CN113322270A - 一种表达混合酶制剂的毕赤酵母的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种表达混合酶制剂的毕赤酵母的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、化学合成改良的2‑10种酶的基因序列；S2、将S1所得序列与毕赤酵母表达载体均酶切后连接或重组，获取多个不同的表达质粒；S3、将S2中构建的表达质粒线性化后混合，转化入毕赤酵母感受态细胞中；S4、通过His缺陷和G418抗性初步筛选出有基因插入的毕赤酵母菌，然后通过PCR方法筛选出含有多个不同基因的阳性克隆菌株，得到能够同时表达多种酶的毕赤酵母。本发明只经过一次构建就可以得到含有多种酶基因的毕赤酵母，而且只需一次发酵在同一菌株中就能表达多种酶，再经一次提纯就可以获得混合的最终酶产物。成本降低，操作简单，省时省力，效率很高。

Description

一种表达混合酶制剂的毕赤酵母的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种表达混合酶制剂的毕赤酵母的制备方法及其应用。

背景技术

现有技术通过将多种饲料用酶基因分别构建入pPIC9或pPIC9K载体中，再将质粒线性化后分别转化毕赤酵母。每种毕赤酵母只含有一种基因。然后通过多种毕赤酵母工程菌分别多次发酵后表达出酶，再将不同的酶纯化后混合在一起使用。

同类方法由于需要构建多个不同的菌株，在构建不同的工程菌时花费大量时间。而且需要使用多种工程菌分别发酵多次才能表达出多种需要的酶。多种酶分别提纯后再混合使用。成本非常高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，本发明提出了一种表达混合酶制剂的毕赤酵母的制备方法及其应用，解决同类方法需要多次构建不同工程菌、使用多种工程菌多次发酵和多次提纯的不足。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种表达混合酶制剂的毕赤酵母的制备方法，包括如下步骤：

S1、化学合成改良的2-10种酶的基因序列；

S2、将S1所得序列与毕赤酵母表达载体均酶切后连接或重组，获取多个不同的表达质粒；

S3、将S2中构建的表达质粒线性化后混合，转化入毕赤酵母感受态细胞中；

S4、通过His缺陷和G418抗性初步筛选出有基因插入的毕赤酵母菌，然后通过PCR方法筛选出含有多个不同基因的阳性克隆菌株，得到能够同时表达多种酶的毕赤酵母。

所述改良的2-10种酶基因序列两端包含EcoRI和Not1酶切位点序列。

进一步地，所述化学合成改良的酶包括多种纤维素酶。

进一步地，所述S3中表达质粒采用SacI酶线性化。

进一步地，所述表达质粒线性化后跑1%的agarose琼脂糖凝胶确认重组质粒完全线性化。

进一步地，将完全线性化的所述表达质粒等量或根据需要定量混合后，电转化入毕赤酵母感受态细胞中，200-260 rpm条件下进行摇床培养1h。

进一步地，所述S4中筛选出含有多个不同基因的阳性克隆菌株方法具体如下：利用所述改良的2-10种酶的基因序列中所示的检测引物对初步筛选所得的毕赤酵母菌进行检测。

进一步地，所述毕赤酵母感受态细胞包括GS115或X33菌株。

进一步地，所述表达混合酶制剂的毕赤酵母由表达混合酶制剂的毕赤酵母的制备方法所制得

进一步地，所述毕赤酵母表达质粒包括pPIC9K载体和EcoRI酶切位点以及Not1酶切位点之间的全长基因如纤维素酶基因序列。

进一步地，一种表达混合酶制剂的毕赤酵母的应用，包括如下步骤：

a、发酵产酶：将含有多个酶基因的毕赤酵母工程菌转接入含有10mL BMGY培养基带透气塞的50mL离心管培养24h，然后加入0.5%甲醇诱导培养5-7天，收集发酵液得粗酶液；

b、提纯：测定收集到的粗酶液酶活性，挑选产酶活高的菌株；

c、应用：将提纯后的酶作为饲料添加剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：只经过一次构建就可以得到含有多种酶基因的毕赤酵母，而且只需一次发酵在同一菌株中就能表达多种酶，再经一次提纯就可以获得混合的最终酶产物用于饲料添加剂。成本降低，操作简单，省时省力，效率很高。

附图说明

参照附图来说明本发明的公开内容。应当了解，附图仅仅用于说明目的，而并非意在对本发明的保护范围构成限制。在附图中，相同的附图标记用于指代相同的部件。其中：

图1示意图显示了根据本发明一个实施方式提出的本发明通过单次发酵后同时得到纤维素酶1、纤维素酶2、纤维素酶3、纤维素酶4与对照通过多次发酵分别得到纤维素酶1、纤维素酶2、纤维素酶3、纤维素酶4的电泳效果图。

图1中标号：A： Protein ladder，B：使用本发明的方法同时表达纤维素酶1、纤维素酶2、纤维素酶3、纤维素酶4，C：单独表达纤维素酶1（分子量45 KDa），D：单独表达纤维素酶2（分子量35 KDa），E：单独表达纤维素酶3（分子量40 KDa），F：单独表达纤维素酶4（分子量23 KDa）。

具体实施方式

容易理解，根据本发明的技术方案，在不变更本发明实质精神下，本领域的一般技术人员可以提出可相互替换的多种结构方式以及实现方式。因此，以下具体实施方式以及附图仅是对本发明的技术方案的示例性说明，而不应当视为本发明的全部或者视为对本发明技术方案的限定或限制。

实施例1 质粒构建，包括如下步骤：

（1）优化改良的纤维素酶1基因，如SEQ ID No.1；优化改良的纤维素酶2基因，如SEQ ID No.2；优化改良的纤维素酶3基因，如SEQ ID No.3；优化改良的纤维素酶4基因，如SEQ ID No.4；

（2）化学合成如SEQ ID No.1、如SEQ ID No.2、如SEQ ID No.3和如SEQ ID No.4所示的序列，各序列两端包含EcoRI和Not1酶切位点序列；

（3）片段和载体pPIC9K均经EcoRI和Not1双酶切，酶切体系如下：

片段/载体	42μL
		EcoRI	6μL
Not1	6μL
		10X buffer	6μL
	60μL

（4）将酶切后的序列分别与酶切后的pPIC9K载体连接，得到表达质粒，连接体系如下：

线性化载体	15μL
		片段	5μL
T4连接酶	5μL
		ddH<sub>2</sub>O	to 50μL

（5）将连接产物转化入大肠杆菌Top10感受态细胞；

（6）涂布含氨苄青霉素的平板；

（7）PCR检测阳性克隆。菌检上游引物PF1: TAATTGCAGGCTGGGACGTT，下游引物PR1:GTTGCTCCAGCCCACCTTAT；菌检上游引物PF2: CTGTCTTGCCATTGGTTGCC，下游引物PR2:ATCATGTCCACCCCACACAC；菌检上游引物PF3: GCAAACTGTGGGCGACAAAT，下游引物PR3:GGATCCTCTATTTGGGGCGG；菌检上游引物PF4: CCACCTACTGGATCTGCTGC，下游引物PR4:GGAACCAGTCGAACCTCCAG；

（8）扩大培养并用质粒小提试剂盒抽提质粒，得到多种目的质粒。

实施例2 工程菌构建，包括如下步骤：

（1）多种质粒均用SacI酶切线性化，酶切体系如下：

质粒	48μL
		SacI	6μL
10X buffer	6μL
			60μL

（2）跑1%的agarose琼脂糖凝胶确认重组质粒完全线性化；

（3）等量或根据需要定量混合线性化的质粒；

（4）将混合的线性化的质粒电转化入毕赤酵母感受态细胞中，200-260 rpm条件下进行摇床培养1h，5000rpm离心5min收集菌体；

（5）将菌体涂布在His缺陷平板上培养2-3天，挑选阳性单菌落；

（6）通过4mg/mL G418的平板筛选出含有融合基因的毕赤酵母菌；

（7）提取毕赤酵母基因组；

（8）利用实施例1中的4对引物检测，4对引物同时检测出条带的为含有所有酶基因的阳性毕赤酵母工程菌。

实施例3 发酵产酶，包括如下步骤：

（1）将含有所有酶基因的毕赤酵母工程菌转接入含有10mL BMGY培养基带透气塞的50mL离心管，在30℃，200-260 rpm条件下进行摇床培养至OD600=1-7；

（2）5000 rpm离心5min收集菌体；

（3）菌体重悬于BMM培养基，200-260 rpm条件下进行摇床培养，每24h加0.5%甲醇诱导，培养5-7天；

（4）5000 rpm离心1min收集发酵液，得到粗酶液；

（5）跑SDS–PAGE胶鉴定分泌蛋白，评估各菌株目标蛋白的表达水平，挑选表达量高的菌株；

（6）酶活性测定，挑选产酶活高的菌株；

（7）粗酶提纯作为饲料添加剂。

本发明的技术范围不仅仅局限于上述说明中的内容，本领域技术人员可以在不脱离本发明技术思想的前提下，对上述实施例进行多种变形和修改，而这些变形和修改均应当属于本发明的保护范围内。

序列表

<110> 上海国龙生物科技有限公司

<120> 一种表达混合酶制剂的毕赤酵母的制备方法及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1266

<212> DNA

<213> 纤维素酶1(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

atgccatcct atgtgctgtc tctatttttg gctggatcag ccatctgcgc acaacaatct 60

tcatggggac agggtggaat aggatattgg agtgtcccta cgtcctgcgt ttcaggttca 120

acttgtgtta ccttaaatgc ctactatgca tgcgctaccc ctggaaccgg ttgtggaggt 180

gacggtggtt ctcaaaccct aaccacaaaa acgactacta ccgctactgc cactccatgc 240

ttcggtggtt gtgttggttc tggaaagact agagctgcag gtgtaattgc aggctgggac 300

gttttcggtt gtggtaccga tggtaccttc tggaatacag ctaaagttga ccctccagtc 360

aactaccctc ccgataacca gaaccatcca gatggtggtt acatgcagca cttctatgcc 420

cgtgacgata acaatatatt tcgtgtttca ccagtgggat ggcagtattt ggtactgaac 480

tttaacttag gtggttccgc ttctactaac tttggttatg tttacgacca gttggttgat 540

gcatgtttgt ggtctactgg tgctacttgt caaatcattg atattaatgt tgccagatgg 600

gttaatggag caggaattgg cgctcaggga ggaccaatca atgaacaagc cgatctatgg 660

agacaattag ccactaaata tgcaaaccaa ccaagaatct ggttttggat tatgaacgaa 720

cctcatgacg gtccaaacat ctccacctgg gcaaccgtgc aggccgcagt taccgcaata 780

aggtgggctg gagcaacctc tcaatttaat tccttgccta acgattgtca gagtgctgct 840

gcctttcagg atggatctgc tgctttgtcc gcttgcgtaa agaacccaga tttgtccact 900

ggtacaaact tgatttttga tgtcgtcaaa cattaccttg attcagataa ttctacccat 960

accgaacatg ccgttaccaa taatattgac tcctttttcg acgcccctct tgccacatgg 1020

ttgagagcaa acaacaggca aattggtctt acagaaaacg gtggaggtaa caccgcctca 1080

tgtcaaacgg tttacgtttg tcagcagttg gcttatctgt gtcagaactc cgatgtgtat 1140

cttggactgg tgggttggca ggctgcagga tcatttgtct cttatatcga gcttgatttg 1200

acaccaactc agaattacgg taattcttgg gacacagcac ttgctgcaaa ggcttgcttc 1260

gcccgt 1266

<210> 2

<211> 1002

<212> DNA

<213> 纤维素酶2(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

atgagaacta cccctatttt ggtcaccctg gccgcttctg tcttgccatt ggttgcctat 60

tctgccgacg gaaagtctac tcgttacgtt tgtaagaagc catcttgctc atggcctgga 120

aaggcattat ggaatcagcc cgtgtatgga gcctgtaaaa acttccaaag aattactagt 180

aatgctaaat cctgctgtga cggtggtagt gccggttcat gtgccgatca aactctgcct 240

tggccaaacg acgattttgc tgctggagct gctacctcac tagctggcgg ttcttgggag 300

gccccttggt gttgtagttg ttacgaattg tctttcacta gtggacctga ggcaggtaaa 360

aaagttgtcg cccaaagtac atcctgtgga ggagacttgg gtagtaccca ttttgttgac 420

ttgaacatct gcggtggcgt tggaatattt gatggttgtt ctaaaggtca gtttggttgg 480

ttgggtggta gagctggttg tggtgtttct tctctaagat ccgagtgcga cgccaagcct 540

gaggcactaa agtccggatc ctgggtttca gctcccgagt tcgcctgtgt gtggggtgga 600

catgatatcg cttatgatga gtgttacagt tggagagact gggttaagaa tgccgacaat 660

cccaactttt tcttcagaca agtgtctctt gatggaaagc catcctcctc ctcatctcca 720

gtggcagttc ctacgccaac ttcaactcca ggcgccgtcg ttcctaaacc aacatctaca 780

cctttgggtg ctgctccaga agcaactcct tgtacatcta aggtcccctc cgttaaaacc 840

tccgcatcat gggttgagtc tccttccaag agttctccag tttcatgttg tactacagaa 900

aaatatggac aatgtggtgg atggggtcag tttactggct gcaacacctg cacttgtggt 960

actcctgaca agaagcagaa tgatgcttac tctcaatgtc ta 1002

<210> 3

<211> 1104

<212> DNA

<213> 纤维素酶3(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

atgcacttgt ttgcagctgg tcttctggca gttttgcccg ttgctttggc tatggctcaa 60

tctggttctg ttcaaacaac acgagattat tgggattgta aaccatcatg tgcctggata 120

tgtggtaagg gatcttcccc agtgcaaact gtgggcgaca aatccgataa tttattcgag 180

gacggtggat ccactgcatc cgtttgtgct ggtggtggtg cttactttat gtgttgtgca 240

caatcctggg ctgtgtcaat cgatgaactg gcttacgact gggcacatgt taacggtgca 300

ggaagtacag ttgaatcagc ttgttgcgcc tgttgttatg agttaacatt ctccggaccc 360

gcagtagtcg gtaaaatgat cgttcaatct gcttcaaaca caggaggaga cttgacccat 420

aatcattttg acttagcaat tccaggtcaa ggtggtgtta tttttaacgc atgcactgat 480

ttccagtacg gtgcagcctg gggttgggga ggtgctagat acaccggttg cttacatgaa 540

aggttcgtgg caagaggagt gcaatacttt ggagccgagg ctgatcacta ccacttaatt 600

aatggtgctt tagatgacat tgtgggaaga gatttcgcac aagttactca ctttaactcc 660

ctgaaagtgg acgccaccgc cccaaataga ggatccttct cattctcatt tgctgaccaa 720

tgcgtcgatt atgcaactgc aattggcaag tatgttagag gacataccgc cctttggcac 780

tctcaactgt gtcagtggcc ttctcaaata aatcttagaa acactttaat tcaagtgatt 840

tttaatcatg tcacatggtt agtgacacga tattctggta aaatattgat ttgggatgtt 900

cacaatgaga tttttgatga agatggtggc cttagagcct caggaggtca ctctcaagag 960

gacgaatgta actcctttcc agaggcactg aaggcaggta attggagatt tgaatgggct 1020

tttattaatg ccaatgtccc aagtgttact tttgttgaag ttgcttgtcc ttccgaattg 1080

ttgacgatct caggttgctc aaga 1104

<210> 4

<211> 666

<212> DNA

<213> 纤维素酶4(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

atgcacctga gcgccaccgg cctgagcgcc gtgctgcccg ccggcgccat ggcctacgcc 60

agcggcagcg gcaacaccac ctactggatc tgctgcaagc ccagcagctg cgccgacccc 120

ggcaagggca gcctgagcag ggtgcagacc tgggacaaga gcaaccccct gaacgccgtg 180

ggcgagagca ccgccagcag cggctgcgag ctgggcggcg gcaggtacat gtgcagcgcc 240

ccccagagcc cctgggcccc cgtgagcaac gagctgggcg cctgggccgc cgtggtgatc 300

gccgacagca ccgagagcca gtggtgctgg gcctgctacg agaccttcac cctgggcccc 360

gtgagcggca ggaagatgat cgtgcagggc accaacaccg gcggcctgct gggcaacttc 420

gacctggcct ggcccggcgg cggcggcttc aacgcctgcg accagtacgg ccccgccaac 480

tactggctgg acaggtacgg cggcgagcac agccaggacg agagcaacag cttccccgag 540

gccctggcca aggcctgcaa ctggaggttc gactggttcc cccagaacgc cgacgtggag 600

agcggcacct tcatcgaggt ggcctgcccc aacgagtaca ccaagagcag cggctgcagc 660

aggagg 666

Claims (10)

1.一种表达混合酶制剂的毕赤酵母的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、化学合成改良的2-10种酶的基因序列；

S2、将S1所得序列与毕赤酵母表达载体均酶切后连接或重组，获取多个不同的表达质粒；

S3、将S2中构建的表达质粒线性化后混合，转化入毕赤酵母感受态细胞中；

S4、通过His缺陷和G418抗性初步筛选出有基因插入的毕赤酵母菌，然后通过PCR方法筛选出含有多个不同基因的阳性克隆菌株，得到能够同时表达多种酶的毕赤酵母；

所述改良的2-10种酶基因序列两端包含EcoRI和Not1酶切位点序列。

2.根据权利要求1所述的表达混合酶制剂的毕赤酵母的制备方法，其特征在于，所述化学合成改良的酶包括多种纤维素酶。

3.根据权利要求1所述的表达混合酶制剂的毕赤酵母的制备方法，其特征在于，所述S3中表达质粒采用SacI酶线性化。

4.根据权利要求3所述的表达混合酶制剂的毕赤酵母的制备方法，其特征在于，所述表达质粒线性化后跑1%的agarose琼脂糖凝胶确认重组质粒完全线性化。

5.根据权利要求4所述的表达混合酶制剂的毕赤酵母的制备方法，其特征在于，将完全线性化的所述表达质粒等量或根据需要定量混合后，电转化入毕赤酵母感受态细胞中，200-260 rpm条件下进行摇床培养1h。

6.根据权利要求1所述的表达混合酶制剂的毕赤酵母的制备方法，其特征在于，所述S4中筛选出含有多个不同基因的阳性克隆菌株方法具体如下：利用所述改良的2-10种酶的基因序列中所示的检测引物对初步筛选所得的毕赤酵母菌进行检测。

7.根据权利要求5所述的表达混合酶制剂的毕赤酵母的制备方法，其特征在于，所述毕赤酵母感受态细胞包括GS115或X33菌株。

8.一种表达混合酶制剂的毕赤酵母，其特征在于，所述表达混合酶制剂的毕赤酵母由权利要求1-7任一所述的表达混合酶制剂的毕赤酵母的制备方法所制得。

9.根据权利要求8所述的表达混合酶制剂的毕赤酵母，其特征在于，所述毕赤酵母表达质粒包括pPIC9K载体和EcoRI酶切位点以及Not1酶切位点之间的全长基因如纤维素酶基因序列。

10.一种表达混合酶制剂的毕赤酵母的应用，其特征在于，包括如下步骤：

a、发酵产酶：将含有多个酶基因的毕赤酵母工程菌转接入含有10mL BMGY培养基带透气塞的50mL离心管培养24h，然后加入0.5%甲醇诱导培养5-7天，收集发酵液得粗酶液；

b、提纯：测定收集到的粗酶液酶活性，挑选产酶活高的菌株；

c、应用：将提纯后的酶作为饲料添加剂。

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