CN101808506B - 体细胞胚层积处理和储存的方法 - Google Patents

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Abstract

一方面，本发明提供了用于产生层积处理的子叶针叶树体细胞胚的方法。方法包括(a)将含有未成熟的针叶树体细胞胚的培养物，在含有重量摩尔渗透压浓度为300mM/Kg到450mM/Kg的发育培养基的培养容器中，在22℃到25℃的温度下温育第一段温育时间，该时间长度足以使至少一部分胚达到解剖学成熟；以及(b)将在步骤(a)的培养容器中的胚，在0℃到10℃的温度下进行至少一周的第二段温育时间，以产生层积处理的子叶体细胞胚。

Description

体细胞胚层积处理和储存的方法
发明领域
本发明涉及在体外生产植物胚，以及任选从植物胚产生植株的方法。
发明背景
对针叶树、例如松树和枞树制造木制品的需求持续不断地增加。针对这个问题提出的一种解决方案是鉴定具有所需特性、例如生长速度快的个体树木，并通过体细胞克隆产生优势树的大量遗传一致的克隆。
体细胞克隆是从雄性和雌性配子之外的树组织产生遗传一致的树木的方法。在体细胞克隆的一种方法中，将植物组织在含有激素例如植物生长素和/或细胞分裂素的起始培养基中进行培养，该激素启动能够发育成体细胞胚的胚发生细胞的形成。然后将胚发生细胞在促进胚发生细胞增殖以形成子叶前胚(即不具有子叶的胚)的维持培养基中继续培养。然后将增殖的胚发生细胞在促进子叶体细胞胚发育的发育培养基中进行培养，子叶体细胞胚可以被例如放置在人工种子中，播种在土壤中，在那里它们萌发产生针叶树苗。树苗可以移植到生长地点进行随后的生长并最终收获，以产生木材或源自木材的产品。
为了增加能够萌发以产生松树植株的子叶体细胞胚的生产，对于提高针叶树胚的体细胞克隆的效率存在着持续的需求。优选，在体外形成的针叶树体细胞胚，与在针叶树种子中体内形成的针叶树合子胚在物理和生理上是相似或一致的。本发明提供了解决对松属(Pinus)针叶树这种需求的方法。
发明简述
一方面，提供了用于产生层积处理的针叶树子叶体细胞胚的方法。方法包括(a)将含有未成熟的针叶树体细胞胚的培养物，在含有重量摩尔渗透压浓度为300mM/Kg到450mM/Kg的发育培养基的培养容器中，在22℃到25℃的温度下温育第一段温育时间，该时间长度足以使至少一部分胚达到解剖学成熟；以及(b)将培养容器中根据步骤(a)的胚在0℃到10℃的温度下进行至少1周的第二段温育时间，以产生层积处理的子叶体细胞胚。
另一方面，提供了产生子叶体细胞胚的方法。方法包括(a)将含有针叶树子叶前体细胞胚的培养物在第一种发育培养基中或其上温育第一段温育时间；(b)将根据步骤(a)处理的大量胚分离成单个；(c)将多个分离成单个的针叶树子叶体细胞胚，在含有重量摩尔渗透压浓度为300mM/Kg到450mM/Kg的发育培养基的培养容器中，在22℃到25℃的温度下培养第二段温育时间，该时间长度足以使至少一部分胚达到解剖学成熟；以及(d)将培养容器中根据步骤(c)的胚在0℃到10℃的温度下进行至少1周的第三段温育时间，以产生层积处理的子叶体细胞胚。
本发明的方法可用于制备成熟的、层积处理的针叶树体细胞胚，它们具有可以通过例如遗传或生物化学手段进一步表征的增加的萌发率和发芽势，和/或如果需要，可以萌发以产生针叶树。因此，例如，本发明的方法可用于更有效地生产具有一种或多种所需特性、例如快的生长速度或改进的木材质量的个体针叶树的克隆。
附图说明
通过结合附图参考下面的详细描述，将更容易认识到并同时更好理解本发明的上述方面以及许多附带优点，其中：
图1是针叶树体细胞胚的早期和晚期发育的示意图解：
图2是在处理组1(对照)条件下产生的萌发物(图2A-2C)，或在处理组14条件下产生的萌发物(图2D-2F)的一组照片，证实了使用如实施例2中所述的处理条件14获得的提高的萌芽发芽势；
图2A是来自处理组1的S-框1的萌发物的照片；
图2B是来自处理组1的S-框2的萌发物的照片；
图2C是来自处理组1的S-框3的萌发物的照片；
图2D是来自处理组14的S-框1的萌发物的照片；
图2E是来自处理组14的S-框2的萌发物的照片；以及
图2F是来自处理组14的S-框3的萌发物的照片。
详细描述
除非在本文中专门定义，否则本文中使用的所有术语都与它们对于本发明的技术领域中专业人员的含义相同。
本文中使用的术语“发育阶段”是指体细胞克隆过程中的一个时期，在此期间在未成熟的胚中发生了组织发生和组织与器官的生长，以达到能够萌发成植株的全尺寸成熟胚。
本文中使用的术语“未成熟胚”是指还不能萌发成植株的胚，包括处于早期发育阶段的胚(即子叶前胚)和中期发育的胚(即具有尚未完全发育的子叶或下胚轴的胚)。
本文中使用的术语“解剖学成熟”是指具有发育好的子叶和下胚轴的胚。
本文中使用的术语“子叶胚”是指具有轮廓分明的、延长的双极结构的胚，在一个末端具有带有一个或多个清晰可见的子叶原基的潜在分生组织中心，在相反末端具有潜在的胚根。
本文中使用的术语“子叶前胚”是指尚未具有子叶的胚。
本文中使用的术语“正常萌发物”，表示在评估时存在所有植物的预期部分。植物的预期部分可以包括胚根、下胚轴、一片或多片子叶，以及上胚轴。在裸子植物的情况下，正常萌发物的特征为胚根具有超过3mm的长度，与从天然种子萌发的胚的外观相比没有视觉可辨别的畸形。
本文中使用的术语“胚根”，是指植物胚中发育成所生成的植物的初生根的部分。
本文中使用的术语“下胚轴”，是指植物胚或苗中位于子叶之下但在胚根之上的部分。
本文中使用的术语“上胚轴”，是指苗茎中在子叶之上的部分。
在本文中使用的术语“胚性胚柄细胞团”或“ESM”，是指铺在包含在半固体凝胶中或作为能够提供物理支持的多孔基质中的液体的营养培养基表面上，并保持生长最长3个月的细胞团。在3个月的温育期间，体细胞胚从显微镜可见的前体细胞团生长成视觉可见的早期胚，并最终成为解剖学成熟的胚。在温育几周后，ESM的结构典型地由增殖的簇构成，所述簇具有几个与培养基直接接触的胚，但是大部分胚形成在仍然增殖的细胞团的顶部或侧面上。
本文中使用的术语“层积处理”是指在萌发前对胚进行冷处理(例如0℃到10℃)。层积处理(冷湿处理)是用于在许多温带物种的种子中克服萌发抗性的处理方法(Taylor & Waring，Plant，Cell，AndEnvironment 2：165-171，1979)。
除非另有陈述，否则所有表示为百分率的浓度值都是重量体积百分率。
根据本发明的方法，意外地发现了将未成熟针叶树的体细胞胚在含有重量摩尔渗透压浓度为300mM/Kg到450mM/Kg的发育培养基中或其上培养第一段温育时间，然后将胚在同样的发育培养基中、在0℃到10℃的温度下培养第二段温育时间，与在发育培养基中温育、然后转移到重量摩尔渗透压浓度低于150mM/kg的层积处理培养基中进行冷处理(层积处理)的胚相比，产生了增加的萌发率和发芽势，如实施例2-4中所述。除了增加萌发率和萌发物发芽势之外，省略了发育和层积处理之间的培养基转移步骤还提供了几个其它优点，包括简化子叶胚的生产，以及任选在萌发之前将胚冷藏在发育培养基上，从而允许了胚的定时和使用的灵活性。例如，本发明的方法允许在田间试验之前积累胚的群体和对它们进行同步化。
根据上述，一方面，提供了用于产生层积处理的针叶树子叶体细胞胚的方法。方法包括(a)将含有未成熟的针叶树体细胞胚的培养物，在含有重量摩尔渗透压浓度为300mM/Kg到450mM/Kg的发育培养基的培养容器中，在22℃到25℃的温度下温育第一段温育时间，该时间长度足以使至少一部分胚达到解剖学成熟；以及(b)将步骤(a)的培养容器中的胚在0℃到10℃的温度下进行至少1周的第二段温育时间，以产生层积处理的子叶体细胞胚。
本发明的方法可用于从任何针叶树产生子叶体细胞胚，例如松属的成员，例如火炬松(Pinus taeda)和辐射松(Radiata pine)。此外，例如绿枞(Douglas fir)胚，也可以通过本发明的方法生产。
按照本发明的方法生产的成熟的针叶树体细胞胚群体，与按照对照方法生产的针叶树体细胞胚群体相比，具有更高的萌发成针叶树植株的效率，对照方法别的地方与本发明的方法一致，只是包含了将胚从重量摩尔渗透压浓度为300mM/Kg到450mM/Kg的发育培养基转移到重量摩尔渗透压浓度低于150mM/kg的层积处理培养基的发育后步骤。
按照本发明的方法，在层积处理之前，将含有未成熟的针叶树体细胞胚、例如胚性胚柄细胞团(ESM)的培养物，在促进子叶胚发育的发育培养基中温育第一段温育时间。
未成熟的针叶树体细胞胚，例如针叶树的子叶前体细胞胚，可以从针叶树体细胞、例如从针叶树胚获得的细胞制备。例如，来自针叶树胚的细胞可以用激素诱导以形成胚性胚柄细胞团(ESMs)，它们可以按照本发明进行处理以产生成熟的针叶树体细胞胚。ESMs可以从例如从种子中取出的子叶前胚制备。例如，将种子表面消毒，然后取出子叶前胚，然后将其培养在允许ESMs形成的诱导培养基上或其中，ESMs包括了通过出芽和分裂进行增殖的过程中的早期阶段的胚。ESMs典型培养在维持培养基中以形成子叶前体细胞胚。ESM培养条件和适合的诱导和维持培养基的非限制性的例子，在下文中进一步描述。
诱导
因此，在某些实施方案中，针叶树体细胞被培养在产生胚发生细胞的诱导培养基中或其上。胚发生细胞是能够产生一个或多个针叶树的子叶体细胞胚的细胞，包括例如针叶树胚性胚柄细胞团。诱导培养基典型地包含无机盐和有机营养物质。诱导培养基的重量摩尔渗透压浓度典型为大约160mg/kg或甚至更低，但是它也可以高达170mM/kg。诱导培养基典型包含生长激素。可以包含在诱导培养基中的激素的例子是植物生长素(例如2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D))和细胞分裂素(例如6-苯甲基氨基嘌呤(BAP))。植物生长素可以以例如从1mg/L到200mg/L的浓度使用。细胞分裂素可以以例如从0.1mg/L到10mg/L的浓度使用。
诱导培养基可以包含吸附性成分，特别是当使用非常高水平的生长激素时。吸附性成分可以是任何在本发明方法的实践中使用的浓度下对胚发生细胞无毒性、并且能够吸附胚发育过程中培养基中存在的生长促进激素和植物细胞产生的有毒化合物的成分。可用的吸附性成分的非限制性的例子包括活性炭、可溶性聚(乙烯吡咯烷酮)、不溶性聚(乙烯吡咯烷酮)、活性氧化铝、和硅胶。吸附性成分存在的量可以为例如大约0.1g/L到大约5g/L。可用于本发明的实践中的诱导培养基的例子是本文实施例1中提出的培养基BM1。诱导培养基典型为固体，并且可以通过包含胶凝剂而固化。
针叶树体细胞在诱导培养基中或其上典型培养的时间为3周到10周，例如6周到8周，培养温度为10℃到30℃，例如15℃到25℃，或例如20℃到23℃。
维持
维持培养基可以是固体培养基，或者它可以是能够被搅拌以促进胚发生组织的生长和繁殖的液体培养基。维持培养基的重量摩尔渗透压浓度典型高于诱导培养基的重量摩尔渗透压浓度，典型在180-400mM/kg的范围内。维持培养基可以包含维持胚发生组织的营养物质，并可以包含激素，例如一种或多种促进胚发生组织的细胞分裂和生长的植物生长素和/或细胞分裂素。典型地，维持培养基中激素的浓度低于它们在诱导培养基中的浓度。
在维持培养基中包含麦芽糖作为唯一或主要的可代谢糖源一般是理想的，尽管不是必需的。可用的麦芽糖浓度的例子在大约1％到大约2.5％的范围内。适合的维持培养基的例子是在本文的实施例1中提出的培养基BM2。针叶树胚发生细胞通常每周转移到新鲜维持培养基中一次。
发育
根据本发明的这个方面的方法，将含有未成熟的针叶树体细胞胚的培养物在促进子叶胚发育的发育培养基中温育第一段温育时间。
用于本发明的这个方面的发育培养基典型地含有维持体细胞胚的营养物质。适合的发育培养基典型地不包含生长促进激素，例如植物生长素和细胞分裂素。发育培养基的重量摩尔渗透压浓度在300mM/Kg到450mM/Kg的范围内。在某些实施方案中，发育培养基的重量摩尔渗透压浓度为350mM或更高。发育培养基可以是液体、固体或半固体。适合的发育培养基的例子BM3显示在本文的实施例1中。其他适合的发育培养基的例子显示在本文实施例2-4中。在方法的某些实施方案中，发育培养基的初始重量摩尔渗透压浓度为至少300mM/kg，在层积处理过程中被维持在至少200mM/kg的水平。
在某些实施方案中，发育培养基含有浓度为1％到5％的PEG。在某些实施方案中，发育培养基含有浓度为7％到15％(例如7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％)的PEG。在某些实施方案中，发育培养基含有浓度为10％到12％的PEG，重量摩尔渗透压浓度为至少350mM/kg到450mM/kg。
麦芽糖可以包含在发育培养基中作为体细胞胚的主要或唯一糖源。可用的麦芽糖浓度在大约1％到大约2.5％的范围内。
发育培养基可以包含结冷胶。结冷胶是一种胶凝剂，以例如GELRITE和PHYTAGEL的名称销售。如果发育培养基中包含结冷胶，其存在的浓度典型地小于大约0.5％，典型浓度为大约0％到大约0.4％。发育培养基典型地是固体培养基，尽管它可以是液体培养基。
发育培养基可以包含吸附性成分，例如活性炭，正如本文中对诱导培养基所描述的。
在某些实施方案中，发育培养基还含有蔗糖和/或脱落酸。发育培养基中脱落酸的浓度可以在0.5mg/L到500mg/L之间。在本发明的方法的某些实施方案中，发育培养基中脱落酸的浓度在1mg/L到100mg/L之间。在某些实施方案中，发育培养基中脱落酸的浓度在5mg/L到20mg/L之间。
在本发明的某些实施方案中，发育培养基含有蔗糖作为主要或唯一的可代谢糖源。可用的蔗糖浓度在大约1％到大约6％的范围内。
根据本发明的这个方面的方法，将包含未成熟的针叶树体细胞胚的培养物，在含有重量摩尔渗透压浓度为300mM/Kg到450mM/Kg的发育培养基的培养容器中，在22℃到25℃的温度下温育第一段温育时间，其长度足以使至少部分胚达到解剖学成熟(即具有发育的子叶和下胚轴)。在某些实施方案中，第一段温育时间的长度足以使胚培养物中大量胚中的至少一部分(例如至少一个胚，至少10％的胚，至少25％、至少50％、超过50％或至少75％的胚)达到解剖学成熟。
如图1中所示，体细胞胚的发育阶段可以分成包括组织发生(即从未分化细胞形成不同组织)的早期阶段，包括器官生长以及开始下胚轴发育和子叶发育的中期阶段，以及包括器官生长完成、下胚轴和子叶发育完成(即解剖学成熟)和贮存产物淀积的晚期阶段。具体来说，未成熟胚的早期阶段发育包括根开始发育，根冠开始发育，中柱原分生组织分化和苗端形成。中期阶段发育包括下胚轴发育和子叶发育的开始，晚期阶段发育包括下胚轴发育和子叶发育的完成，产生了解剖学成熟的胚。
在一个或多个胚上一种或多种结构(例如子叶原基或子叶)的形成，可以通过培养的胚的视觉检查或成像分析来确定。视觉检查或成像分析可以任选在5-10X放大倍数下进行。
第一段温育时间可以根据基因型而不同。在某些实施方案中，第一段温育时间的长度为至少6周到至少12周，例如从8到12周。在发育培养基上的第一次温育可以在10℃到30℃的温度下进行，例如从15℃到25℃，或例如从20℃到23℃。
层积处理
层积处理(冷湿处理)是用于在许多温带物种的种子中克服萌发抗性的处理方法(Taylor & Waring，Plant，Cell，AndEnvironment 2：165-171，1979)。正如本文所述，意外地发现层积处理可以在重量摩尔渗透压浓度为至少300mM/Kg到高达450mM/kg的发育培养基中进行，导致胚的产量增加，与使用重量摩尔渗透压浓度低于150mM/kg的层积处理培养基(例如BM4)生产的胚相比，具有增加的萌发率(如实施例2-4中所述)。
根据本发明的这个方面的方法，在将体细胞胚在发育培养基上温育长度足以使至少一部分胚达到解剖学成熟的第一段温育时间之后，然后将胚在0℃到10℃的温度下进行至少1周的第二段温育时间，以产生层积处理的子叶体细胞胚。
在一个实施方案中，在重量摩尔渗透压浓度为至少300mM/Kg到高达450mM/kg的发育培养基中或其上的松树子叶体细胞胚，在0℃到10℃的温度下进行至少1周到长达8周(例如1周到8周，例如4周大6周)的第二段温育时间，以产生层积处理的子叶体细胞胚。在另一个实施方案中，在重量摩尔渗透压浓度为至少300mM/Kg到高达450mM/kg的发育培养基中或其上的松树子叶体细胞胚，在0℃到10℃的温度下进行至少2个月到长达6个月(例如至少2个月，至少3个月，至少4个月，至少5个月到长达6个月)的第二段温育时间，以产生在萌发前储存的层积处理的子叶体细胞胚。第二段温育时间典型在暗处，在1℃到6℃、例如1℃到4℃的温度下进行。
在本发明的方法的一个实施方案中，在步骤(a)中的第一段温育时间开始时，发育培养基的初始重量摩尔渗透压浓度为至少300mM/Kg，在步骤(b)的第二段温育时间期间维持在至少200mM/kg的水平。维持重量摩尔渗透压浓度水平可以通过向发育培养基添加各种不同的渗透压调节剂(例如PEG，添加各种不同糖类、肌醇或其他增加重量摩尔渗透压浓度的渗透压调节剂)，或通过调整在发育和层积处理过程中胚在其中或其上温育的发育培养基的体积，如实施例4中所述。
典型地，胚在胚发生细胞团、例如胚性胚柄细胞团的表面上形成。在将子叶胚在层积处理培养基中或其上培养之前，子叶胚可以被分离成个体(成单个的)子叶胚，或者它们可以作为未分离成单个的胚团进行培养。可以在将子叶胚在0℃到10℃的温度下进行至少1周的第二段温育时间以产生层积处理的子叶体细胞胚之前，将子叶胚分离成个体(分离成单个的)子叶胚，或者它们可以作为未分离成单个的胚团进行培养。
层积处理后
层积处理后，如果需要，使用本发明的方法生产的子叶胚可以任选萌发，以形成可以生长成松树的松树植株。典型地，在萌发前对子叶胚进行干燥处理，如实施例1中所述。子叶胚也可以放置到人造种子中用于以后萌发。子叶胚可以在固体萌发培养基、例如本文实施例1中提出的BM5培养基上萌发。典型地，对子叶体细胞胚进行光照以刺激萌发。典型地，本发明的方法的所有步骤，除了萌发之外，都在暗处进行。萌发的植物可以转移到土壤中进一步生长。例如，萌发的植物可以种植在温室的土壤中并允许其生长，然后移植到户外位点。
在某些实施方案中，本发明的这个方面的方法，与其中胚发生细胞培养在重量摩尔渗透压浓度为至少300mM/Kg到高达450mM/kg的发育培养基(例如含有PEG)上、然后在重量摩尔渗透压浓度低于150mM/kg的层积处理培养基(例如不含PEG)中或其上层积处理的同样方法相比，产生了更高的体细胞子叶胚产量，如实施例2-4中所示。
另一方面，提供了产生子叶体细胞胚的方法。方法包括(a)将含有针叶树子叶前体细胞胚的培养物在第一种发育培养基中或其上温育第一段温育时间；(b)将根据步骤(a)处理的大量胚分离成单个；(c)将多个分离成单个的针叶树子叶体细胞胚，在含有重量摩尔渗透压浓度为300mM/Kg到450mM/Kg的发育培养基的培养容器中，在22℃到25℃的温度下培养第二段温育时间，该时间长度足以使至少一部分胚达到解剖学成熟；以及(d)将步骤(c)的培养容器中的胚在0℃到10℃的温度下进行至少1周的第三段温育时间，以产生层积处理的子叶体细胞胚。
根据本发明的这个方面，未成熟的针叶树体细胞胚、例如针叶树子叶前体细胞胚，可以从针叶树体细胞、例如从针叶树胚获得的细胞，通过将细胞如上所述培养在诱导培养基中或其上以产生胚发生细胞来制备。然后可以如上所述将胚发生细胞培养在维持培养基中或其上，以增殖胚发生细胞。然后可以将增殖的胚发生细胞在第一种发育培养基中或其上培养第一段温育时间，分离成单个，并在第二种发育培养基中温育第二段温育时间，然后在第二种发育培养基上层积处理。
第一和第二种发育培养基典型包含维持体细胞胚的营养物质。适合的发育培养基典型不包含生长促进激素，例如植物生长和细胞分裂素。在某些实施方案中，第一和第二种发育培养基具有同样的配方。在某些实施方案中，第一和第二种发育培养基具有不同的配方。
第一和/或第二种发育培养基的重量摩尔渗透压浓度可以被调整到位于所需范围内的值，例如从大约300mM/Kg到大约450mM/Kg。典型地，在本发明的方法中，350mM或更高的重量摩尔渗透压浓度是有利的。适合的发育培养基BM3的例子显示在本文的实施例1中。其他适合的发育培养基的例子显示在本文的实施例2-4中。在方法的某些实施方案中，第二种发育培养基的重量摩尔渗透压浓度(例如从350mM/Kg到450mM/Kg)高于第一种发育培养基(例如从300mM/Kg到400mM/Kg)。在某些实施方案中，选择第二种发育培养基的重量摩尔渗透压浓度与第一种发育培养基在第一段温育时间结束时的重量摩尔渗透压浓度相匹配。
在某些实施方案中，第一和/或第二种发育培养基含有浓度为1％到15％的PEG。在某些实施方案中，第一种发育培养基含有浓度为7％到10％(例如7％、8％、9％、10％)的PEG。在某些实施方案中，第二种发育培养基含有浓度为8％到15％(例如8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％)的PEG。在某些实施方案中，第二种发育培养基含有比第一种发育培养基更高浓度的PEG。
麦芽糖可以包含在第一和/或第二种发育培养基中作为体细胞胚的主要或唯一糖源。可用的麦芽糖浓度在大约1％到大约2.5％的范围内。
第一和/或第二种发育培养基可以含有结冷胶。结冷胶是一种胶凝剂，以例如GELRITE和PHYTAGEL的名称销售。如果发育培养基中包含结冷胶，它典型存在的浓度低于大约0.5％，典型浓度在0％到大约0.4％的范围内。第一和第二种发育培养基典型地是固体培养基，尽管一种或这两种也可以是液体培养基。
第一和/或第二种发育培养基可以包含吸附性成分，例如活性炭，如上文中对于诱导培养基所描述的。
在某些实施方案中，第一和/或第二种发育培养基还含有蔗糖和/或脱落酸。发育培养基中脱落酸的浓度可以在0.5mg/L到500mg/L之间。在本发明的方法的某些实施方案中，发育培养基中脱落酸的浓度在1mg/L到100mg/L之间。在某些实施方案中，发育培养基中脱落酸的浓度在5mg/L到20mg/L之间。
在本发明的某些实施方案中，第一和/或第二种发育培养基含有蔗糖作为主要或唯一可代谢糖源。可用的蔗糖浓度在大约1％到大约6％的范围内。
第一和第二种发育培养基可以是液体、固体或半固体。在液体培养基中，渗透压调节剂例如聚乙二醇(PEG)或其他渗透压调节剂的浓度可以被升高，以产生与相应的固体培养基相同的重量摩尔渗透压浓度。典型地，与液体发育培养基等价的固体发育培养基的重量摩尔渗透压浓度，在液体发育培养基的重量摩尔渗透压浓度的大约50mM/kg的范围内。
在本发明的这个方面的某些实施方案中，第一段温育时间的长度足以在第一种胚培养物的大量胚的一部分(例如至少一个胚，至少10％的胚，至少25％、超过50％或至少75％的胚)中，形成至少一种下列结构：一个或多个具有子叶原基的胚；一个或多个具有子叶的胚；一个或多个具有4+子叶的胚；或一个或多个具有出现了下胚轴和根区的不同子叶的胚。
第一段温育时间可以根据基因型而不同。在某些实施方案中，第一段温育时间的长度为至少6周到至少8周，例如7到8周。在第一种发育培养基上的第一次温育可以在10℃到30℃的温度下进行，例如从15℃到25℃，或例如从20℃到23℃。
在第一段温育时间结束时，例如当在一部分胚上观察到了一个或多个子叶原基的出现时，或在至少6周的时间后，方法包括将来自胚的第一种培养物的大量个体胚分离成单个。
可以使用将胚的第一种培养物物理分离成个体胚的任何手段，将本发明方法的胚分离成单个。例如，在胚性胚柄细胞团(ESM)培养物的情况下，可以使用物理分离方法，例如洗掉ESM(例如通过水性液体的压力控制的喷雾进行喷雾分离)，真空吸去ESM，振动，或从ESM挑取胚。其他可用的分离成单个的方法的非限制性的例子，包括根据物理属性例如尺寸、形状而通过例如筛网，或根据其他物理属性例如表面粗糙度、疏水性、密度或质量，对胚进行过滤或分拣。
在某些实施方案中，分离成单个的步骤还包括根据一种或多种选择标准来挑取个体胚。例如，熟练的技术人员可以使用视觉评估筛选标准，或者使用计算机化的成像系统，根据一种或多种形态学特征来选择胚，这些特征包括但不限于胚的尺寸、形状(例如轴对称)、表面质地、颜色(例如没有可见的发绿)、不存在裂开的下胚轴，或没有半透明的子叶。胚也可以根据与化学或外部结构的吸收、反射、透射或发射光谱相关的标准，通过使用近红外光谱仪(NIR)进行选择，正如在题为“用于对体细胞胚进行分类的方法”(Methods forClassification of Somatic Embryos)的美国专利申请No.2004/0072143中描述的，在此引为参考。
可以使用任何适合的仪器，例如镊子，将所需胚从第一种胚培养物(例如胚性胚柄细胞团)中单个挑出(通过手动或自动过程)。胚的挑取可以手动或通过自动化方法来进行，例如在题为“用于植物胚的收获和多阶段筛选的自动化系统和方法”(Automated System andMethod for Harvesting and Multi-Stage Screening of Plant Embryos)的美国专利申请No.2004/0267457中描述的，在此引为参考。
在本方法的某些实施方案中，挑取的胚被直接放置在第二种发育培养基的表面上，或放置在与第二种发育培养基接触的多孔基质上，该第二种发育培养基可以是固体或液体形式的。
可用于本发明的方法的各种不同实施方案的实践中的多孔基质，典型具有大约5微米到大约1200微米的孔径，例如大约50到500微米，例如大约70到大约150微米，例如大约100微米。多孔材料典型为平面的，并可以是任何所需形状或选定的尺寸，以易于操作和放置得与第二种发育培养基相接触。示例性的多孔材料包括可灭菌并具有足够强度来抵抗当将材料抬起以便将分离成单个的胚转移到体细胞胚生产过程的随后阶段、例如层积处理时的撕裂的材料。可用的多孔材料的例子包括但不限于膜，尼龙纤维，编织筛网(例如尼龙，不锈钢或塑料)，和聚合纤维。
在某些实施方案中，分离成单个的胚被转移到第二种发育培养基，或与第二种发育培养基相接触的多孔基质中，使得分离成单个的胚彼此之间没有物理接触。
根据本发明的方法，在分离成单个后，分离成单个的未成熟胚与第二种发育培养基接触第二段温育时间。在某些实施方案中，第二段温育时间的长度足以使大量分离成单个的胚中的至少一部分(例如至少一个胚，至少10％的胚，至少25％、至少50％、超过50％、或至少75％的胚)，达到解剖学成熟(即具有发育的子叶和下胚轴)，如上面参考图1所述。
第二段温育时间可以根据基因型而不同。在某些实施方案中，第二段温育时间的长度为至少3周，例如3周到5周。在某些实施方案中，胚在发育培养基上温育的总时间长度(包括第一段温育时间和第二段温育时间)为至少12周。在第二种发育培养基上的第二次温育可以在10℃到30℃的温度下进行，例如从15℃到25℃，或例如从20℃到23℃。
根据本发明的方法的这个方面，在第二种发育培养基中或其上温育之后，然后将分离成单个的胚，通过在0℃到10℃的温度下进行至少1周的第三段温育时间，来进行层积处理。
在一个实施方案中，将重量摩尔渗透压浓度为至少300mM/Kg到高达450mM/kg的发育培养基中或其上的松树子叶体细胞胚，在0℃到10℃的温度下进行至少1周到长达8周(例如从1周到8周，例如从4周到6周)的第三段温育时间，以产生层积处理的子叶体细胞胚。在另一个实施方案中，将重量摩尔渗透压浓度为至少300mM/Kg到高达450mM/kg的发育培养基中或其上的松树子叶体细胞胚，在0℃到10℃的温度下进行至少2个月到长达6个月(例如至少2个月，至少3个月，至少4个月，至少5个月到长达6个月)的第三段温育时间，以产生层积处理的子叶体细胞胚，在萌发前储存。第三段温育时间典型在暗处，在1℃到6℃、例如从1℃到4℃的温度下进行。
在本发明的方法的一个实施方案中，在步骤(a)的第二段温育时间开始时，发育培养基的初始重量摩尔渗透压浓度为至少300mM/Kg，并且在步骤(c)的第三段温育时间内维持在至少200mM/kg的水平。
本发明的各种不同方面的方法，各包括下述步骤：将含有未成熟的针叶树体细胞胚的培养物，在重量摩尔渗透压浓度为300mM/kg到450mM/kg的发育培养基中温育第一段温育时间，然后将培养容器中的胚在0℃到10℃的温度下进行至少1周的温育以产生层积处理的胚。本发明的方法可用于例如产生具有一种或多种所需特征、例如快的生长速度的个体松树的克隆。因此，一方面，本发明提供了用于生产遗传一致的松树体细胞胚的群体的方法。本文中使用的术语“遗传一致的松树体细胞胚”是指源自于相同的原始植株的胚。该术语包括了含有在体细胞胚发育过程中可能出现的少量突变的松树体细胞胚。本文描述的任何方法都可用于产生遗传一致的松树子叶体细胞胚的群体。
下面的实施例仅仅说明了现在考虑到的用于实践本发明的最佳方式，而不应该被解释为对本发明的限制。
实施例1
本实施例描述了使用发育培养基(BM3)和层积处理培养基(BM4)从火炬松生产松树体细胞胚的方法。
方法：
在受精后4周到5周，从种子中取出含有合子胚的雌性配子体。除去种皮，但是除了切除珠心端之外，没有将胚从周围的配子体中进一步剖出。球果在4℃储存，直到使用。就在取出未成熟胚之前，使用最初的清洗和去污剂处理，然后在15％H2O2中消毒10分钟，对种子进行消毒。在每次处理后，将外植体用无菌蒸馏水充分清洗。
表1和2显示了可用于生产松树体细胞胚的培养基的组成。
表1
Figure GPA00001073247000181
+如果需要固体培养基时使用。
表2
Figure GPA00001073247000191
诱导：将具有完整胚的无菌配子体放置在固体BM1培养基上，在22-25℃的环境中，以24小时的暗光周期保持3周到5周的时间。时间的长度取决于培养的具体基因型。在该时间结束时，形成了与原始的外植体相连的白色粘液质细胞团。显微镜检查典型地发现了大量与细胞团相连的早期阶段的胚。它们一般来说特征为带有长的、具有薄壁的胚柄细胞，连有小的头，头具有浓稠的细胞质和大的核。
在某些情况下，诱导培养基的重量摩尔渗透压浓度可以高达150mM/kg，典型为约120mM/kg或甚至更低(例如110mM/kg)。
维持和增殖：将从诱导阶段产生的细胞团中取出的早期阶段的胚，首先放置在BM2凝胶化维持和增殖培养基上。它与诱导培养基的差别在于生长激素(植物生长素和细胞分裂素二者)被降低了至少一整个数量级。该培养基的重量摩尔渗透压浓度为120mM/kg或更高(对于火炬松来说，典型地在大约120-150mM/kg的范围内)。温度和光周期仍然是22-25℃，在暗处24小时。将胚在BM2固体培养基上培养12-14天，然后转移到液体培养基中进一步传代培养。该液体培养基具有与BM2相同的组成，但是缺少胶凝剂。在固体维持阶段结束时，胚在外观上典型地与来自诱导阶段的相似。在液体维持培养基上进行每周一次、5到6次传代培养后，形成了高级的早期阶段胚。它们的特征为光滑的胚头，据估计典型地含有超过100个个体细胞，并具有大量胚柄。
胚的发育：将早期阶段的未成熟胚从维持培养基转移到固体发育培养基。发育培养基或者完全缺乏生长激素，或者仅存在非常低水平的生长激素。通常包含脱落酸，以促进进一步发育。此外，在该培养基中包含吸附性成分是有利的。吸附性成分可以选自许多具有高表面积和/或受控的孔径的化学材料，例如活性炭、可溶或不溶形式的聚(乙烯吡咯烷酮)、活性氧化铝和硅胶。吸附性成分通常存在的浓度为大约0.1-5g/L，更通常为大约0.25-2.5g/L。可以包含浓度为大约0.25％的结冷胶。
发育培养基的渗透势可以显著升高到超过维持培养基的渗透势。已经发现，具有高达360mM/kg或更高(例如450mM/kg)的重量摩尔渗透压浓度是有利的。发育优选在完全黑暗中，在22℃-25℃的温度下进行，直到子叶胚已经发育(例如达到解剖学成熟)。
成熟和层积处理：
在发育培养基BM3上7到12周后，将子叶胚分离成单个，并转移到层积处理培养基BM4上的滤纸支持物上。层积处理培养基BM4与发育培养基BM3类似，但是缺少脱落酸、PEG-8000和结冷胶。不含PEG的层积处理培养基的重量摩尔渗透压浓度典型低于150mM/kg，例如为大约120mM/kg。将胚在层积处理培养基上，在1℃到大约10℃之间，在暗处培养1周到8周，例如2周到6周。
干燥：将仍在其滤纸支持物上的成熟的胚从衬垫上抬起，在水上的密闭容器中，在97％到99％的相对湿度下，放置大约3周的时间。
萌发：通过将将仍然在滤纸支持物上的干燥的成熟胚，在用液体萌发培养基饱和的衬垫上放置大约24小时，使它们重新水化。然后将胚单个放置在固体BM5培养基上进行萌发。这是缺少生长激素的基本培养基，已经通过减少蔗糖、肌醇和有机氮而修改过。将胚在BM5培养基上，在23℃-25℃、16小时光-8小时暗的光周期的环境条件下，温育大约10周，直到获得的小植株具有发育良好的胚根和下胚轴，以及绿色的子叶结构和上胚轴。
因为降低了糖类的浓度，萌发培养基的渗透势进一步降低到低于发育培养基。通常低于大约150mM/kg(例如大约100mM/kg)。
实施例2
本实施例证明了将未成熟的火炬松(Pinus taeda)胚在重量摩尔渗透压浓度为365mM/kg的发育培养基(+10％PEG)上温育，然后在同样的发育培养基上层积处理，与将胚在重量摩尔渗透压浓度为365mM/kg的发育培养基上温育、然后在重量摩尔渗透压浓度低于150mM/kg的层积处理培养基(0.0％PEG)上层积处理相比，增加了胚的产量和成功的萌发。
方法：
按照实施例1中描述的方法从7种不同基因型的种子中取出了含有合子胚的雌性配子体。诱导和维持阶段按照实施例1中的描述，将胚性胚柄细胞团(ESM)培养物的储存物冷冻。
从低温储存物回收ESM培养物：
将每种基因型的一个小管融化在维持培养基BM2上的滤纸上。一旦培养物生长出足够的ESM，形成了宽度为大约1cm、高度为0.4cm的小丘后，将ESM从滤纸上收集下来，并清除掉愈合组织。这种转移过程以14天为周期继续进行，直到对于每种基因型收集到1-4个宽度为大约1cm、高度为0.4cm的ESM小丘。
维持和增殖
在从冷冻的储存物回收ESM后大约7周，将ESM培养物以1∶5的比例集中到含有100ml维持培养基的500ml培养瓶中。
发育：
600ml半固体发育培养基BM3(+10％PEG，重量摩尔渗透压浓度＝365mM/kg)在一半尺寸的(浅的)Cambro盒(深度为2″)中，产生了大约1/2英寸的培养基深度，将ESM培养物铺在该培养基上的尼龙膜上。对于每种基因型来说，总共24ml细胞被铺在两个一半尺寸的Cambro盒上。Cambro盒中每个框在12个液滴构造(a twelve dropconfiguration)中含有6ml细胞，每个盒含有总共12ml细胞。将细胞分配到每个框的12个液滴构造中，每个0.5ml。在铺板后，将Cambro盒在室温下放置在暗处，以进行为期12周的发育。在发育时期后，按照下面表3中的描述，对下面的层积处理进行了试验。
层积处理：
在发育培养基BM3上温育12周后，将处理组1和8中的胚转移到包含在一半尺寸的Cambro盒中的320ml层积处理培养基BM4(0.0％PEG，重量摩尔渗透压浓度＝120mM/kg)上的衬垫上。将处理组14中的胚在层积处理过程中维持在发育培养基BM3上。所有处理组的层积处理在4℃到7℃下进行4周。
表3：发育后处理条件的描述
  处理参考号  处理描述   试验的克隆的数量
  1(对照)  在室温下在发育培养基BM3中温育12周，在层积处理培养基BM4中层积处理1个月，COW1周，萌发5周。   61
  8  在室温下在发育培养基BM3中温育12周，在暗处在4-8℃下储存3个月，在层积处理培养基BM4中层积处理1个月，COW 1周，萌发5周。   30
  14  在室温下在发育培养基BM3中温育12周，发育后将Cambro盒在暗处在4℃到8℃下储存3个月，(不改变培养基)，COW1周，萌发5周。   15
在水上调节(COW)和分离成单个：
在层积处理后，通过喷雾分离将胚分离成单个，然后放置在98％相对湿度的环境中，在室温下在COW盒中在水上调节1周。
萌发：
在水上调节后，将每种处理(每种基因型)的75个胚用手转移到萌发培养基BM5上(每个Cambro盒中分配150ml培养基)。将这些胚放置在萌发培养基的顶部而不种植。每个盒中放置25个胚，产生每种基因型每种处理3个萌发盒。对任何剩余的胚进行计数，以确定总的胚的产量。
使用下列标准视觉选择用于萌发的胚：三片或以上可见的子叶；光滑的胚(没有形成愈合组织)；胚的颜色为象牙色、黄色或绿色，并且是不透明的；不选择融合在一起的胚；不选择具有宽而扁平的下胚轴的胚；以及细长的胚可以接受。
在人工将胚转移到含有萌发培养基的萌发盒之后，将盒在1℃到2℃放置3个月。然后将萌发盒移动到室温，在暗处放置7天，然后放置在光照房间中继续萌发。在萌发培养基上温育8周后，监测萌发物以确定它们是否准备好移植到温室中。处理1(对照)的萌发物当大部分满足选择标准时进行收获。所有随后的实验处理使用每种个体基因型克隆的对照萌发时间进行收获。
结果：
处理1(对照)与处理14之间的比较
本实验对比了在层积处理过程中将胚在发育培养基上继续温育(不使用层积处理培养基)(处理14)，与其中将胚在发育培养基上温育，然后在层积处理之前转移到层积处理培养基上的对照处理1。正如在下面的表4中显示的，与从处理1生产的胚相比，处理14产生的胚具有较高的萌发率，萌发物具有增加的发芽势。
表4：处理1和14的估算的平均萌发率和置信区间(n＝15个基因型)
  处理   估算的平均萌发率   90％置信区间(CI)下限   90％置信区间(CI)上限
  1(对照)   0.335   0.280   0.395
  14(在发育培养基上在冷储存中层积处理)   0.373   0.316   0.434
正如上面表4中所示，来自处理组14的胚的萌发率(37％)略高于对照处理1的(34％)，尽管观察到的差异没有统计学显著性(p＝0.42)。
表5：处理1和14的估算的平均存活率和置信区间(n＝15个基因型)
  处理   估算的平均存活率   90％置信区间下限   90％置信区间上限
  1   0.756   0.690   0.812
  14   0.748   0.686   0.802
正如上面表5中显示的，使用处理14产生的萌发物与处理1(对照)相比具有略微低的存活率(75％对76％)，但是差异没有统计学显著性(p＝0.87)。
观察到萌发物的发芽势的增加有利于处理14。在处理组14中包含的15个基因型中的13个，被发现与处理组1的胚相比，具有更茁壮的上胚轴、更长的根，或二者。尽管在本实验中没有测量器官的长度，但在移植前对每个处理组中的萌发物获取了照片。图2是一组在处理组1(对照)条件下产生的萌发物(图2A-2C)或在处理组14条件下产生的萌发物(图2D-2F)的照片。正如图2中所示，使用处理组14(图2D-F)与处理组1(对照)(图2A-2C)的条件相比，获得了萌发物发芽势的增加。
处理1、8与14的比较
本分析比较了在处理1、8和14中共有的基因型的结果，以便确定在温育和任选储存在发育培养基中之后如果将胚转移到层积处理培养基，是否对胚的萌发有害。萌发率结果显示在表6中。
表6：处理1、8和14的平均萌发率和置信区间(n＝7个基因型)
  处理   估算的平均萌发率   90％置信区间下限   90％置信区间上限
  1(对照)   0.396   0.315   0.484
  8   0.180   0.125   0.254
  14   0.403   0.321   0.491
表6中显示的对照和处理之间的萌发率的差异有统计学显著性(p＝0.0005)。在处理8和14之间的直接对比中，处理8明显低于处理14(p＝0.0008)和对照(p＝0.0011)。此外，处理8的胚在喷雾分离后被观察到是畸形的(数据未显示)。
概括和结论：这些结果证实了在层积处理过程中将胚在发育培养基(10％PEG，重量摩尔渗透压浓度＝365mM/kg)上继续温育(省略使用层积处理培养基)(处理组14)产生的胚，与其中将胚在发育培养基(10％PEG，重量摩尔渗透压浓度＝365mM/kg)上温育并在层积处理之前转移到层积处理培养基(0.0％PEG，重量摩尔渗透压浓度＝120mM/kg)上的处理组1和处理组8产生的胚相比，具有更高的萌发率，萌发物具有增加的发芽势。此外，正如在图2中所示，观察到萌发物发芽势的增加有利于处理14，其中包含在处理组14中的15种基因型中的13种，被观察到与处理组1的胚相比，具有更茁壮的上胚轴、更长的根，或二者。
实施例3
本实施例证明了在发育和层积处理之间省略培养基改变步骤，产生了具有增加的萌发率的胚。
方法：
按照实施例1中描述的方法从4种不同基因型的种子中取出了含有合子胚的雌性配子体。诱导、维持和发育阶段按照实施例1中的描述进行。
表7描述了发育后实验处理的条件。
表7：发育后处理条件
  处理参考号   描述
  1(对照)   在发育培养基修改的BM3(10％PEG，重量摩尔渗透压浓度＝336mM/kg)上温育12周，在层积处理培养基BM4(0％PEG，重量摩尔渗透压浓度＝120mM/kg)上层积处理4周
  2   在发育培养基修改的BM3(10％PEG，重量摩尔渗透压浓度＝336mM/kg)上温育12周，在层积处理培养基BM4(0％PEG，重量摩尔渗透压浓度＝120mM/kg)上层积处理8周
  3   在发育培养基修改的BM3(10％PEG，重量摩尔渗透压浓度＝336mM/kg)上温育12周，在发育后将Cambro盒在暗处、在4℃下、在同样的发育培养基上(不改变培养基)储存4周
  4   与处理3相同，在4℃下、在发育培养基上8周
在上面表7中显示的层积处理处理后，将每种基因型/处理的d框上的胚，喷雾分离到3个s框(全尺寸cambro盒)上。从每个s框中选择两个萌发盒，各含25个胚。对于每种基因型/处理产生了总共6个萌发盒。将胚放置在萌发培养基上，不种植在培养基中。在萌发培养基上温育6周后对萌发物进行评估。在所有1类植物上也测量了根的长度。
1类萌发物包括下列特征：出现1mm的根(没有小瘤)，出现大约5个长度为大约5mm的上胚轴叶，没有大尺度的下胚轴破裂，以及下胚轴弯曲不超过90度。
1+2类萌发物(双极)包括下列特征：出现1mm的根(没有小瘤)，并且出现肉眼可见的上胚轴叶(没有尺寸或数量要求)。
统计学分析：
存在4种处理，全部析因因子包括2种层积处理培养基(标准的和旧的发育培养基)乘以两种时间长度(4周和8周)。各种不同的培养基用于全图实验单位(whole plot experimental units)，温育时间长度用于分开的图。结果通过萌发率(1类和1类+2类)和根的长度进行评估。根的长度在进行自然对数转换以稳定方差后使用混合模型进行分析。1类和1类+2类萌发物使用统一化线性混合模型进行分析。
1类的萌发率结果显示在下面的表8中。
表8：1类平均萌发率(包含所有基因型)
  处理   平均萌发率   90％置信区间(CI)下限   90％置信区间(CI)上限
  1(对照)   0.083   0.046   0.143
  2   0.064   0.036   0.113
  3   0.098   0.056   0.167
  4   0.104   0.059   0.176
正如上面表8中所示，在处理3和4中1类萌发物的萌发率较高，其中胚在层积处理步骤中(即在4℃温育)维持在发育培养基上。
总的双极萌发率结果(1类+2类)显示在下面的表9中。
表9：总的双极萌发(1类+2类)的平均值(包含所有基因型)
  处理   平均萌发率   90％CI下限   90％CI上限
  1(对照)   0.300   0.202   0.422
  2   0.296   0.199   0.417
  3   0.243   0.147   0.374
  4   0.205   0.122   0.325
测试的4种基因型每种的1类萌发率或双极(1类+2类)萌发率的平均值，只变化了大约10-20％(数据未显示)。
平均根长度测量值的结果显示在表10中。
表10：平均根长度(包含所有基因型)
  处理   平均值(mm)   90％CI下限   90％CI上限
  1(对照)   13.5   10.3   17.7
  2   19.0   14.5   24.8
  3   12.8   9.8   16.8
  4   17.4   13.3   22.8
表11：来自3种模型的试验结果的比较
  变量   1类萌发物的P值   双极萌发物(1类+2类)的P值   根长度的P值
  用于层积处理的培养基((层积处理培养基对发育培养基)   0.07(发育培养基较好)   0.42   0.40
  时间长度(4周对8周)   0.30   0.09(4周较好)   ＜0.01(8周较好)
  培养基*时间长度   0.10   0.16   0.85
P值＜0.10表示显著的结果。
结果概述：就1类萌发来说，如表8中所示，对于在层积处理步骤(即在4℃温育)期间维持在发育培养基(修改的BM310％PEG，重量摩尔渗透压浓度＝336mM/kg)上的胚，观察到了萌发率有统计学显著差异(p＝0.07)。就时间长度来说，在发育培养基(修改的BM310％PEG，重量摩尔渗透压浓度＝336mM/kg)上层积处理的胚，得益于附加的4周温育，而在层积处理培养基(BM40.0％PEG，重量摩尔渗透压浓度＝120mM/kg)上的胚则没有。观察到的总体低的萌发值，可以通过在发育过程中使用早期分离成单个、然后在分离成单个后在整个层积处理期间将胚维持在发育培养基上来提高。
总体来说，这些结果表明，在最初的发育培养基上进行层积处理步骤(即省略将胚转移到层积处理培养基的步骤)，对于获得更发芽势的1类萌发来说是有利的。这是显著的结果，因为省略向层积处理培养基的转移，允许发育、储存和层积处理都在同样的发育培养基上进行，使得工艺过程更加有效得多。例如，省略将胚从发育培养基转移到层积处理培养基，减少了劳力、层积处理培养基的制备以及附加的cambro盒的制备。
实施例4
本实施例测定了发育和层积处理处理过程中培养基体积和培养基深度对体细胞胚萌发率的影响。
方法：
按照实施例1中描述的方法从4种不同基因型的种子中取出了含有合子胚的雌性配子体。诱导和维持阶段按照实施例1中的描述进行，不同之处在于将ESM铺展在发育框架上的筛网上，而不是滴加铺板。
发育和层积处理步骤按照下面表12中显示的进行。本实验中所有的胚在初始的重量摩尔渗透压浓度为336mM/kg的发育培养基(10％PEG)上温育12周，然后如表12中所示层积处理4周。
表12：发育和层积处理
  处理   培养基体积   Cambro盘深度   发育和层积处理之间是否有培养基转移？   在4℃下层积处理
  1(对照)   600ml   浅(2″)   是   层积处理培养基(BM4，0.0％PEG，osmol＝120mM/kg)
  2   900ml   浅(2″)   是   层积处理培养基(BM4，0.0％PEG，osmol＝120mM/kg)
  3   1200ml   浅(2″)   是   层积处理培养基(BM4，0.0％PEG，osmol＝120mM/kg)
  4(对照)   600ml   深(4″)   是   层积处理培养基(BM4，0.0％PEG，osmol＝120mM/kg)
  5   900ml   深(4″)   是   层积处理培养基(BM4，0.0％PEG，osmol＝120mM/kg)
  6   1200ml   深(4″)   是   层积处理培养基(BM4，0.0％PEG，osmol＝120mM/kg)
  7   600ml   浅(2″)   否   发育培养基(修改的BM310％PEG，osmol＝336mM/kg)
  8   900ml   浅(2″)   否   发育培养基(修改的BM310％PEG，osmol＝336mM/kg)
  9   1200ml   浅(2″)   否   发育培养基(修改的BM310％PEG，osmol＝336mM/kg)
  10   600ml   深(4″)   否   发育培养基(修改的BM310％PEG，osmol＝336mM/kg)
  11   900ml   深(4″)   否   发育培养基(修改的BM310％PEG，osmol＝336mM/kg)
  12   1200ml   深(4″)   否   发育培养基(修改的BM310％PEG，osmol＝336mM/kg)
发育后，所有的处理按照下面的描述进行，一直到萌发。
层积处理：如表12中所示，对于处理1-6来说，将铺在D-框架上的胚移动到层积处理培养基(BM4，0.0％PEG，osmol＝120mM/kg)。对于处理7-12来说，铺在发育培养基(修改的BM310％PEG，osmol＝336mM/kg)上的D-框架上的胚，在层积处理过程中保留在同样的发育培养基上。
在发育培养基上温育12周后，测定每种处理的胚的总产量。在水上的调节(COW)在大的1x1cambro盒中进行1周。
萌发：将每种处理的100个胚人工转移到萌发盒中。用于萌发的胚的选择标准是：选择具有所有三个部分(子叶、下胚轴和胚根区)、且没有明显缺陷的对称的胚，具有4片或以上的子叶，没有任何融合的子叶或从中心萌发的子叶。胚的尺寸是可变的。胚是不透明的，具有所有白色、黄色或绿色色调的颜色。不选择半透明或玻璃状的绿色胚。萌发率在6周时评估。
结果：
表13显示了发育和层积处理过程中培养基体积、盘的深度和培养基深度对平均胚产量的影响，使用线性混合模型进行分析。
表13：发育和层积处理过程中培养基体积、盘深度和培养基深度的统计学显著性
  处理变量   DF(自由度)   P-值
  培养基体积   2   0.073
  盘深度   1   0.009
  培养基深度   2   0.177
如上面表13所述，Cambro盒的深度(盘深度)对胚产量的影响是统计学显著的，p-值为0.009。培养基体积的影响是弱显著的，p-值为0.073，而对于这些变量之间的相互影响没有观察到统计学显著性。
表14显示了对于每种培养基体积和盘深度水平估算的平均产量(“LS平均值”)，以及95％置信区间。正如在表14中的组列中显示的，同样组字母内的变量在90％置信度水平下不是统计学显著的，而不同组字母的因子是统计学显著的。
表14：发育和层积处理过程中培养基体积和盒深度对胚产量的影响
 变量   估算的胚产量   90％CI下限   90％的CI上限   组
 培养基体积：600ml   641   421   861   A
 培养基体积：900ml   785   575   994   B
 培养基体积：1200ml   780   570   990   B
 盘深度：浅(2″)   650   432   869   A
 盘深度：深(4″)   820   616   1024   B
如上面表14中所示，含有900ml和1200ml培养基体积的cambro盒与含有600ml培养基体积的盒相比，产生了统计学显著高的胚产量。900ml和1200ml体积处理彼此之间没有显著差别，每个的估算产量与来自600ml体积的cambro盒的产量相比，每个盒高出大约140个胚。
表15：在层积处理培养基或发育培养基上层积处理(即在4℃温育)后胚产量的比较
  处理   培养基体积   Cambro盘   层积处理   胚产量
  1(对照)   600ml   浅(2″)，(培养基深度＝1/2″)   层积处理培养基   668
  2   900ml   浅(2″)，(培养基深度＝3/4″)   层积处理培养基   746
  3   1200ml   浅(2″)，(培养基深度＝1″)   层积处理培养基   755
  4(对照)   600ml   深(4″)   层积处理培养基   863
  5   900ml   深(4″)   层积处理培养基   794
  6   1200ml   深(4″)   层积处理培养基   843
  7   600ml   浅(2″)   发育培养基   612
  8   900ml   浅(2″)   发育培养基   821
  9   1200ml   浅(2″)   发育培养基   803
  10   600ml   深(4″)   发育培养基   757
  11   900ml   深(4″)   发育培养基   843
  12   1200ml   深(4″)   发育培养基   821
如上表15中所示，在具有较高量培养基(900ml和1200ml)的Cambro盒上进行胚的发育和层积处理，与对照量的培养基(600ml)相比，显示处统计学显著的更高的胚产量。这些培养基体积处理之间估算的差值为每盒大约140个胚。此外，深的Cambro盒(4″)与浅的Cambro盒(2″)相比，显示出统计学显著的较高的胚产量。这两种盒深度处理之间的估算的差值是每盒大约170个胚。
重量摩尔渗透压浓度测量：在发育培养基上温育12周后，测量了培养基的重量摩尔渗透压浓度。发育培养基的初始重量摩尔渗透压浓度为336mM/kg(10％PEG)。结果显示在下面的表16中。
表16：在12周发育温育后发育培养基的重量摩尔渗透压浓度的变化
  处理条件   重量摩尔渗透压浓度(mM/kg)
  对照浅cambro盒(2″)(600ml)   160
  浅cambro盒：900ml   200
  浅cambro盒：1200ml   220
  对照深cambro盒(4″)(600ml)   170
  深cambro盒：900ml   190
  深cambro盒：1200ml   210
结论：如表16中所示，在12周的温育后，较高的发育培养基体积维持了较高的重量摩尔渗透压浓度。但是，使用初始重量摩尔渗透压浓度为336mM/kg的发育培养基，即使增加培养基体积，也没有盒子在12周后将重量摩尔渗透压浓度维持在250mM以上。
萌发数据
使用广义线性混合模型，分析了培养基体积、盒子深度和层积处理对胚的萌发率的影响。该模型中的随机影响是批次和批次中的cambro盒。
1类萌发物：
1类萌发物按照实施例3中的描述进行评估。
表17显示了对于每种层积处理估算的平均1类萌发率，以及90％置信区间。
 处理条件  平均萌发率(1类)   90％CI下限   90％CI上限   组
 层积处理培养基(发育后培养基改变成层积处理培养基(w/o PEG))   4.1％   0.020   0.084   A
 维持在发育培养基(+PEG)上   6.7％   0.034   0.130   B
表17中显示的具有同样组水平的处理条件，在90％置信水平上不是统计学显著的，而具有不同组字母的处理条件是显著不同的。
正如上面表17中所示，层积处理过程中维持在发育培养基(+PEG)上的胚产生的1类萌发物的频率，与层积处理前从发育培养基转移到层积处理培养基(无PEG)的胚产生的1类萌发物的频率相比，存在显著的差异(p＝0.007，置信水平90％)。
1+2类萌发物如下进行评估：1+2类萌发物(双极)包括下列特点：出现1mm的根(没有小瘤)，出现肉眼可见的上胚轴叶(没有尺寸或数量要求)。
表18显示了对于每种层积处理估算的平均1类萌发率，以及90％置信区间。
 处理条件  平均萌发率(1类)   90％CI下限   90％CI上限   组
 层积处理培养基(发育后培养基改变成层积处理培养基(w/o PEG))   7.0％   0.037   0.128   A
 维持在发育培养基(+PEG)上   11.5％   0.064   0.198   B
表18中显示的具有同样组水平的处理条件，在90％置信水平下不是统计学显著的，而具有不同组字母的处理条件是显著不同的。
正如上面的表18中所示，层积处理过程中维持在发育培养基(+10％PEG，重量摩尔渗透压浓度＝336mM/kg)上的胚产生的1+2类萌发物的频率，与层积处理前从发育培养基转移到层积处理培养基(0.0％PEG，重量摩尔渗透压浓度＝120mM/kg)的胚产生的1+2类萌发物的频率相比，存在显著的差异(p＝0.002，置信水平90％)。
对于按照表12中所述使用处理1到6产生的胚获得的1类和1+2类萌发物的萌发率，也进行了评估。在萌发率中观察到的差异的统计学分析结果，显示在下面的表19中。
表19：使用不同处理方法观察到的萌发差异的统计学显著性。
  处理条件   DF  在1类萌发率中观察到的差异(p-值)  在1+2类萌发率中观察到的差异(p-值)
  培养基体积(600ml对照对900ml或1200ml)   2   0.453   0.454
  盒深度(浅的2″对深的4″)   1   0.943   0.791
  层积处理培养基(发育后培养基改变为层积处理培养基(w/oPEG)对在层积处理过程中维持在发育培养基上)   1   0.007   0.002
  培养基*深度   2   0.820   0.879
  培养基*层积处理   2   0.424   0.654
  深度*层积处理   1   0.348   0.340
  培养基*深度*层积处理   2   0.914   0.918
正如上面表19中所示，当对用不同培养基体积、不同盒深度和不同层积处理培养基条件进行胚的处理后观察到的萌发率的差异的显著性进行分析时，只有在不同层积处理培养基条件后观察到的差异是统计学显著的。对于1类萌发物(0.007)和1类+2类萌发物(0.002)二者来说，都观察到了层积处理培养基条件中的统计学显著性差异。
这是重要的结果，表明将胚在初始重量摩尔渗透压浓度为至少300mM/kg到450的发育培养基上、在室温温育7到12周的时间，然后将胚在同样的发育培养基上进行层积处理、即将发育培养基上的胚转移到0℃到10℃至少1周的方法，导致了胚产量的增加(如实施例2-3中所述)，并增加了胚的频率和改善了萌发物的发芽势(如实施例2和图2中所示(显示了在处理14中的15种基因型中的13种中，观察到了具有更茁壮的上胚轴，更长的根，或二者))。这些结果与对照方法进行了对比，对照方法包括将胚从发育培养基(重量摩尔渗透压浓度为至少300mM/kg)转移到层积处理培养基(重量摩尔渗透压浓度为120mM/kg)，然后在1℃到10℃层积处理至少1周。
因此，在层积处理过程中将胚维持在发育培养基上的方法，提供了意料之外的增加胚产量和增加萌发率的优点。本发明的方法还提供了由于减少了步骤数量而容易操作大量胚、以及在萌发前能够将发育后阶段的胚在1℃到10℃下层积处理和任选储存长达3个月到6个月的优点。
尽管已经对本发明的优选实施方案进行了说明和描述，但应该认识到，在其中可以进行各种不同的改变，而不背离本发明的精神和范围。

Claims (15)

1.用于产生层积处理的针叶树子叶体细胞胚的方法，包括：
(a)将含有未成熟的针叶树体细胞胚的培养物，在含有重量摩尔渗透压浓度为300mM/Kg到450mM/Kg的发育培养基的培养容器中，在22℃到25℃的温度下温育第一段温育时间，该时间长度足以使至少一部分胚达到解剖学成熟，所述发育培养基含有浓度为1％到15％的聚乙二醇；以及
(b)将胚维持在步骤(a)的培养容器和发育培养基中，以及将成熟的胚在0℃到10℃的温度下进行至少1周的第二段温育时间，以产生层积处理的子叶体细胞胚。
2.权利要求1的方法，其中发育培养基含有浓度为7％到15％的聚乙二醇。
3.权利要求1的方法，其中第一段温育时间为7周到12周。
4.权利要求1的方法，其中第二段温育时间为1周到8周。
5.权利要求1的方法，其中第二段温育时间为1周到6个月。
6.权利要求1的方法，还包括将步骤(b)处理的胚在萌发培养基中或其上进行培养，以产生萌发物。
7.权利要求1的方法，其中第一种培养物中的胚在第一段温育时间之前分离成单个。
8.用于生产子叶体细胞胚的方法，包括：
(a)将含有针叶树子叶前体细胞胚的培养物在第一种发育培养基中或其上温育第一段温育时间；
(b)将步骤(a)处理的大量胚分离成单个；
(c)将多个分离成单个的针叶树子叶体细胞胚，在含有重量摩尔渗透压浓度为300mM/Kg到450mM/Kg的第二种发育培养基的培养容器中，在22℃到25℃的温度下培养第二段温育时间，该时间长度足以使至少一部分胚达到解剖学成熟，所述第二种发育培养基含有浓度为1％到15％的聚乙二醇；以及
(d)将胚维持在步骤(c)的培养容器和发育培养基，以及将成熟的胚在0℃到10℃的温度下进行至少1周的第三段温育时间，以产生层积处理的子叶体细胞胚。
9.权利要求8的方法，其中第二种发育培养基含有浓度为8％到15％的聚乙二醇。
10.权利要求8的方法，其中第一段温育时间为6周到8周。
11.权利要求8的方法，其中第一段温育时间与第二段温育时间的组合，合计为至少12周的时间长度。
12.权利要求8的方法，其中第三段温育时间为1周到6个月。
13.权利要求8的方法，其中第三段温育时间为1周到8周。
14.权利要求8的方法，其中培养容器中分离成单个的胚彼此没有物理接触。
15.权利要求8的方法，还包括将步骤(d)处理的胚在萌发培养基中或其上进行培养，以产生萌发物。
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