CN105255843A - 大肠杆菌漆酶突变体及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌漆酶突变体及其编码基因和应用，属于大肠杆菌漆酶的突变体领域。本发明将野生型大肠杆菌漆酶第276位的甘氨酸突变为谷氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或精氨酸中的任意一种，获得酶活显著高于野生型大肠杆菌漆酶的突变体。其中，将野生型大肠杆菌漆酶第276位甘氨酸突变为精氨酸获得的突变体G276R，其在最适条件下的酶活约是野生型大肠杆菌漆酶的3倍。本发明进一步公开了含有所述大肠杆菌漆酶突变体编码基因的重组表达载体和重组宿主细胞。本发明所述大肠杆菌漆酶突变体及其编码基因在洗涤剂、食品、饮料、环保或化妆品工业，造纸、纺织或医用传感器等领域中具有重要的应用前景。

Description

大肠杆菌漆酶突变体及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及漆酶突变体，尤其涉及大肠杆菌漆酶的突变体，本发明还涉及所述漆酶突变体的应用，属于大肠杆菌漆酶的突变体领域。
背景技术
漆酶(Laccase，苯二醇:氧氧化还原酶，EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，和植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白同属蓝色多铜氧化酶(bluemulticopperoxidase)家族。漆酶最早发现于日本漆树(Rhusvenicifera)的汁液中，后来证实，漆酶除了存在于植物中，还更广泛地存在于真菌(尤其是白腐真菌)和细菌中。由于漆酶具有特殊的催化性能和宽泛的作用底物，其在生物制浆，生物漂白以及有毒化合物的降解等方面具有潜在应用价值，因而成为环境保护用酶研究的热点。
漆酶按其来源主要分为漆树漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶三大类。由于漆酶来源很多，不同来源的漆酶在结构和性质方面存在一定差别，因此不同来源的漆酶表现出来的催化特性相差较大。即便是同一来源，如同一白腐菌菌种，可分泌出不同性质的漆酶组分，其催化氧化作用也各不相同。
大肠杆菌漆酶CueO蛋白在大肠杆菌中由长1551bp的一段基因编码(cueo基因，又名YacK基因)，全长516个氨基酸，其中1-28个氨基酸为信号肽区段(大肠杆菌漆酶(CueO)的结构与功能研究，李旭，中国科学技术大学，博士学位论文，2006.)。但是野生型大肠杆菌漆酶的催化效率较低，限制了其在造纸、食品或环保等行业中的应用。因此，开发催化效率更高的大肠杆菌漆酶突变体，将具有重要的市场价值和应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种大肠杆菌漆酶突变体，该突变体的酶活高于野生型大肠杆菌漆酶(CueO)；
本发明所要解决的另一个技术问题是将所述大肠杆菌漆酶突变体应用于造纸、纺织、环保或医用传感器、洗涤剂、食品、饮料或化妆品工业等领域。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明首先公开了一种大肠杆菌漆酶突变体，所述突变体是将野生型大肠杆菌漆酶的第276位的甘氨酸(G)突变为谷氨酸(E)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)或精氨酸(R)中的任意一种。
根据侧链基团的极性进行分类，甘氨酸(G)、谷氨酸(E)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)和精氨酸(R)均属于极性氨基酸(亲水氨基酸)；其中，甘氨酸(G)、酪氨酸(Y)和天冬酰胺(N)为极性不带电荷的氨基酸；精氨酸(R)为极性带正电荷的氨基酸(碱性氨基酸)；谷氨酸(E)为极性带负电荷的氨基酸(酸性氨基酸)。
其中，所述野生型大肠杆菌漆酶的氨基酸序列为SEQIDNO.3所示；其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.4所示。
本发明优选将野生型大肠杆菌漆酶的第276位的甘氨酸(G)突变为精氨酸(R)获得的大肠杆菌漆酶突变体，其氨基酸序列为SEQIDNO.1所示。
本发明还公开了编码所述大肠杆菌漆酶突变体的基因；优选的，编码SEQIDNO.1所示氨基酸序列的基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。
本发明提取土壤宏基因组并设计引物扩增大肠杆菌漆酶基因cueo，克隆获得了大肠杆菌漆酶突变体G276R。该突变体与野生型大肠杆菌漆酶(CueO)相比在只有一个氨基酸的差异，在G276位突变为R。本发明通过对大肠杆菌漆酶突变体G276R进行蛋白质性质的测定，结果表明，突变体G276R的最适温度为60℃，最适pH为3.5(野生型大肠杆菌漆酶的最适条件为70℃，pH3.5)，且突变体G276R的反应pH范围较野生型宽。突变体G276R的Tm值为76.2℃；从酶的动力学参数看，突变体G276R与底物的亲和能力更强，总体来看突变体的酶学性质要优于野生型。
本发明进一步将野生型大肠杆菌漆酶的G276突变为其他氨基酸，比较不同突变体的酶活。结果发现，G276突变为E、Y、N或R的酶活较好，在最适条件下，突变体G276E(6.56U/mg)，G276Y(6.52U/mg)，G276N(6.35U/mg)的酶活基本上都是野生型的1.5倍，而G276R(12.56U/mg)的酶活约是野生型(4.38U/mg)的3倍。因此，突变体G276R是该位的最优选择。
本发明进一步公开了含有所述大肠杆菌漆酶突变体的编码基因的重组表达载体以及含有所述重组表达载体的重组宿主细胞。
本发明还公开了一种制备所述大肠杆菌漆酶突变体的方法，包括以下步骤：(1)构建含有所述大肠杆菌漆酶突变体的编码基因的重组表达载体，转化宿主细胞；(2)诱导表达大肠杆菌漆酶突变体，分离纯化，即得。
将本发明所述的大肠杆菌漆酶突变体的编码基因可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在宿主细胞中表达该编码基因的重组表达载体。所述表达调控元件可以包括由5′端非编码区和3′非编码区，其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。转化方案可视用于转化的宿主细胞的类型而变化。将所述多核苷酸引入宿主细胞的合适方法包括：电转化法、原生质体法、化学转化法等，这些操作方法通常为本领域所了解。所述宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，包括但不限于大肠杆菌或酵母菌。
本发明大肠杆菌漆酶突变体的酶活远高于野生型，因此，本发明所述大肠杆菌漆酶突变体或其编码基因在洗涤剂、食品、饮料、环保或化妆品工业，造纸、纺织或医用传感器等领域中将具有广泛的应用前景。
例如，在造纸工业中，将大肠杆菌漆酶突变体应用于纸浆漂白。漆酶能选择性地催化木质素降解，不会损伤纤维素和半纤维素，不会产生有毒物质，并且生产在常温、常压的温和条件下进行，节约设备和能耗。漆酶能够脱甲基和部分溶解纸浆中的木素。
在食品、饮料工业中的应用，大肠杆菌漆酶突变体能够氧化多酚类物质生成多酚氧化物，多酚氧化物自身能够发生再聚合，形成可以被滤膜截留的大颗粒，最终达到净化饮料的目的。由于这一催化反应专一性强，污染问题少，澄清的果汁色浅且稳定。在面包加工方面，大肠杆菌漆酶突变体的使用可以增加面包体积，改善面包结构和柔软性，同时可以提高加工时面团的机械强度、稳定性，并能降低粘性。对于质量较差的面粉，能明显改善面团的机械加工性能。此外，漆酶突变体还可用来测定食品中抗坏血酸的总含量。
大肠杆菌漆酶突变体在医用传感器中的应用包括：利用固定化漆酶制成的电位免疫传感器进行胰岛素或肾上腺素分析等。
大肠杆菌漆酶突变体在环境保护中的应用，例如，将漆酶突变体吸附在炭上制成固定化酶电极能有效地催化负极氧化还原，间接地进行环境监测。这种方法的特点是专一性强、速度快、可连续操作、手续简便。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明从土壤中克隆到了大肠杆菌漆酶突变体G276R，在最适条件下，其酶活约是野生型的3倍。本发明进一步将野生型大肠杆菌漆酶第276位的甘氨酸突变为谷氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或精氨酸中的任意一种，获得的大肠杆菌漆酶突变体的酶活均高于野生型，但突变体G276R是该位的最优选择。本发明所述大肠杆菌漆酶突变体及其编码基因在洗涤剂、食品、饮料、环保或化妆品工业，造纸、纺织或医用传感器等领域中将具有重要的应用前景。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,NucleicAcidRes.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,MolCell.Probes8:91-98(1994))。
术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。
术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。
术语“转化”指将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。
术语“表达”意指内源性基因或转基因在细胞中的转录和/或翻译。
附图说明
图1为大肠杆菌漆酶突变体G276R的最适温度测定结果；
图2为大肠杆菌漆酶突变体G276R的最适pH测定结果；
图3为大肠杆菌漆酶突变体G276R的Tm值测定结果；其中，276：大肠杆菌漆酶突变体G276R；cueo：野生型大肠杆菌漆酶；
图4为野生型大肠杆菌漆酶G276位突变为不同氨基酸的酶活测定；
图5为不同大肠杆菌漆酶突变体在最适条件下的酶活；
图6为G276R突变体与野生型大肠杆菌漆酶分别在最适条件下的酶活。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1大肠杆菌漆酶突变体基因的克隆
1、实验方法
1.1CTAB法提取江西化工厂土壤宏基因组
(1)称取5g江西化工厂土样，倒入50ml离心管中，加入20ml裂解液(CTAB)混合均匀。
(2)向混合液中加入50ul蛋白酶K(20mg/ml)，于37℃，250rpm摇床中振荡30min；
(3)向振荡后的混合液中加入5ml2％SDS，65℃水浴2h，期间每隔30min颠倒几下，混合均匀。
(4)液氮冷冻10min后65℃水浴10min，如此反复3个循环。
(5)室温6000g离心10min后收集上清。
(6)加入与上清等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，3500g离心15min。
(7)水相以0.6倍体积的异丙醇室温沉淀1h。
(8)室温3500g离心20min，收集核酸沉淀。
(9)用冷的70％的乙醇洗涤沉淀，3500g离心2min，倒掉上清。
(10)重复步骤(9)一次。
(11)真空冷冻抽干沉淀，用250ulTE溶解沉淀。
1.2设计引物扩增大肠杆菌漆酶基因
设计引物cueo-F:5’-ATAGGATCCGCAGAACGCCCAACGTTACC-3’和cueo-R:5’-ATAAAGCTTTACCGTAAACCCTAACATCATCCC-3’扩增大肠杆菌漆酶基因cueo，引物两端引入酶切位点BamHI和HindIII。
扩增体系为：
扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min40s，共30个循环，72℃10min。
1.3扩增的漆酶基因构建表达载体并转化大肠杆菌
将扩增出的漆酶基因构建于表达载体pET-30a，进行阳性PCR鉴定后送测序。
将PCR产物和表达载体pET-30a用BamHI和HindIII双酶切，酶切体系如下：
37℃酶切3h以上。
酶切后产物用PCR纯化回收试剂盒回收后电泳检测其浓度后连接，连接体系如下：
16℃连接8h以上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布卡那霉素平板，挑取单克隆进行PCR阳性鉴定，阳性克隆子送测序。
1.4测序正确的克隆子的诱导表达
挑取单克隆220rpm，37℃培养过夜，将菌液按1％的比例转接至50mlLB液体培养基，30℃，120rpm培养至菌液OD600＝0.6-0.8时加入终浓度为1mmol/L的IPTG和终浓度为0.25mmol/L的Cu2+，25℃，120rpm振荡培养4h后静置培养20h。
菌体收集及破碎：将菌液倒入200ml离心瓶中，8000rpm，4℃离心10min，弃上清。菌体沉淀用5ml20MmTris-Hcl重悬，冰水混合物中超声破碎，破碎条件为：超3s，停3s，共10个循环，至菌液变澄清。破碎后混合液离心，取上清即为粗酶液，可用于进一步的纯化。
蛋白的纯化：上样后采用NTA-20洗脱杂蛋白，NTA-200洗脱目的蛋白。
1.5蛋白性质的测定
反应体系为：750ul0.2M磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液与200ul5mM的ABTS温浴2min后，向其中加入50ul酶液，反应3min后，冰水混合物中终止反应1min后于420nm读数。
1.5.1最适温度的测定
将纯化后的蛋白进行适当稀释，于pH4.5的缓冲液中，从30℃到100℃每隔10℃进行酶活测定。
1.5.2最适pH的测定
将纯化后的蛋白进行适当稀释后，在最适温度的条件下，pH范围从2.5到8.0，pH每隔0.5进行酶活测定。
1.5.3酶动力学参数的测定
在最适温度和最适pH条件下，向反应体系中加入终浓度为8mmol/L的Cu2+，底物浓度从500umol/L到10mol/L。
1.5.4Tm值的测定
纯化后蛋白用PBS缓冲液溶解，防止高温导致缓冲液挥发使pH变化，影响蛋白稳定性。各取400ulPBS和样品加入至深孔板，扫描温度从30℃到110℃。
2、实验结果
2.1克隆得到的大肠杆菌漆酶基因
本发明扩增出的cueo基因具有多样性，其中大肠杆菌漆酶突变体G276R的氨基酸序列为SEQIDNO.1所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示(去除信号肽)。野生型大肠杆菌漆酶(CueO)的氨基酸序列为SEQIDNO.3所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.4所示(去除信号肽)。
本发明克隆的大肠杆菌漆酶突变体(G276R)，与野生型大肠杆菌漆酶(CueO)相比只有一个氨基酸的差异，是在野生型大肠杆菌漆酶的G276位发生G276R突变。
2.2大肠杆菌漆酶突变体G276R的最适温度
大肠杆菌漆酶突变体G276R的最适温度为60℃，野生型大肠杆菌漆酶的最适温度为70℃，最适pH为3.5，且突变体反应pH范围较野生型宽(图1、图2)。
2.3大肠杆菌漆酶突变体G276R的Tm值测定结果
野生型大肠杆菌漆酶的Tm值为80.86℃，突变体G276R的Tm值为76.2℃(图3)。
2.4酶动力学参数的测定结果
从酶的动力学参数来看，突变体G276R与底物的亲和能力更强，但反应常数不及野生型，总体来看突变体的酶学性质要优于野生型(表1)。
表1突变体G276R酶动力学参数的测定
实施例2野生型大肠杆菌漆酶的G276突变为其他氨基酸
1、实验方法
设计引物G276-F：5’-GGTCAGCCAGATGNNKATGGCGATTGCGC-3’和G276-R：5’-TTATACCGTAAACCCTAACATC-3’，以野生型cueo基因(核苷酸序列为SEQIDNO.4所示)为模板进行扩增。将扩增后的基因转化大肠杆菌BL21(DE3)后，从平板上挑取35个单克隆至3mlLB培养基，37℃，220rpm振荡培养12h后取10ul加入1ml含0.25mmol/LCu2+，0.1mmol/L的IPTG，50μg/mL的自诱导培养基中，30℃，200rpm振荡培养24h。将培养后的菌液取至EP管中，13000rpm离心1min后弃上清。
菌体破碎：
渗透压破碎法：向菌体中加入100μl的1号缓冲液(20mmol/L的pH＝8.0的Tris-Hcl，20％的蔗糖)重悬菌体后，冰浴30min后13000rpm，4℃离心10min后弃上清。
向沉淀中加入100μl的2号缓冲液(20mmol/L的pH＝8.0的Tris-Hcl)重悬菌体，冰浴60min后13000rpm，4℃离心20min后取上清测酶活。取酶活较高的菌株进行测序。
2、实验结果
35个单克隆的破碎上清的酶活测定结果见图4。
将酶活在0.1U/ml以上的单克隆送测序，结果发现G276突变为E、Y、N、R时的酶活较好，在最适条件下对几个突变体进行比较发现(图5)，突变体G276E(6.56U/mg)，G276Y(6.52U/mg)，G276N(6.35U/mg)酶活基本上都是野生型的1.5倍，G276R(12.56U/mg)的酶活约是野生型(4.38U/mg)的3倍，因此突变体G276R是该位的最优选择。
cueo的最适条件为70℃，pH3.5。G276R突变体的最适条件为60℃，pH3.5。最适条件下，突变体G276R的酶活约是野生型的3倍(图6)。

Claims (10)

1.大肠杆菌漆酶突变体，其特征在于：所述突变体选自将野生型大肠杆菌漆酶的第276位的甘氨酸突变为谷氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或精氨酸后得到的突变体中的任意一种。
2.按照权利要求1所述的大肠杆菌漆酶突变体，其特征在于：所述野生型大肠杆菌漆酶的氨基酸序列为SEQIDNO.3所示。
3.按照权利要求1所述的大肠杆菌漆酶突变体，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列为SEQIDNO.1所示。
4.编码权利要求1-3任何一项所述大肠杆菌漆酶突变体的基因。
5.按照权利要求4所述的基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。
6.含有权利要求4或5所述基因的重组表达载体。
7.含有权利要求6所述重组表达载体的重组宿主细胞。
8.一种制备权利要求1至3任何一项所述大肠杆菌漆酶突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建含有权利要求4或5所述基因的重组表达载体，转化宿主细胞；(2)诱导表达大肠杆菌漆酶突变体，分离纯化，即得。
9.权利要求4或5所述基因在造纸、纺织、环保中的应用或者在制备洗涤剂、食品、饮料、化妆品或医用传感器中的应用。
10.权利要求1至3任何一项所述大肠杆菌漆酶突变体在造纸、纺织、环保中的应用或者在制备洗涤剂、食品、饮料、化妆品或医用传感器中的应用。
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