SE534887C2

SE534887C2 - Förfarande för stratifiering och förvaring av somatiska embryon

Info

Publication number: SE534887C2
Application number: SE1050412A
Authority: SE
Inventors: Amy M Jamruszka
Original assignee: Weyerhaeuser Nr Co
Priority date: 2007-09-27
Filing date: 2008-09-22
Publication date: 2012-02-07
Also published as: CA2698134C; US8216840B2; CN101808506A; AU2008304630A1; FI126715B; NZ584616A; AR068567A1; WO2009042553A1; FI20105297A; AU2008304630B2; US20090087908A1; SE1050412A1; UY31358A1; CA2698134A1; CN101808506B

Abstract

44 SAM MAN DRAG Ett förfarande för framställning av stratifierade hjärtbladsförsedda so-matiska barrträdsembryon beskrivs, varvid förfarandet inbegriper (a) inkuba-tion av en kultur inbegripande omogna somatiska barrträdsembryon i ett od-lingskärl inbegripande ett utvecklingsmedium med en osmolalitet i områdetfrån 300 mM/kg till 450 mM/kg vid en temperatur av från 22°C till 25°C underen första inkubationsperiod som är tillräckligt lång för att åtminstone en del avembryona ska uppnå anatomisk mognad; och (b) steget att underkastaembryona i odlingskärlet enligt steg (a) en temperatur av från 0°C till 10°Cunder en andra inkubationsperiod av minst en vecka för framställning av stra-tifierade hjärtbladsförsedda somatiska embryon.

Description

534 887 2 banträdsembryon som bildats in vivo i barrträdsfrön. Med föreliggande upp- finning tillhandahålls förfaranden uppfyller detta behov med avseende på banträd av släktet Pinus.

Sammanfattning I en aspekt tillhandahålls ett förfarande för framställning av stratiﬁerade hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon. Förfarandet inbegriper (a) lnkubation av en kultur inbegripande omogna somatiska barrträdsembryon i ett odlingskärl inbegripande ett utvecklingsmedium med en osmolalitet i områ- det från 300 mM/kg till 450 mM/kg vid en temperaturfrån 22°C till 25°C för en första inkubationsperiod som är tillräckligt lång för att åtminstone en del av embryona ska nå anatomisk mognad; och (b) steget att underkasta embryona i odlingskärlet från steg (a) en temperatur av från 0°C till 10°C under en andra inkubationsperiod av minst 1 vecka för framställning av stratifierade somatis- ka hjärtbladsförsedda embryon.

I en annan aspekt tillhandahålls ett förfarande för framställning av hjärt- bladsförsedda somatiska embryon. Förfarandet inbegriper (a) lnkubation av en kultur inbegripande pre-hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon i eller på ett första utvecklingsmedium under en första inkubationsperiod; (b) singularisering av ett ﬂertal av embryona som behandlats enligt steg (a); (c) odling av mångfalden av singulariserade hjärtbladsförsedda somatiska barr- trädsembryon i ett odlingskärl inbegripande ett utvecklingsmedium med en osmolalitet i omrâdet från 300 mM/kg till 450 mM/kg vid en temperatur av från 22°C till 25°C under en andra inkubationsperiod som är tillräckligt lång för att åtminstone en del av embryona ska uppnå anatomisk mognad; och (d) steget att underkasta embryona iodlingskärlet från steg (c) en temperatur av från 0°C till 10°C under en tredje inkubationsperiod av minst 1 vecka för framställ- ning av stratifierade somatiska hjärtbladsförsedda embryon.

Förfarandena enligt föreliggande uppﬁnning är användbara för bered- ning av mogna stratifierade hjärtbladsförsedda somatiska embryon med ökad groningsfrekvens och en växtkraft, som kan karakteriseras ytterligare, såsom på genetisk eller biokemisk väg, och/eller som kan underkastas groning för framställning av barrträd, om så är önskvärt. Förfarandena enligt uppﬁn- ningen kan t ex således användas för mera effektiv framställning av kloner av 10 15 20 25 30 534 88? 3 individuella barrträd med en eller flera önskvärda egenskaper, såsom hög tillväxthastighet eller förbättrad träkvalitet. ßeskrivlngLiv ritninqarna Ovanstående aspekter och många av de åtföljande fördelama med fö- religgande uppfinning inses lättare genom hänvisning till efterföljande detalje- rade beskrivning tillsammans med de åtföljande rltningarna.

I FIGUR 1 visas en schematisk representation av utvecklingen av somatiska barrträdsembryon i ett tidigt och sent skede.

I F IGUR 2 visas en uppsättning av fotografier av groddämnen som pro- ducerats vid betingelserna (FIGUR 2A-2C) för behandiingsgrupp 1 (kontroll) eller som producerats vid betingelserna (FIGUR 2D-2F) för behandiingsgrupp 14, vilka visar den förbättrade groningsväxtkraft som erhållits genom använd- ning av betingelsema vid behandling 14, såsom beskrivs i EXEMPEL 2.

I FIGUR 2A visas ett fotografi av groddämnen från behandiingsgrupp 1, S-ram 1.

I FIGUR 2B visas ett fotograﬁ av groddämnen från behandiingsgrupp 1, S-ram 2.

I FIGUR 2C visas ett fotografi av groddämnen från behandiingsgrupp 1, S-ram 3.

I FIGUR 2D visas ett fotograﬁ av groddämnen från behandiingsgrupp 14, S-ram 1.

I FIGUR 2E visas ett fotograﬁ av groddämnen från behandiingsgrupp 14, S-ram 2.

I FIGUR 2F visas ett fotograﬁ av groddämnen från behandiingsgrupp 14, S-ram 3.

Detaljerad beskrivning Såvida inget annat speciﬁkt deﬁnieras här, har alla här använda be- grepp samma innebörd som de skulle ha för en fackman på samma teknik- område som föreliggande uppﬁnning.

Det här använda uttrycket "utvecklingsskede" hänför sig till den period under den somatiska kloningen under vilken histogenes och tillväxt av vävna- der och organ sker i ett omoget embryo för uppnående av ett moget embryo i full storlek med förmåga till groning till en planta. 10 15 20 25 30 534 B87 4 Det här använda uttrycket ”omoget embryo” hänför sig till ett embryo som ännu inte harförmåga till groning till en planta och inkluderar embryon i ett tidigt utvecklingsskede (dvs pre-hjärtbladsförsedda embryon) och utveck- ling i ett mellanskede (dvs embryon med hjärtblad eller hypokotyler som ännu inte är fullständigt utvecklade).

Det här använda uttrycket “anatomisk mognad” hänför sig till ett emb- ryo som har utvecklade hjärtblad och hypokotyler.

Det här använda uttrycket "hjärtb|adsförsett embryo” hänför sig till ett embryo med en väldefinierad längsträckt bipolär struktur med latenta meriste- matiska centra med en eller ﬂera tydligt synliga hjärtbladsförsedda primordier i ena änden och ett latent rotämne iden motsatta änden.

Det här använda uttrycket "pre-hjärtbladsförsett embryo" hänför sig till ett embryo som ännu inte har hjärtblad.

Det här använda uttrycket "normalt groddämne” betecknar närvaron av samtliga förväntade delar hos en planta vid utvärderingstillfället. De förvänta- de delarna av en planta kan inkludera ett rotämne, en hypokotyl, ett eller ﬂera hjärtblad och en epikotyl. I fallet med gymnospermer kännetecknas ett nor- malt groddämne av att rotämnet har en längd av mer än 3 mm och att det saknar synliga urskiljningsbara missbildningar jämfört med utseendet hos embryon som grott med utgångspunkt från ett naturligt frö.

Det här använda uttrycket "rotämne" hänför sig till den del av ett växt- embryo som utvecklas till den primära roten hos den resulterande plantan.

Det här använda uttrycket "hypokotyl" hänför sig till den del av ett växt- embryo eller en groddplanta som är belägen under hjärtbladen, men ovanför rotämnet.

Det här använda uttrycket ”epikotyl” hänför sig till den del av en grodd- plantstjälk som befinner sig ovanför hjärtbladen.

Det här använda uttrycket "embryonal suspensormassa" eller "ESM" hänför sig till en cellmassa som strukits ut på ytan av ett näringsmedium som inneslutits i antingen en halvfast gel eller såsom en vätska i en porös matris med förmåga att tillhandahålla fysiskt stöd och som lämnats att gro under en period av upp till tre månader. Under denna inkubationstid av tre månader växer somatiska embryon med utgångspunkt från mikroskopiska prekursor- 10 15 20 25 30 534 B87 5 cellgrupper till synliga embryon i ett tidigt skede och slutligen till anatomiskt mogna embryon. Strukturen för ESM efter ﬂera veckors inkubation består vanligtvis av en prolifererad matta med ett fåtal embryon i direkt kontakt med mediet, men ﬂertalet embryon bildas ovanpå eller på sidan av den fortfarande prolifererande cellmassan.

Det här använda uttrycket ”stratiﬁering” hänför sig till steget att under- kasta embryon för kall behandling (t ex O°C till 10°C) före groning. Stratifiering (kylning med fukt) är en behandling som används för kringgående av gro- ningsresistens i frön hos många tempererade arter (Taylor & Waring, Plant, Cell, And Environment 2:165-171, 1979).

Såvida inget annat anges, är samtliga koncentratiohsvärden som är uttryckta som procent viktprocent per volymsenhet. l enlighet med förfarandena enligt föreliggande uppﬁnning har det oväntat upptäckts att odling av omogna somatiska barrträdsembryon i eller på ett utvecklingsmedium inbegripande en osmolalitet i området från 300 mM/kg till 450 mM/kg under en första inkubationsperiod, följt av odling av embryona på samma utvecklingsmedium vid en temperatur av från O°C till 10°C under en andra inkubationsperiod, ger embryon med ökad groningsfrekvens och växtkraft i jämförelse med embryon som inkuberas i ett utvecklingsmedium och därefter överförs till ett stratiﬁeringsmedium som har en osmolalitet av mindre än 150 mM/kg och som underkastas kall behandling (stratifiering), så- som beskrivs i EXEMPEL 2-4. Utöver den förbättrade groningsfrekvensen och groningsväxtkraften, ger uteslutningen av mediumöverföringssteget mel- lan utvecklingen och stratifieringen ett ﬂertal andra fördelar, inkluderande för- enklad produktion av hjärtbladsförsedda embryon, och eventuell kall förvaring av embryon på utvecklingsmedium före groning, vilket därigenom möjliggör ﬂexibilitet beträffande tidsanpassningen och användningen av embryona. För- farandena enligt föreliggande uppfinning möjliggör t ex ackumulation och syn- kronisering av embryopopulatloner före fälttester.

Enligt ovanstående tillhandahålls i en aspekt ett förfarande för fram- ställning av stratifierade hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon. För- farandet inbegriper (a) inkubation av en kultur inbegripande omogna somatis- ka barrträdsembryon i ett odlingskärl inbegripande ett utvecklingsmedium 10 15 20 25 30 534 88? 6 med en osmolalitet i området från 300 mM/kg till 450 mM/kg vid en tempera- tur av från 22°C till 25°C under en första inkubationsperiod som är tillräckligt lång för att åtminstone en del av embryona ska uppnå anatomisk mognad; och (b) steget att underkasta embryona i odlingskärlet från steg (a) en tempe- ratur av från 0°C till 10°C under en andra inkubationsperiod av minst 1 vecka för framställning av stratifierade hjärtbladsförsedda somatiska embryon.

Förfarandena enligt uppfinningen kan användas för framställning av hjärtbladsförsedda somatiska embryon med utgångspunkt från vilket barrträd som helst, såsom medlemmar av släktet Pinus, såsom sydstatsgultall (Loblolly-tall) (Pinus taeda) och Radiata-tall. Embryon till Douglas-gran kan tex också framställas med hjälp av förfarandena enligt uppfinningen.

En population av mogna somatiska barrträdsembryon som framställts med hjälp av förfarandena enligt uppfinningen har en högre effektivitet för groning till barrträdsplantor än en population av somatiska barrträdsembryon som framställts enligt någon annan identisk kontrollmetod som inkluderar det efterföljande utvecklingssteget av överföring av embryon från utvecklings- medium med en osmolalitet i området från 300 Mm/kg till 450 mM/kg till ett stratifieringsmedium med en osmolalitet av mindre än 150 mM/kg.

Före stratiﬁering inkuberas i enlighet med förfarandena enligt förelig- gande uppfinning en kultur inbegripande omogna somatiska barrträds- embryon, såsom embryonala suspensorcellmassor (ESM), i ett utvecklings- medium som befrämjar utvecklingen av hjärtbladsförsedda embryon under en första inkubationsperiod.

Omogna somatiska barrträdsembryon, såsom pre-hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon, kan beredas med utgångspunkt från somatiska barrträdsceller, såsom celler erhållna från barrträdsembryon. Cellerfrån barr- trädsembryon kan t ex med hjälp av hormoner induceras att bilda embryonala suspensorcellmassor (ESM), som kan behandlas med hjälp av föreliggande uppfinning för erhållande av mogna somatiska barrträdsembryon. ESM kan tex beredas med utgångspunkt från pre-hjärtbladsförsedda embryon som av- lägsnats från frön. Fröet ytsteriliseras t ex före avlägsnandet av de pre-hjärt- bladsförsedda embryona, som därefter odlas på eller i ett induktionsmedium som möjliggör bildning av ESM, som vid förökningsprocessen inducerar emb- 10 15 20 25 30 534 887 7 ryon i ett tidigt skede genom knoppning och klyvning. ESM odlas vanligtvis i ett underhållsmedium för bildning av pre-hjärtbladsförsedda somatiska emb- ryon. Icke-begränsande exempel på ESM-odlingsbetingelser och lämpliga induktions- och underhållsmedier beskrivs ytterligare nedan.

Induktion vid vissa utföringsforrner odlas således somatiska barrträdsceller i eller på ett induktionsmedium för erhållande av embryogena celler. Embryogena celler är celler med förmåga att producera ett eller ﬂera hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon och inkluderar t ex embryonala barrträdssuspen- sormassor. lnduktionsmediet inkluderar vanligtvis oorganiska salter och orga- niska näringsmaterial. Osmolaliteten för lnduktionsmediet är vanligtvis cirka 160 mg/kg eller t o m lägre, men kan vara så hög som 170 mM/kg. lnduk- tionsmediet inkluderar vanligtvis tillväxthormoner. Exempel på hormoner som kan vara inkluderade i lnduktionsmediet är auxiner (t ex 2,4-diklorfenoxiättik- syra (2,4-D)) och cytokininer (t ex 6-bensylaminopurin (BAP)). Auxiner kan tex utnyttjas i en koncentration av från 1 mg/I till 200 mg/l. Cytokininer kan tex utnyttjas i en koncentration av från 0,1 mg/l till 10 mg/I. lnduktionsmediet kan innehålla en absorbentkomposition, särskilt när höga halter av tillväxthormoner används. Absorbentkompositionen kan vara vilken komposition som helst som inte är toxisk för de embryogena cellerna vid de koncentrationer som används vid utövandet av de aktuella förfaran- dena och som har förmåga att absorbera tillväxtbefrämjande hormoner samt i mediet befintliga toxiska föreningar som producerats av växtcellerna under embryoutvecklingen. icke-begränsande exempel på användbara absorbent- kompositioner inkluderar aktivt kol, löslig poly(vinylpyrrolidon), olöslig poly- (vinylpyrrolidon), aktiverad aluminiumoxid och silikagel. Absorbentkompositio- nen kan föreligga i en mängd av t ex från cirka 0,1 g/l till cirka 5 g/l. Ett exem- pel på ett induktionsmedium som är användbart vid utövandet av föreliggande uppﬁnning är BM1-medium, som beskrivs i EXEMPEL 1 nedan. lnduktions- mediet är vanligtvis fast och kan solidifieras genom inklusion av ett gelnings- medel.

Somatiska barrträdsceller odlas vanligtvis i eller på ett induktions- medium under en period av från 3 veckor till 10 veckor, såsom från 6 veckor 10 15 20 25 30 534 B87 8 till 8 veckor, vid en temperatur av från 10°C till 30°C, såsom från 15°C till 25°C, eller såsom fràn 20°C till 23°C.

Underhåll Underhållsmediet kan vara ett fast medium, eller kan det vara ett ﬁy- tande medium som kan omröras för befrämjande av tillväxt och förökning av den embryogena vävnaden. Osmolaliteten för underhàllsmediet är vanligtvis högre än osmolaliteten för induktionsmediet och ligger vanligtvis i området 180-400 mM/kg. Underhållsmediet kan innehålla näringsämnen som upprätt- håller den embryogena vävnaden och kan inkludera hormoner, såsom en eller flera auxiner och/eller cytokininer, som befrämar celldelning och tillväxt av den embryogena vävnaden. Vanligtvis är koncentrationerna av hormoner i underhàllsmediet lägre än motsvarande koncentration i induktionsmediet.

Det är i allmänhet önskvärt, dock inte nödvändigt, att inkludera maltos som den enda eller huvudsakliga metaboliserbara sockerkällan i underhàlls- mediet. Exempel på användbara maltoskoncentrationer ligger inom området från cirka 1% till cirka 2,5%. Ett exempel på ett lämpligt underhållsmedlum är BM2-medium, som beskrivs i EXEMPEL 1 nedan. Embryogena barrträdsceller överförs vanligtvis till färskt underhållsmedium en gång per vecka.

Utveckling l enlighet med förfarandena enligt denna aspekt av föreliggande upp- finning inkuberas en kultur inbegripande omogna somaliska barrträds- embryon l ett utvecklingsmedium som befrämjar utveckling av hjärtblads- försedda embryon under en första inkubationsperiod.

Utvecklingsmediet för användning i denna aspekt av uppﬁnningen innehåller vanligtvis näringsämnen som upprätthåller de somatiska embryo- na. Lämpliga utvecklingsmedier inkluderar vanligtvis inte några tillväxt- befrämjande hormoner, såsom auxiner och cytokininer. Osmolaliteten för ut- vecklingsmediet ligger i området från 300 mM/kg till 450 mM/kg. Vid vissa utföringsformer har utvecklingsmediet en osmolalitet av 350 mM eller högre.

Utvecklingsmediet kan vara vätskeformigt, fast eller halvfast. Ett exempel på ett lämpligt ßMa-utveckllngsmedium beskrivs i EXEMPEL 1 nedan. Andra exempel på ett lämpligt utvecklingsmedium beskrivs i EXEMPEL 2-4 nedan.

Vid vissa utföringsformer av förfarandet har utvecklingsmediet en initial 10 15 20 25 30 534 887 9 osmolalitet av minst 300 mM/kg, som upprätthålls på en nivå av minst 200 mM/kg under stratifiering.

Vid vissa utföringsformer inbegriper utvecklingsmediet PEG i en kon- centration av från 1% till 15%. Vid vissa utföringsformer inbegriper utveck- lingsmediet PEG i en koncentration av 7-15% (t ex 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%). Vid vissa utföringsformer inbegriper utvecklings- mediet PEG i en koncentration från 10 till 12% och en osmolalitet av minst 350 mM/kg till 450 mM/kg.

Maltos kan vara inkluderat i utvecklingsmediet som huvudsaklig eller enda sockerkälla för de somatiska embryona. Användbara maltoskoncentra- tioner Iigger inom området från cirka 1% till cirka 2,5%.

Utvecklingsmediet kan innehålla gellangummi. Gellangummi är ett gel- ningsmedel som t ex marknadsförs under namnen GELRITE och PHYTA- GEL. Om gellangummi är inkluderat i utvecklingsmediet föreligger det vanligt- vis i en koncentration av mindre än cirka 0,5%, vanligtvis i en koncentration från cirka 0% till cirka 0,4%. Utvecklingsmediet är vanligtvis ett fast medium, även om det kan vara ett ﬂytande medium.

Utvecklingsmediet kan innehålla en absorbentkomposition, såsom aktivt kol, vilket beskrivs här, för induktionsmediet.

Vid vissa utföringsformer inbegriper utvecklingsmediet dessutom sackaros och/eller abscisinsyra. Koncentrationen av abscisinsyra i utveck- lingsmediet kan vara mellan 0,5 mg/I och 500 mg/I. Vid vissa utföringsformer av förfarandena enligt uppfinningen är koncentrationen av abscisinsyra i ut- vecklingsmediet mellan 1 mg/I och 100 mg/I. Vid vissa utföringsformer är kon- centrationen av abscisinsyra i utvecklingsmediet mellan 5 mg/I och 20 mg/l.

Vid vissa utföringsforrner av uppfinningen innehåller utvecklingsmediet sackaros som huvudsaklig eller enda källa av metaboliserbart socker. An- vändbara sackaroskoncentrationer ligger inom området cirka 1% till cirka 6%.

Enligt förfarandena i denna aspekt av uppfinningen inkuberas kulturen inbegripande omogna somatiska barrträdsembryon i ett odlingskärl inbegri- pande utvecklingsmediet med en osmolalitet i området från 300 mM/kg till 450 mM/kg vid en temperatur av från 22°C till 25°C under en första inkuba- tionsperiod som är tillräckligt lång för att åtminstone en del av embryona ska 10 15 20 25 30 534 887 10 uppnå anatomisk mognad (dvs ha utvecklade hjärtblad respektive hypokotyl).

Vid vissa utföringsformer är den första inkubationsperioden tillräckligt lång för att minst en del (t ex minst ett embryo, minst 10% av embryona, minst 25%, minst 50%, mer än 50% eller minst 75%) av mångfalden av embryon i emb- ryokulturen ska uppnå anatomisk mognad.

Såsom visas i FlGUR1 kan utvecklingsskedet för somatiska embryon uppdelas i det tidiga skedet, som involverar histogenes (dvs bildning av olika vävnader med utgångspunkt från odifferentierade celler), mellanskedet, som involverar organtillväxt och initiering av hypokotylutveckling och hjärtblads- utveckling, och det sena skedet, som involverar fullbordande av organtillväxt, fullbordande av hypokotyl- och hjärtbladsutveckling (dvs anatomisk mognad) och avsättning av lagringsprodukter. Det tidiga utvecklingsskedet för ett omoget embryo inkluderar särskilt initial rotutveckling, påbörjan av utveckling av rotmössa, differentiering av stele promeristem och skottspetsbildning. Ut- vecklingen i mellanskedet inkluderar initiering av hypokotylutveckling och hjärtbladsutveckling, och utvecklingen i det sena skedet inkluderar fullbordan- de av hypokotylutveckling och hjärtbladsutveckling, vilket resulterar i ett ana- tomiskt moget embryo.

Bildningen av en eller ﬂera strukturer eller ett eller ﬂera embryon (t ex hjärtbladsförsedda primordier eller hjärtblad) kan bestämmas genom visuell inspektion eller bildalstringsanalys av de odlade embryona. Visuell inspektion eller bildalstringsanalys kan eventuellt utföras vid en förstoring av 5-10 ggr.

Den första inkubationsperioden kan vara olikartad beroende på geno- typen. Vid vissa utföringsformer är den första inkubationsperioden från minst 6 veckor till minst 12 veckor i längd, såsom från 8 till 12 veckor. Den första inkubationen på utvecklingsmediet kan utföras vid en temperatur av från 10°C till 30°C, såsom från 15°C till 25°C, eller såsom från 20°C till 23°C.

Stratiﬁering Stratiﬁering (kylning med fukt) är en behandling som används för kring- gående av groningsresistens i frön hos många tempererade arter (Taylor & Waring, Plant, Cell, And Environment 2:165-171, 1979). Såsom beskrivs här har det oväntat visat sig att stratifiering kan utföras på utvecklingsmedier in- begripande en osmolalitet av minst 300 mM/kg upp till 450 mM/kg, vilket re- 10 15 20 25 30 534 887 11 sulterar i ett ökat utbyte av embryon med en ökad groningsfrekvens (såsom beskrivs i EXEMPEL 2-4) ijämförelse med embryon som producerats genom användning av stratiﬁeringsmediet med en osmolalitet av mindre än 150 mM/kg (såsom BM4).

Efter inkubation av de somatiska embryona på utvecklingsmediet för den första inkubationsperioden, som är tillräckligt lång för att åtminstone en del av embryona ska uppnå anatomisk mognad, underkastas enligt förfaran- dena i denna aspekt av föreliggande uppfinning embryona därefter för en temperatur av från 0°C till 10°C under en andra inkubationsperiod av minst 1 vecka för framställning av stratiﬁerade hjärtbladsförsedda somatiska embryon.

Vid en utföringsform underkastas hjärtbladsförsedda somatiska tall- embryon i eller på utvecklingsmediet inbegripande en osmolalitet av minst 300 mM/kg upp till 450 mM/kg för en temperatur av från 0°C till 10°C under en andra inkubationsperiod av minst 1 vecka upp till 8 veckor (t ex från 1 vecka till 8 veckor, såsom från 4 veckor till 6 veckor) för framställning av stratifierade hjärtbladsförsedda somatiska embryon. Vid en annan utförings- form underkastas hjärtbladsförsedda somatiska tallembryon i eller på utveck- Iingsmediet som inbegriper en osmolalitet av minst 300 mM/kg upp till 450 mM/kg för en temperatur av från 0°C till 10°C under en andra inkubations- period av minst 2 månader upp till 6 månader (t ex minst 2 månader, minst 3 månader, minst 4 månader, minst 5 månader och upp till 6 månader) för fram- ställning av stratifierade hjärtbladsförsedda somatiska embryon som lagras före groning. Den andra inkubationsperioden sker vanligtvis i mörker vid en temperatur av från 1°C till 6°C, såsom från 1°C till 4°C.

Vid en utföringsform av förfarandet enligt uppfinningen är den initiala osmolaliteten för utvecklingsmediet vid starten av den första inkubationsperio- den enligt steg (a) minst 300 mM/kg och upprätthålls på en nivå av minst 200 mM/kg under den andra inkubationsperioden enligt steg (b). Osmolalitets- nivån kan upprätthållas genom tillsättning av olika osmotiskt aktiva medel (”osmoticants”) till utvecklingsmediet (t ex PEG, tillsättning av olika socker- arter, myoinositol eller andra osmotiskt aktiva medel för ökning av osmolalite- ten), eller genom justering av volymen av det utvecklingsmedium embryona 10 15 20 25 30 534 88? 12 inkuberas i eller på under utveckling och stratifiering, såsom beskrivs i EXEM- PEL 4.

Vanligtvis bildas embryon på ytan av en massa av embryogena celler, såsom en embryonal suspensormassa. De hjärtbladsförsedda embryona kan separeras i individuella (singulariserade) hjärtbladsförsedda embryon före od- ling av dessa i eller på stratifieringsmediet, eller kan de odlas som en massa av icke-singulariserade embryon. De hjärtbladsförsedda embryona kan sepa- reras till individuella (singulariserade) hjärtbladsförsedda embryon innan de underkastas en temperatur av från 0°C till 10°C under en andra inkubatlons- period av minst 1 vecka för framställning av stratitierade hjärtbladsförsedda somatiska embryon, eller kan de odlas som en massa av icke-singulariserade embryon.

Efter stratiﬁering Efter stratiﬁering kan de hjärtbladsförsedda embryon som framställts genom användning av förfarandena enligt föreliggande uppﬁnning eventuellt underkastas groning för bildning av tallplantor, som kan tillåtas växa till träd, om så är önskvärt. Vanligtvis underkastas de hjärtbladsförsedda embryona en torkningsbehandling före groning, såsom beskrivs i EXEMPEL 1. De hjärt- bladsförsedda embryona kan också placeras i tillverkade fröer för efterföljan- de groning. De hjärtbladsförsedda embryona kan underkastas groning på t ex ett fast groningsmedium, såsom ßMs-medium, som beskrivs i EXEMPEL 1 nedan. Vanligtvis belyses de hjärtbladsförsedda somatiska embryona för stimulering av groning. Vanligtvis utförs samtliga steg vid förfarandena enligt föreliggande uppfinning, förutom groning, i mörker. De grodda plantorna kan överföras till jord för ytterligare tillväxt. De grodda plantorna kan t ex planteras i jord i ett växthus och tillåtas växa före överföring till ett ställe utomhus.

Vid vissa utföringsformer ger förfarandena i denna aspekt av upp- finningen ett högre utbyte av somatiska hjärtbladsförsedda embryon än en identisk metod vid vilken de embryogena cellerna odlas på ett utvecklings- medium med en osmolalitet av minst 300 mM/kg upp till 450 mM/kg (som t ex innehåller PEG), följt av stratifiering i eller på ett stratiﬁeringsmedium med en osmolalitet av mindre än 150 mM/kg (som t ex inte innehåller PEG), såsom visas i EXEMPEL 2-4. 10 15 20 25 30 534 887 13 I en annan aspekt tillhandahålls ett förfarande för framställning av hjärt- bladsförsedda somatiska embryon. Förfarandet inbegriper (a) inkubation av en kultur inbegripande pre-hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon i eller på ett första utvecklingsmedium under en första inkubationsperiod; (b) singularisering av ett ﬂertal av embryona som behandlats enligt steg (a); (c) odling av mångfalden av singulariserade hjärtbladsförsedda somatiska barr- trädsembryon i ett odlingskärl inbegripande ett utvecklingsmedium med en osmolalitet i området från 300 mM/kg till 450 mM/kg vid en temperatur av från 22°C till 25°C under en andra inkubationsperiod som är tillräckligt lång för att åtminstone en del av embryona ska uppnå anatomisk mognad; och (d) steget att underkasta embryona i odlingskårlet enligt steg (c) för en temperatur av från 0°C till 10°C under en tredje inkubationsperiod av minst 1 vecka för fram- ställning av stratifierade hjärtbladsförsedda somatiska embryon.

Enligt denna aspekt av uppﬁnningen kan omogna somatiska barrträds- embryon, såsom pre-hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon, bere- das med utgångspunkt från somatiska barrträdsceller, såsom celler som er- hållits från barrträdsembryon, genom odling av cellerna i eller på ett induk- tionsmedium för framställning av embryogena celler, såsom beskrivits ovan.

De embryogena cellerna kan därefter odlas i eller på ett underhållsmedium för förökning av de embryogena cellerna, såsom beskrivits ovan. De förökade embryogena cellerna kan därefter odlas i eller på ett första utvecklings- medium under en första inkubationsperiod, singulariseras och inkuberas i ett andra utvecklingsmedium under en andra inkubationsperiod, följt av stratifie- ring på det andra utvecklingsmediet.

Det första och det andra utvecklingsmediet innehåller vanligtvis nä- ringsämnen som upprätthåller de somatiska embryona. Lämpliga utvecklings- medier inkluderar vanligtvis inte några tillväxtbefrämjande hormoner, såsom auxiner och cytokininer. Vid vissa utföringsformer har det första och det andra utvecklingsmediet samma formulering. Vid vissa utföringsformer har det förs- ta och det andra utvecklingsmediet olika formuleringar.

Osmolaliteten för det första och/eller det andra utvecklingsmediet kan justeras till ett värde som faller inom ett önskvärt område, såsom från cirka 300 mM/kg till cirka 450 mM/kg. Vanligtvis är en osmolalitet av 350 mM eller 10 15 20 25 30 534 887 14 högre fördelaktig vid förfarandena enligt uppﬁnningen. Ett exempel på ett lämpligt BM3-utvecklingsmedium beskrivs i EXEMPEL 1 nedan. Andra exem- pel pà lämpliga utvecklingsmedier beskrivs i EXEMPEL 2-4 nedan. Vid vissa utföringsformer av förfarandet har det andra utvecklingsmediet en högre os- molalitet (t ex från 350 mM/kg till 450 mM/kg) än det första utvecklingsmediet (t ex fràn 300 mM/kg till 400 mM/kg). Vid vissa utföringsformer är osmolalite- ten för det andra utvecklingsmediet vald så att den matchar osmolaliteten för det första utvecklingsmediet vid slutet av den första inkubationsperioden.

Vid vissa utföringsformer inbegriper det första och/eller det andra ut- vecklingsmediet PEG len koncentration av från 1% till 15%. Vid vissa ut- föringsformer inbegriper det första utvecklingsmediet PEG i en koncentration av 7% till 10% (t ex 7%, 8%, 9%, 10%). Vid vissa utföringsformer inbegriper det andra utvecklingsmediet PEG i en koncentration av 8%-15% (t ex 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%). Vid vissa utföringsformer inbegriper det andra utvecklingsmediet PEG i en högre koncentration än det första ut- vecklingsmediet.

Maltos kan vara inkluderat i det första och/eller andra utvecklings- mediet som den huvudsakliga eller enda kolkällan för de somatiska embryo- na. Användbara maltoskoncentrationer ligger i omrädet frän cirka 1% till cirka 2,5%.

Det första och/eller det andra utvecklingsmediet kan innehålla gellan- gummi. Gellangummi är ett gelningsmedel som t ex marknadsförs under namnen GELRlTE och PHYTAGEL. Om gellangummi är inkluderat i utveck- lingsmediet föreligger det vanligtvis i en koncentration av mindre än 0,5%, vanligtvis i en koncentration av från cirka 0% till cirka 0,4%. Det första och det andra utvecklingsmediet är vanligtvis ett fast medium, även om det ena av dem eller båda kan vara ett ﬂytande medium.

Det första och/eller det andra utvecklingsmediet kan innehålla en ab- sorbentkomposition, såsom aktiverat kol, vilket beskrivs här, för induktions- mediet.

Vid vissa utföringsformer inbegriper det första och/eller det andra ut- vecklingsmediet dessutom sackaros och/eller abscisinsyra. Koncentrationen av abscislnsyra i utvecklingsmediet kan vara mellan 0,5 mg/l och 500 mgll. 10 15 20 25 30 534 887 15 Vid vissa utföringsformer av förfarandena enligt uppﬁnningen är koncentratio- nen av abscisinsyra i utvecklingsmediet mellan 1 mg/I och 100 mg/I. Vid vissa utföringsforrner är koncentrationen av abscisinsyra i utvecklingsmediet mellan 5 mg/lg och 20 mg/I.

Vid vissa utföringsformer av uppﬁnningen innehåller det första och/eller det andra utvecklingsmediet sackaros som huvudsaklig eller enda kolkälla för metaboliserbart socker. Användbara sackaroskoncentrationer ligger i området av cirka 1% till cirka 6%.

Det första och det andra utvecklingsmediet kan vara flytande, fast eller halvfast. Koncentrationerna av de osmotiska medlen, såsom polyetenglykol (PEG), eller andra osmotiska medel kan vara förhöjd i det ﬂytande mediet för åstadkommande av samma osmolalitet som i det motsvarande fasta mediet.

Vanligtvis har ett fast utvecklingsmedium som är ekvivalent med ett ﬂytande utvecklingsmedium en osmolalitet som ligger inom cirka 50 mM/kg av osmo- laliteten för det ﬂytande utvecklingsmediet.

Vid vissa utföringsformer av denna aspekt av förfarandet är den första in kubationsperioden tillräckligt lång för bildning av minst en av följande struk- turer på en del (t ex minst ett embryo, minst 10% av embryona, minst 25%, minst 50%, mer än 50% eller minst 75%) av mångfalden av embryon i den första embryokulturen: ett eller ﬂera embryon med hjärtbladsförsedda primor- dier; ett eller ﬂera embryon med hjärtblad; ett eller ﬂera embryon med minst 4 hjärtblad; ett eller ﬂera embryon med distinkta hjärtblad med närvarande hy- pokotyl och rotregioner.

Den första inkubationsperioden kan vara annorlunda beroende på genotypen. Vid vissa utföringsformer är den första inkubationsperioden från minst 6 veckor till minst 8 veckor lång, såsom från 7 till 8 veckor. Den första inkubationen på det första utvecklingsmediet kan utföras vid en temperatur av från 10°C till 30°C, såsom från 15°C till 25°C, eller såsom från 20°C till 23°C.

Vid slutet av den första inkubationsperioden, t ex när närvaron av en eller ﬂera hjärtbladsförsedda primordier observeras på en del av embryona, eller efter en tidsperiod av cirka 6 veckor, inbegriper förfarandet singularise- ring av ett ﬂertal individuella embryon från den första kulturen av embryon. 10 15 20 25 30 534 88? 16 Vilket medel som helst för fysikalisk separation av individuella embryon från den första kulturen av embryon kan användas för singularisering av emb- ryona i enlighet med förfarandena enligt föreliggande uppfinning. Vad beträf- far kulturen med embryonal suspensormassa (ESM) kan t ex fysikaliska se- parationsmetoder användas, såsom borttvättning av ESM (t ex besprutnings- singularisering via tryckreglerad besprutning av vattenbaserad vätska), va- kuumeliminering av ESM, vibration eller upplockning av embryona från nämn- da ESM. Andra icke-begränsande exempel på användbara singulariserings- metoder inkluderar filtrering eller sortering av embryon baserat på en fysika- lisk egenskap, såsom storlek, form, t ex via en sikt, eller med basis på andra fysikaliska egenskaper, såsom ytråhet, hydrofobicitet, densitet eller massa.

Vid vissa utföringsformer inbegriper singulariseringssteget dessutom upplockning av individuella embryon baserat på ett eller ﬂera selektionskrite- rier. Visuellt utvärderade selektionskriterier kan t ex användas av en fackman eller ett datoriserat bildalstringssystem för urval av embryon med basis pà en eller ﬂera morfologiska egenskaper, som inkluderar, men inte är begränsade till, embryots storlek, form (t ex axiell symmetri), yttextur, färg (t ex ingen syn- bar grönfärgning), frånvaro av delade hypokotyler och avsaknad av genom- skinliga hjärtblad. Embryon kan också selekteras med basis på kriterier som är relaterade till kemi eller adsorption baserad på extern struktur, reﬂektans-, transmittans- eller emissionsspektra genom användning av nära infraröd- spektroskopi (NIR), såsom beskrivs i USA-patentansökan nr 2004/0072143 med titeln “Methods for Classification of Somatic Embryos", som härmed är införlivad genom referens. Önskvärda embryon kan plockas upp individuellt (via ett manuellt eller automatiserat förfarande) från den första embryokulturen (t ex som en emb- ryonal suspensorrnassa) med hjälp av vilket instrument som helst, såsom en pincett. Upplockningen av embryon kan utföras manuellt eller via ett automati- serat förfarande, såsom beskrivs i USA-patentansökan nr 2004/0267457 med titeln ”Automated System and Method for Harvesting and Multi-Stage Scree- ning of Plant Embryos", som härmed är införlivad genom referens.

Vid vissa utföringsformer av förfarandet läggs de upplockade embryo- na ut direkt på ytan av ett andra utvecklingsmedium eller på ett poröst sub- 10 15 20 25 30 534 BB? 17 strat som står i kontakt med ett andra utvecklingsmedium, vilket kan föreligga i fast eller ﬂytande form.

Ett poröst substrat som är användbart vid utövandet av olika utförings- former av förfarandena enligt uppﬁnningen har vanligtvis en pordiameter i om- rådet från cirka 5 pm till cirka 1200 pm, såsom från cirka 50 till 500 pm, så- som från cirka 70 till cirka 150 pm, såsom cirka 100 pm. Det porösa materia- let är vanligtvis plant och kan ha vilken önskvärd form eller dimension som helst som är vald för att förenkla hanteringen och för åstadkommande av kon- takt med det andra utvecklingsmediet. Exempel på porösa material inkluderar material som är steriliserbara och tillräckligt starka för att motstå brott när ma- terialen lyfts i syfte att överföra singulariserade embryon till efterföljande ske- den av förfarandet för produktion av somatiska embryon, såsom stratifiering.

Exempel på användbara porösa material inkluderar, dock utan begränsning därtill, membraner, nylonfibrer, ﬁberduk (t ex nylon, rostfritt stål eller plast) och polymerfibrer.

Vid vissa utföringsformer överförs de singulariserade embryona till ett andra utvecklingsmedium eller ett poröst substrat som ståri kontakt med ett andra utvecklingsmedium på så sätt att de singulariserade embryona inte står i fysisk kontakt med varandra.

I enlighet med förfarandena enligt föreliggande uppﬁnning bringas de singulariserade omogna embryona efter singulariseringen i kontakt med ett andra utvecklingsmedium under en andra inkubationsperiod. Vid vissa ut- föringsformer är den andra inkubationsperioden tillräckligt lång för att åtmins- tone en del (t ex minst ett embryo, minst 10% av embryona, minst 25%, minst 50%, mer än 50% eller minst 75%) av mångfalden av singulariserade emb- ryon ska uppnå anatomisk mognad (dvs ha utvecklade hjärtblad respektive hypokotyl), såsom beskrivs ovan med hänvisning till FIGUR 1.

Den andra inkubationsperioden kan vara annorlunda beroende på genotypen. Vid vissa utföringsformer är den andra inkubationsperioden minst 3 veckor lång, såsom 3 veckor till 5 veckor. Vid vissa utföringsformer inkube- ras embryona under en total tidsperiod (inkluderande den första inkubations- perioden och den andra inkubationsperioden) av minst 12 veckor på utveck- lingsmediet. Den andra inkubationen på det andra utvecklingsmediet kan 10 15 20 25 30 534 887 18 utföras vid en temperatur av från 10°C till 30°C, såsom från 15°C till 25°C, eller såsom från 20°C till 23°C.

I enlighet med denna aspekt av förfarandena enligt uppﬁnningen strati- fieras därefter de singulariserade embryona efter inkubation i eller på det andra utvecklingsmediet genom steget att underkasta dem en temperatur av fràn 0°C till 10°C under en tredje inkubationsperiod av minst 1 vecka.

Vid en utföringsform underkastas hjärtbladsförsedda somatiska tall- embryon i eller på utvecklingsmediet inbegripande en osmolalitet av minst 300 mM/kg upp till 450 mM/kg en temperatur av från 0°C till 10°C under en tredje inkubationsperiod av minst 1 vecka upp till 8 veckor (t ex från 1 vecka till 8 veckor, såsom från 4 veckor till 6 veckor), för framställning av stratifiera- de hjärtbladsförsedda somatiska embryon. Vid en annan utföringsforrn under- kastas hjärtbladsförsedda somatiska tallembryon i eller på utvecklingsmediet inbegripande en osmolalitet av minst 300 mM/kg upp till 450 mM/kg en tem- peratur av från 0°C till 10°C under en tredje inkubationsperiod av minst 2 må- nader upp till 6 månader (t ex minst 2 månader, minst 3 månader, minst 4 månader, minst 5 månader och upp till 6 månader) för framställning av strati- fierade hjärtbladsförsedda somatiska embryon som lagras före groning. Den tredje inkubationsperioden förlöper vanligtvis i mörker vid en temperatur av från 1°C till 6°C, såsom från 1°C till 4°C.

Vid en utföringsform av förfarandet enligt uppfinningen är den initiala osmolaliteten för utvecklingsmediet vid starten av den andra inkubationsperio- den enligt steg (a) minst 300 mM/kg och upprätthålls på en nivå av minst 200 mM/kg under den tredje inkubationsperioden enligt steg (c).

Förfarandena i de olika aspekterna av uppﬁnningen inkluderar vart och ett steget av inkubation av en kultur inbegripande omogna somatiska barr- trädsembryon i ett utvecklingsmedium med en osmolalitet i området från 300 mM/kg till 450 mM/kg under en första inkubationsperiod, följt av steget att underkasta embryona i odlingskärlet en temperatur av från 0°C till 10°C under minst 1 vecka för framställning av stratiﬁerade embryon. Förfarandena enligt uppﬁnningen kan tex användas för framställning av kloner av individuella tall- träd med en eller flera önskvärda egenskaper, såsom hög tillväxthastighet. l en aspekt tillhandahålls med föreliggande uppﬁnning förfaranden för fram- 10 15 20 25 534 887 19 ställning av en population av genetiskt identiska somatiska tallembryon. Det här använda uttrycket "genetiskt identiska somatiska tallembryon" hänför sig till embryon som är härledda från samma ursprungsplanta. Uttrycket inklude- rar somatiska tallembryon innehållande ett litet antal mutationer som kan ske under utvecklingen av somatiska embryon. Vilket som helst av de här beskriv- na förfarandena kan användas för framställning av populationer av genetiskt identiska somatiska hjärtbladsförsedda tallembryon.

Följande exempel illustrerar enbart det för närvarande bästa sättet att utöva uppfinningen, men bör inte tolkas som begränsande för uppﬁnningen.

EXEMPEL 1 l detta exempel beskrivs ett förfarande för framställning av somatiska tallembryon med utgångspunkt från sydstatsgultall genom användning av ett utvecklingsmedium (BM3) och ett stratiﬁeringsmedium (BM4).

Metoder: Hongametofyter innehållande zygotiska embryon avlägsnas från frön 4 veckor till 5 veckor efter befruktning. Fröhöljena avlägsnas, men embryona dissekeras inte ut ytterligare från den omgivande gametofyten mer än att den nucellära änden skärs bort. De konformiga produktema ("cones“) förvaras vid 4°C fram till användning. Omedelbart före avlägsnande av de omogna emb- ryona sterliseras fröna genom användning av en initial tvättnings- och deter- gensbehandling, följt av sterilisering under tio minuter i 15% H2O2. Explanta- ten tvättas noggrant med sterilt destillerat vatten efter varje behandling. l tabell 1 och 2 beskrivs sammansättningama av medier som är an- vändbara för framställning av somatiska tallembryon. 534 887 20 TABELL1 Basalt medium (BM) för Pinus taeda Bestàndsdel Koncentration (mg/l) NH4NO3 150,0 KNOf, 909,9 KH2PO4 136,1 Ca(NO3)2~4-H2O 236,2 CaCIZ-4HZO 50,0 MgSO4-7H2O 246,5 Mg(NO3)2-6H2O 256,5 MQCMÖHZÛ 50,0 Kl 4,15 H3BO3 15,5 MnSO4-H2O 10,5 ZnSO4-7H2O 14,4 NaMoO4-2H2O 0,125 CuSO4-5H2O 0,125 CoC|2-6H20 0,125 FeSO4-7H2O 27,86 NazEDTA 37,36 Maltos 30 000 Myoinositol 200 Kasaminosyror 500 L-glutamin 1000 Tiamin-HCI 1,00 Pyridoxin-HCI 0,50 Nikotinsyra 0,50 Glycin 2,00 Gelrite 1600 gH-justerat till 5,7 + Används om ett fast medium är önskvärt TABELL2 BMZ-underhàllsmedium ßMg-utvecklingsmedium Sammansättnins av medier för olika behandlingm BM1-induktionsmedium BM + 2,4-D (15 (JM) + kinetin (2 pM) + BAP (2 UM).

BM + 2,4-D (5 uM) + kinetin (0,5 uM) + BAP (0,5 uM), Gelrite (1600 mg/I) tillsätts när ett fast medium är önskvärt.

BM + 25 mg/I abscislnsyra + 10% PEG-8000 + 0,01% myo- inositol, + 0,1% aktivt kol + 1% glukos, + 2,5% maltos.

Följande aminosyrablandning tillsätts: L-prolin (100 mg/I), L-asparagin (100 mg/I), L-arginin (50 mg/I), L-alanin (20 mgll) och L-serin (20 mg/I). Gelrite (2500 mgll) tillsätts när ett fast medium är önskvärt. 10 15 20 25 534 88? 21 Osmolalitet = 365 mM/kg BM4-stratifieringsmedium BM3 modiﬁerat genom uteslutning av abscisinsyra och ute- slutning av PEG-8000. Gelrite (2500 mg/I) tillsätts när ett fast medium är önskvärt.

Osmolalitet = 120 mM/kg BM5-groningsmedium BM modifierat genom ersättning av maltos med 2% sacka- ros. Myoinositol reduceras till 100 mgll, glutamin och kas- aminosyror reduceras till 0,0 mg/I, FeSO4-7H2O reduceras till 13,9 mg/I och NaZEDTA reduceras till 18,6 mg/I. Gelrite ersätts med 8 g/låagar, och 0,25% aktivt kol tillsätts.

Induktion: Sterila gametofyter med intakta embryon placeras på fast ßMi-odlingsmedium och förvaras i en miljö av 22-25°C med en mörk foto- period av 24 timmar under en tidsperiod av 3-5 veckor. Tidsperiodens längd beror på den särskilda genotyp som odlas. I slutet av denna tidsperiod bildas en vit slemartad massa i association med ursprungsexplantaten. En mikro- skopisk undersökning avslöjar vanligtvis ett ﬂertal embryon i ett tidigt skede associerade med massan. Dessa kännetecknas i allmänhet som att ha en tunnväggig suspensor associerad med ett litet huvud med tät cytoplasma och stora kämor.

Osmolaliteten för induktionsmedlet kan i vissa fall vara så hög som 150 mM/kg och är vanligtvis cirka 120 mM/kg eller t o m lägre (såsom 110 mM/kg).

Underhåll och förökning: Embryon i ett tidigt skede som avlägsnas fràn massorna som bildats vid induktionssteget placeras först på ett gelat BMZ- underhàlls- och -förökningsmedium. Detta skiljer sig från induktionsmedlet i det att tillväxthormonema (både auxiner och cytokininer) reducerats med ät- minstone en hel storleksordning. Osmolaliteten för detta medium är 120 mM/kg eller högre (vanligtvis inom ett område av cirka 120-150 mM/kg för Pinus taeda). Temperaturen och fotoperioden var även här 22-25°C med 24 timmar i mörker. Embryona odlas under 12-14 dagar på det fasta BMQ-mediet före överföring till ett ﬂytande medium för ytterligare subodling. Detta ﬂytande medium har samma sammansättning som BM2, men saknar gelningsmediet.

Embryona är i slutet av underhållssteget på fast medium vanligtvis till utseen- det likartade de från induktionssteget. Efter 5-6 subodlingar per vecka pà det 10 15 20 25 30 534 B87 22 ﬂytande underhållsmediet har avancerade embryon i ett tidigt skede bildats.

Dessa kännetecknas av jämna embryonala huvuden och uppskattades till att vanligtvis ha mer än 100 individuella celler med multipla suspensorer.

Embgoutveckling: Omogna embryon i ett tidigt skede överförs från underhållsmediet till ett fast utvecklingsmedium. Utvecklingsmediet antingen saknar hormoner helt och hållet eller har sådana närvarande i endast mycket låga halter. Abscisinsyra inkluderas vanligtvis för underlättande av ytterligare utveckling. Den ytterligare inklusionen av adsorbentkomposition i detta me- dium är fördelaktig. Absorbentkompositionen kan väljas från ett antal kemiska material med stor ytarea och/eller reglerad porstorlek, såsom aktivt kol, lösli- ga och olösliga former av poly(vinylpyrrolidon), aktiverad aluminiumoxid och silikagel. Adsorbentkompositionen är vanligtvis närvarande i en koncentration av cirka 0,1-5 g/l, närmare bestämt cirka 0,25-2,5 g/l. Gellangummi kan vara inkluderat i en koncentration av cirka 0,25%.

Den osmotiska potentialen för utvecklingsmediet kan ökas till betydligt över den för underhållsmediet. Det har visat sig vara fördelaktigt att ha en så hög osmolalitet som 360 mM/kg eller högre (t ex upp till 450 mM/kg). Utveck- lingen sker företrädesvis i fullständigt mörker vid en temperatur av 22-25°C tills hjärtbladsförsedda embryon har utvecklats (dvs uppnått anatomisk mog- nad) Mognad och stratiﬁering: Efter 7-12 veckor på ßMg-utvecklingsmedium singulariseras hjärtblads- försedda embryon och överförs till en filterpapperbärare på ett BM4-stratifie- ringsmedium. BM4-stratifieringsmediet är likartat BM3-utvecklingsmediet, men saknar abscisinsyra, PEG-8000 och gellangummi. Osmolaliteten för stratifie- ringsmediet utan PEG är vanligtvis under 150 mM/kg, såsom cirka 120 mM/kg. Embryon odlas på stratifieringsmediet vid mellan 1°C och 10°C i mörker under mellan 1 vecka och 8 veckor, såsom mellan 2 veckor och 6 veckor.

Torkning: De mogna embryona, som fortfarande beﬁnner sig på ﬁlter- papperbäraren, lyfts upp från dynan och placeras i en tillsluten behållare över vatten vid en relativ luftfuktighet av 97-99% under en period av cirka 3 veckor. 10 15 20 25 30 534 887 23 Groning: De torkade mogna embryona återhydratiseras genom place- ring av dem, medan de fortfarande beﬁnner sig på filterpapperbäraren, under cirka 24 timmar på en dyna som är mättad med ﬂytande groningsmedium.

Embryona placeras därefter individuellt på fast BMs-medium för groning. Det- ta är ett basalt medium som saknar tillväxthormoner och som har modifierats genom reduktion av sackaros, myoinositol och organiskt kväve. Embryona inkuberas på BM5-medium under cirka 10 veckor vid omgivande betingelser av 23-25°C och en fotoperiod av 16 timmar i ljus och 8 timmar i mörker tills de resulterande småplantorna har ett välutvecklat rotämne och en dito hypokotyl samt en grön hjärtbladsförsedd struktur och epikotyl.

På grund av den reducerade kolhydratkoncentrationen reduceras gro- ningsmediets osmotiska potential ytterligare till under den för utvecklings- mediet. Den är vanligtvis lägre än cirka 150 mM/kg (såsom cirka 100 mM/kg).

EXEMPEL 2 I detta exempel visas att inkubation av omogna embryofrön från syd- statsgultall (Pinus taeda) på ett utvecklingsmedium (+10% PEG) med en osmolalitet av 365 mM/kg, följt av stratifiering medan de fortfarande befinner sig på samma utvecklingsmedium, förbättrar embryoutbytet och ger fram- gàngsrik groning jämfört med inkubation av embryon på utvecklingsmedium med en osmolalitet av 365 mM/kg, följt av stratiﬁering på ett stratifierings- medium (0,0% PEG) med en osmolalitet av mindre än 150 mM/kg.

Metoder: Hongametofyter innehållande zygotiska embryon avlägsnades från fröer av sju olika genotyper enligt de metoder som beskrivs i EXEMPEL 1. ln- duktions- och underhållsstegen utfördes såsom beskrivs i EXEMPEL 1, och förråd av embryonala suspensormass(ESM)kulturer frystes. utvinnirgaviSM-kulturer från krvoförvamq: En ﬂaska av varje genotyp upptinades på filterpapper över BM2-under- hållsmedium. När väl ESM hos kulturema hade vuxit tillräckligt för bildning av en upphöjning av cirka 1 cm i bredd och 0,4 cm i höjd, uppsamlades ESM från filterpappret och befriades från kallus. Detta överföringsförfarande fort- satte under en 14-dagarscykel tills 1-4 upphöjningar av ESM med en bredd av cirka 1 cm och en höjd av 0,4 cm uppsamlades för varje genotyp. 10 15 20 25 534 88? 24 Underhåll och förökning Cirka 7 veckor efter utvinningen av ESM från frusna förrådskulturer fylldes ESM-kulturerna i en kolv av 500 ml innehållande 100 ml underhålls- medium i ett förhållande av 1:5.

Utveckling: ESM-kulturen ströks ut på ett nylonmembran över 600 ml halvfast BM3- utvecklingsmedium (+10% PEG, osmolalitet = 365 mM/kg) i Cambro-boxar med halverad storlek (grunda) (ett djup av 5,08 cm (2 tum)), vilket resulterade i ett mediumdjup av cirka 1,27 cm (% tum). Totalt 24 ml celler ströks ut för varje genotyp på två Cambro-boxar med halverad storlek. Varje ram (”frame”) i en Cambro-box innehöll 6 ml celler, vilket gav totalt 12 ml celler per box i en konfiguration av tolv droppar. Cellerna dispenserades som 12 droppar av 0,5 ml vardera per ram. Efter utstrykning placerades Cambro-boxama i mörker vid rumstemperatur under en utvecklingsperiod av 12 veckor. Efter utveck- lingsperioden testades följande stratiﬁeringsbehandlingar, såsom beskrivs i TABELL 3.

Stratiﬁering: Efter inkubation under 12 veckor på ßMg-utvecklingsmedium överför- des embryona från behandlingsgrupperna 1 och 8 till en dyna över 320 ml BM4-stratifieringsmedium (0,0% PEG, osmolalitet = 120 mM/kg) i Cambro- boxar med halverad storlek. Embryona i behandlingsgrupp 14 upprätthölls på ßMa-utvecklingsmedium under stratiﬁeringen. Stratiﬁeringen av samtliga behandlingsgrupper utfördes under 4 veckor vid 4°C till 7°C. 10 15 20 534 88? 25 TABELL 3: BESKRIVNING AV BEHANDLINGSBETINGELSER EFTER UTVECKLING _ antal Behandhngs- Beskrivning av behandling testade referensnr kloner 1 (kontroll) lnkubation under 12 veckor i BM-yutvecklingsmedium vid rums- 61 temperatur, stratifiering i BM4-stratifieringsmedium under 1 må- nad, COW under 1 veckaﬁoningﬂider 5 veckor. 8 lnkubation under 12 veckori ßMa-utvecklingsmedium vid rums- 30 temperatur, förvaring under 3 månader i mörker vid 4-8°C, stratifiering i BM4-stratifieringsmedium under 1 månad, COW under 1 vecka. groning under 5 veckor. 14 lnkubation under 12 veckor i ßMs-utvecklingsmedium vid rums- 15 temperatur, efter utveckling förvarades Cambro-boxar i mörker vid 4°C till 8°C under 3 månader i ßMg-utvecklingsmedium (ingen mediumförändring), COW under 1 vecka, groning under 5 veckor. ïitionering över vatten (COW) och singularisering: Efter stratiﬁering singulariserades embryona med hjälp av separation medelst besprutning och placerades därefter i en miljö med 98% relativ luft- fuktighet och konditionerades över vatten vid rumstemperatur under 1 vecka i COW-boxar.

Groning: Efter konditionering över vatten överfördes 75 embryon från varje be- handlingsgrupp (per genotyp) för hand till BMS-groningsmedium (150 ml me- dium dispenserat per Cambro-box). Dessa embryon placerades ovanpå gro- ningsmediet, men planterades inte. 25 embryon placerades i varje box, vilket resulterade i 3 groningsboxar per behandlingsgrupp per genotyp. Eventuella kvarvarande embryon räknades för bestämning av totala embryoutbytet.

Embryon selekterades visuellt med avseende på groning genom an- vändning av följande kriterier: tre eller ﬂera synliga hjärtblad; jämnt embryo (ingen kallusbi|dning); embryot är elfenbensfärgat, gult eller grönt och är opakt; embryon som smält samman selekterades inte; embryon med breda utplattade hypokotyler selekterades inte; làngsträckta embryon accepterades.

Efter manuell embryoöverföring till groningsboxar innehållande gro- ningsmedium placerades boxarna vid 1°C till 2°C under 3 månader. Gro- 10 15 20 25 534 887 26 ningsboxarna förﬂyttades därefter till rumstemperatur i mörker under 7 dagar och placerades därefteri ett ljust rum för fortsatt groning. Efter 8 veckors in- kubation på groningsmediet övervakades groddplantorna för bestämning av huruvida de var färdiga för förﬂyttning till växthuset. Groddplantor från be- handlingsgrupp 1 (kontroll) skördades när majoriteten uppfyllde selektionskri- teriema. Alla efterföljande försöksgrupper skördades under användning av kontrollgroningsperioden för varje individuell genotypklon.

Resultat: Jämförelse mellan Behandling 1 (kontroll) och Behandling 14 l försöken jämförs fortsatt inkubatlon av embryon pà utvecklings- medium under stratifiering (uteslutning av användning av stratiﬁerings- medium) (behandling 14) med kontrollbehandlingen 1, vid vilken embryon in- kuberades pä utvecklingsmedium och överfördes till stratiﬁeringsmedium före stratifiering. Såsom visas nedan i TABELL 4 gav behandling 14 embryon med en högre groningsfrekvens samt groddplantor med förbättrad växtkraft jämfört med embryon som framställts vid behandling 1.

TABELL 4: UPPSKATTAD GENOMSNITTLIG GRONINGSFREKVENS OCH KONFIDENSINTERVALL FÖR BEHANDLING 1 OCH 14 LN=15 GENOTYPER) Uppskattad genom Lägre gräns för Övre gräns för Behandling snitmg groningsfrekvens 90% konﬁdens- 90% konfidens- intervall (CI) intervall (Cl) 1 íkontroll) 0,335 0,280 0,395 14 (stratiﬁering på ut- 0,373 0,316 0,434 vecklingsmedium vid kall förvaringL Såsom visas ovan i TABELL 4 hade embryon fràn behandlingsgrupp 14 något högre groningsfrekvens (37%) än kontrollbehandling 1 (34°/°), även om den observerade skillnaden inte var statistiskt signifikant (p=0,42). 10 15 20 25 534 887 27 TABELL s; uPPskAwAo GENoMsNmLiG övERLEvNAo ocH koN- F|oENs|NTERvALLER FÖR BEHANDLWGARNA 1 ocH 14 @=1s GENOTYPER¿ Uppskattad genom_ Lägre gräns för Övre gräns för Behandling snimig överlevnad 90% konfidens- 90% konfidens- intervall (Cl) |nterva|| (Cl) 1 0,756 0,690 0,812 14 0,748 0,686 0,802 Såsom visas i TABELL 5 hade groddplantor som bildats genom an- vändning av behandling 14 en något lägre överlevnad än behandling 1 (kontroll) (75% jämfört med 76%), men skillnaden var inte statistiskt signiﬁ- kant (p=0,87).

En förbättring i groddplantväxtkraft observerades för behandling 14. 13 av de 15 genotyperna som var inkluderade i behandlingsgrupp 14 observe- rades ha mer kraftfull epikotyl, längre rötter, eller bàdadera, än embryon frán behandlingsgrupp 1. Även om organlängderna inte mättes vid detta försök, togs fotografier av groddplantorna i varje behandlingsgrupp före överföring. I FIGUR 2 visas en uppsättning av fotografier av groddplantor som framställts vid betingelsema för behandlingsgrupp 1 (kontroll) (FIGURERNA 2A-2C) eller som framställts vid betingelserna för behandlingsgrupp 14 (FIGURERNA 2D- 2F). Såsom visas i FIGUR 2 erhölls en förbättring av växtkraften för grodd- plantorna genom användning av betingelsema för behandlingsgrupp 14 (FIGURERNA 2D-F)jämfört med behandlingsgrupp 1 (kontroll) (FIGURERNA zA-c). i Jämförelse mellan behandlingama 1, 8 och 14 Vid denna analys jämfördes resultaten för genotyper som var gemen- samma vid behandlingarna 1, 8 och 14 i syfta att bestämma om överföring av embryon till stratifieringsmedium efter inkubation och eventuell förvaring i ut- vecklingsmedium var skadlig för embryonas groning. Groningsfrekvens- resultaten visas i TABELL 6. 10 15 20 25 534 887 28 TABELL 6: GENOMSNITTLIG GRONINGSFREKVENS OCH KONFIDENS- INTERVALLER FÖR BEHANDLINGARNA 1, 8 OCH 14 (N=7 eENoTvPEFï Lä re gräns för Övre gräns för Behandling snïtzzsgfåaigggsïëïrvnèns Qllä: konfidens- 90% konfidens- intervall intervall 1 (kontroll) 0,396 0,315 0,484 8 0,180 0,125 0,254 14 0,403 0,321 0,491 Skillnaden i gronlngssekvenser bland kontrollerna och behandlingarna som visas i TABELL 6 är statistiskt signiﬁkant (p=0,0005). Vid en direkt jäm- förelse mellan behandlingarna 8 och 14 erhålls betydligt lägre värden vid be- handling 8 jämfört med behandling 14 (p=0,0008) och kontrollen (p=0,0011).

Embryona fràn behandling 8 observerades dessutom vara missformade efter separation med hjälp av besprutning (data ej visade).

Sammanfattning och slutsats: Dessa resultat visar att fortsatt inkuba- tion av embryon pà utvecklingsmedium (10% PEG, osmolalitet = 365 mM/kg) under stratiﬁering (uteslutning av användning av stratiﬁeringsmedium) (be- handlingsgrupp 14) ger embryon med en högre groningssekvens och grodd- plantor med förbättrad livskraft jämfört med embryona som framställts med ut- gàngspunkt fran behandlingsgrupp 1 och behandlingsgrupp 8, där embryon inkuberades på utvecklingsmedium (10% PEG, osmolalitet = 365 mM/kg), och överfördes till stratifieringsmedium (0,0% PEG, osmolalitet = 120 mM/kg) före stratiﬁering. Såsom visas i FIGUR 2 observerades dessutom en förbätt- ring i groddplantornas växtkraft i favör för behandling 14, där tretton av de femton genotyperna som var inkluderade i behandlingsgrupp 14 observera- des ha mer kraftfull epikotyl, längre rötter, eller bàdadera, än embryona fràn behandlingsgrupp 1.

EXEMPEL 3 I detta exempel visas att uteslutning av medieutbytessteget mellan ut- veckling och stratifiering ger embryon med ökad groningssekvens. 10 15 20 534 B87 29 Metoder: Hongametofyter innehållande zygotiska embryon avlägsnades från fröer från fyra olika genotyper enligt de metoder som beskrivs i EXEMPEL 1. lnduktions-, underhàlls- och utvecklingsstegen utfördes såsom beskrivits i EXEMPEL 1. i TABELL 7 beskrivs försöksbehandlingsbetingelserna efter utveckling.

TABELL 72 BEHANDLINGSBETINGELSER EFTER UTVECKLING Behandlingsreferensnr Beskrivning 1 (kontroll) 12 veckors inkubation på modiﬁerat BM3-utvecklingsmedium (10% PEG, osmolalitet = 336 mM/kg), stratiﬁering pà BM.,- stratiﬁerlngsmedium (0% PEG, osmolalitet = 120 mM/kg) under 4 veckor 2 12 veckors inkubation pà modifierat BMQ-utvecklingsmedium (10% PEG, osmolalitet = 336 mM/kg), stratiﬁering pà BM4- stratifieringsmedium (0% PEG, osmolalitet = 120 mM/kg) under 8 veckor 3 12 veckors inkubation på modifierat BM3-utvecklingsmedium (10% PEG, osmolalitet = 336 mM/kg), och efter utveckling förvarades Cambro-boxar i mörker vid 4°C under 4 veckor pá samma utvecklingsmedium (irLqet mediumutbyte) 4 samma som för behandling 3 med 8 veckors förvaring på utvecklingsmedium vid 4°C Efter de i TABELL 7 ovan visade stratiﬁeringsbehandlingarna bespruta- des embryona på d-ramarna separat på 3 s-ramar (fullständiga Cambro- boxar) per genotyp/behandling. Två groningsboxar av 25 embryon vardera valdes ut från varje s-ram. Totalt 6 groningsboxar ästadkoms per genotyp/ behandling. Embryona placerades på groningsmediet och planterades inte ut i mediet. Groddplantorna bedömdes efter inkubation under 6 veckor pà gro- ningsmedium. Rotlängden mättes också för samtliga plantor enligt kategori 1.

En groddplanta enligt kategori 1 inkluderar följande egenskaper: när- varo av en 1 mm làng rot (inga outvecklade stumpar (”nubbins")), närvaro av cirka 5 epikotylblad med en ungefärlig längd av 5 mm, inga storskaliga hypo- kotylrupturer och en hypokotyl som inte är böjd mer än 90 grader. 10 15 20 25 534 88? 30 En groddplanta (bipolär) av kategori 1 + 2 inkluderar följande egen- skaper: närvaro av en 1 mm lång rot (inga outvecklade stumpar) och närvaro av epikotylblad (ingen storlek eller inget antal) som är synliga för ögat.

Statistisk analys: 4 behandlingar utfördes, en fullständig fakultet (”factorial") inbegrep 2 stratiﬁeringsmedier (standard- och gammalt utvecklingsmedium) gånger två varaktigheter (4 veckor och 8 veckor). De olika medierna applicerades på full- plottförsöksenheter, och varaktigheten av inkubationen applicerades på de uppdelade plottarna. Resultaten bedömdes med avseende på gronings- frekvens (kategori 1 och kategori 1 + kategori 2) och rotlängd. Rotlängden analyserades med hjälp av en blandmodell efter åstadkommande av en om- vandling med hjälp av en naturlig logaritm för stabilisering av variansen.

Groddplantor av kategori 1 och kategori 1 + kategori 2 analyserades genom användning av en generaliserad linjär blandmodell.

Groningsfrekvensresultaten för kategori 1 visas nedan i TABELL 8.

TABELL 8: GENOMSNITTLIG GRONINGSFREKVENS FÖR KATEGORI 1 (SAMTLIGA GENOTYPER INKLUDERADE) Genomsnittlig Lägre gräns för Övre gräns för Behandling _ 90% konﬁdens- 90% konfidens- 9'°"'"9sf'°'°'°"s intervall (cl) intervall (cl) 1 (kontroll) 0,083 0,046 0,143 2 0,064 0,036 0,113 3 0,098 0,056 0,167 4 0,104 0,059 0,176 Såsom visas i TABELL 8 var groningsfrekvensen för groddplantorna enligt Kategori 1 högre vid behandlingarna 3 och 4, där embryon upprätthölls på utvecklingsmedium under stratifieringssteget (dvs inkubation vid 4°C).

Resultaten för den totala bipolära groningsfrekvensen (kategori 1 + kategori 2) visas nedan i TABELL 9. 10 15 534 88? 31 TABELL 9: MEDELVÄRDE FÖR TOTAL BIPOLÄR GRONING (KATEGORI 1 + KATEGORI 2) (SAMTLIGA GENOTYPER INKLUDERADE) Behandling Genomsnittlig Lägre gräns för Övre gräns för groningsfrekvens 90% Cl 90% Cl 1 (kontroß 0,300 0,202 0,422 2 0,296 0,199 0,417 3 0,243 0,147 0,374 4 0,205 0,122 0,325 Medelvärdet för groningsfrekvensen för kategori 1 eller för det bipolära provet (kategori 1 + kategori 2) för var och en av de fyra testade genotypema varierade endast med cirka 10-20% (data ej visad).

Resultaten för mätningarna av genomsnittliga rotlängden visas i TA- BELL 10.

TABELL 10: GENOMSNITTLIG ROTLÄNGD (SAMTLIGA GENOTYPER INKLUDERAD§ _ Medelvärde (mm) Lägre gräns för Övre gräns för Behandhng 90% oi 90% cr 1 (kontroll) 13,5 10,3 17,7 2 19,0 14,5 24,8 3 12,8 9,8 16,8 4 17,4 13,3 22,8 TABELL 11: JÄMFÖRELSE AV FÖRSÖKSRESULTAT FRÅN 3 MODELLER Kategori 1 Bipolära groddplantor Roﬂän d variabel Groddplantor (kategori 1 + kategori 2) P vårdge P-värde P-värde Medium för stratifiering (strati- , ﬁeringsmedium jämfört med (avvikelsen 0,42 0,40 , _ ar battre) utvecklingsmedium) _ .. <0.01 varaktighet (4 veckor jamfort __ __ __ 0,30 0,09 (4 veckor ar battre) (8 veckor ar med 8 veckor) bättre) Medium * varaktighet 0,10 0,16 0,85 P-värden <0,10 indikerar ett signiﬁkant resultat Sammanfattning av resultat: Med avseende på groning enligt kategori 1 observerades en statistiskt signiﬁkant skillnad (p=0,07) i groningsfrekven- serna för embryon som upprätthölls på utvecklingsmedium (modifierat BM3, 10 15 20 25 30 534 B87 32 10% PEG, osmolalitet = 336 mM/kg) under stratiﬁeringssteget (dvs inkubation vid 4°C), såsom visas i TABELL 8. Vad beträffar varaktigheten drog embryon som stratiﬁerats på utvecklingsmedium (modifierat BM3, 10% PEG, osmolali- tet = 336 mM/kg) nytta av ytterligare 4 veckors inkubation, till skillnad från de på stratiﬁeringsmedium (BM4, 0,0% PEG, osmolalitet = 120 mM/kg). De över lag låga observerade värdena för groning kan ökas genom användning av tidig singularisering under utveckling, följt av upprätthållande av embryona på utvecklingsmedium efter singularisering under stratiﬁeringsperioden.

Sammanfattningsvis indikerar dessa resultat att utförande av strati- fieringssteget på det ursprungliga utvecklingsmediet (dvs uteslutning av ste- get av överföring av embryon till stratifieringsmedium) är fördelaktig för er- hållande av embryon med mer kraftfull groning enligt kategori 1. Detta är ett signifikant resultat, eftersom uteslutandet av överföringen till stratifierings- medium möjliggör utveckling, förvaring och stratiﬁering på samma utveck- lingsmedium, vilket gör förfarandet mycket mer effektivt. Uteslutandet av embryoöverföring från utvecklingsmediet till stratifieringsmediet reducerar t ex arbetsbelastningen, beredningen av stratiﬁeringsmedium och beredningen av ytterligare Cambro-boxar.

EXEMPEL 4 l detta exempel mäts effekten av mediumvolym och mediumdjup under utvecklings- och stratifieringsbehandling på groningsfrekvenser för somatiska embryon.

Metoder: Hongametofyter innehållande zygotiska embryon avlägsnades från frön hos fyra olika genotyper enligt de metoder som beskrivs i EXEMPEL 1. lnduktions- och underhållsstegen utfördes såsom beskrivs i EXEMPEL 1, med undantag av att ESM spreds över trådnätet på utvecklingsramen istället för att den ströks ut via droppar.

Utvecklings- och stratiﬁeringsstegen utfördes såsom visas i TABELL 12. Samtliga embryon i detta försök inkuberades på utvecklingsmedium med en initial osmolalitet av 336 mM/kg (10% PEG) under 12 veckor, följt av strati- fiering, såsom visas i TABELL 12, under 4 veckor. 534 88? 33 TABELL 122 UTVECKLINGS- OCH STRATIFIERINGSBEHANDLINGAR I Medium_ Djup av Överföring mellan _ I I Behandling Volym Cam bro- utvecklmgs- och Stratiﬁering v|d 4°C behållare stratiﬁeﬂgsmedium? 1 (kontroll) 600 ml grund (5,08 ja stratiﬁeringsmedium (BM4, cm (2 tum)) 0,0% PEG, osmolalitet = 120 mM/kL 2 900 ml grund (5,08 ja stratiﬁeringsmedium (BM4, cm (2 tum)) 0,0% PEG, osmolalitet = 120 mM/kgï 3 1200 ml grund (5,08 ja stratiﬁeringsmedium (BM4, cm (2 tum)) 0,0% PEG, osmolalitet = 120 mM/kk 4 (kontroll) 600 ml djup (10,16 ja stratiﬁeringsmedium (BM4, cm (4 tum)) 0,0% PEG, osmolalitet = 120 mM/kg 5 900 ml djup (10,16 ja stratiﬁeringsmedium (BM4, cm (4 tum)) 0,0% PEG, osmolalitet = 120 mM/kg 6 1200 ml djup (10,16 ja stratifieringsmedium (BM4, cm (4 tum)) 0,0% PEG, osmolalitet = 120 mM/kg 7 600 ml grund (5,08 nej utvecklingsmedium (modi- cm (2 tum)) fierat BM3 10% PEG, osmolalitet = 336 mM/kg__ 8 900 ml grund (5,08 nej utvecklingsmedium (modi- cm (2 tum)) fierat BM; 10% PEG, osmolalitet = 336 mM/kg_ 9 1200 ml grund (5,08 nej utvecklingsmedium (modi- cm (2 tum)) fierat BM; 10% PEG, osmolalitet = 336 mM/kg_ 10 600 ml djup (10,16 nej utvecklingsmedium (modi- cm (4 tum)) fierad BM3 10% PEG, osmolalitet = 336 mM/kg__ 11 900 ml djup (10,16 nej utvecklingsmedium (modi- cm (4 tum)) fierat BM3 10% PEG, osmolalitet = 336 mM/kg__ 12 1200 ml djup (10,16 nej utvecklingsmedium (modi- cm (4 tum)) ﬁerat BM; 10% PEG, osmolalitet = 336 mM/kg_ Efter utveckling ﬁck samtliga behandlingsgrupper gro, såsom beskrivs nedan. 10 15 20 25 534 88? 34 Stratiﬁering: Såsom visas i TABELL 12 förﬂyttades vid behandlingarna 1-6 embryon som strukits ut på en D-ram till stratifieringsmedium (BM4, 0,0% PEG, osmolalitet = 120 mM/kg). För behandlingarna 7-12 förblev embryon som strukits ut på en D-ram på ett utvecklingsmedium (modifierat BM3, 10% PEG, osmolalitet = 336 mM/kg) på samma utvecklingsmedium under stratiﬁe- ring.

Totalutbytet av embryon per behandling bestämdes efter 12 veckors inkubation pà utvecklingsmedium. Konditionering över vatten (COW) utfördes i en stor Cambro-box med dimensionen 1x1 under 1 vecka.

Gröning: 100 embryon per behandling överfördes manuellt till gro- ningsboxar. Embryoselektionskriterier för groning: Symmetriska embryon med samtliga tre delar (hjärtblad, hypokotyler och rotämnesregioner) valdes utan uppenbara defekter och med fyra eller ﬂer hjärtblad utan några samman- smälta hjärtblad eller hjärtblad som skjuter ut från centrum. Embryonas stor- lek varierade. Embryona var opaka med färger i samtliga nyanser av vitt, gult eller grönt. Inga genomskinliga eller förglasade gröna embryon valdes ut.

Groningsfrekvensen bestämdes efter 6 veckor.

Resultat: I TABELL 13 visas effekten av mediumvolym, behàllardjup och me- diumdjup under utveckling och stratifiering på det genomsnittliga embryo- utbytet genom analys med hjälp av en linjär blandmodell.

TABELL 13: STATISTISK SIGNIFIKANS FÖR MEDIUMVOLYM, BEHÅL- LARDJUP OCH MEDIUMDJUP UNDER UTVECKLING OCH STRATIFIERING ariabel DF P-värde 0 073 0 009 Mediumd 0 177 Såsom visas ovan i TABELL 13 är effekten av Cambro-boxdjupet (be- hàllardjupet) pà embryoutbytet statisktiskt signiﬁkant med ett p-värde av 0,009. Effekten av mediumvolymen är svagt signifikant med ett p-värde av 10 15 20 534 88? 35 0,073, medan ingen statistisk signiﬁkans observerades för en interaktions- effekt mellan dessa variabler. l TABELL 14 visas det uppskattade genomsnittliga utbytet ("LS-medel- värdet") för varje nivå av mediumvolym och behållardjup tillsammans med 95% konfidensintervaller. Såsom visas i spalten för Grupp i TABELL 14 är variablerna inom samma bokstavsgrupp inte statistiskt signifikanta på en kon- fidensnivå av 90%, medan faktorer inom olika bokstavsgrupper är signifikant olika.

TABELL 14: EFFEKT AV MEDIUMVOLYM OCH BEHÅLLARDJUP UNDER UTVECKLING OCH STRATIFIERING PÅ EMBRYOUTBYTE _ Uppskattat Nedre räns Övre gräns för Vamabe' embryoutbyte för eoâ, ci 90% ci Grupp Mediumvolym: 600 ml 641 421 861 A Mediumvolym: 900 ml 785 575 994 B Mediumvgl/m: 1200 ml 780 570 990 B Behâllardjup: grund (5,08 650 432 869 A cm (2 tum)) Behâllardjup: djup (10,16 820 616 1024 B cm (4 tum)) Såsom visas i TABELL 14 resulterade Cambro-boxarna med medium- volymer av 900 ml och 1200 ml i ett statistiskt signifikant högre embryoutbyte än boxarna med en mediumvolym av 600 ml. Behandlingama med volymer av 900 ml och 1200 ml var inte signifikant annorlunda jämfört med varandra, och var och en hade ett uppskattat utbyte som var cirka 140 embryon per box större än utbytet för Cambro-boxen med volymen 600 ml. 10 15 534 887 36 TABELL 15: JÄMFÖRELSE AV EMBRYOUTBYTE EFTER STRATIFIERING (DVS INKUBATION VID 4°C) PÅ STRATIFIERINGSMEDIUM ELLER UTVECKLINGSMEDIUM Behandling Mvejï- Cam bro-behållare Stratifiering Elïåyrï: 1 (kontroll) 600 ml grund (2 tum), (mediumdjup = stratiﬁeringsmedium 668 1,27 cm ('/¿tum)) 2 900 ml grund (2 tum), (mediumdjup = stratifieringsmedium 746 1,91 cm (3/4 tum)) 3 1200 ml grund (2 tum), (mediumdjup = stratifieringsmedium 755 2,54 cm (1 tum)) 4 (kontroll) 600 ml djup (10,16 cm (4 tum)) stratiﬁeringsmedium 863 5 900 ml djup (10,16 cm (4 tum)) stratifiiingsmedium 794 6 1200 ml djup (10,16 cm (4 tum)) stratifieringsmedium 843 7 600 ml rund (5,08 om (2 tum)) utvecﬁgsmedium 612 8 900 ml ggd (5,08 cm (2 tum)) utvecklingsmedium 821 9 1200 ml ggtd (5,08 cm (2 IUQ) utvecklingsmedium 803 10 600 ml djup (10,16 cm (4 tum)) utvec@gsmedium 757 11 900 ml djup (10,16 cm (4 tum)) utvecﬁgsmedium 843 12 1200 ml djup (10,16 om (4 tum)) utvec@gsmedium 821 Såsom visas i TABELL 15 uppvisade utveckling och stratiﬁering av embryon pà Cambro-boxar med större mängder medium (900 ml och 1200 ml) statistiskt signiﬁkanta högre embryoutbyten än kontrollmängden av me- dium (600 ml). Den uppskattade skillnaden mellan dessa mediumvolym- behandlingar var cirka 140 embryon per box. Dessutom uppvlsade de djupa Cambro-boxarna (10,16 cm (4 tum)) statistiskt signiﬁkanta högre embryo- utbyten än de grunda Cambro-boxama (5,08 (2 tum)). Den uppskattade skillnaden mellan dessa tvä behandlingar vid olika boxdjup var cirka 170 per box.

Osmolalitetsmätningar: Osmolaliteten för mediet mättes efter 12 vec- kors inkubation på utvecklingsmedium. Utvecklingsmedlet hade en initial osmolalitet av 336 mM/kg (10% PEG). Resultaten visas nedan i TABELL 16. 10 15 20 534 88? 37 TABELL 16: FÖRÄNDRING I OSMOLALITET FÖR UTVECKLINGSMEDIUM EFTER 12 VECKORS INKUBATION UNDER UTVECKLING Behandlingsbetingelse Osmolalitet (mM/kg_)_ grund Cambro-box (5,08 cm (2 tum)) (600 ml) (kontroll) 160 _grund Cambro-box: 900 ml 200 _grund Cambro-box: 1200 ml 220 djup kontroll Cambro-box (10,16 cm (4 tum)) (600 ml) 170 djup Cambro-box: 900 ml 190 djup Cambro-box: 1200 ml 210 Slutsats: Såsom visas i TABELL 16 upprätthöll större utvecklings- mediumvolymer högre osmolaliteter efter in kubation under 12 veckor. Med utvecklingsmedium med en initial osmolalitet av 336 mM/kg, to m med ytterligare mediumvolym, upprätthöll ingen av boxarna en osmolalitet av mer än 250 mM efter 12 veckor.

Groningsdata Effekten av mediumvolym, boxdjup och stratiﬁeringsbehandling på embryogroningsfrekvensen analyserades genom användning av en generali- serad linjär blandmodell. De slumpmässiga effekterna i denna modell förelàg i satser och Cambro-boxar inom satser.

Groddplantor enligt kategori 1: Groning för kategori 1 bedömdes såsom beskrivs i Exempel 3.

TABELL 17 VISAR DEN UPPSKATTADE GENOMSNITTLIGA GRONINGS- FREKVENSEN FÖR KATEGORI 1 FÖR VARJE STRATIFIERINGS- BEHANDLING TILLSAMMANS MED 90% KONFIDENSINTERVALLER Nedre Övre Behandlingsbetingelse Gâgïlïïtëtïtïgïrlrlinï; grfšrrïs gçzrrls Grupp 90% CI 90% CI Stratifieringsmedium (byte av ut- 4,1% 0,020 0,084 A vecklingsmedium till stratiﬁerings- medium i efterhand) (w/o PEG) Upprätthâllen på utvecklingsmedium 6,7% 0,034 0,130 B (+PEG) 10 15 20 25 534 887 38 De i TABELL 17 visade behandlingsbetingelsema på samma bokstavsgruppnivå är inte statistiskt signifikanta på 90% konﬁdensnivå, medan behandlingsbetingelserna för olika gruppbokstäver är signifikant olikartade.

Såsom visas ovan i TABELL 17 förelåg en signiﬁkant skillnad i frekven- sen för groddplantori kategori 1 (p=0,007, konﬁdensnivå 90%) härrörande från embryon som upprätthölls på utveckiingsmedium (+PEG) under stratifie- ring i jämförelse med frekvensen för groddplantor i kategori 1 från embryon som överfördes från utveckiingsmedium till stratifieringsmedium (ingen PEG) före stratifiering.

Groddplantor enligt kategori 1 + 2 bedömdes enligt följande: en grodd- planta (bipolär) i kategori 1 + 2 inkluderar följande egenskaper: närvaro av en 1 mm lång rot (inga outvecklade stumpar) och närvaro av epikotylblad (ingen storlek eller inget antal) som är synliga för ögat.

TABELL 18 VISAR DEN UPPSKATTADE GENOMSNITTLIGA GRONINGS- FREKVENSEN FÖR KATEGORI 1 FÖR VARJE STRATIFIERINGS- BEHANDLING TILLSAMMANS MED 90% KONFIDENSINTERVALLER Nedre Övre Behandlingsbetingelse Gågmïïtêtgtïgïrllinfi- 9:2? 92:25 Grupp 90% Cl 90% Cl Stratífieringsmedium (byte av ut- 7,0% 0,037 0,128 A vecklingsmedium till stratiﬁerings- medium i efterhand) (w/o PEG) Upprätthållen på utveckiingsmedium 11.5% 0,064 0,198 B QPEG) De i TABELL 18 visade behandlingsbetingelserna på samma bokstavs- gruppnivå är inte statistiskt signifikanta på en 90% konﬁdensnivå, medan behandlingsbetingelser med olika bokstavsgrupper är signifikant olikartade.

Såsom visas i TABELL 18 förelåg en signifikant skillnad i frekvensen för groddplantor enligt kategori 1 + 2 (p=0,002, konfidensnivå 90%) härröran- de från embryon som upprätthölls på utveckiingsmedium (+10% PEG, osmo- lalitet = 336 mM/kg) under stratifiering ijämförelse med frekvensen för grodd- plantor i kategori 1 + 2 härrörande från embryon som överförts från utveck- 10 15 20 534 887 39 lingsmedium till stratiﬁeringsmedium (0,0% PEG, osmolalitet = 120 mM/kg) före stratifiering.

Groningsfrekvensen bedömdes även för groddplantor i kategori 1 och kategori 1 + 2 härrörande från embryon som bildats genom användning av behandlingarna 1-6, såsom beskrivits i TABELL 12. Resultaten av den statis- tiska analysen av skillnaderna som observerats i groningsfrekvens visas ne- dan i TABELL 19.

TABELL 192 STATISTISK SIGNIFIKANS AV SKILLNADER l GRONING SOM OBSERVERATS GENOM ANVÄNDNING AV OLIKA BEHANDLINGSMETODER Skillnad observerad Skillnad observerad i Behandlingsbetingelse DF i groningsfrekvens i groningsfrekvens i kategari 1 (ﬂärde) kategori 1 + 2 (p-värde) Mediumvolym (600 ml kontroll i 2 0,453 0,454 jämförelse med 900 ml eller 1200 ml) Boxdjup (grund, 5,08 cm (2 tum) 1 0,943 0,791 jämfört med djup, 10,16 cm (4 tum)) Stratiﬁeringsmedium (byte från ut- 1 0,007 0,002 vecklingsmedium till stratiﬁerings- medium i eﬂerhand (w/o PEG) jäm- fört med upprätthållen pà utveck- lingsmedium under stratiﬁerigi) Medium * Djup 2 0,820 0,879 Medium " Stratiﬁﬁg 2 0,424 0,654 qup * Stratiﬁering 1 0,348 0,340 Medium * Djup * Stratifieﬁ 2 0,914 0,918 Vid analys av signiﬁkansen av skillnaderna som observerats i gro- ningsfrekvens efter embryobehandling med olika mediumvolymer, olika box- djup och olika stratiﬁeringsmediumbetingelser, var, såsom visas ovan i TABELL 19, endast skillnadema som observerats efter olika stratiferings- mediumbetingelser statistiskt signifikanta. En statistiskt signiﬁkant skillnad i stratiﬁeringsmediumbetingelser observerades både för groddplantor i kategori 1 (0,007) och för groddplantor i kategori 1 + kategori 2 (0,002).

Detta är ett viktigt resultat, som indikerar att förfarandet för inkubation av embryon på utvecklingsmedium med en initial osmolalitet av minst 300 10 15 20 534 887 40 mM/kg till 450 mM/kg under en period av från 7 till 12 veckor vid rumstempe- ratur, följt av stratifiering av embryona på samma utvecklingsmedium, dvs omvandling av betingelserna för embryona på utvecklingsmediet från 0°C till 10°C under minst 1 vecka, resulterar i ökat embryoutbyte (såsom beskrivs i EXEMPEL 2-3), ökad embryofrekvens samt förbättrad växtkraft för grodd- plantor (såsom visas i EXEMPEL 2 och i FIGUR 2 (som visar att 13 av 15 genotyper vid behandling 14 observerades ha mer kraftfull epikotyl, längre rötter, eller bådadera). Dessa resultat jämförs med de för en kontrollmetod som involverade överföring av embryon från utvecklingsmedium (en osmolali- tet av minst 300 mM/kg) till stratifieringsmedium (en osmolalitet av 120 mM/kg), följt av stratiﬁerlng av 1°C till 10°C under minst 1 vecka.

Förfarandet för upprätthållande av embryon på utvecklingsmedium un- der stratifieringen ger därför den oväntade fördelen av ökat embryoutbyte och ökad groningsfrekvens. Förfarandena enligt uppfinningen medför även för- delar med förenklad hantering av ett stort antal embryon p g a det reducerade antalet steg och möjlighet att stratlfiera och eventuellt förvara embryon vid ett efterföljande utvecklingssteg vid 1°C till 10°C under upp till 3 månader till 6 månader före groning. Även om föredragna utföringsformer av uppfinningen har belysts och beskrivits, inses det att olika förändringar kan göras utan att man fràngår upp- finningens innebörd och skyddsomfång.

Claims

10 15 20 25 30 534 B87 41 PATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av stratiﬁerade hjàrtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon, varvid det inbegriper: (a) inkubation av en kultur inbegripande omogna somatiska barrträds- embryon i ett odlingskärl innehållande ett utvecklingsmedium inbegripande PEG i en koncentration av frán 1% till 15% och med en osmolalitet i området från 300 mM/kg till 450 mM/kg vid en temperatur av från 22°C till 25°C under en första inkubationsperod av från 7 veckor till 12 veckor för framställning av anatomiskt mogna embryon med utvecklade hjärtblad och utvecklad hypokotyl; och (b) steget att upprätthålla embryona i odlingskärlet och utvecklingsmediet enligt steg (a) och att underkasta embryona en temperatur av från 0°C till 10°C under en andra inkubationsperiod av minst en vecka för framställning av stratiﬁerade hjärtbladsförsedda somatiska embryon.

2. Förfarande enligt kravet 1, varvid utvecklingsmediet inbegriper PEG i en koncentration av från 7% till 15%.

3. Förfarande enligt kravet 1, varvid den andra inkubationsperioden är från 1 vecka till 8 veckor.

4. Förfarande enligt kravet 1, varvid den andra inkubationsperioden är från 1 vecka till 6 månader.

5. Förfarande enligt kravet 1, varvid det dessutom inbegriper odling av emb- ryona som behandlats enligt steg (b) i eller på ett groningsmedium för framställning av groddplantor.

6. Förfarande enligt kravet 1, varvid embryona i den första kulturen singulari- seras före den första inkubationsperioden.

7. Förfarande för framställning av stratiﬁerade hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon, varvid det inbegriper: 10 15 20 25 30 534 887 42 (a) inkubation av en kultur inbegripande pre-hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon i eller på ett första utvecklingsmedium under en första inkubationsperiod av minst 6 veckor; (b) singularisering av ett ﬂertal av embryona som behandlats enligt steg (al: (c) odling av mångfalden av singulariserade hjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon i ett odlingskårl innehållande ett andra utvecklings- medium inbegripande PEG i en koncentration av från 1% till 15% och med en osmolalitet i området från 300 mM/kg till 450 mM/kg vid en temperatur av från 22°C till 25°C under en andra inkubationsperiod av minst 3 veckor för framställning av anatomiskt mogna embryon med utvecklade hjärtblad och en utvecklad hypokotyl; och (d) steget att upprätthålla embryona i odlingskärlet och utvecklingsmediet enligt steget (c) och att underkasta embryona en temperatur av från 0°C till 10°C under en tredje inkubationsperiod under minst en vecka för framställning av stratifierade hjärtbladsförsedda somatiska embryon.

8. Förfarande enligt kravet 7, varvid det andra utvecklingsmediet inbegriper PEG i en koncentration av från 8% till 15%.

9. Förfarande enligt kravet 7, varvid den första inkubationsperioden är från 6 veckor till 8 veckor.

10. Förfarande enligt kravet 7, varvid kombinationen av den första inkuba- tionsperioden och den andra inkubationsperioden totalt uppgår till en tids- period av minst 12 veckor.

11. Förfarande enligt kravet 7, varvid den tredje inkubationsperioden är från 1 vecka till 6 månader.

12. Förfarande enligt kravet 7, varvid den tredje inkubationsperioden är från 1 vecka till 8 veckor. 534 B87 43

13. Förfarande enligt kravet 7, varvid de singulariserade embryona i odlings- kärlet inte står i fysisk kontakt med varandra.

14. Förfarande enligt kravet 7, varvid det dessutom inbegriper odling av embryona som behandlats enligt steg (d) i eller på ett groningsmedium för framställning av groddplantor.