果胶含有更多RG-I活性成分，提取果胶的得率是传统酸提法的2.45倍。
在强酸和强碱性条件下，果胶均易降解。本发明采用适宜pH值，避免了果胶降解，保证了产率。
基于熊蜂糖尿病模型的西葫芦果胶降血糖活性试验表明，饲喂本方法制得的西葫芦果胶可以有效预防熊蜂糖尿病，西葫芦粗果胶具有一定的降血糖活性，可以在一定程度上改善熊蜂的糖尿病症状。
附图说明
图1为制备流程图。
图2为样品单糖组成液相色谱图。
图3为ZPA样品HPGPC色谱图，根据保留时间计算得ZPA平均分子量为70297Da。
图4为ZPB样品HPGPC色谱图，根据保留时间计算得ZPB平均分子量为126170Da。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
如无特别说明，说明书中使用的试验原料、测试仪器均可市购。
流程参见图1。在实施例中，样品经过酸法或酸碱联合提取，冻干后得到粗果胶的质量。
实施例中，果胶得率计算公式为：
Figure BDA0003709499730000051
西葫芦果胶基本成分组成和结构特征测定方法包括：傅里叶变换红外光谱；HPGPC法，用高效液相色谱仪配示差检测器；色谱方法，使用Thermo U3000液相色谱系统，色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18。
实施例1：果胶的提取
(1)原料预处理
取新鲜西葫芦，清水洗净，削皮。将西葫芦均匀切成5mm厚的半圆形薄片，放入冻干机冻干48小时。取出后磨粉，保存于-20℃冰箱中。
(2)酸法提取
配制0.4％HCl溶液，以料液比1:30的比例进行酸法提取。取1000mL烧杯4只，分别加入900mL、质量分数为0.4％的HCl溶液。加热恒温至28℃。取120g样品粉末，均匀分成4份，分别少量多次加入到烧杯中，磁力搅拌40分钟。搅拌完成后以10000转常温离心15分钟，分离出沉淀。
将上清液用1mol/L NaOH调节pH至3-4，使用旋蒸仪将上清液浓缩至原体积的约1/4，加入4倍体积的无水乙醇至浓度为80％。4℃下沉淀12h，再次进行同条件离心。用少量纯水溶解沉淀后进行72h透析，每8h换一次水。进行透析的透析膜为MD44(3500Da)(下同)。透析完成后冻干称重，将得到的产物标记为ZPA。
对比例1：
步骤(2)经酸法提取后，醇沉、离心，溶解后用大孔树脂脱盐制备果胶。
初始样品粉末均为120g，大孔树脂脱盐法得到酸提果胶的得率比实施例1方法少约30％。且透析操作简单，是更优选的制备方法。
实施例2酸碱联合提取
步骤(1)和步骤(2)同实施例1。得到酸提取后分离出的沉淀，进一步碱法提取：
(3)碱法提取
取步骤(2)离心(第一次离心)分离出的沉淀，用0.6％NaOH以料液比1:30的比例进行重悬：将NaOH溶液加热恒温至32℃，残渣粉末少量多次加入溶液，磁力搅拌10分钟。10000转常温离心15分钟后，取上清液，用1M HCl调节溶液pH至6-7。
使用旋蒸仪将上清液浓缩至原体积的约1/4，加入4倍体积的无水乙醇至浓度为80％。4℃下沉淀12h，再次进行同条件离心。用少量纯水溶解沉淀后进行32h透析，每8h换一次水。透析完成后冻干称重，将得到的产物标记为ZPB。
对比例2
步骤(3)中，离心后的上清液pH值约为13。
离心后上清液呈澄清，用1M HCl调节溶液pH分别为7-8和5-6，浓缩至原体积的约1/4，加入4倍体积的无水乙醇至浓度为80％。4℃下沉淀12h，离心，透析，相比于实施例2用1M HCl调节溶液pH至6-7的操作，得到的果胶得率分别降低5％和15％，因此确定调节所述清液的pH至6～7为适宜参数。
产物分析
通过实施例1和实施例2的提取方法，得到酸提果胶(ZPA)，碱提果胶(ZPB)两种粗果胶样品。ZPA为柔软的白色絮状物，ZPB为略有韧性的白色片状物。ZPA提取量为3.46g，ZPB提取量为8.48g。初始样品粉末为200g，根据得率计算公式可得：
Figure BDA0003709499730000071
Figure BDA0003709499730000072
可以看出，酸碱联合提取果胶的得率是酸提法的2.45倍。
经基本组分测定，ZPB的总糖含量为40.03±0.51％，高于ZPA(33.63±0.59％)，表明酸碱联合提取的西葫芦果胶的纯度更高。ZPA的糖醛酸含量为9.37±0.21％，ZPB的糖醛酸含量为9.19±0.16％。ZPA和ZPB中都含有一定的蛋白质和少量的酚类组分，但主要组成成分均为糖类。由单糖组成结果可见，ZPA和ZPB均属于含有RG-I结构的杂聚果胶。鼠李糖和半乳糖醛酸是RG-I结构的主要组成部分，ZPB的RG-I比例为0.421，高于ZPA(0.149)，说明其含有更多RG-I结构。ZPA，ZPB均含有较高比例的阿拉伯糖和半乳糖，证明RG-I结构侧链保留较为完好。
通过结构特征测定(见图2至图4)，求取RG-I比例，结果见下表。
表1 RG-I及RG-I区域侧链比例
Figure BDA0003709499730000073
Figure BDA0003709499730000081
由单糖组成结果可见，ZPA和ZPB均属于含有RG-I结构的杂聚果胶。鼠李糖和半乳糖醛酸是RG-I结构的主要组成部分，ZPB的RG-I比例为0.421，高于ZPA(0.149)说明其含有更多RG-I结构。
应用实施例
取健康，大小相近的0日龄熊蜂48只，分为四组，每组12只。将3只熊蜂装入杯中，每组四杯，标记为ND组，HFD组，ZPA组，ZPB组。首先，对熊蜂进行颜色标记，称量每只熊蜂的重量并记录。ND组为正常饮食组，该组熊蜂喂食50％蔗糖水和花粉；HFD组为高脂饮食组，该组喂食掺有5％棕榈油的蔗糖水和掺油花粉；ZPA和ZPB组为样品组，分别喂食加入样品7.2mg/mL的掺油蔗糖水和掺油花粉。通过同时造模和喂食，探究样品对糖尿病症状的预防作用。
试验结论：
以七日作为一个养蜂周期，在此周期中，HFD组的熊蜂体重增量和两项血糖指标均显著高于ND组熊蜂，HFD组熊蜂出现糖尿病典型症状，说明利用高脂饮食成功构建了熊蜂糖尿病模型。ZPA，ZPB样品组的体重增量和血液中葡萄糖，海藻糖含量显著低于HFD组，证明两种样品可以有效改善糖尿病模型熊蜂的症状。ZPA组熊蜂的体重增量显著低于ZPB组的体重增量，ZPA，ZPB组的熊蜂两项血糖指标不存在显著性差异。
综上所述，饲喂适当浓度的ZPA，ZPB样品可以有效降低糖尿病熊蜂的血糖，初步表明西葫芦粗果胶具有一定的降血糖活性，可以在一定程度上改善熊蜂的糖尿病症状。
虽然，以上通过实施例对本发明进行了说明，但本领域技术人员应了解，在不偏离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的改进和变型，均应属于本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种富含RG-I结构的西葫芦果胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)原料预处理：将西葫芦制成干粉；
(2)酸法提取：步骤(1)所得冻干粉加入酸溶液，料液比为1：(25～35)(g/mL)，在搅拌的条件下进行提取30～50min；固液分离，分离出沉淀；
(3)碱法提取：步骤(2)中固液分离所得沉淀用碱溶液重悬提取，然后固液分离，取清液，调节所述清液的pH至6～7；浓缩后再用无水乙醇调节体积，静置沉淀；
再次固液分离，将分离得到的沉淀进行透析。
2.根据权利要求1所述的富含RG-I结构的西葫芦果胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述西葫芦用冻干的方法制成干粉，具体为：西葫芦切片，放入冻干机冻干，取出后磨粉。
3.根据权利要求1所述的富含RG-I结构的西葫芦果胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酸溶液为盐酸或硫酸的溶液，质量浓度为0.1～1％，所述提取的条件为25～30℃，30～50min。
4.根据权利要求1所述的富含RG-I结构的西葫芦果胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)和(3)中，所述的静置沉淀的条件为：在4℃下沉淀10～15h。
5.根据权利要求1所述的富含RG-I结构的西葫芦果胶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述碱溶液为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠中的一种或多种的溶液，碱的质量浓度为0.5～1％，沉淀与所述碱溶液的料液比为1：(25～35)(g/mL)。
6.根据权利要求1所述的富含RG-I结构的西葫芦果胶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述浓缩为：使用旋蒸仪将所述清液浓缩至原体积的15～30％，然后加入所得浓缩液体积3～6倍的无水乙醇。
7.根据权利要求1所述的富含RG-I结构的西葫芦果胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)和(3)中，所述固液分离的方式为离心分离，离心分离的条件为：10000～15000转/min，常温，离心10～20分钟。
8.根据权利要求1所述的富含RG-I结构的西葫芦果胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)和(3)中，进行透析的透析膜孔径为3000～4000Da；所述透析的操作为：用少量纯水溶解沉淀后进行28～36h透析，每7～9h换一次水。
9.权利要求1～8任一项所述制备方法制得的西葫芦果胶。
10.权利要求9所述的西葫芦果胶在制备降血糖营养补充剂中的应用。
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