CN104273036B - 兰云杉Hoopsii离体体细胞胚诱导及植株再生方法 - Google Patents

Abstract

本专利涉及植物繁殖技术，具体为兰云杉新品种Hoopsii田间未成熟有性胚最佳外植体材料收集时间筛选、体细胞胚性离体愈伤组织诱导、体细胞胚离体成熟培养、体细胞胚离体萌发、体细胞胚幼苗移栽等一系列配套技术。本发明首次成功完成了该品种离体体细胞成熟胚在试管内萌芽、生长、直至长成幼苗的整个种子萌芽生长的全过程；并首次成功获得该品种离体体细胞胚温室移栽幼苗和室外移栽大树；为Hoopsii兰云杉新品种未来人工种子的大规模工厂化生产提供成套技术。

Description

兰云杉Hoopsii离体体细胞胚诱导及植株再生方法

技术领域

本发明涉及植物离体繁殖技术，具体为兰云杉新品种Hoopsii田间未成熟有性胚最佳外植体材料收集时间筛选、离体体细胞胚诱导与成熟各环节最佳培养基配方与最适培养条件筛选，包括胚性愈伤组织诱导、体细胞胚发育与成熟、体细胞胚萌发、试管幼苗生长发育和移栽等一系列配套技术。

背景技术

Hoopsii为兰云杉树种的一个芽变变种，于1994年在加拿大被第一次报道。传统的兰云杉品种仅当年生新叶呈兰色，二年生以上老叶即开始变绿。而该变种的新老叶子呈均一蓝色、树体美丽高耸，呈塔型，为珍稀兰云杉新品种，在北美被视作为高档圣诞树和庭院绿化树种，一经面世，便很受欢迎，市场供不应求。但是，该品种自然生长植株存在种胚严重败育问题，即该品种在自然条件下无法形成正常的合子胚和天然种子，因此无法通过种子进行繁殖。

发明内容

目前，关于兰云杉Hoopsii品种的繁殖方法，无论是有性种子繁殖，还是无性的扦插、嫁接繁殖均未曾见有任何成功报道。

本发明首次提出借助植物组织培养技术对兰云杉Hoopsii品种进行离体无性繁殖，该方法是目前兰云杉Hoopsii品种幼苗繁殖的唯一一种成功途径。

本发明是采用如下技术方案实现的：

一种兰云杉Hoopsii离体体细胞胚诱导方法，包括如下步骤：

（1）、选择外植体材料：每年的6月中旬至7月中旬采集兰云杉Hoopsii品种的种球未成熟合子胚用作体细胞胚诱导外植体材料。

（2）、胚性愈伤组织诱导：无菌操作台下，将步骤（1）准备好的外植体材料接入诱导培养基，完成接种后，移入培养室开始进行体细胞胚愈伤组织诱导培养；其中，培养室温度：25±2℃；光照：黑暗；所述诱导培养基配方为1/2MS+植物细胞分裂素A0.5-5mg/L+植物生长素B1.0-10mg/L+CH0.5-4g/L+L-Glu0.2-0.8g/L+蔗糖10-40g/L+凝胶2-8mg/L；

经过3-5周的诱导培养后，从胚根一端会产生白色丝状细胞团，即胚性愈伤组织。

（3）、体细胞胚的成熟培养：

a、预培养：将胚性愈伤组织培养瓶从培养室移到无菌接种室，无菌切取胚性愈伤组织，用于预培养处理；每1g的新鲜组织被悬浮培养在装有2-20ml液体培养基中，形成均匀的悬浮液；然后用布氏漏斗将其真空倒入一铺有过滤膜的漏斗上，然后在常压下将此表面已吸附有愈伤组织团块的滤膜转接到诱导培养基上培养5-7天；

b、成熟培养：转接愈伤组织的无菌操作过程同预培养，只是诱导培养基更换为成熟培养基，培养5-6周后，可用肉眼观察到处于不同成熟阶段的到最后带有明显子叶的充分发育的体细胞胚；其中，成熟培养条件为：弱光照4-6uMm^-2s^-1，15-20h光照周期，温度25±1℃；

所述成熟培养基配方为1/2MS+植物生长物质C0.0-5.0mg/L+蔗糖30-60g/L+凝胶4-10mg/L。

一种利用兰云杉Hoopsii离体体细胞胚诱导植株再生方法，包括如下步骤：

（1）、兰云杉Hoopsii离体体细胞胚诱导方法同上所述，将得到处于子叶阶段的体细胞胚继续成熟培养1-2周后充分发育为成熟的无性胚；

（2）、体细胞胚试管内萌发：将幼胚放入胚萌发培养基内，培养8-10周，从成熟体细胞胚到具有功能性根和芽；其中，胚萌发培养条件为：光照强度第一周控制在8-12uMm^-2s^-1，第二周控制在15-25uMm^-2s^-1，随后为25-35uMm^-2s^-1；

胚萌发培养基配方为：MS+蔗糖5-30g/L+凝胶2-8g/L。

（3）、温室移栽：

a、练苗：当健康的子叶和根系伸长后，将培养瓶移入温室，在自然光照下练苗10-18天；

b、移栽入培养基质：培养基质为果园土、珍珠岩和蛭石以质量比为2.5-3.5：0.5-1.5：1混合而成。

本发明首次成功地利用该品种的未成熟合子胚作为外植体材料，诱导出胚性愈伤组织。

本发明通过营造与天然合子胚成熟发育过程类似的营养成份环境条件，包括温度、光照、湿度、培养基硬度等，首次成功完成该品种离体体细胞胚发育成熟的完整过程，包括①球体阶段（globe-shapedstage），②鱼雷体阶段（torpedo-shapedstage），③子叶雏形期阶段(earlycotyledonarystage)，和④子叶充分发育、可进行播种的成熟胚阶段（mature-embryostage）。

本发明首次成功完成了该品种离体体细胞成熟胚在试管内萌芽、生长、直至长成幼苗的整个种子萌芽生长的全过程。

本发明首次成功获得该品种离体体细胞胚温室移栽幼苗和室外移栽大树。

本发明设计合理，首次为兰云杉新品种Hoopsii未来人工种子的大规模工厂化生产提供成套技术，具有很好的市场应用前景和推广价值。

附图说明

图1表示第一阶段中胚性愈伤组织细胞团。

图2表示第一阶段中胚性愈伤组织细胞团继代培养。

图3表示处于第二阶段成熟培养阶段的离体体细胞胚。

图4表示体细胞胚萌发后长成的幼苗。

图5表示兰云杉Hoopsii体细胞胚诱导和植株再生全过程。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施例进行详细说明。

由天然生长母株未成熟合子胚诱导体细胞胚形成和植株再生过程可分为以下几个阶段：

第一阶段：由适宜外植体材料进行胚性愈伤组织诱导。

第二阶段：体细胞胚发育与成熟。本发明体细胞胚发育和成熟可观察到四个明显的阶段：①球体阶段（globe-shapedstage），②鱼雷体阶段（torpedo-shapedstage），③子叶雏形期阶段(earlycotyledonarystage)，和④子叶已充分发育、可进行播种的成熟胚阶段（mature-embryostage）。

第三阶段：试管内成熟体细胞胚的栽种与萌发。

第四阶段：试管幼苗的成长，在4-6周刚萌发的体细胞胚可长成1-2cm高小苗。

第五阶段：试管苗温室练苗与移栽。

第六阶段：大田移栽。

一种兰云杉新品种Hoopsii离体体细胞胚诱导与植株再生方法，具体如下：

第一阶段最佳外植体材料的确定过程如下：

1、未成熟合子胚

该兰云杉新品种Hoopsii的种球果实分别从加拿大渥太华三个不同的试验点收集。其中两个家庭院落单株栽培的树（14年生的和25年生的）分别被标记为第一、第二原始材料母株。而第三原始材料母株（25年生）采自一个自然保护区的小片混交林，该保护区位于渥太华市Rideau河岸。样本的采集工作连续进行三年（2004年，2005年，2006年），根据前期对该品种种胚生长发育特性的调查结果，这里将种球采集日期定在从每年的6月初到7月底（两个月）。根据各阶段未成熟种胚和胚珠的发育情况，种球每隔一星期、两星期或一个月被采集一次。种子被随机从母树上采下来后，放于冰袋中带回实验室，保存在4℃条件下。在做无菌消毒之前，种球宜浸在0.2%高锰酸钾溶液中5分钟，用蒸馏水冲洗干净后，移于超净工作台下，再用70%酒精浸泡2分钟和15%的漂白粉（3.7%wt/volsodiumhypochlorite，70%v/vClorox）浸泡15分钟给种球表面消毒。超净工作台下做解刨时，首先将鳞片从基部向顶端剥离，选择带有正在发育的胚珠（外观看个体明显大）的鳞片，放于底部铺有一层湿润纱布的培养皿，在解剖显微镜下用无菌解剖刀剥离未成熟胚。早期（六月）采集的种球，由于合子胚太小（＜1mm），且胚和胚乳很嫩，此阶段的样本很难将胚从种子中分离。所以，早期的外植体实际上是一个完整的、没有种皮的未成熟种子。所有这些被分离的外植体材料被立即放于诱导培养基上进行诱导培养。

本发明对不同发育阶段未成熟合子胚对诱导培养的反应做了为期三年的连续调查。结果显示，只有从六月中旬到七月中旬的合子胚外植体材料上才会诱导出胚性愈伤组织，而六月中旬以前采集的处于早期发展阶段的合子胚外植体材料仅会产生大量非胚性愈伤组织细胞团。从发育早期的幼嫩胚乳组织上仅可诱导出无效细胞团，而生长后期木质化的胚乳对诱导培养无任何反应。根据观察，该品种的授粉受精发生在六月十日左右，随后，受精胚珠开始发育生长。显微镜下观察，此期的胚仅显现胚性细胞团，而六月中旬到七月中旬的合子胚已经呈鱼雷体形状，且子叶雏形开始显现。随后很快，肉眼可观察到胚的顶端生长点和子叶。观察发现只有这一阶段（六月中旬-七月中旬）的合子胚在离体培养条件下才能产生胚性细胞团。就该品种来讲，从七月上旬到七月中旬之间，由于胚败育，胚乳开始变硬干缩，造成很多空的种子，此时能健康生长发育的合子胚数量陡然下降。研究结果显示这些空的种子无论培养时间多长均没有任何类型的细胞团产生。据此推断，该品种未成熟合子胚外植体材料采收适宜时间非常有限，仅有从六月中旬到七月中旬的3-4周。进一步对这期间材料进行每隔一周的采样试验，结果显示，在6月24日-6月30日采收的合子胚具有最高诱导率11.21%。因此，虽然合子胚外植体材料适宜采收时间可延续一个月（6月中旬到7月中旬），但最佳采集时间仅仅不到一周。

2、针叶、茎段、茎尖、芽

从同样的母株上采集，但采集时间分春夏生长期枝条和冬季越冬枝条。从野外带回后，先用肥皂水和流水对枝条进行清洗，然后移于超净工作台下进行表面消毒处理。消毒程序为：在0.1%KMnO₄浸泡30分钟，70%酒精浸泡2分钟和15%的漂白粉（3.7%wt/volsodiumhypochlorite，70%v/vClorox）浸泡20分钟。在无菌条件下，切割针叶成0.5～1.0cm小段。茎尖生长点（0.3～0.5cm）是从顶端芽子上用刀片分离出来的。

3、试管内离体培养过程中处于各个不同发育时期的体细胞胚和试管幼苗：该阶段的所有材料因一直培养在无菌条件下，所以无需进行表面消毒，可直接转移到愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养。

将在成熟培养阶段剔除的体细胞胚和萌发阶段生长弱小的幼苗作为新的外植体材料转接到诱导培养基上，开始下一代体细胞胚诱导培养。与母树合子胚相比，试管内无菌培养的无性系材料，包括不同发育阶段的体细胞胚和不同苗龄的试管幼苗，都很容易产生大量的胚细胞团，其诱导率介于19.05-73.33%。

最佳外植体筛选结论如下：

经过无数次最佳外植体材料筛选试验，本发明从该品种针叶、茎段、茎尖、芽和种球未成熟合子胚等不同植物组织器官的试验结果得出结论：该品种天然生长植株的各组织器官，仅种球未成熟合子胚可以用作体细胞胚诱导外植体材料进行胚性体细胞胚诱导，而其余植物组织器官仅可获得无效愈伤组织细胞团，这类愈伤组织的细胞团在随后的继代培养中，会失去生命力，进而褐化死亡。既然该品种自然生长条件下严重的胚败育导致有性合子胚数量非常有限，后期的试管内无性系材料就变成非常珍贵的外植体材料。

第一阶段胚性愈伤组织的诱导过程如下：

1、基本培养基配方：四个不同的培养基配方被检测：MS(Murashige和Skoog1962)，LP(vonArnold和Eriksson1981；vonArnold1988)，DCR(Gupta和Durzan，1985)，和MLV（Klomaszewskaetal.，1977）。MS，LP和DCR均被添加以MS维生素混合物。根据LV（Litvayetal.，1985）培养基构成，MLV为一半LV的大量元素，全量微量元素和全量维生素混合物。所有这四个基本培养基均被加入酪蛋白水解物（CH）0.5-4g/L，L-谷氨酰胺200-800mg/L，蔗糖10-40g/L和凝胶2-8g/L。L-谷氨酰胺要进行过滤灭菌，然后在培养基温度下降到50℃后，加入培养基中。在加入凝胶之前，用NaOH和HCl将pH值调整到5.8。

不同基本培养基对诱导率的影响是极其明显的，在四个被测试的基本培养基中，只有在1/2MS和MLV两个培养基上培养的合子胚对诱导处理产生反应。这点与其它常绿针叶树种的培养结果不同，传统技术上，其它云杉类和松树类树种体细胞愈伤组织诱导最佳培养基为DCR（Gupta和Durzan1985；Becwaretal.，1990，1995；Nagmanietal.，1993；Liao和Amerson，1996）。然而，对兰云杉品种Hoopsii，DCR培养基上的培养物仅能产生普通的非胚性愈伤组织。用6月24-6月30日期间采收的无性胚接种在1/2MS培养基上时给与最高诱导率11.21%。因此，1/2MS可被认为是该兰云杉品种体细胞胚诱导最佳诱导培养基。

2、植物生长物质：本发明涉及植物细胞分裂素A，植物生长素B。

通过对一系列植物生长调节物质BAP，KT，ZT，GA3，NAA，IAA，IBA，2，4-D，ABA及其不同配比浓度的筛选，现已知植物细胞分裂素A和植物生长素B对该兰云杉品种胚诱导是必不可少的。其中，胚性愈伤组织的诱导率和体细胞胚的生长发育对细胞分裂素A浓度水平极为敏感，而对植物生长素B浓度水平的变化较为迟钝。

3、胚性愈伤组织最佳诱导培养基配方如下：

1/2MS+植物细胞分裂素A0.5-5mg/L+植物生长素B1.0-10mg/L+CH0.5-4g/L+L-Glu0.2-0.8g/L+蔗糖10-40g/L+凝胶2-8mg/L。

植物细胞分裂素A优选为6-苄氨基嘌呤（6-BA），玉米素（ZT）或者激动素（KT）。

植物生长素B优选为吲哚乙酸（IAA），吲哚丁酸（IBA），奈乙酸（NAA）；2，4-D，脱落酸（ABA）或者赤霉素（GA3）。

具体可以为：

ⅰ、1/2MS+细胞分裂素A（6-BA）0.5mg/L+植物生长素B（IAA）3mg/L+CH4g/L+L-Glu0.8g/L+蔗糖25g/L+凝胶4mg/L；

ⅱ、1/2MS+细胞分裂素A（ZT）1mg/L+植物生长素B（IBA）5mg/L+CH2g/L+L-Glu0.3g/L+蔗糖10g/L+凝胶6mg/L；

ⅲ、1/2MS+细胞分裂素A（KT）2mg/L+植物生长素B（NAA）10mg/L+CH0.5g/L+L-Glu0.6g/L+蔗糖15g/L+凝胶2mg/L；

ⅳ、1/2MS+细胞分裂素A（6-BA）3mg/L+植物生长素B（2，4-D）1mg/L+CH3g/L+L-Glu0.5g/L+蔗糖30g/L+凝胶8mg/L；

ⅴ、1/2MS+细胞分裂素A（KT）5mg/L+植物生长素B（ABA或者GA3）8mg/L+CH1g/L+L-Glu0.2g/L+蔗糖40g/L+凝胶5mg/L。

灭菌条件：120℃，0.1MPa，20分钟。灭菌完后将培养瓶移入无菌操作室，备用。

4、接种

无菌操作台下，将上面准备好的外植体材料接入诱导培养基，每瓶接入1-6个外植体。完成接种后，移入培养室开始进行体细胞胚愈伤组织诱导培养。

5、培养条件

初期诱导培养阶段要求培养室温度：25±2℃；光照：黑暗。

6、胚性细胞团特征和产生过程

在诱导培养基上，适宜的外植体材料一般在大约3-5周的诱导培养后，从胚根一端会产生白色、似丝状的细胞团，如图1所示。显微镜下观测，可看到这些细胞团上分化出的胚胎头部和胚柄，此类细胞团即为胚性愈伤组织。同时，从其它一些外植体材料上会有另一类颜色发暗、质地紧密的细胞团大量产生，呈现这种特征的细胞团为无效细胞团，是非胚性愈伤组织。

7、继代培养

每两周作一次继代培养，将培养材料转移到新鲜的相同诱导培养基上，如图2所示。

8、诱导率的确定方法如下：

最佳采集时间和基本培养基的筛选为完全随机区组设计，对植物细胞分裂素A和植物生长素B最佳配比的设计则选用拉丁方设计。用方差分析（Analysis-itforMicrosoftExcel）对实验数据进行处理。多重比较被用于以上两个试验，来决定不同采集日期，不同基本培养基和不同植物生长物质A和B组合诸因子中的最关键因子及水平。每个处理有3-5个培养皿（60×15cm）组成，每个培养皿内种植4-6个合子胚，每个试验处理重复三次。就每个采集时间和每种基本培养基，大约36个合子胚被用于测试。对外植体培养诱导进程及时在显微镜下进行显微跟踪记载。八周后，按照以下公式计算诱导率：

诱导率（%）=产生胚性愈伤组织的外植体数量/总外植体数量×100。

第二阶段体细胞胚的成熟过程如下：

1、成熟培养基配方

在诱导培养基的基础上，对培养基成份做以下调整：1、去掉原来的植物生长物质；2、添加植物生长物质C0.0-5.0g/L；3、通过提高蔗糖和凝胶浓度来增加培养基渗透压；4、保持维生素和其他添加剂不变。

成熟培养基配方为：1/2MS+植物生长物质C0.0-5.0mg/L+蔗糖30-60g/L+凝胶4-10mg/L。

所述植物生长物质C为脱落酸ABA。

具体可以为：

ⅰ、1/2MS+蔗糖60g/L+凝胶8mg/L；

ⅱ、1/2MS+植物生长物质C3.0mg/L+蔗糖30g/L+凝胶5mg/L；

ⅲ、1/2MS+植物生长物质C5.0mg/L+蔗糖40g/L+凝胶3mg/L；

ⅳ、1/2MS+植物生长物质C1.0mg/L+蔗糖50g/L+凝胶6mg/L；

2、培养基灭菌

高温高压灭菌基本培养基，过滤灭菌植物生长物质C，然后在超净工作台下混合，装瓶，然后将培养瓶移入无菌操作室备用。

3、成熟培养的预处理

将可以进行成熟培养的胚性愈伤组织培养瓶从培养室移到无菌接种室，用70%乙醇进行表面喷洒消毒，然后移于超净工作台上，轻轻打开培养瓶口，无菌切取健康的胚性愈伤组织（通常位于细胞团表面），用于预培养处理。每1g的新鲜组织被悬浮培养在装有2-20ml液体培养基（上面不加凝胶的成熟培养基）离心管中，剧烈震动该管以便形成均匀的悬浮。用一宽嘴吸管，每次吸取0.5-5ml悬浮液，然后用布氏漏斗将其真空倒入一铺有过滤膜（WhatmanNo.1-4）的漏斗上，然后在常压下将此表面已吸附有愈伤组织团块的滤膜用镊子轻轻移到培养皿上，在同样的诱导培养基上培养5-7天。

4、成熟培养

操作程序同预处理，只是诱导培养基更换为成熟培养基。

5、成熟培养条件

弱光照（4-6uMm^-2s^-1），15-20h光照周期，温度25±1℃。

具体可以为：

ⅰ、弱光照5uMm^-2s^-1，20h光照周期，温度25±1℃。

ⅱ、弱光照6uMm^-2s^-1，16h光照周期，温度25±1℃。

ⅲ、弱光照4uMm^-2s^-1，15h光照周期，温度25±1℃。

6、体细胞胚成熟过程如下：

在体细胞胚的成熟培养过程中，四个明显的发展阶段被观察到：①球体阶段（globe-shapedstage），②鱼雷体阶段（torpedo-shapedstage），③子叶雏形期阶段(earlycotyledonarystage)，和④子叶已充分发育、可进行播种的成熟胚阶段（mature-embryostage）。大约培养2-3周后，可观察到处于球状和鱼雷状阶段的胚原体。这些胚发育整齐，生长健康。大约4周后，可在显微镜下观察到子叶雏形。5-6周后，可用肉眼观察到带有明显子叶的，充分发育的体细胞胚。处于子叶阶段的胚还另需要1-2周可充分发育为成熟胚，如图3所示。

第三阶段体细胞胚试管内萌发过程如下：

1、胚萌发培养基配方为MS+蔗糖5-30g/L+凝胶2-8g/L。

具体可以为：

ⅰ、MS+蔗糖5g/L+凝胶6g/L；

ⅱ、MS+蔗糖20g/L+凝胶8g/L；

ⅲ、MS+蔗糖10g/L+凝胶2g/L；

ⅳ、MS+蔗糖30g/L+凝胶4g/L。

2、可进行萌发培养的胚体状态

经过6-8周成熟培养，且充分发育成熟的无性胚，外观可见明显的子叶突起。

3、转接

将单个幼胚水平放在培养皿上，大约每个培养皿放30个胚。然后，这些培养皿被垂直放在培养架上。

4、胚萌发培养条件

光照强度第一周控制在8-12uMm^-2s^-1，第二周为15-25uMm^-2s^-1，随后一直为25-35uMm^-2s^-1；

优选为：光照强度第一周控制在10uMm^-2s^-1，第二周为20uMm^-2s^-1，随后一直为30uMm^-2s^-1。

5、体细胞胚萌发过程

放在具有萌发培养基的培养皿内两天后，体细胞胚的子叶开始转绿，并开始伸长。

第四阶段幼苗成长

然后，体细胞胚的根部区域变成粉红色，大概4周后，基部可观测到白色根系，随后快速发育延伸。体细胞幼苗生长非常迅速，到6周时，幼苗高度达到1.0-1.5cm高，根长为0.5-2.0cm，根部颜色变暗。从成熟体细胞胚到具有功能性根和芽的转化过程需要8-10周，如图4所示。此阶段结束后，幼苗可从温室移栽到土壤里，幼苗转化率平均为92.85%。

第五阶段温室移栽过程如下：

1、练苗

当健康的子叶和根系伸长后，将培养瓶移入温室，在自然光照下练苗两周。

2、移栽入培养基质

培养基质为果园土、珍珠岩和蛭石以质量比为2.5-3.5：0.5-1.5：1混合而成。

优选的，培养基质为果园土、珍珠岩和蛭石以质量比为3：1：1

第六阶段：完成大田移栽。

Claims (1)

1.一种利用兰云杉Hoopsii离体体细胞胚诱导植株再生的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）、选择外植体材料：每年的6月24日-30日期间采集兰云杉Hoopsii品种的种球未成熟合子胚用作体细胞胚诱导外植体材料；

（2）、胚性愈伤组织诱导：无菌操作台下，将步骤（1）准备好的外植体材料接入诱导培养基，完成接种后，移入培养室开始进行体细胞胚愈伤组织诱导培养；其中，培养室温度：25±2℃；光照：黑暗；所述诱导培养基配方为1/2MS+细胞分裂素A0.5-5mg/L+植物生长素B1.0-10mg/L+CH0.5-4g/L+L-Glu0.2-0.8g/L+蔗糖10-40g/L+凝胶2-8mg/L；所述细胞分裂素A为6-苄氨基嘌呤，玉米素或者激动素；所述植物生长素B为吲哚乙酸，吲哚丁酸、萘乙酸、2，4-D、脱落酸或者赤霉素；

经过3-5周的诱导培养后，从胚根一端会产生白色细胞团，即胚性愈伤组织；

（3）、体细胞胚的成熟培养：

a、预培养：将胚性愈伤组织培养瓶从培养室移到无菌接种室，无菌切取胚性愈伤组织，用于预培养处理；每1g的新鲜组织被悬浮培养在2-20ml液体培养基中，形成均匀的悬浮液；然后用布氏漏斗将其真空倒入一铺有过滤膜的漏斗上，然后在常压下将此表面已吸附有愈伤组织团块的滤膜转接到诱导培养基上培养5-7天；

b、成熟培养：转接愈伤组织的无菌操作过程同预培养，只是诱导培养基更换为成熟培养基，培养5-6周后，可用肉眼观察到处于不同成熟阶段的到最后带有明显子叶的充分发育的体细胞胚；其中，成熟培养条件为：弱光照4-6μM·m^-2·s^-1，15-20h光照周期，温度25±1℃；所述成熟培养基配方为1/2MS+植物生长物质C0.0-5.0mg/L+蔗糖30-60g/L+凝胶4-10mg/L；所述植物生长物质C为脱落酸ABA；

（4）、处于子叶阶段的体细胞胚继续成熟培养1-2周后充分发育为成熟的无性胚；

（5）、体细胞胚试管内萌发：将幼胚放入胚萌发培养基内，培养8-10周，从成熟体细胞胚到具有功能性根和芽；其中，胚萌发培养条件为：光照强度第一周控制在8-12μM·m^-2·s^-1，第二周控制在15-25μM·m^-2·s^-1，随后为25-35μM·m^-2·s^-1；胚萌发培养基配方为：MS+蔗糖5-30g/L+凝胶2-8g/L；

（6）、温室移栽：

a、炼苗：当健康的子叶和根系伸长后，将培养瓶移入温室，在自然光照下炼苗10-18天；

b、移栽入培养基质：培养基质为果园土、珍珠岩和蛭石以质量比为2.5-3.5：0.5-1.5：1混合而成。