CN114107262A - 一种高比活木聚糖酶突变体及其应用 - Google Patents

一种高比活木聚糖酶突变体及其应用 Download PDF

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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)

Abstract

一种高比活木聚糖酶突变体及其应用，是以木聚糖酶GtXyn10为母本对Gly29、His32和Gln99三个氨基酸位点突变后得到的三种突变体G29L、H32K和Q99A；所述突变体G29L的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述突变体H32K的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述突变体Q99A的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。三个突变体的催化活力明显提升，比活分别为1520U/mg、1830U/mg和1720U/mg，比野生型分别提高43%、73%和62%，且热稳定性无明显降低。

Description

一种高比活木聚糖酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程和遗传工程技术领域，涉及一种高比活木聚糖酶突变体及其应用。
背景技术
纤维素、半纤维素和木质素是构成植物细胞壁的主要成分，其中纤维素占比最高，约为30％–50％，其次为半纤维素(20％–35％)和木质素(5％–10％)。半纤维素是指植物细胞壁中除果胶和纤维素类之外的多糖类物质，主要包括木聚糖、甘露聚糖和部分葡聚糖。木聚糖在半纤维素中占比最高，广泛存在于玉米芯、麦麸、米糠、秸秆和甘蔗渣等植物组织中。木聚糖的结构比较复杂，主链是由吡喃木糖以β-D-1,4-木糖苷键连接，并带有多种形式的取代基，如α-L-阿拉伯呋喃糖残基、阿魏酸、香豆酸、O–乙酰基和葡萄糖醛酸残基等，因此木聚糖的降解需要多种酶的共同参与。
木聚糖酶能够降解木聚糖主链的β-1,4-糖苷键，是木聚糖降解过程中最关键的一类酶。木聚糖酶在自然界中分布极广，其中微生物来源的木聚糖酶是目前工业应用中最常用的材料。木聚糖酶主要分布在糖苷水解酶(GH)第5、7、8、10、11、30和43家族，其中GH10和GH11家族木聚糖酶报道最多，研究也相对透彻。GH10家族木聚糖酶热稳定性较好，但催化效率较低，限制了其工业应用。木聚糖的应用十分广泛，主要包括动物造纸、饲料、食品、啤酒酿造以及绿色能源等领域，因此获得热催化活力高的木聚糖酶对工业生产至关重要。
目前，蛋白质工程在酶分子改良方面应用广泛，即通过对基因或者蛋白本身进行修改或修饰以改变蛋白结构从而实现酶功能的改造。蛋白质工程主要用于酶的热稳定性、催化效率、底物特异性和极端环境耐受性等酶学性质的设计和改造。主要涉及的方法有定向进化、理性设计和半理性设计。其中理性设计是一种快速且有效的改造手段，其常用的方法主要有模块替换和定点突变。如通过该方法，显著提高了Thermoascus aurantiacus来源的木聚糖酶XynA的热稳定性。王晓宇等通过理性设计优化Talaromyces leycettanus木聚糖酶TlXyn10A的催化通道，使得比活提高了40％，且pH稳定性也有明显改善。
发明内容
解决的第一个技术问题：本发明一种高比活木聚糖酶突变体及其应用，以Gloeophyllum trabeum来源的第10家族木聚糖酶GtXyn10为基础对氨基酸位点Gly29、His32和Gln99进行定点突变，具体将第29位的Gly突变为Leu，将32位的His突变为Lys，将99位的Gln突变为Ala。
技术方案：一种高比活木聚糖酶突变体，是以木聚糖酶GtXyn10为母本对Gly29、His32和Gln99三个氨基酸位点突变后得到的三种突变体G29L、H32K和Q99A；所述突变体G29L的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述突变体H32K的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述突变体Q99A的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
翻译上述突变体的基因。
所述突变体G29L的核酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述突变体H32K的核酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述突变体Q99A的核酸序列如SEQ ID NO：8所示。
携带上述基因的重组表达载体。
含有上述重组表达载体的表达菌株。
上述菌株在生产动物饲料添加剂中的应用。
上述菌株在生物质降解产糖中的应用。
有益效果：本发明通过以来源于Gloeophyllum trabeum的第10家族木聚糖酶GtXyn10为母本对Gly29、His32和Gln99位点突变后得到的三种突变体，具体通过构建含有该突变体的重组菌株，诱导培养后筛选出催化效率和比活力大幅度提高的三种木聚糖酶突变体GtXyn10_G29L、GtXyn10_H32K和GtXyn10_Q99A。突变体与野生型的最适pH在3.5-4.0之间，最适温度在70-75℃之间。在催化活力方面，突变体GtXyn10_G29L、GtXyn10_H32K和GtXyn10_Q99A的比活分别为1520U/mg、1830U/mg和1720U/mg，比野生型GtXyn10(1060U/mg)分别提高43％、73％和62％；催化效率分别为300mL/s·mg、610mL/s·mg和360mL/s·mg比野生型GtXyn10(210mL/s·mg)分别提高43％、1.9倍和71％。在热稳定性方面，突变体GtXyn10_G29L、GtXyn10_H32K和GtXyn10_Q99A在75℃下处理30min，剩余酶活分别为45％、64％和28％，与野生酶GtXyn10(62％)相比，突变体GtXyn10_G29L和GtXyn10_H32K热稳定性变化不明显，而突变体GtXyn10_Q99A热稳定性明显降低。因此，将本发明的高比活木聚糖酶突变体在动物饲料和生物质降解产糖方面应用潜力较大。
附图说明
图1为高比活木聚糖酶突变体的SDS-PAGE分析，其中，M为低分子量蛋白质Marker；A、B、C和D分别为纯化后的野生酶GtXyn10以及突变体GtXyn10_G29L、GtXyn10_H32K和GtXyn10_Q99A；
图2为高比活木聚糖酶突变体与野生型的最适pH；
图3为高比活木聚糖酶突变体与野生型的pH稳定性；
图4为高比活木聚糖酶突变体与野生型的最适温度；
图5为高比活木聚糖酶突变体与野生型的热稳定性。
具体实施方式
实施例所用的试验材料：
1.菌株及载体：表达宿主Pichia pastoris GS115为本实验室保存。
2.酶类及其它生化试剂：高保真聚合酶购自Fermentas公司，榉木木聚糖购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3.培养基：
1)YPD培养基：2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母提取物；
2)LB培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，1％琼脂粉(固体)；
3)MD培养基：1.5％琼脂糖，2％葡萄糖，0.00004％Biotin，1.34％YNB；
5)BMGY培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，1％甘油(V/V)，0.00004％Biotin1.34％YNB；
6)BMMY培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，1.34％YNB，0.5％甲醇(V/V)，0.00004％Biotin。
实施例1高比活耐热木聚糖酶突变体编码基因的获得
以来源于Gloeophyllum trabeum的木聚糖酶基因GtXyn10(氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示)的重组表达载体pic9r-GtXyn10为模板，采用定点突变的方法对Gly29、His32和Gln99位点进行定点突变，引物设计如表1所示，突变方法以及克隆方法参考文献(Improvement in catalytic activity and thermostability of aGH10 xylanase and its synergistic degradation of biomass with cellulase；You，et al.,2019)。
表1引物合成清单
Figure BDA0003370205480000031
Figure BDA0003370205480000041
实施例2高比活木聚糖酶突变体的制备
将经实施例1PCR获得的线性重组表达载体直接转化DMT感受态，菌落PCR验证，获得目标位点突变体的核酸序列，将重组质粒线性化后转化毕赤酵母GS115，获得重组酵母菌株GS115/G29L、GS115/H32K和GS115/Q99A。
将含有重组质粒的GS115菌株，接种于2mL BMGY培养基的10mL试管中，置于30℃，220rpm摇床培养48h后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用2mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30℃，220rpm条件下诱导培养48h。取上清用于酶活性检测，筛选到酶活较野生酶提高的突变体G29L(氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示)、H32K(氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示)和Q99A(氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示)。
将野生型GS115/GtXyn10和三个突变体GS115/G29L、GS115/H32K和GS115/Q99A放大发酵体系，首先接种于YPD培养基中获得种子培养液，按1％接种量接种于300mL BMGY培养基的1L三角瓶中，置于30℃，220rpm摇床培养48h；后将培养液4000g离心5min，弃上清，沉淀用100mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30℃，220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加0.5mL甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％，同时取上清用于酶活性检测。最后将上清液浓缩至30mL，采用阴离子交换法纯化蛋白用于酶学性质测定和比较。所表达的木聚糖酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的95％以上(如图1所示)。
实施例3重组高比活木聚糖酶突变体和野生型的酶学性质比较分析
一、DNS法测定
具体方法如下：在各自最适pH、最适温度条件下，1mL的反应体系包括100μL稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下，每分钟分解木聚糖生成1μmoL还原糖所需的酶量。
二、重组高比活木聚糖酶突变体和野生型的性质测定
1、重组高比活耐热木聚糖酶突变体和野生型的最适pH测定方法
将实施例2纯化的木聚糖酶突变体和野生型木聚糖酶在不同的pH(2.0-7.0)下进行酶促反应，以测定其最适pH。底物榉木木聚糖用不同pH(2.0、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7.0)的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中75℃下进行木聚糖酶活力测定。
结果如图2所示，野生型木聚糖酶和木聚糖酶突变体的最适反应pH相近在3.5-4.0之间。
2、野生型木聚糖酶和木聚糖酶突变体的最适温度测定方法
重组高比活耐热木聚糖酶突变体和野生型木聚糖酶的最适温度的测定为：在0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.5)缓冲液体系及不同温度(37-95℃)下进行酶促反应。
结果如图3所示,表明重组野生型木聚糖酶和三个突变体的最适温度在70-75℃之间，突变体H32K在高温(90℃)下的相对酶活较野生酶明显降低。
3、野生型木聚糖酶和突变体热稳定性测定方法
70℃下热稳定性比较：木聚糖酶突变体和野生型木聚糖酶在70℃下处理不同时间(5min、10min、20min、30min、40min、50min和60min)，检测各自的剩余酶活。
结果如图5所示，木聚糖酶突变体G29L、H32K和Q99A在70℃处理30min剩余酶活分别为53％、66％和21％，与野生型(62％)相比，突变体Q99A的热稳定性明显降低，其他突变体变化不大。
4、重组高比活木聚糖酶突变体和野生型木聚糖酶的动力学参数测定方法
检测方法参照文献(A thermophilic and acid stable family-10xylanasefrom the acidophilic fungus Bispora sp MEY-1.Extremophiles.2009；13:849-57.Luo，et al.,2009)，测定反应的一级反应时间。确定测定Km值及Vmax的反应时间为5min。用不同浓度的榉木木聚糖(1.25，1.0，0.8，0.4，0.2，0.15和0.1mg/mL)为底物，在最适条件(温度、pH)下测定酶活性，计算出相应的反应速度，利用GraFit7软件计算Km值及Vmax。
在各自最适条件下以榉木木聚糖为底物时，在比活方面，突变体G29L、H32K和Q99A的比活分别为1520U/mg、1830U/mg和1720U/mg，比野生型GtXyn10(1060U/mg)分别提高43％、73％和62％；催化效率分别为300mL/s·mg、610mL/s·mg和360mL/s·mg比野生型GtXyn10(210mL/s·mg)分别提高43％、1.9倍和71％。(见表2)。
表2野生酶和突变体的比活力和催化效率比较
Figure BDA0003370205480000061
序列表
<110> 江苏科技大学
<120> 一种高比活木聚糖酶突变体及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Pro Leu Ala Arg Gln Leu Pro Thr Ser Pro Phe Glu Thr Leu Arg
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ala Pro Arg Tyr Phe Gly Ala Ala Leu Gly Val Pro His
20 25 30
Leu Leu Asn Phe Thr His Asp Pro Leu Phe Asp Val Thr Ala Val Leu
35 40 45
Gln Phe Asn Gly Ala Thr Pro Glu Asn Glu Met Lys Trp Ala Tyr Ile
50 55 60
Glu Pro Glu Arg Asn Gln Phe Asn Phe Thr Gly Gly Asp Ile Val Ala
65 70 75 80
Ala Phe Ser Ala Ala Asn Asp Tyr Val Leu Arg Gly His Asn Leu Val
85 90 95
Trp Tyr Gln Glu Leu Ala Pro Trp Val Glu Thr Leu Thr Gly Glu Asp
100 105 110
Leu Trp Asn Ala Thr Val Asn His Ile Thr Thr Val Met Thr His Tyr
115 120 125
Lys Glu Ser Phe Asn Ile Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Phe
130 135 140
Asn Asp Asn Gly Thr Tyr Arg Glu Asn Val Trp Tyr Thr Gln Leu Gly
145 150 155 160
Pro Asp Tyr Ile Pro Asn Ala Tyr Ala Val Ala Arg Ser Val Asn Thr
165 170 175
Pro Ser Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Asn Thr Glu Gly Ile Asn Asn
180 185 190
Lys Ser Asp Ala Leu Leu Ala Val Val Gln Ser Met Lys Ala His Asn
195 200 205
Leu Val Asp Gly Val Gly Phe Gln Cys His Phe Phe Val Gly Glu Leu
210 215 220
Pro Pro Asp Leu Glu Gln Asn Phe Ala Arg Phe Val Ala Ala Gly Val
225 230 235 240
Glu Ile Ala Val Thr Glu Leu Asp Ile Arg Met Asn Leu Pro Pro Ser
245 250 255
Gln Ala Asp Ile Glu Gln Gln Ala Arg Asp Tyr Ala Thr Val Val Asn
260 265 270
Ala Cys Lys Ala Gln Gly Ala Ala Cys Val Gly Ile Thr Thr Trp Gly
275 280 285
Ile Thr Asp Leu Tyr Ser Trp Ile Pro Ser Thr Tyr Pro Gly Glu Gly
290 295 300
Tyr Ala Leu Leu Phe Asp Asp Asn Tyr Val Pro His Pro Ala Phe Asn
305 310 315 320
Ala Thr Ile Gln Ala Leu Leu Ala
325
<210> 2
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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1 5 10 15
Ala Ala Ala Ala Pro Arg Tyr Phe Gly Ala Ala Leu Leu Val Pro His
20 25 30
Leu Leu Asn Phe Thr His Asp Pro Leu Phe Asp Val Thr Ala Val Leu
35 40 45
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50 55 60
Glu Pro Glu Arg Asn Gln Phe Asn Phe Thr Gly Gly Asp Ile Val Ala
65 70 75 80
Ala Phe Ser Ala Ala Asn Asp Tyr Val Leu Arg Gly His Asn Leu Val
85 90 95
Trp Tyr Gln Glu Leu Ala Pro Trp Val Glu Thr Leu Thr Gly Glu Asp
100 105 110
Leu Trp Asn Ala Thr Val Asn His Ile Thr Thr Val Met Thr His Tyr
115 120 125
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130 135 140
Asn Asp Asn Gly Thr Tyr Arg Glu Asn Val Trp Tyr Thr Gln Leu Gly
145 150 155 160
Pro Asp Tyr Ile Pro Asn Ala Tyr Ala Val Ala Arg Ser Val Asn Thr
165 170 175
Pro Ser Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Asn Thr Glu Gly Ile Asn Asn
180 185 190
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195 200 205
Leu Val Asp Gly Val Gly Phe Gln Cys His Phe Phe Val Gly Glu Leu
210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
Gln Ala Asp Ile Glu Gln Gln Ala Arg Asp Tyr Ala Thr Val Val Asn
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Ala Cys Lys Ala Gln Gly Ala Ala Cys Val Gly Ile Thr Thr Trp Gly
275 280 285
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290 295 300
Tyr Ala Leu Leu Phe Asp Asp Asn Tyr Val Pro His Pro Ala Phe Asn
305 310 315 320
Ala Thr Ile Gln Ala Leu Leu Ala
325
<210> 3
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ser Pro Leu Ala Arg Gln Leu Pro Thr Ser Pro Phe Glu Thr Leu Arg
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ala Pro Arg Tyr Phe Gly Ala Ala Leu Gly Val Pro Lys
20 25 30
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50 55 60
Glu Pro Glu Arg Asn Gln Phe Asn Phe Thr Gly Gly Asp Ile Val Ala
65 70 75 80
Ala Phe Ser Ala Ala Asn Asp Tyr Val Leu Arg Gly His Asn Leu Val
85 90 95
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130 135 140
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145 150 155 160
Pro Asp Tyr Ile Pro Asn Ala Tyr Ala Val Ala Arg Ser Val Asn Thr
165 170 175
Pro Ser Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Asn Thr Glu Gly Ile Asn Asn
180 185 190
Lys Ser Asp Ala Leu Leu Ala Val Val Gln Ser Met Lys Ala His Asn
195 200 205
Leu Val Asp Gly Val Gly Phe Gln Cys His Phe Phe Val Gly Glu Leu
210 215 220
Pro Pro Asp Leu Glu Gln Asn Phe Ala Arg Phe Val Ala Ala Gly Val
225 230 235 240
Glu Ile Ala Val Thr Glu Leu Asp Ile Arg Met Asn Leu Pro Pro Ser
245 250 255
Gln Ala Asp Ile Glu Gln Gln Ala Arg Asp Tyr Ala Thr Val Val Asn
260 265 270
Ala Cys Lys Ala Gln Gly Ala Ala Cys Val Gly Ile Thr Thr Trp Gly
275 280 285
Ile Thr Asp Leu Tyr Ser Trp Ile Pro Ser Thr Tyr Pro Gly Glu Gly
290 295 300
Tyr Ala Leu Leu Phe Asp Asp Asn Tyr Val Pro His Pro Ala Phe Asn
305 310 315 320
Ala Thr Ile Gln Ala Leu Leu Ala
325
<210> 4
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ser Pro Leu Ala Arg Gln Leu Pro Thr Ser Pro Phe Glu Thr Leu Arg
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ala Pro Arg Tyr Phe Gly Ala Ala Leu Gly Val Pro His
20 25 30
Leu Leu Asn Phe Thr His Asp Pro Leu Phe Asp Val Thr Ala Val Leu
35 40 45
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85 90 95
Trp Tyr Ala Glu Leu Ala Pro Trp Val Glu Thr Leu Thr Gly Glu Asp
100 105 110
Leu Trp Asn Ala Thr Val Asn His Ile Thr Thr Val Met Thr His Tyr
115 120 125
Lys Glu Ser Phe Asn Ile Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Phe
130 135 140
Asn Asp Asn Gly Thr Tyr Arg Glu Asn Val Trp Tyr Thr Gln Leu Gly
145 150 155 160
Pro Asp Tyr Ile Pro Asn Ala Tyr Ala Val Ala Arg Ser Val Asn Thr
165 170 175
Pro Ser Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Asn Thr Glu Gly Ile Asn Asn
180 185 190
Lys Ser Asp Ala Leu Leu Ala Val Val Gln Ser Met Lys Ala His Asn
195 200 205
Leu Val Asp Gly Val Gly Phe Gln Cys His Phe Phe Val Gly Glu Leu
210 215 220
Pro Pro Asp Leu Glu Gln Asn Phe Ala Arg Phe Val Ala Ala Gly Val
225 230 235 240
Glu Ile Ala Val Thr Glu Leu Asp Ile Arg Met Asn Leu Pro Pro Ser
245 250 255
Gln Ala Asp Ile Glu Gln Gln Ala Arg Asp Tyr Ala Thr Val Val Asn
260 265 270
Ala Cys Lys Ala Gln Gly Ala Ala Cys Val Gly Ile Thr Thr Trp Gly
275 280 285
Ile Thr Asp Leu Tyr Ser Trp Ile Pro Ser Thr Tyr Pro Gly Glu Gly
290 295 300
Tyr Ala Leu Leu Phe Asp Asp Asn Tyr Val Pro His Pro Ala Phe Asn
305 310 315 320
Ala Thr Ile Gln Ala Leu Leu Ala
325
<210> 5
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcacccctcg cacggcaact gcccacgtcc ccgttcgaga cgctgagggc agcagcggca 60
ccgcgctact ttggtgcagc tctgggtgtc ccccacctgt tgaatttcac gcatgatccg 120
ctgtttgatg tgactgctgt cttgcagttc aacggtgcca cgccggagaa cgagatgaaa 180
tgggcgtaca tcgagccgga gcggaaccag ttcaacttta ctggtggcga catcgttgct 240
gcgttctccg ccgccaacga ctatgtcctg cgcggtcaca atctcgtctg gtaccaggag 300
ctcgcaccgt gggtggagac cctgacgggt gaggacctat ggaacgctac tgtgaatcac 360
atcacgactg tgatgacaca ctacaaggag agcttcaata tctacgcttg ggacgttgtc 420
aacgaggctt tcaacgacaa cggtacctac cgggagaacg tttggtacac ccagctcgga 480
ccggattaca tcccgaacgc gtacgccgta gccagatccg tgaacacgcc gtctaagctg 540
tacatcaacg actacaatac tgagggcatc aacaacaagt ccgatgcact gctcgccgtt 600
gtgcagagca tgaaagcaca taacttggtt gacggtgttg gcttccaatg ccacttcttc 660
gtcggcgagc tccccccgga cctcgagcag aacttcgcgc ggtttgtggc cgcgggcgtc 720
gagatcgccg tcaccgaact cgatatcagg atgaacctcc cgccttcaca ggctgacatt 780
gagcagcagg cccgcgacta cgccacagtc gtgaatgcat gcaaatcaca gggtgctgcc 840
tgcgttggga tcaccacctg gggtatcacc gacctttact catggattcc ctccacgtat 900
cccggcgagg gatatgccct gctcttcgat gacaattatg ttccccaccc ggcattcaat 960
gcgactattc aggccttgct cgcttga 987
<210> 6
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcacccctcg cacggcaact gcccacgtcc ccgttcgaga cgctgagggc agcagcggca 60
ccgcgctact ttggtgcagc tctgctggtc ccccacctgt tgaatttcac gcatgatccg 120
ctgtttgatg tgactgctgt cttgcagttc aacggtgcca cgccggagaa cgagatgaaa 180
tgggcgtaca tcgagccgga gcggaaccag ttcaacttta ctggtggcga catcgttgct 240
gcgttctccg ccgccaacga ctatgtcctg cgcggtcaca atctcgtctg gtaccaggag 300
ctcgcaccgt gggtggagac cctgacgggt gaggacctat ggaacgctac tgtgaatcac 360
atcacgactg tgatgacaca ctacaaggag agcttcaata tctacgcttg ggacgttgtc 420
aacgaggctt tcaacgacaa cggtacctac cgggagaacg tttggtacac ccagctcgga 480
ccggattaca tcccgaacgc gtacgccgta gccagatccg tgaacacgcc gtctaagctg 540
tacatcaacg actacaatac tgagggcatc aacaacaagt ccgatgcact gctcgccgtt 600
gtgcagagca tgaaagcaca taacttggtt gacggtgttg gcttccaatg ccacttcttc 660
gtcggcgagc tccccccgga cctcgagcag aacttcgcgc ggtttgtggc cgcgggcgtc 720
gagatcgccg tcaccgaact cgatatcagg atgaacctcc cgccttcaca ggctgacatt 780
gagcagcagg cccgcgacta cgccacagtc gtgaatgcat gcaaatcaca gggtgctgcc 840
tgcgttggga tcaccacctg gggtatcacc gacctttact catggattcc ctccacgtat 900
cccggcgagg gatatgccct gctcttcgat gacaattatg ttccccaccc ggcattcaat 960
gcgactattc aggccttgct cgcttga 987
<210> 7
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcacccctcg cacggcaact gcccacgtcc ccgttcgaga cgctgagggc agcagcggca 60
ccgcgctact ttggtgcagc tctgggtgtc cccaaactgt tgaatttcac gcatgatccg 120
ctgtttgatg tgactgctgt cttgcagttc aacggtgcca cgccggagaa cgagatgaaa 180
tgggcgtaca tcgagccgga gcggaaccag ttcaacttta ctggtggcga catcgttgct 240
gcgttctccg ccgccaacga ctatgtcctg cgcggtcaca atctcgtctg gtaccaggag 300
ctcgcaccgt gggtggagac cctgacgggt gaggacctat ggaacgctac tgtgaatcac 360
atcacgactg tgatgacaca ctacaaggag agcttcaata tctacgcttg ggacgttgtc 420
aacgaggctt tcaacgacaa cggtacctac cgggagaacg tttggtacac ccagctcgga 480
ccggattaca tcccgaacgc gtacgccgta gccagatccg tgaacacgcc gtctaagctg 540
tacatcaacg actacaatac tgagggcatc aacaacaagt ccgatgcact gctcgccgtt 600
gtgcagagca tgaaagcaca taacttggtt gacggtgttg gcttccaatg ccacttcttc 660
gtcggcgagc tccccccgga cctcgagcag aacttcgcgc ggtttgtggc cgcgggcgtc 720
gagatcgccg tcaccgaact cgatatcagg atgaacctcc cgccttcaca ggctgacatt 780
gagcagcagg cccgcgacta cgccacagtc gtgaatgcat gcaaatcaca gggtgctgcc 840
tgcgttggga tcaccacctg gggtatcacc gacctttact catggattcc ctccacgtat 900
cccggcgagg gatatgccct gctcttcgat gacaattatg ttccccaccc ggcattcaat 960
gcgactattc aggccttgct cgcttga 987
<210> 8
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcacccctcg cacggcaact gcccacgtcc ccgttcgaga cgctgagggc agcagcggca 60
ccgcgctact ttggtgcagc tctgggtgtc ccccacctgt tgaatttcac gcatgatccg 120
ctgtttgatg tgactgctgt cttgcagttc aacggtgcca cgccggagaa cgagatgaaa 180
tgggcgtaca tcgagccgga gcggaaccag ttcaacttta ctggtggcga catcgttgct 240
gcgttctccg ccgccaacga ctatgtcctg cgcggtcaca atctcgtctg gtacgcagag 300
ctcgcaccgt gggtggagac cctgacgggt gaggacctat ggaacgctac tgtgaatcac 360
atcacgactg tgatgacaca ctacaaggag agcttcaata tctacgcttg ggacgttgtc 420
aacgaggctt tcaacgacaa cggtacctac cgggagaacg tttggtacac ccagctcgga 480
ccggattaca tcccgaacgc gtacgccgta gccagatccg tgaacacgcc gtctaagctg 540
tacatcaacg actacaatac tgagggcatc aacaacaagt ccgatgcact gctcgccgtt 600
gtgcagagca tgaaagcaca taacttggtt gacggtgttg gcttccaatg ccacttcttc 660
gtcggcgagc tccccccgga cctcgagcag aacttcgcgc ggtttgtggc cgcgggcgtc 720
gagatcgccg tcaccgaact cgatatcagg atgaacctcc cgccttcaca ggctgacatt 780
gagcagcagg cccgcgacta cgccacagtc gtgaatgcat gcaaatcaca gggtgctgcc 840
tgcgttggga tcaccacctg gggtatcacc gacctttact catggattcc ctccacgtat 900
cccggcgagg gatatgccct gctcttcgat gacaattatg ttccccaccc ggcattcaat 960
gcgactattc aggccttgct cgcttga 987
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggtgcagctc tgctggtccc ccacctgttg a 31
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cagcagagct gcaccaaagt agcgcggtgc c 31
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctgggtgtcc ccaaactgtt gaatttcacg c 31
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tttggggaca cccagagctg caccaaagta g 31
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctcgtctggt acgcggagct cgcaccgtgg g 31
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgcgtaccag acgagattgt gaccgcgcag g 31

Claims (7)

1.一种高比活木聚糖酶突变体，是以木聚糖酶GtXyn10为母本对Gly29、His32和Gln99三个氨基酸位点突变后得到的三种突变体G29L、H32K和Q99A；所述突变体G29L的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述突变体H32K的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述突变体Q99A的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.翻译权利要求1所述突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述突变体G29L的核酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述突变体H32K的核酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述突变体Q99A的核酸序列如SEQID NO：8所示。
4.携带权利要求1或2所述基因的重组表达载体。
5.含有权利要求4所述重组表达载体的表达菌株。
6.权利要求5所述菌株在生产动物饲料添加剂中的应用。
7.权利要求5所述菌株在生物质降解产糖中的应用。
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