DE4123107A1 - Verfahren zur langzeitlagerung und sterilversendung von mikroorganismen im latenten lebenszustand - Google Patents

Description

Bisher ist es üblich, Kulturstämme von pro- oder ausgewähl­ ten eukaryotischen Organismen in Kulturensammlungen auf geeigneten Nährmedien zu kultivieren. Für den Stammerhalt werden die Organismen vor Erschöpfung des Nährmediums auf ein frisches Nährmedium übertragen. Dabei verbleiben die Organismen im aktiven Lebenszustand. Dies kann für eine schnelle Vermehrung eines Kulturstammes aus der Kulturen­ sammlung zu Forschungs- oder Produktionszwecken von Vorteil sein. In der Regel verbleiben aber die Stämme für lange Zeit in der Kulturensammlung. Zum Zwecke ihres Erhaltes müssen die Organismen ständig umgesetzt werden. Dafür sind Arbeits­ kräfte notwendig, die die Nährmedien vorbereiten und in Kul­ turgefäße füllen, diese sterilisieren und schließlich die Organismen umsetzen. Der Inhalt nicht mehr verwendungsfähi­ ger Kulturgefäße muß vernichtet und die Gefäße gereinigt werden. Diese Methode ist arbeits- und kostenintensiv und schließt das Risiko von Kontaminationen mit ein. Andere Ver­ fahren zum Erhalt von Kulturstämmen stellen z. B. die Sporen­ konservierung und die Gefriertrocknung dar. Die Sporenkon­ servierung beschränkt sich jedoch auf sporenbildende Bakterien und Pilze. Bei der Gefriertrocknung wirkt sich nachteilig aus, daß dieses Verfahren für großzellige Mi­ kroorganismen, z. B. Hefen und filamentöse Organismen, nicht geeignet ist.

Ferner ist bekannt, daß Mikroorganismen durch Überführung aus dem aktiven in den latenten Lebenszustand mittels Trock­ nung in einen lagerfähigen Zustand gebracht werden können (schweizerische Patentschrift Nr. CH 5 57 425 und europäische Patentschrift Nr. EP 6 671). Diese beschriebenen Verfahren sind aber für filamentöse oder mycelartig wachsende Organismen, wie höhere Pilze, nicht geeignet. Außerdem werden Hilfsmittel bzw. Stabilisatoren eingesetzt. Weiterhin ist dadurch, daß bis zum Erhalt des lagerfähigen Produktes Ar­ beitsschritte in verschiedenen Behältnissen ablaufen, die Gefahr einer Kontamination mit Fremdorganismen erhöht.

Der in Anspruch 1 angegebenen Erfindung liegt das Problem zugrunde, neben ein- bis mehrzelligen Mikroorganismen fila­ mentöse und mycelartig wachsende, großzellige Mikroorganis­ men in ein und demselben Gefäß bequem, sicher und billig in einen Zustand des latenten Lebens zu bringen, daß sie unter sterilen Bedingungen lange Zeit auch ohne zusätzliche Be­ handlung gelagert und versendet werden können. Die Mikroor­ ganismen sollen zu einem beliebigen Zeitpunkt wieder in den aktiven Lebenszustand überführt und dabei frei von Kontami­ nationen gehalten werden können.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, die Mikroorganis­ men so zu lagern, daß sie im latenten Lebenszustand steril, sicher und mit geringstem Aufwand verpackt, gelagert und versendet werden können.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß Kultu­ ren der jeweiligen Mikroorganismen unter sterilen Bedingun­ gen in Kulturgefäßen auf dünne Schichten eines mit ge­ eigneten Nährstoffen versetzten gelartigen oder quellfähi­ gen, zunächst annähernd wassergesättigten Feststoffes gege­ ben werden. Anschließend werden die Kulturgefäße gelagert, wobei ausreichend warme und trockene Räume Voraussetzung sind. Nun beginnen die Mikroorganismen auf der Oberfläche des Feststoffes zu wachsen und erleiden schon nach wenigen Wochen durch die beginnende Austrocknung der Nährstoff­ schicht einen Wassermangel. Die Wirkung dieses zunehmenden Wassermangels, hervorgerufen durch ein Absinken des Wasser­ potentials in der Nährstoffschicht, konzentriert sich nicht auf wenigen Stunden, sondern erstreckt sich über mehrere Ta­ ge. Diese Zeit ist ausreichend, damit auch großzellige Mi­ kroorganismen nicht vertrocknen und absterben, sondern vom aktiven zum latenten Leben übergehen. Die dünne Nährstoff­ schicht mit den latent lebensfähigen Mikroorganismen wird nun noch so lange getrocknet, bis ein dünner fester Nähr­ stoffilm entsteht, der ohne weiteres Zutun in der Lagerung belassen werden kann.

Dieses zufällig gefundene Verfahren erlaubt es, die so be­ handelten Mikroorganismen unter geeigneten Bedingungen lange Zeit zu lagern. Die Lagerzeit ist von der Organismenart abhängig und kann wenige Jahre bis viele Jahrzehnte betra­ gen. Wünscht man die Überführung der so gelagerten Organis­ men aus dem latenten wieder in den aktiven Lebenszustand, so wird eine für die Kultivierung des Mikroorganismus geeig­ nete flüssige und sterilisierte Nährlösung auf die ge­ trockneten Nährstoffilme gegeben. Unter geeigneten Kultivie­ rungsbedingungen keimen die so befeuchteten Mikroorganismen bereits nach wenigen Tagen bis Wochen aus und können durch Umsetzen steril vermehrt werden.

Eine vorteilhafte Ausgestaltung ist im Anspruch 2 der Erfin­ dung angegeben. Die getrockneten Nährstoffilme mit den la­ tent lebensfähigen Organismen können vom Boden der Kulturge­ fäße abgelöst werden. Das Ablösen läßt sich wesentlich er­ leichtern, wenn der Boden des Kulturgefäßes vor dem Ste­ rilisieren und Einfüllen des Nährmediums mit einer wasser­ abweisenden, hitzebeständigen und biokompatiblen Substanz dünn ausgekleidet wurde. Die bevorzugte Substanz ist ein Öl und Silikonöl ist das bevorzugte Öl.

Die abgelösten Nährstoffilme können leicht in kleine Stücke zerschnitten werden (z. B. Kantenlänge 1 cm) und unter ste­ rilen Bedingungen in selbstklebende, sterilisierte Polyäthy­ lenfolie verpackt werden. Dazu schneidet man größere Stücke aus Polyäthylenfolie (z. B. Kantenlänge 2 cm) aus. Ein Stück Nährstoffilm wird nun im Zentrum der Polyäthylenfolie posi­ tioniert und mit einem zweiten Stück Polyäthylenfolie abge­ deckt. Anschließend drückt man die beiden Polyäthylenfolien an den Rändern fest zusammen. Solche Packungen können auch unter unsterilen Bedingungen gelagert werden. Diese Art der Verpackung ermöglicht es, gewünschte Mikroorganismen ste­ ril, sicher und mit geringstem Aufwand und Risiko (z. B. in einem Brief) zu versenden.

Wünscht man die Überführung der auf diese Art und Weise ver­ packten und gelagerten bzw. versendeten Organismen aus dem latenten in den aktiven Lebenszustand, so zieht man unter sterilen Bedingungen die beiden Polyäthylenfolien ausein­ ander und kann das Stück Nährstoffilm mit den latent lebensfähigen Organismen steril entnehmen und einer Vermeh­ rung zuführen.

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen insbeson­ dere darin, daß die Mikroorganismen nicht mit dem Quellmit­ tel gemischt als Suspension kultiviert, sondern in getrenn­ ten Schichten, bestehend aus Nährmedium und Quellmittel einerseits und Mikroorganismen andererseits, in Kulturgefä­ ßen aufgetragen und gelagert werden. Die Überführung der Mi­ kroorganismen vom aktiven in den passiven Lebenszustand mittels Trocknung auf im Vergleich zu den Mikroorganismen großflächigen Nährstoffschichten ermöglicht es, nicht nur ein- oder mehrzellige oder nur sporenbildende, sondern ein breites Spektrum an Mikroorganismen, überraschenderweise z. B. auch Mycelien höherer Pilze, zu trocknen und lange Zeit zu lagern. Vorteilhaft ist weiterhin, daß durch die Trocknung und Lagerung in ein- und demselben Gefäß ohne Zu­ gabe von Hilfs- oder Zusatzstoffen die Gefahr einer Konta­ mination mit Fremdorganismen auf ein Minimum beschränkt ist.

Beispiele

In mit Silikonöl ausgekleidete, sterilisierte Petrischalen wurden die für die Kultivierung der jeweiligen Mikroorganis­ men geeigneten, mit Agar verfestigten Nährmedien gegeben. Auf diesem Nähragar wurden die Mikroorganismen kultiviert und unter Raumbedingungen gelagert. Während der Vermehrung der Mikroorganismen kam es gleichzeitig zur Austrocknung der Nährstoffschicht. Nach wenigen Wochen waren die Mikroorga­ nismen vom aktiven in den latenten Lebenszustand übergegan­ gen. Die Petrischalen mit den so behandelten Mikroorganismen konnten lange Zeit unter Raumbedingungen weiter gelagert werden (Tabelle).

Eine zweite Möglichkeit der Lagerung bestand darin, die aus­ getrockneten Nährstoffschichten mit den im latenten Lebens­ zustand befindlichen Mikroorganismen herauszulösen und in Polyäthylenfolie zu verpacken. Diese Packungen wurden sowohl unter sterilen als auch unsterilen, aber staubgeschützten Bedingungen in Petrischalen gelagert. Ein Teil der Packungen wurde in Briefsendungen verschickt.

Nach bestimmten Lagerungszeiten (Tabelle) wurden Proben der im latenten Lebenszustand befindlichen Mikroorganismen aus den Petrischalen bzw. den Polyäthylenpackungen unter steri­ len Bedingungen entnommen und in geeigneten Nährmedien kultiviert. Die so gewonnenen Kulturen der verwendeten Mi­ kroorganismen zeigten eine gute Auskeimungsrate und waren frei von Kontaminationen.

Organismenart
Lagerungszeit
(Monate)
Anabaena variabilis
36
Nostoc muscorum	36
Saccharomyces cerevisiae	12
Pleurotus ostreatus	12

Claims (2)

1. Verfahren zur Langzeitlagerung und Sterilversendung von Mikroorganismen im latenten Lebenszustand, gekennzeichnet dadurch, daß die Kulturen unter sterilen Bedingungen auf ei­ ner dünnen, im Vergleich zu den Mikroorganismen großflächi­ gen Schicht eines mit Nährstoffen versetzten gelartigen oder quellfähigen, zunächst annähernd wassergesättigten Feststoffes vermehrt werden, wobei durch die Art des Kultur­ gefäßes das Eindringen von Fremdorganismen verhindert und das Entweichen von Wasserdampf ermöglicht wird, so daß die Kulturen mit der Feststoffschicht an der Luft zu einem Film getrocknet werden, die Trocknungszeit ein Vielfaches der für den Zellteilungszyklus erforderlichen Zeit beträgt und die Kulturen so lange Zeit weiter gelagert und/oder ver­ sendet werden können.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nährstoffilme mit den im latenten Lebenszustand befind­ lichen Mikroorganismen unter sterilen Bedingungen dem Kul­ turgefäß entnommen, in Kunststoffolie verpackt, gelagert und/oder versendet werden können.