CN111575304A - 一种α-L-鼠李糖苷酶突变体的编码基因及其表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种α‑L‑鼠李糖苷酶突变体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明以棘孢曲霉野生型α‑L‑鼠李糖苷酶基因为基础进行位点突变，突变后的α‑L‑鼠李糖苷酶突变体基因与野生型α‑L‑鼠李糖苷酶基因相似性为99.89％，突变后的α‑L‑鼠李糖苷酶突变体基因在毕赤酵母中表达后，与野生型相比，α‑L‑鼠李糖苷酶的酶活力和耐热性能都明显提高。本发明能提高α‑L‑鼠李糖苷酶在高温条件下的催化性能和稳定性。

Description

一种α-L-鼠李糖苷酶突变体的编码基因及其表达载体

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种序列改良的α-L-鼠李糖苷酶突变体的编码基因及其表达载体。

背景技术

柑橘类果汁是橙、桔和柚等柑橘类水果经过压榨而获得的天然果汁，主要含果肉、原果胶和纤维等成分，因酸甜多汁，营养丰富，是销量较大的果汁产品。但是经过压榨得到的柑橘类果汁普遍存在苦味，降低了果汁的品质。柑橘类果汁出现苦味的原因是由于含有苦味成分，其中最主要的苦味物质为柚皮苷。柚皮苷别名又称为柚苷、柑橘甙和异橙皮甙等，是一种双氢黄酮类化合物，柑橘类水果的果皮、果肉和种子中都含有柚皮苷，其中果皮中柚皮苷的含量最高。在柑橘类水果果汁加工过程中，各个部位的柚皮苷会不可避免的释放到果汁中，最终导致果汁出现苦味。

柑橘类果汁脱苦的方法有很多种，包括吸附脱苦、酶法脱苦、膜分离脱苦和超临界二氧化碳脱苦法等，其中酶法脱苦利用柚苷酶对柚皮苷进行专一性降解，具有反应条件温和、对果汁风味成分影响小、操作简单和脱苦效果好等优点，是最有发展前景的脱苦方法。

柚苷酶是一种通过降解柚皮苷起到脱苦作用的酶，它是一种复合酶类，由α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶组成。柚皮苷先由α-鼠李糖苷酶水解为鼠李糖与普鲁宁，后者再由β-葡萄糖苷酶水解为无苦味的柚配质和葡萄糖。α-L-鼠李糖苷酶来源很广泛，细菌、酵母、丝状真菌和植物都能产α-L-鼠李糖苷酶。α-L-鼠李糖苷酶的研究主要集中在微生物菌种的筛选、发酵条件的优化及酶学性质的研究。目前缺乏产耐高温α-L-鼠李糖苷酶的菌株用于工业化生产，耐高温α-L-鼠李糖苷酶产生菌的选育研究对实现柚苷酶工业化生产极为重要。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，提高α-L-鼠李糖苷酶的耐热稳定性，本发明提供了一种序列突变的α-L-鼠李糖苷酶突变体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明所述的序列突变α-L-鼠李糖苷酶突变体基因，是由核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示的棘孢曲霉野生型α-L-鼠李糖苷酶基因定点突变而获得的。

本发明提供包含核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示α-L-鼠李糖苷酶突变体基因的重组载体。

本发明所述的序列突变α-L-鼠李糖苷酶突变体基因，是核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示的棘孢曲霉野生型α-L-鼠李糖苷酶基因的第421位核苷酸由G突变为T，以及第1144位核苷酸由A突变为T。序列突变后的α-L-鼠李糖苷酶突变体基因相对于野生型基因表达酶的耐热稳定性显著提高，可用于α-L-鼠李糖苷酶突变体的合成。

与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明所述的α-L-鼠李糖苷酶突变体的酶活力和耐热稳定性显著提高，在65℃保温10min后，仍能保持28％的酶活性，而野生型α-L-鼠李糖苷酶仅保持13％的酶活性。

附图说明

图1为原始α-L-鼠李糖苷酶保温处理10min的热稳定性；

图2为α-L-鼠李糖苷酶突变体保温处理10min的热稳定性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明一种α-L-鼠李糖苷酶突变体的编码基因及其表达载体作进一步的详细说明。

实施例1：序列突变α-L-鼠李糖苷酶突变体的编码基因的获得

为了提高野生型α-L-鼠李糖苷酶的温度稳定性，申请人对该野生型α-L-鼠李糖苷酶基因(GenBank：AF284762.1)进行点突变筛选，最终筛选到温度稳定性提高的序列突变基因。序列突变后的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。采用化学合成的方法，分别合成带酶切位点(EcoR I和Not I)的野生型α-L-鼠李糖苷酶基因和SEQ ID NO：1序列。

实施例2：序列突变α-L-鼠李糖苷酶突变体基因的表达

分别用EcoR I和Not I双酶切野生型α-L-鼠李糖苷酶基因、序列突变α-L-鼠李糖苷酶突变体基因和pPIC9K载体，将野生型α-L-鼠李糖苷酶基因和序列突变α-L-鼠李糖苷酶突变体基因连接到pPIC9K载体的EcoR I和Not I位点，获得重组载体pPIC9K-R(含野生型α-L-鼠李糖苷酶基因)和pPIC9K-RM(含序列突变α-L-鼠李糖苷酶突变体基因)。将重组载体pPIC9K-R转入毕赤酵母GS115获得含野生型α-L-鼠李糖苷酶基因的重组毕赤酵母RhaO，重组载体pPIC9K-RM转入毕赤酵母GS115获得含序列突变α-L-鼠李糖苷酶突变体基因的重组毕赤酵母RhaR。

分别将重组毕赤酵母RhaO和重组毕赤酵母RhaR接种到50mL液体培养基(液体培养基配方：每升含葡萄糖20g，酵母粉15g，蛋白胨12g，(NH₄)₂SO₄ 1g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄ 0.2g，CaC1₂ 0.2g)中，在温度30℃和转速200rpm条件下培养48h，再转接5mL种子培养液到45mL发酵培养基(发酵培养基配方：每升含葡萄糖20g，酵母粉8g，蛋白胨5g，甲醇10g，KH₂PO₄ 2g，(NH₄)₂SO₄ 2g，MgSO₄ 0.3g，CaC1₂ 0.3g)中，在温度30℃和转速200rpm条件下培养，每隔24h补加0.8g甲醇，发酵168h后将发酵液离心，取发酵上清酶液在4℃冰箱中保存备用。

以对硝基苯基-α-L-鼠李糖苷为底物检测发酵上清酶液中的α-L-鼠李糖苷酶活力。一个酶活力单位为在温度55℃条件下每小时水解1.0mg底物而所需的酶量，以U/mL表示。检测结果显示重组毕赤酵母RhaO发酵上清液酶活为13.2U/mL，重组毕赤酵母RhaR发酵上清酶液酶活为18.6U/mL，本发明所述的α-L-鼠李糖苷酶突变体菌株的产酶酶活显著提高。

实施例3：α-L-鼠李糖苷酶突变体温度稳定性分析

将实施例3含原始α-L-鼠李糖苷酶基因的重组毕赤酵母菌株和将含突变α-L-鼠李糖苷酶突变体基因的重组毕赤酵母菌株的发酵产酶上清液分别在温度35℃、45℃、55℃、65℃、75℃和85℃条件下存放保温10min，取样测定α-L-鼠李糖苷酶活，以初始α-L-鼠李糖苷酶活为100％计算相对酶活，结果显示(图1和图2)本发明所述的α-L-鼠李糖苷酶突变体耐热稳定性显著提高，在65℃保温10min后，仍能保持28％的酶活性，而野生型α-L-鼠李糖苷酶仅保持13％的酶活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围的内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。

序列表

<110> 江西省科学院微生物研究所

<120> 一种α-L-鼠李糖苷酶突变体的编码基因及其表达载体

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1794

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atgcacatta tcactccttt gctgatacca gcagtgttag tggccgcagc ccgggtccca 60

taccgggagt atattctagc cccgtcctct cgagtgattg tccctgcctc agttcgtcag 120

gtcaacgggt ctgtcactaa tgcggctggc ctgactggat cctcattggg caccgccgtc 180

ttccatggcg tttcgtcggt gacctacgac tttggaaaga acgttgcagg cattgtgtcc 240

ctcacggttg gatcttcttc ctctccatct gccttcctgg gggtcacctt ctctgaatca 300

agcctgtggg cgagcagtga ggcgtgcgat gctactggaa attctggcct cgatgcacct 360

ttgtggttcc cggttggaca aaaggcggga acatataccc ctgacagcaa atacgttcga 420

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ctccacatca cattcacagc tgccccggat caagatctgc aagcgtacca aggctggttc 540

cactcgaatg acgaattact gaacgagatc tggtatgcgg gagcatatac caatcagctg 600

tgtacaattg atccaacata tggctccgcg agctcggaga ctatttccac ctccggcctg 660

aattactggt ataacaatct cactatcgcc aatggaacca gcacagtgac cgatggcgca 720

aaacgagatc gcgctgtttg gccaggcgac atgtcgatct ctctcgagag tatcgcggtc 780

agcaccaacg atctgtacag tgttagaatg ggattggagg ccctactcgc tttgcaatca 840

tctgagggac aactgccttg gggtggcaag cctttcaaca ttgatgttag ttacacttac 900

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gatggtgtca aatctgcagc caaccagcta ctctgggacg accaagcagg actttaccga 1080

gataaccaga caaccgagct ccatccacag gacggaaacg cctgggctgt caaatccaat 1140

ttgtcccttt ccggcagtca aaatcgagct atttctcagg cactcaaggc gcgctggggt 1200

cgttacggtg cccccgcgcc cgaggccggg gcaaccatct cgcctttcat cggcggcttt 1260

gaaattcaat ctcactttct ggctaaccag cccgatgtgg ctctggatat gattcggttg 1320

cagtgggggt tcatgctgcg cgatccccga atgacccagt cgacattgat tgagggatac 1380

tccacggatg gctcgatcca ttacgccccg tacgccaacg acgcacgcat ctcgcatgct 1440

cacggttggt ccaccggccc aacatatgcc ttaacagcct atgccgctgg tctgcagcta 1500

ctcggaccgg ctggaaacag ttggttaatt gctccgcaac ctgggggtct gactagcata 1560

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ggccgttata attctttctc ttttggcgcg ccgactggga ctaccggcag gattgagtta 1680

ccaggggtcc gaggcacgtt ggtctccacc acgggccaac gcgtgcagct ggttaatggt 1740

acagcttccg gtttgagagg aggaaaatgg aagctgattg agtcagccga ctga 1794

<210> 2

<211> 1794

<212> DNA

<213> Aspergillus aculeatus

<400> 2

atgcacatta tcactccttt gctgatacca gcagtgttag tggccgcagc ccgggtccca 60

taccgggagt atattctagc cccgtcctct cgagtgattg tccctgcctc agttcgtcag 120

gtcaacgggt ctgtcactaa tgcggctggc ctgactggat cctcattggg caccgccgtc 180

ttccatggcg tttcgtcggt gacctacgac tttggaaaga acgttgcagg cattgtgtcc 240

ctcacggttg gatcttcttc ctctccatct gccttcctgg gggtcacctt ctctgaatca 300

agcctgtggg cgagcagtga ggcgtgcgat gctactggaa attctggcct cgatgcacct 360

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aaacgagatc gcgctgtttg gccaggcgac atgtcgatct ctctcgagag tatcgcggtc 780

agcaccaacg atctgtacag tgttagaatg ggattggagg ccctactcgc tttgcaatca 840

tctgagggac aactgccttg gggtggcaag cctttcaaca ttgatgttag ttacacttac 900

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ctttccaact attggggtca atactcgaag ggggtcgaat gggcagtaag gagtgttgct 1020

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acagcttccg gtttgagagg aggaaaatgg aagctgattg agtcagccga ctga 1794

Claims (5)

1.一种α-L-鼠李糖苷酶突变体的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求1所述的α-L-鼠李糖苷酶突变体的编码基因。

3.一种重组菌株，其特征在于，由权利要求2所述的重组表达载体转化到菌株中获得。

4.如权利要求2所述的重组菌株，其特征在于，所述菌株为毕赤酵母GS115。

5.一种获得权利要求1所述α-L-鼠李糖苷酶突变体的编码基因的方法，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的α-L-鼠李糖苷酶突变体的编码基因，是将核苷酸序列为SEQID NO：2所示的棘孢曲霉野生型α-L-鼠李糖苷酶基因的第421位核苷酸由G突变为T、第1144位核苷酸由A突变为T。

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