FI126715B - Menetelmiä somaattisten alkioiden tuottamiseksi - Google Patents

Description

Menetelmiä somaattisten alkioiden tuottamiseksi

Keksinnön ala

Esillä oleva keksintö koskee menetelmiä kasvialkioiden tuottamiseksi in vitro ja valinnaisesti kasvien tuottamista näistä kasvialkioista.

Tausta

Havupuiden (esim. mäntyjen ja kuusien) kysyntä puutuotteiden valmistukseen kasvaa jatkuvasti. Yksi ehdotettu ratkaisu tähän ongelmaan on sellaisten yksittäisten puiden tunnistaminen, joilla on toivottuja ominaisuuksia, kuten nopea kasvunopeus, ja useiden geneettisesti identtisten kloonien tuottaminen valiopuista somaattisella kloonauksella.

Somaattinen kloonaus on menetelmä, jossa tuotetaan geneettisesti identtisiä puita muusta puukudoksesta kuin koiras- ja naaraspuolisista sukusoluista. Yhdessä somaattisen kloonauksen lähestymistavassa kasvikudosta viljellään aloitusalustalla, joka sisältää hormoneja, kuten auksiineja ja/tai sytoki-niinejä, jotka käynnistävät sellaisten embryogeenisten solujen muodostumisen, jotka kykenevät kehittymään somaattisiksi alkioiksi. Tämän jälkeen embryo-geenisiä soluja jatkoviljellään ylläpitoalustalla, joka edistää embryogeenisten solujen moninkertaistumista esisirkkalehtisten alkioiden (eli alkioiden, joissa ei ole sirkkalehtiä) muodostumiseksi. Tämän jälkeen moninkertaistuneita embryo-geenisiä soluja viljellään kypsytysalustassa, joka edistää sellaisten sirkkalehtis-ten somaattisten alkioiden kehittymistä, jotka voidaan esimerkiksi asettaa kei-nosiemeniin ja kylvää maahan, jossa ne itävät ja muodostavat havupuun-taimia. Taimet voidaan siirtää jatkokasvatuspaikkaan, jossa ne kasvavat ja josta ne lopulta korjataan puutavaran tai puusta valmistettujen tuotteiden aikaansaamiseksi.

Havupuualkioiden somaattisen kloonauksen tehokkuuden parantamiseen on jatkuva tarve, jotta saadaan lisättyä sellaisten sirkkalehtisten somaattisten havupuualkioiden tuotantoa, jotka kykenevät itämään ja muodostamaan havupuukasveja. In vitro muodostetut havupuiden somaattiset alkiot ovat edullisesti fysikaalisesti ja fysiologisesti samanlaisia kuin havupuiden siemenissä in vivo muodostuneet havupuiden tsygoottiset alkiot tai identtisiä näiden kanssa. Esillä oleva keksintö tarjoaa tähän tarpeeseen sopivia menetelmiä Pinus-suvun havupuille.

Yhteenveto

Erään aspektin mukaan toteutetaan menetelmä stratifioitujen sirkka-lehtisten somaattisten havupuualkioiden tuottamiseksi. Menetelmässä (a) in-kuboidaan epäkypsiä somaattisia havupuualkioita käsittävä viljelmä viljelyasti-assa, joka käsittää kypsytysalustan, jonka osmolaalisuus on alueella 300 mM/kg - 450 mM/kg, 22 °C - 25 °C:n lämpötilassa ensimmäisen inkubaatiojak-son ajan, joka on riittävän pitkä, jotta ainakin osa alkioista saavuttaa anatomisen kypsyyden, jolloin anatominen kypsyys käsittää sen, että alkiossa on kehittyneet sirkkalehdet ja sirkkavarsi; ja (b) ylläpidetään alkiot viljelyastiassa ja vaiheen (a) mukaisella kypsytysalustalla, jonka osmolaarisuus on alueella 300 mM/kg - 459 mM/kg, ja saatetaan kypsät alkiot 0 °C - 10 °C:n lämpötilaan vähintään yhden viikon pituisen toisen inkubaatiojakson ajaksi stratifioitujen sirk-kalehtisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi.

Erään toisen aspektin mukaan toteutetaan menetelmä sirkkalehtis-ten somaattisten alkioiden tuottamiseksi. Menetelmässä (a) inkuboidaan sirk-kalehtisiä somaattisia havupuualkioita käsittävä viljelmä viljelyastiassa tai -astialla, jonka osmolaarisuus on alueella 300 mM/kg - 450 mM/kg, ensimmäisen inkubaatiojakson ajan; (b) singuloidaan useita vaiheen (a) mukaisesti käsiteltyjä alkioita; (c) viljellään nämä useat singuloidut sirkkalehtiset somaattiset havupuualkiot viljelyastiassa, joka käsittää kypsytysalustan, jonka osmolaalisuus on alueella 300 mM/kg - 450 mM/kg, 22 °C - 25 °C:n lämpötilassa toisen inkubaatiojakson ajan, joka on riittävän pitkä, jotta ainakin osa alkioista saavuttaa anatomisen kypsyyden, jolloin anatominen kypsyys käsittää sen, että alkiossa on kehittyneet sirkkalehdet ja sirkkavarsi; ja (d) ylläpidetään alkiot viljely-astiassaja vaiheen (c) mukaisella kypsytysalustalla, jonka osmolaarisuus on alueella 300 mM/kg - 459 mM/kg, ja saatetaan kypsät alkiot 0 °C - 10 °C:n lämpötilaan vähintään yhden viikon mittaisen kolmannen inkubaatiojakson ajaksi stratifioitujen sirkkalehtisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi.

Keksinnön mukaiset menetelmät ovat hyödyllisiä kypsien, stratifioitujen somaattisten havupuualkioiden valmistamiseksi siten, että niillä on suurempi itämisfrekvenssi ja -voima, joita voidaan haluttaessa edelleen karakterisoida esimerkiksi geneettisin tai biokemiallisin keinoin ja/tai idättää havupuiden tuottamiseksi. Keksinnön mukaisia menetelmiä voidaan siis käyttää esimerkiksi, kun halutaan tuottaa tehokkaammin yksittäisistä havupuista klooneja, joilla on yksi tai useampia toivottuja ominaisuuksia, kuten nopeampi kasvu tai parempi puunlaatu.

Piirustusten kuvaus

Edellä esitetyt keksinnön aspektit ja monet niihin liittyvistä eduista tulevat selvemmiksi samalla kun ne tulevat paremmin ymmärretyiksi seuraa-van yksityiskohtaisen kuvauksen yhteydessä, kun se yhdistetään oheisiin piirustuksiin, joissa: kuvio 1 on kaavioesitys somaattisten havupuualkioiden varhaisista ja myöhäisistä kehitysvaiheista; kuvio 2 on valokuvaryhmä taimista, jotka on tuotettu käsittelyryh-mässä 1 (vertailu)olosuhteissa (kuviot 2A - 2C) tai käsittely ryhmän 14 mukaisissa olosuhteissa (kuviot 2D - 2F), ja se osoittaa, että käsittelyryhmän 14 olosuhteissa itäneet siemenet olivat elinvoimaisempia, kuten esimerkissä 2 on kuvattu; kuvio 2A on valokuva käsittelyryhmän 1, S-kehyksen 1 mukaisista itäneistä siemenistä; kuvio 2B on valokuva käsittelyryhmän 1, S-kehyksessä 2 itäneistä siemenistä; kuvio 2C on valokuva käsittelyryhmän 1, S-kehyksessä 3 itäneistä siemenistä; kuvio 2D on valokuva käsittelyryhmän 14, S-kehyksessä 1 itäneistä siemenistä; kuvio 2E on valokuva käsittelyryhmän 14, S-kehyksessä 2 itäneistä siemenistä; ja kuvio 2F on valokuva käsittelyryhmän 14, S-kehyksessä 3 itäneistä siemenistä.

Yksityiskohtainen kuvaus

Ellei erityisesti ole määritelty, kaikilla tässä keksinnössä käytetyillä termeillä on sama merkitys kuin niillä olisi keksinnön alaan perehtyneelle ammattilaiselle. Tässä esityksessä termi ”kehitysaste” viittaa somaattisen kloonauksen jaksoon, jonka aikana epäkypsässä alkiossa tapahtuu histogeneesi ja kudokset sekä elimet kasvavat täysikasvuiseksi kypsäksi alkioksi, joka kykenee itämään kasviksi. Tässä esityksessä termi ”epäkypsä alkio” viittaa alkioon, joka ei vielä kykene itämään kasviksi, ja se sisältää varhaisen kehitysvaiheen (eli esisirk- kalehtiset) ja keskivaiheen alkiot (eli alkiot, joissa sirkkalehdet tai sirkkavarret eivät ole vielä kokonaan kehittyneet). Tässä esityksessä termillä ”anatominen kypsyys” viitataan alkioon, jossa on kehittyneet sirkkalehdet ja sirkkavarsi. Tässä esityksessä termillä ”sirkkalehtinen alkio” viitataan alkioon, jossa on selvä, pitkänomainen bipolaarinen rakenne, jossa latenttien meriste-maattisten keskustojen yhdessä päässä on yksi tai useampi selvästi erottuva sirkkalehtialku ja vastakkaisessa päässä latentti juuri. Tässä esityksessä termillä ”esisirkkalehtinen alkio” viitataan alkioon, jossa ei vielä ole sirkkalehtiä. Tässä esityksessä termillä ”normaalisti itänyt siemen” ilmaistaan kasvin kaikkien odotettujen osien läsnäoloa arvioinnin hetkellä. Kasvin odotetut osat sisältävät juuren, sirkkavarren, yhden tai useamman sirkkalehden ja epi-kotyylin. Paljassiemenisillä normaalisti itäneelle siemenelle on tunnusomaista alkujuuri, joka on pidempi kuin 3 mm ja jossa ei ole selvästi erottuvia epämuodostumia verrattuna luonnonsiemenistä itäneiden alkioiden ulkonäköön. Tässä esityksessä termillä ”alkujuuri” viitataan kasvialkion osaan, joka kehittyy tuloksena olevan kasvin ensisijaiseksi juureksi. Tässä esityksessä termillä ”sirkkavarsi” viitataan kasvialkion tai taimen osaan, joka on sirkkalehtien alapuolella, mutta alkujuuren yläpuolella. Tässä esityksessä termillä ”epikotyyli” viitataan taimen varren osaan, joka on sirkkalehtien yläpuolella. Tässä esityksessä termillä ”alkiosuspensorisolukkomassa” (embryonal suspensor mass) tai ”ESM” viitataan solukkomassaan, joka maljataan ravintoalustalle, joka on joko puolikiinteää geeliä tai nestemäisenä huokoisena matriisina ja kykenee tarjoamaan fyysisen tuen ja johon massa jätetään kasvamaan enimmillään kolmen kuukauden ajaksi. Kolme kuukautta kestävän inkubaation aikana somaattisia alkioita kasvaa mikroskooppisista esiasteen soluryhmistä näkyviksi varhaisvaiheen alkioiksi ja lopulta anatomisesti kypsiksi alkioiksi. ESM:n rakenne useiden viikkojen inkubaation jälkeen koostuu tyypillisesti proliferoituneesta huokoisesta aineesta, jossa on useita alkioita suorassa kosketuksessa alustoihin, mutta useimmat alkiot muodostuvat edelleen prolife-roituvan solukkomassan päälle tai sivulle. Tässä esityksessä termillä ”stratifikaatio” tarkoitetaan alkioiden altistamista kylmäkäsittelylle (esim. 0 °C - 10 °C) ennen idätystä. Stratifikaatio (useimmiten jäähdytys) on käsittely, jota käytetään useiden lauhkeiden aluei- den lajien siemenissä olevan itämisvastustuksen voittamiseksi (Taylor & Waring, Plant, Cell, And Environment 2:165-171, 1979).

Ellei toisin ole mainittu, kaikki prosentteina esitetyt konsentraatioar-vot ovat paino/tilavuus-prosentteja.

Keksinnön mukaisten menetelmien yhteydessä on yllättäen todettu, että kun epäkypsiä somaattisia havupuualkioita viljellään kypsytysalustassa tai -alustalla, jonka osmolaalisuus on alueella 300 mM/kg - 450 mM/kg, ensimmäisen inkubaatiojakson ajan ja kun sen jälkeen seuraava alkioiden viljely tehdään samalla kypsytysalustalla 0 °C - 10 °C:n lämpötilassa toisen inkubaatiojakson ajan, tuloksena saadaan alkioita, joilla on suurempi itämisfrekvenssi ja elinvoima kuin alkioilla, joita inkuboidaan kypsytysalustassa ja sitten siirretään stratifikaatioalustaan, jonka osmolaalisuus on alle 150 mM/kg, ja altistetaan kylmäkäsittelylle (stratifikaatio), kuten esimerkeissä 2 - 4 on kuvattu. Paremman itämisfrekvenssin ja itäneiden siementen suuremman elinvoiman lisäksi kasvualustan siirtovaiheen poisjäänti kypsytyksen ja stratifikaation välistä saa aikaan useita muita etuja, joihin kuuluvat yksinkertaisempi sirkkalehtisten alkioiden tuotanto ja valinnaisesti alkioiden kylmävarastointi kypsytysalustalla ennen idätystä, jolloin saadaan joustavuutta ajoitukseen ja alkioiden käyttöön. Keksinnön mukaisten menetelmien avulla on mahdollista kerätä ja synkronoida alkiopopulaatioita ennen käytännön kokeita.

Edellä olevan mukaisesti yhtenä aspektina toteutetaan menetelmä stratifioitujen sirkkalehtisten somaattisten havupuualkioiden tuottamiseksi. Menetelmässä (a) inkuboidaan epäkypsiä somaattisia havupuualkioita käsittävä viljelmä viljelyastiassa, joka käsittää kypsytysalustan, jonka osmolaalisuus on alueella 300 mM/kg - 450 mM/kg, 22 °C - 25 °C:n lämpötilassa ensimmäisen inkubaatiojakson ajan, joka on riittävän pitkä, jotta ainakin osa alkioista saavuttaa anatomisen kypsyyden; ja (b) kohdistetaan viljelyastiassa oleviin alkioihin vaiheen (a) mukaisesti 0 °C -10 °C:n lämpötila vähintään yhden viikon pituisen toisen inkubaatiojakson ajan stratifioitujen sirkkalehtisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi.

Keksinnön mukaisia menetelmiä voidaan käyttää sirkkalehtisten somaattisten havupuualkioiden muodostamiseksi mistä tahansa havupuusta, kuten Pinus-suvun jäsenistä, esim. loblolly-männystä (Pinus taeda) ja radiata-männystä. Myös esimerkiksi douglasinkuusen alkioita voidaan tuottaa keksinnön mukaisilla menetelmillä.

Keksinnön mukaisilla menetelmillä tuotettu kypsien somaattisten havupuualkioiden populaatio kehittyy havupuukasveiksi tehokkaammin kuin somaattisten havupuualkioiden populaatio, joka tuotetaan muuten identtisellä ohjausmenetelmällä, johon kuuluu jälkikypsytysvaihe, jossa alkioita siirretään kypsytysalustoilta, jonka osmolaalisuus on välillä 300 mM/kg - 450 mM/kg, strat if i kaatioa I u sto i I le, joissa osmolaalisuus on alle 150 mM/kg.

Keksinnön mukaisissa menetelmissä epäkypsiä somaattisia havu-puualkioita käsittävää viljelmää, kuten alkiosuspensorisolukkomassoja (EMS-solukkoja), inkuboidaan ennen stratifikaatiota ensimmäisen inkubaatioajan kypsytysalustassa, joka edesauttaa sirkkalehtisten alkioiden kehittymistä.

Epäkypsiä somaattisia havupuualkioita, kuten esimerkiksi esisirkka-lehtisiä somaattisia havupuualkioita, voidaan valmistella somaattisista havu-puusoluista, kuten havupuualkioista saaduista soluista. Havupuualkioista saatuja soluja voidaan esimerkiksi indusoida hormoneilla muodostamaan alkiosuspensorisolukkomassoja (EMS-solukkoja), joita voidaan käsitellä keksinnön mukaisesti kypsien somaattisten havupuualkioiden saamiseksi. ESM-solukkoja voidaan valmistella esimerkiksi siemenistä otetuista esisirkkalehtisistä alkioista. Siemenet esimerkiksi pintasteriloidaan ennen esisirkkalehtisten alkioiden ottamista, minkä jälkeen alkioita viljellään induktioalustalla tai -alustassa, joka voi muodostua ESM-solukkoja, joihin kuuluu myös varhaisen vaiheen alkioita, jotka ovat silmikoitumisella tai vakoutumisella tapahtuvassa moninkertaistu-misprosessissa. ESM-solukkoja viljellään tyypillisesti ylläpitoalustassa esisirkkalehtisten somaattisten alkioiden muodostamiseksi. Ei-rajoittavia esimerkkejä ESM-viljelyolosuhteista ja sopivia induktio- ja ylläpitoalustoja kuvataan alla lisää.

Induktio

Joissain suoritusmuodoissa somaattisia havupuualkioita siis viljellään induktioalustassa tai -alustalla embryogeneettisten solujen aikaansaamiseksi. Embryogeneettiset solut ovat soluja, jotka kykenevät tuottamaan yhden tai useampia sirkkalehtisiä somaattisia havupuualkioita ja joihin sisältyy esimerkiksi havupuun alkiosuspensorisolukkomassoja. Induktioalustaan kuuluu tyypillisesti epäorgaanisia suoloja ja orgaanisia ravintoaineita. Induktioalustan osmolaalisuus on tyypillisesti noin 160 mg/kg tai jopa pienempi, mutta se voi olla jopa 170 mM/kg. Induktioalustaan kuuluu tyypillisesti kasvuhormoneja. Esimerkkejä hormoneista, joita induktioalusta voi sisältää, ovat auksiinit (esim. 2,4-diklorofenoksietikkahappo (2,4-D)) ja sytokiinit (esim. 6-bentsyyliamino- puriini (BAP)). Auksiineja voidaan käyttää esimerkiksi 1 mg/l - 200 mg/l:n kon-sentraatiossa. Sytokiineja voidaan käyttää esimerkiksi 0,1 mg/l - 10 mg/l kon-sentraatiossa.

Induktioalusta voi sisältää absorbenttikoostumusta, erityisesti kun käytetään korkeita kasvuhormonitasoja. Absorbenttikoostumus voi olla mikä tahansa koostumus, joka ei ole toksinen embryogeneettisille soluille näiden menetelmien yhteydessä käytettävissä konsentraatioissa ja joka kykenee absorboimaan kasvua edistäviä hormoneja ja toksisia yhdisteitä, joita alustassa olevat kasvisolut tuottavat alkion kasvun aikana. Ei-rajoittavia esimerkkejä hyödyllisistä absorbenttikoostumuksista ovat mm. puuhiili, liukoinen po-ly(vinyylipyrrolidoni), liukenematon poly(vinyylipyrrolidoni), aktivoitu alumiinioksidi ja silikageeli. Absorbenttikoostumusta voi olla läsnä määränä, joka on esimerkiksi noin 0,1 g/l - noin 5 g/l. Eräs esimerkki keksinnön toteutuksessa hyödyllisestä induktioalustasta on alusta BMi, joka on tässä esitetty esimerkissä 1. Induktioalusta on tyypillisesti kiinteä ja se voidaan kiinteyttää geeliyttä-misaineella.

Somaattisia havupuualkioita viljellään tyypillisesti induktioalustassa tai -alustalla 3-10 viikon ajan, esimerkiksi 6-8 viikkoa, lämpötilassa, joka on 10 °C - 30 °C, esimerkiksi 15 °C - 25 °C tai 20 °C - 23 °C.

Ylläpito

Ylläpitoalusta voi olla kiinteä alusta tai se voi olla nestemäinen alusta, jota voidaan sekoittaa embryogeneettisen kudoksen kasvun ja moninkertaistumisen edistämiseksi. Ylläpitoalusta osmolaalisuus on tyypillisesti suurempi kuin induktioalustan osmolaalisuus, tyypillisesti välillä 180 - 400 mM/kg. Ylläpitoalusta voi sisältää ravintoaineita, jotka vahvistavat embryogeneettistä kudosta ja hormoneja, kuten yhden tai useampia auksiineja ja/tai sytokiinejä, jotka edistävät embryogeneettisen kudoksen solujen jakautumista ja kasvua. Tyypillisesti hormonikonsentraatiot ylläpitoalustassa ovat pienempiä kuin niiden konsentraatiot induktioalustassa.

On yleensä toivottavaa, vaikka ei välttämätöntä, sisällyttää ylläpito-alustaan maltoosia ainoaksi tai pääasialliseksi metaboloitavaksi sokeri lähteeksi. Esimerkkirajat käyttökelpoisista maltoosikonsentraatioista ovat noin 1 % -noin 2,5 %. Esimerkki sopivasta ylläpitoalustasta on BlVh-alusta, joka on esitetty tässä esimerkissä 1. Embryogeneettisiä havupuusoluja siirretään tyypillisesti tuoreeseen ylläpitoalustaan kerran viikossa.

Kypsytys

Keksinnön tämän aspektin menetelmien mukaan epäkypsiä somaattisia havupuualkioita käsittävä viljelmä inkuboidaan ensimmäisen inkubaatio-jakson ajan kypsytysalustassa, joka edesauttaa esisirkkalehtisten alkioiden kehittymistä.

Keksinnön tässä aspektissa käytettävä kypsytysalusta sisältää tyypillisesti ravintoaineita, jotka vahvistavat somaattisia alkioita. Sopivissa kypsy-tysalustoissa ei ole kasvua edistäviä hormoneja, kuten auksiineja ja sytokiine-jä. Kypsytysalustan osmolaalisuus on alueella 300 mM/kg - 450 mM/kg. Joissain suoritusmuodoissa kypsytysalustan osmolaalisuus on 350 mM/kg tai enemmän. Kypsytysalusta voi olla nestemäinen, kiinteä tai puolikiinteä. Eräs esimerkki sopivasta kypsytysalustasta BM3 on esitetty tässä esimerkissä 1. Muita esimerkkejä sopivista kypsytysalustoista on tässä esitetty esimerkeissä 2 - 4. Joissain menetelmän suoritusmuodoissa kypsytysalustan alkuosmolaali-suus on ainakin 300 mM/kg, ja se pidetään ainakin tasolla 200 mM/kg stratifi-kaation aikana.

Joissain suoritusmuodoissa kypsytysalusta käsittää PEG:iä kon-sentraationa, joka on noin 1-15 %. Joissain suoritusmuodoissa kypsytysalusta käsittää PEG:iä konsentraationa, joka on 7 -15 % (esim. 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %). Joissain suoritusmuodoissa kypsytysalusta käsittää PEG:iä konsentraationa, joka on 10 -12 % ja jonka osmolaalisuus on ainakin 350 mM/kg - 450 mM/kg.

Kypsytysalusta voi sisältää maltoosia pääasiallisena tai ainoana embryogeneettisten alkioiden sokerilähteenä. Hyödylliset maltoosikonsentraa-tiot ovat välillä noin 1 - noin 2,5 %.

Kypsytysalusta voi sisältää gellaanihartsia. Gellaanihartsi on geeliyt-tämisaine, jota markkinoidaan esimerkiksi tuotenimillä GELRITE ja PHYT-AGEL. Jos kypsytysalusta sisältää gellaanihartsia, sitä on tyypillisesti läsnä konsentraationa, joka on alle noin 0,5 %, tyypillisesti konsentraationa, joka on noin 0 - 0,4 %. Kypsytysalusta on tyypillisesti kiinteä alusta, vaikka se voi olla nestemäinen alusta.

Kypsytysalusta voi sisältää absorbenttikoostumuksen, kuten aktivoitua kivihiiltä, kuten tässä on kuvattu, induktioalustaa varten.

Joissain suoritusmuodoissa kypsytysalusta käsittää edelleen sakkaroosia ja/tai abskisiinihappoa. Abskisiinihappokonsentraatio kypsytysalustassa voi olla 0,5 mg/l - 500 mg/l. Joissain keksinnön mukaisen menetelmän suoritus muodoissa abskisiinihappokonsentraatio kypsytysalustassa on 1 mg/l -100 mg/l. Joissain suoritusmuodoissa abskisiinihappokonsentraatio kypsytysalustassa on 5 mg/l - 20 mg/l.

Joissain keksinnön suoritusmuodoissa kypsytysalusta sisältää sakkaroosia pääasiallisena tai ainoana metabolisoituvana sokerina. Hyödylliset sakkaroosikonsentraatiot ovat noin 1 %:n ja noin 6 %:n välillä.

Keksinnön tämän aspektin menetelmien mukaan epäkypsiä somaattisia havupuualkioita käsittävää viljelmää inkuboidaan viljelyastiassa, joka käsittää kypsytysalustaa, jonka osmolaalisuus on välillä 300 mM/kg - 450 mM/kg, 22 °C - 25 °C:n lämpötilassa ensimmäisen inkubaatiojakson ajan, joka on riittävän pitkä, jotta ainakin osa alkioista saavuttaa anatomisen kypsyyden (eli niissä on kehittyneet sirkkalehdet ja sirkkavarsi). Joissain suoritusmuodoissa ensimmäinen inkubaatiojakso on riittävän pitkä, jotta ainakin osa (esim. ainakin yksi alkio, ainakin 10 %, ainakin 25 %, ainakin 50 %, enemmän kuin 50 % tai ainakin 75 % alkioista) useista alkioista alkioviljelyssä saavuttavat anatomisen kypsyyden.

Kuten kuviossa 1 on esitetty, somaattisten alkioiden kehitysvaihe voidaan jakaa varhaisvaiheeseen, johon liittyy histogeneesi (eli eri kudosten muodostuminen erilaistumattomista soluista), keskivaihe, johon liittyy orgaanien kasvu ja sirkkavarsi- sekä sirkkalehtikehityksen alku, ja myöhäisvaihe, johon liittyy elinkasvun valmistuminen sekä sirkkavarsi-ja sirkkalehtikehityksen valmistuminen (eli anatominen kypsyys) ja varastotuotteen säilytys. Erityisesti epäkypsän alkion varhaisvaiheen kehitykseen sisältyy juuren alkukehitys, juuren hunnun kehittymisen alku, johtosolukon alkeissolujen erilaistuminen, ja verson kärjen muodostuminen. Keskivaiheen kehitykseen kuuluu sirkkavarren kehityksen ja sirkkalehtikehityksen alku, ja myöhäisvaiheen kehitykseen kuuluu sirkkavarsi- ja sirkkalehtikehityksen valmistuminen, minkä tuloksena on anatomisesti kypsä alkio.

Yhden tai useamman rakenteen (esim. esisirkkalehtien alkujen tai sirkkalehtien) muodostuminen yhdelle tai useammalle alkiolle voidaan määritellä viljeltyjen alkioiden silmämääräisellä tarkastuksella tai kuvantamisanalyy-sillä. Silmämääräinen tarkastus tai kuvantamisanalyysi voidaan valinnaisesti toteuttaa 5 - 10-kertaisella suurennoksella.

Ensimmäinen inkubaatiojakso voi olla erilainen genotyypin mukaan. Joissain suoritusmuodoissa ensimmäinen inkubaatiojakso kestää vähintään 6 -vähintään 12 viikkoa, esimerkiksi kahdeksasta kahteentoista viikkoa. Ensim- mainen kypsytysalustojen inkubaatio voidaan toteuttaa 10 °C - 30 °C:ssa, esim. 15 °C - 25 °C:ssa tai 20 °C - 23 °C:ssa.

Strati fikaatio

Stratifikaatio (kosteajäähdytys) on käsittely, jota käytetään monissa lauhkean alueen siemenissä olevan itämisvastustuksen voittamiseksi (Taylor & Waring, Plant, Cell, And Environment 2:165-171, 1979). Kuten tässä on esitetty, odottamatta havaittiin, että stratifikaatio voidaan toteuttaa kypsytysalustoilla, jotka käsittävät osmolaalisuuden, joka on vähintään 300 mM/kg - 450 mM/kg, jolloin tuloksena on suurempi saanto alkioita, joilla on suurempi itämisfrek-venssi (kuten esimerkeissä 2 - 4 on kuvattu) kuin alkioilla, jotka on tuotettu käyttämällä stratifikaatioalustaa, jonka osmolaalisuus on alle 150 mM/kg (kuten BM4).

Keksinnön tämän aspektin menetelmien mukaan somaattiset alkiot, joita on inkuboitu kypsytysalustalla ensimmäisen inkubaatiojakson ajan, joka on riittävän pitkä, jotta ainakin osa alkioista saavuttaa anatomisen kypsyyden, ne altistetaan 0 °C -10 °C:n lämpötilalle vähintään yhden viikon pituisen toisen inkubaatiojakson ajaksi stratifioitujen sirkkalehtisten somaattisten havupuualki-oiden tuottamiseksi.

Eräässä suoritusmuodossa vähintään 300 mM/kg - 450 mM/kg:n osmolaalisuuden käsittävällä tai käsittävässä kypsytysalustalla tai -alustassa olevia männyn sirkkalehtisiä somaattisia alkioita altistetaan 0 °C -10 °C:n lämpötilalle toisen inkubaatiojakson ajaksi, joka on ainakin 1 - 8 viikkoa (esim. 1 -8 viikkoa, kuten 4-6 viikkoa, stratifioitujen sirkkalehtisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi. Eräässä toisessa suoritusmuodossa vähintään 300 mM/kg -450 mM/kg:n osmolaalisuuden käsittävällä tai käsittävässä kypsytysalustalla tai -alustassa olevia männyn sirkkalehtisiä somaattisia alkioita altistetaan 0 °C - 10 °C:n lämpötilalle toisen inkubaatiojakson ajaksi, joka on vähintään 2-6 kuukautta (esim. vähintään 2 kuukautta, vähintään 3 kuukautta, vähintään 4 kuukautta, vähintään 5 kuukautta, aina 6 kuukauteen asti), stratifioitujen sirkkalehtisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi, jotka varastoidaan ennen idätystä. Toinen inkubaatiojakso toteutetaan tyypillisesti pimeässä ja lämpötilassa, joka on 1 °C - 6 °C, kuten 1 °C - 4 °C.

Keksinnön mukaisen menetelmän eräässä suoritusmuodossa kypsy-tysalustan alkuosmolaalisuus vaiheen (a) mukaisen ensimmäisen inkubaatiojakson alussa on vähintään 300 mM/kg ja se pidetään vähintään tasolla 200 mM/kg vaiheen (b) mukaisen toisen inkubaatiojakson ajan. Osmolaalisuuden taso voi daan säilyttää lisäämällä useita erilaisia osmoosiaineita kypsytysalustoihin (esim. PEG:iä, useiden erilaisten sokerien lisääminen, myo-inositolia tai muita osmoosiaineita osmolaalisuuden lisäämiseksi) tai säätämällä kypsytysalusto-jen tilavuutta, joissa tai joilla alkioita inkuboidaan kypsytyksen ja stratifikaation ajan, kuten esimerkissä 4 on kuvattu.

Tyypillisesti alkiot muodostuvat embryogeenisen solukkomassan, kuten embryonaalisen suspensorisolukkomassan, pinnalle. Sirkkalehtiset alkiot voidaan singuloida sirkkalehtisiksi alkioiksi ennen niiden viljelyä stratifikaatio-alustassa tai -alustalla, tai niitä voidaan viljellä singuloimattomana alkiomassa-na. Sirkkalehtiset alkiot voidaan singuloida sirkkalehtisiksi alkioiksi ennen niiden altistamista 0 °C -10 °C:n lämpötilalle vähintään yhden viikon pituisen toisen inkubaatiojakson ajaksi stratifioitujen esisirkkalehtisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi, tai niitä voidaan viljellä singuloimattomana alkiomassana. Jälkistratifikaatio

Stratifikaation jälkeen keksinnön mukaisilla menetelmillä tuotetut sirkkalehtiset alkiot voidaan valinnaisesti idättää mäntykasvien muodostamiseksi, jotka voidaan haluttaessa kasvattaa mäntypuiksi. Tyypillisesti sirkka-lehtisiin alkioihin kohdistetaan kuivatuskäsittely ennen idätystä, kuten esimerkissä 1 on kuvattu. Sirkkalehtiset alkiot voidaan myös sijoittaa valmistettuihin siemeniin myöhempää idätystä varten. Sirkkalehtiset alkiot voidaan idättää esimerkiksi kiinteällä idätysalustalla, kuten esimerkissä 1 esitetyllä BMs-alus-talla. Tyypillisesti sirkkalehtisiä somaattisia alkioita valaistaan itämisen stimu-loimiseksi. Tyypillisesti kaikki keksinnön mukaisten menetelmien vaiheet, idätystä lukuunottamatta, toteutetaan pimeässä. Idätetyt kasvit voidaan siirtää multaan jatkamaan kasvamista. Idätetyt kasvit voidaan esimerkiksi istuttaa multaan kasvihuoneeseen ja niiden voidaan antaa kasvaa ennen siirtoistutusta ulkoilmaan.

Joissain suoritusmuodoissa keksinnön tämän aspektin mukaiset menetelmät tuottavat korkeamman saannon sirkkalehtisiä somaattisia alkioita kuin identtinen menetelmä, jossa embryogeenisiä alkioita viljellään kypsytys-alustalla, jonka osmolaalisuus on vähintään 300 mM/kg - 450 mM/kg (sisältää esim. PEG: iä), minkä jälkeen seuraa stratifikaatio stratifikaatioalustassa tai -alustalla, jonka osmolaalisuus on pienempi kuin 150 mM/kg (esim. ei sisällä PEG:iä), kuten esimerkeissä 2 - 4 on esitetty.

Erään toisen aspektin mukaan tarjotaan menetelmä sirkkalehtisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi. Menetelmässä (a) inkuboidaan esisirkka- lehtisiä somaattisia havupuualkioita käsittävä viljelmä kypsytysalustassa tai -alustalla ensimmäisen inkubaatiojakson ajan; (b) singuloidaan useita vaiheen (a) mukaisesti käsiteltyjä alkioita; (c) viljellään useat singuloidut sirkkalehtiset somaattiset havupuualkioit viljelyastiassa, joka käsittää toisen kypsytysalustan, jonka osmolaalisuus on välillä 300 mM/kg - 450 mM/kg, 22 °C - 25 °C:n lämpötilassa toisen inkubaatiojakson ajan, joka on riittävän pitkä, jotta ainakin osa alkioista saavuttaa anatomisen kypsyyden; ja (d) kohdistetaan viljelyastiassa oleviin alkioihin vaiheen (c) mukaisesti 0 °C - 10 °C:n lämpötila vähintään yhden viikon pituisen kolmannen inkubaatiojakson ajan stratifioitujen sirkkalehtis-ten somaattisten alkioiden tuottamiseksi.

Keksinnön tämän aspektin mukaisesti epäkypsiä somaattisia havupuualkioita, kuten esimerkiksi esisirkkalehtisiä somaattisia havupuualkioita voidaan valmistaa somaattisista havupuusoluista, kuten havupuualkioista saaduista soluista, viljelemällä soluja induktioalustassa tai -alustalla embryogee-nisten solujen tuottamiseksi edellä kuvatulla tavalla. Näitä embryogeenisiä soluja voidaan sitten viljellä ylläpitoalustassa tai -alustalla embryogeenisten solujen moninkertaistamiseksi, kuten edellä on kuvattu. Moninkertaistettuja embryogeenisiä soluja voidaan sitten viljellä ensimmäisessä/-llä kypsytysalustas-sa/-alustalla toisen inkubaatiojakson ajan, jonka jälkeen seuraa stratifikaatio toisella kypsytysalustalla.

Ensimmäinen ja toinen kypsytysalusta sisältävät tyypillisesti ravintoaineita, jotka tukevat somaattisia alkioita. Sopivat kypsytysalustat eivät tyypillisesti sisällä kasvua edistäviä hormoneja, kuten auksiineja ja sytokiinejä. Joissain suoritusmuodoissa ensimmäisellä ja toisella kypsytysalustalla on sama formulaatio. Joissain suoritusmuodoissa ensimmäisellä ja toisella kypsytysalustalla on eri formulaatio.

Ensimmäisen ja/tai toisen kypsytysalustan osmolaalisuus voidaan säätää arvoon, joka on toivotulla alueella, kuten noin 300 mM/kg - 450 mM/kg. Tyypillisesti 350 mM:n tai korkeampi osmolaalisuus on edullinen keksinnön mukaisissa menetelmissä. Eräs esimerkki sopivasta kypsytysalustasta BM3 esitetään tässä esimerkkinä 1. Muita esimerkkejä sopivista kypsytysalustoista on esitetty tässä esimerkkeinä 2-4. Joissain menetelmän suoritusmuodoissa toisen kypsytysalustan osmolaalisuus on korkeampi (esim. 350 mM/kg - 450 mM/kg) kuin ensimmäisen kypsytysalustan (esim. 300 mM/kg - 450 mM/kg). Joissain suoritusmuodoissa toisten kypsytysalustojen osmolaalisuus valitaan siten, että se täsmää ensimmäisten kypsytysalustojen osmolaalisuuden kanssa ensimmäisen inkubaatiojakson lopussa.

Joissain suoritusmuodoissa ensimmäinen ja/tai toinen kypsytysalus-ta käsittää PEG:iä konsentraationa, joka on 1 % -15 %. Joissain suoritusmuodoissa ensimmäinen kypsytysalusta käsittää PEG:iä konsentraationa, joka on 7 % - 10 % (esim. 7 %, 8 %, 9 %, 10 %). Joissain suoritusmuodoissa toinen kypsytysalusta käsittää PEG:iä konsentraationa, joka on 8 % -15 % (esim. 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %). Joissain suoritusmuodoissa toinen kypsytysalusta käsittää PEG:iä korkeampana konsentraationa kuin ensimmäinen kypsytysalusta.

Ensimmäinen ja/tai toinen kypsytysalusta voi sisältää maltoosia pääasiallisena tai ainoana somaattisten alkioiden sokerilähteenä. Hyödylliset maltoosipitoisuudet ovat noin 1 %:n ja noin 2,5 %:n välillä.

Ensimmäinen ja/tai toinen kypsytysalusta voi sisältää gellaanihart-sia. Gellaanihartsi on geeliyttämisaine, jota markkinoidaan esimerkiksi tuote-nimillä GELRITE ja PHYTAGEL. Jos kypsytysalusta sisältää gellaanihartsia, sitä on tyypillisesti läsnä konsentraationa, joka on alle noin 0,5 %, tyypillisesti konsentraationa, joka on noin 0 - 0,4 %. Ensimmäinen ja toinen kypsytysalusta ovat tyypillisesti kiinteitä alustoja, mutta toinen tai molemmat voivat olla nestemäisiä alustoja.

Ensimmäinen ja/tai toinen kypsytysalusta voi sisältää absorbentti-koostumuksen, kuten aktivoitua kivihiiltä, kuten tässä on kuvattu, induktioalus-taa varten.

Joissain suoritusmuodoissa ensimmäinen ja/tai toinen kypsytysalusta käsittää edelleen sakkaroosia ja/tai abskisiinihappoa. Abskisiinihappokon-sentraatio kypsytysalustassa voi olla 0,5 mg/l - 500 mg/l. Joissain keksinnön mukaisen menetelmän suoritusmuodoissa abskisiinihappokonsentraatio kypsytysalustassa on 1 mg/l - 100 mg/l. Joissain suoritusmuodoissa abskisiinihappokonsentraatio kypsytysalustassa on 5 mg/l - 20 mg/l.

Joissain keksinnön suoritusmuodoissa ensimmäinen ja/tai toinen kypsytysalusta sisältää sakkaroosia pääasiallisena tai ainoana metabolisoituvana sokerina. Hyödylliset sakkaroosikonsentraatiot ovat noin 1 %:n ja noin 6 %:n välillä.

Ensimmäinen ja/tai toinen kypsytysalusta voi olla nestemäinen, kiinteä tai puolikiinteä. Nestemäisessä alustassa voi olla korkeampia konsentraa-tioita osmoosiaineita, kuten polyetyleeniglykolia (PEG) tai muita osmoosiainei- ta, saman osmolaalisuuden aikaansaamiseksi kuin vastaavassa kiinteässä alustassa. Tyypillisesti nestemäistä kypsytysalustaa vastaavalla kiinteällä kyp-sytysalustalla on osmolaalisuus, joka on noin 50 mM/kg:n puitteissa nestemäisen kypsytysalustan osmolaalisuudesta.

Joissain menetelmän tämän aspektin mukaisissa suoritusmuodoissa ensimmäinen inkubaatiojakso on riittävän pitkä, jotta ensimmäisessä al-kioviljelyssä osalle useista alkioista (esim. ainakin yhdelle alkiolle, ainakin 10 prosentille alkioista, ainakin 25, ainakin 50, yli 50 tai ainakin 75 prosentille) muodostuu ainakin yksi seuraavista rakenteista: yksi tai useampia alkioita, joissa on esisirkkalehtien alkuja; yksi tai useampia alkioita, joissa on sirkkalehtiä; yksi tai useampia alkioita, joissa on 4+ sirkkalehteä; tai yksi tai useampia alkioita, joissa on selvästi sirkkalehtiä, joissa on sirkkavarsi ja juurialueita läsnä.

Ensimmäinen inkubaatiojakso voi olla erilainen genotyypin mukaan. Joissain suoritusmuodoissa ensimmäinen inkubaatiojakso on vähintään 6 -vähintään 8 viikkoa pitkä, esimerkiksi 7-8 viikkoa. Ensimmäinen inkubaatio ensimmäisillä kypsytysalustoilla voidaan toteuttaa 10 °C - 30 °C:ssa, esim. 15 -25 °C:ssa, tai esimerkiksi 20 - 23 °C:ssa.

Inkubaatiojakson lopussa, esimerkiksi kun havaitaan yhden tai useamman sirkkalehtialun läsnäolo osalla alkioista tai kun vähintään 6 viikkoa on kulunut, menetelmä käsittää useiden yksittäisten alkioiden singulaation ensimmäisestä alkioviljelystä.

Alkiot voidaan singuloida keksinnön mukaisilla menetelmillä käyttämällä mitä tahansa välineitä yksittäisten alkioiden erottamiseksi fyysisesti ensimmäisestä alkioviljelystä. Esimerkiksi embryonaalisen suspensorisolukko-massan (ESM) viljelyn puitteissa voidaan käyttää fyysisiä erottelumenetelmiä, kuten ESM:in pesua (esim. ruiskusingulaatio paineohjatulla vesipitoisella nes-teruiskulla), ESM:n poisto imuroimalla, vibraatiolla tai poimimalla alkiot ESM:istä. Muita ei-rajoittavia esimerkkejä hyödyllisistä singulaatiomenetelmistä ovat mm. alkioiden suodatus tai lajittelu fyysisten ominaisuuden, kuten koon, muodon perusteella esimerkiksi siivilän läpi, tai joidenkin muiden fyysisten piirteiden, kuten pinnan karkeuden, hydrofobisuuden, tiheyden tai massan, perusteella.

Joissain suoritusmuodoissa singulaatiovaihe käsittää lisäksi yksittäisten alkioiden poimimisen yhden tai useamman valintakriteerin perusteella. Ammattitaitoinen tekninen henkilöstö tai tietokoneperusteinen kuvantamisjär- jestelmä voi esimerkiksi käyttää visuaalisia lajitteluperusteita alkioiden valitsemiseksi yhden tai useamman morfologisen piirteen perusteella, joihin ovat mm. mutta ei ainoastaan: alkion koko, muoto (esim. aksiaalinen symmetria), pintarakenne, väri (esim. ei näkyvää vihertymistä) ja haljenneiden sirkkavarsien ja läpikuultavien sirkkalehtien puuttuminen. Alkioita voidaan valita myös kemiallisin tai ulkoisen rakenteen adsorptioon, reflektanssiin, transmittanssiin tai emis-siospektriin liittyvin perustein käyttämällä lähi-infrapunaspektroskopiaa (near infrared spectroscopy, NIR), kuten on kuvattu US-patenttihakemuksessa 2004/0072143, jonka otsikko on ”Methods for Classification of Somatic Embryos” ja joka liitetään tähän viitteeksi.

Haluttuja alkioita voidaan poimia yksitellen (manuaalisella tai automaattisella menetelmällä) ensimmäisestä alkioviljelystä (esim. embryonaali-sesta suspensorisolukkomassasta) millä tahansa sopivalla instrumentilla, kuten pinseteillä. Alkiot voidaan poimia manuaalisesti tai automaattisesti, kuten on kuvattu US-patenttihakemuksessa 2004/0267457, jonka otsikko on ”Automated System and Method for Harvesting and Multi-Stage Screening of Plant Embryos” ja joka liitetään tähän viitteeksi.

Joissain keksinnön mukaisissa menetelmissä poimitut alkiot levitetään suoraan toisen kypsytysalustan pinnalle tai huokoiselle substraatille kosketukseen toisen kypsytysalustan kanssa, joka voi olla muodoltaan kiinteä tai nestemäinen.

Huokoisessa substraatissa, joka on käyttökelpoinen keksinnön mukaisten menetelmien useiden erilaisten suoritusmuotojen toteutuksessa, huokosen halkaisija on tyypillisesti noin 5 mikrometriä - noin 1200 mikrometriä, esimerkiksi noin 50 - 500 mikrometriä, esimerkiksi noin 70 - noin 150 mikro-metriä, esimerkiksi 100 mikrometriä. Huokoinen materiaali on tyypillisesti tasomainen ja sen voi olla muodoltaan ja ulottuvuuksiltaan valittu halutulla tavalla, jolla helpotetaan käsittelyä sekä materiaalin saattamista kosketukseen toisten kypsytysalustojen kanssa. Esimerkkejä huokoisista materiaaleista ovat mm. materiaalit, jotka ovat steriloitavissa ja riittävän vahvoja vastustamaan repeytymistä, kun materiaalit nostetaan singuloitujen alkioiden siirtämiseksi myöhempiin somaattisen alkion tuotantoprosessin vaiheisiin, kuten stratifikaa-tioon. Esimerkkejä huokoisista materiaaleista ovat membraanit, nylonkuitu, kudottu verkko (esim. nylon, ruostumaton teräs tai muovi) ja polymeerikuidut, näihin kuitenkaan rajoittumatta.

Joissain suoritusmuodoissa singuloidut alkiot siirretään toisille kyp-sytysalustoille tai huokoiselle substraatille kosketukseen toisen kypsytysalus-tan kanssa siten, että singuloidut alkiot eivät ole fyysisesti kosketuksessa toisiinsa.

Keksinnön mukaisissa menetelmissä singuloidut epäkypsät alkiot saatetaan singulaation jälkeen kosketukseen toisen kypsytysalustan kanssa toisen inkubaatiojakson ajaksi. Joissain suoritusmuodoissa toinen inkubaatio-jakso on riittävän pitkä, jotta ainakin osa (esim. ainakin yksi alkio, ainakin 10 prosenttia, ainakin 25, ainakin 50, yli 50 tai ainakin 75 prosenttia alkioista) useiden singuloitujen alkioiden joukosta saavuttaa anatomisen kypsyyden (eli niillä on kehittyneitä sirkkalehtiä ja sirkkavarsi), kuten edellä kuvion 1 yhteydessä on kuvattu.

Toinen inkubaatiojakso voi olla erilainen genotyypin mukaan. Joissain suoritusmuodoissa toinen inkubaatiojakso on ainakin 3 viikkoa pitkä, esimerkiksi 3 - 5 viikkoa. Joissain suoritusmuodoissa alkiot inkuboidaan kypsy-tysalustalla koko vähintään 12 viikon pituisen ajan (joka sisältää ensimmäisen inkubaatiojakson ja toisen inkubaatiojakson). Toinen inkubaatio toisilla kypsy-tysalustoilla voidaan toteuttaa 10 °C - 30 °C:ssa, esimerkiksi 15 °C - 25 °C:ssa tai esimerkiksi 20 °C - 23 °C:ssa.

Keksinnön menetelmien tämän aspektin mukaan toisessa tai toisella kypsytysalustassa/-alustalla tehdyn inkubaation jälkeen singuloidut alkiot strati-fioidaan kohdistamalla niihin 0 °C - 10 °C:n lämpötila ainakin 1 viikon pituisen inkubaatiojakson ajaksi.

Eräässä suoritusmuodossa osmolaalisuudeltaan vähintään 300 mM/kg - 450 mM/kg:n kypsytysalustassa tai -alustalla olevia sirkkalehtisiä männyn somaattisia alkioita altistetaan 0 °C -10 °C:n lämpötilalle kolmannen inkubaatiojakson ajaksi, joka on vähintään 1 viikkoa ja enintään 8 viikkoa (esim. 1 - 8 viikkoa, kuten 4-6 viikkoa) stratifioitujen sirkkalehtisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi. Eräässä toisessa suoritusmuodossa osmolaalisuudeltaan vähintään 300 mM/kg - 450 mM/kg:n kypsytysalustassa tai -alustalla olevia sirkkalehtisiä männyn somaattisia alkioita altistetaan ennen idätystä 0 °C - 10 °C:n lämpötilalle kolmannen inkubaatiojakson ajaksi, joka on vähintään 2 kuukautta ja enintään 6 kuukautta (esim. vähintään 2 kuukautta, vähintään 3 kuukautta, vähintään 4 kuukautta, vähintään 5 kuukautta aina 6 kuukauteen asti) varastoitavien stratifioitujen sirkkalehtisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi. Koi- mas inkubaatiojakso toteutetaan tyypillisesti pimeässä ja lämpötilassa, joka on 1 °C - 6 °C, esimerkiksi 1 °C - 4 °C.

Keksinnön mukaisen menetelmän eräässä suoritusmuodossa kyp-sytysalustojen alkuosmolaalisuus vaiheen (a) mukaisen toisen inkubaatiojak-son alussa on vähintään 300 mM/kg ja se pidetään tasolla, joka on vähintään 200 mM/kg vaiheen (c) mukaisen kolmannen inkubaatiojakson ajan.

Jokaiseen keksinnön eri aspektien mukaiseen menetelmään kuuluu vaihe, jossa inkuboidaan epäkypsiä somaattisia havupuualkioita käsittävä viljelmä kypsytysalustassa, jonka osmolaalisuus on 300 mM/kg - 450 mM/kg ensimmäisen inkubaatiojakson ajan, jonka jälkeen alkiot altistetaan viljelyastiassa 0 °C - 10 °C:n lämpötilalle, vähintään yhden viikon ajan stratifioitujen alkioiden muodostamiseksi. Keksinnön mukaisia menetelmiä voidaan käyttää esimerkiksi kloonien tuottamiseksi yksittäisistä mäntypuista, joissa on yksi tai useampia toivottuja ominaisuuksia, kuten suuri kasvunopeus. Näin ollen keksinnön yhden aspektin mukaan toteutetaan menetelmiä geneettisesti identtisten somaattisten mäntyalkioiden populaation tuottamiseksi. Termillä ”geneettisesti identtiset somaattiset mäntyalkiot” tarkoitetaan tässä alkioita, jotka on johdettu samasta alkuperäisestä kasvista. Termi sisältää somaattiset mäntyalkiot, joissa on vähän mutaatioita, joita voi esiintyä somaattisten alkioiden kehityksen aikana. Mitä tahansa tässä kuvatuista menetelmistä voidaan käyttää geneettisesti identtisten sirkkalehtisten somaattisten mäntyalkioiden tuottamiseen.

Seuraavat esimerkit ainoastaan havainnollistavat tapaa, joka nyt on ajateltu parhaaksi keksinnön toteuttamiselle, mutta sen ei pidä tulkita rajoittavan keksintöä.

Esimerkki 1 Tämä esimerkki kuvaa menetelmää somaattisten mäntyalkioiden tuottamiseksi loblolly-männystä käyttämällä kypsytysalustaa (BM3) ja stratifi-kaatioalustaa (BM4).

Menetelmät:

Tsygoottisia alkioita sisältävät naaraspuoliset gametofyytit poistetaan siemenistä 4-5 viikon kuluttua hedelmöitymisestä. Siemenpeitot poistetaan, mutta alkioita ei eroteta ympäröivästä gametofyytistä muuten kuin leikkaamalla nukelluspää. Kävyt varastoidaan lämpötilassa 4 °C, kunnes ne käytetään. Välittömästi epäkypsien alkioiden poiston jälkeen siemenet steriloidaan käyttämällä alkupesua ja pesuainekäsittelyä, jonka jälkeen seuraa kymmenen minuutin sterilointi 15-prosenttisessa hbC^ssa. Eksplantit pestään perusteellisesti steriilillä tislatulla vedellä jokaisen käsittelyn jälkeen.

Taulukoissa 1 ja 2 esitetään alustojen koostumuksia, joka ovat hyödyllisiä somaattisten mäntyalkioiden tuottamiseksi.

Taulukko 1

+ Käytetään, jos halutaan kiinteä alusta.

Taulukko 2

Induktio: Steriilit gametofyytit, joissa on ehjät alkiot, asetetaan kiinte-älle BMi-viljelyalustalle ja pidetään ympäristössä, jossa lämpötila on 22 - 25 °C ja jossa fotoperiodina käytetään 24 tunnin pitoa pimeässä 3-5 viikon ajan.

Kesto on riippuvainen viljeltävänä olevasta tietystä nimenomaisesta genotyypistä. Tämän ajan kuluttua umpeen on muodostunut alkuperäisiin eksplanttei-hin assosioitunutta valkeaa limaista solukkomassaa. Mikroskopointi paljastaa tyypillisesti useita massaan assosioituneena olevia varhaisalkioita. Näille on tavallisesti tunnusomaista, että niillä on pitkä ohutseinämäinen suspensori, johon assosioituu pieni alkiopää, jossa on tiheä sytoplasma ja suuret tumat.

Induktioalustan osmolaalisuus voi joissakin tapauksissa olla jopa niinkin suuri kuin 170 mM/kg. Se on tavallisesti noin 160 mM/kg tai jopa alhaisempi (kuten 150 mM/kg).

Ylläpito ja moninkertaistaminen: Induktiovaiheessa muodostuneista solukkomassoista poistetut varhaisalkiot asetetaan ensin geeliytetylle BM2-yllä-pito- ja moninkertaistamisalustalle. Tämä eroaa induktioalustasta siinä suhteessa, että kasvuhormonien (sekä auksiinien että sytokiniinien) pitoisuuksia on vähennetty vähintään yhden kokonaisen kertaluokan verran. Tämän alustan osmolaalisuus on 120 mM/kg tai korkeampi (tyypillisesti noin 120 -150 mM/kg:n alueella Pinus taedan ollessa kyseessä). Lämpötila ja fotoperiodi olivat jälleen 22 - 25 °C ja 24 tunnin pimeys. Alkioita viljellään ensin 12-14 päivää kiinteällä BM2-alustalla ennen niiden siirtoa nestemäiseen alustaan jatkoviljelyä varten. Tämän nestemäisen alustan koostumus on sama kuin BM2:lla mutta siitä puuttuu geeliyttämisaine. Kiinteällä alustalla toteutetun ylläpitovaiheen lopussa alkiot ovat ulkonäöltään tyypillisesti samankaltaisia kuin induktiovaiheesta peräisin olevat alkiot. Nestemäiseen ylläpitoalustaan on 5 - 6 viikoittaisen jatkoviljelyn jälkeen muodostunut pitkälle edistyneitä varhaisalkioita. Näille ovat tunnusomaisia sileät alkiopäät, joiden on arvioitu sisältävän tyypillisesti yli 100 yksittäistä solua ja joissa on useita suspensoreita.

Alkion kypsyminen: Epäkypsät varhaisalkiot siirretään ylläpitoalustal-ta kiinteälle kypsytysalustalle. Kypsytysalustassa joko ei ole ollenkaan kasvuhormoneja tai niitä on ainoastaan hyvin pieniä määriä. Abskisiinihappoa sisällytetään tyypillisesti jatkokypsymisen edistämiseksi. Tähän alustaan on lisäksi edullista sisällyttää adsorbenttikoostumusta. Absorbenttikoostumus voidaan valita useista pinta-alaltaan suurista ja/tai huokoskooltaan kontrolloiduista kemiallisista materiaaleista, kuten aktiivihiilestä, poly(vinyylipyrrolidonin) liukoisista ja liukenemattomista muodoista, aktivoidusta alumiinioksidista ja silikagee-listä. Adsorbenttikoostumusta on tavallisesti läsnä konsentraatiossa, joka on noin 0,1-5 g/l, tavallisemmin noin 0,25 - 2,5 g/l. Gellaanihartsia voidaan sisällyttää noin 0,25-prosenttiseen konsentraatioon.

Kypsytysalustan osmoottista potentiaalia voidaan nostaa huomattavasti ylläpitoalustan osmoottista potentiaalia korkeammaksi. On havaittu edulliseksi pitää osmolaalisuus jopa niinkin suurena kuin 350 mM/kg tai vielä tätäkin suurempana (esim. jopa 450 mM/kg). Kypsyminen toteutetaan edullisesti täydellisessä pimeydessä 22 - 25 °C:n lämpötilassa siihen asti, kunnes sirkka-lehdellisiä alkioita kehittynyt (esim. saavuttanut anatomisen kypsyyden).

Maturaatio ja stratifikaaticr. Oltuaan 7-12 viikkoa kypsytysalustalla BM3 sirkkalehdelliset alkiot irtaannutetaan ja siirretään suodatinpaperialustalle stratifikaatioalustalle BM4. Tämä stratifikaatioalusta BM4 on samanlainen kuin kypsytysalusta BM3, mutta siitä puuttuvat abskisiinihappo, PEG-8000 ja gel-laanihartsi. Osmolaalisuus stratifikaatioalustassa, jossa ei ole PEG:iä on tyypillisesti alle 150 mM/kg, esimerkiksi 120 mM/kg. Alkioita viljellään strati-fikaatioalustalla noin 1 °C:n ja noin 10 °C:n välillä pimeässä yhdestä kahdeksaan viikkoa, esimerkiksi kahdesta kuuteen viikkoa.

Kuivatus: Suodatinpaperialustallaan edelleen olevat kypsät alkiot nostetaan alustalta ja asetetaan suljettuun säiliöön veden päälle 97 - 99-pro-senttiseen suhteelliseen kosteuteen noin kolmen viikon ajaksi.

Idätys: Kuivatut kypsät alkiot hydrataan uudelleen asettamalla ne, kun ne edelleen ovat suodatinpaperialustalla, noin 24 tunnin ajaksi nestemäisellä idätysalustalla kyllästetylle alustalle. Tämän jälkeen alkiot asetetaan yksitellen kiinteälle BMs-alustalle niiden idättämiseksi. Tämä on perusalusta, jossa ei ole kasvuhormoneja ja jota on modifioitu vähentämällä sakkaroosin, myoi-nositolin ja orgaanisen typen määrää. Alkioita inkuboidaan BMs-alustalla noin 10 viikkoa ympäristöolosuhteissa, joissa lämpötila on 23 - 25 °C ja valoperiodi 16 tuntia valossa - 8 tuntia pimeässä, kunnes tulokseksi saaduilla taimilla on hyvin kehittynyt alkeisjuuri ja sirkkavarsi ja vihreä sirkkalehtirakenne ja epiko-tyyli.

Pienemmän hiilihydraattikonsentraation johdosta idätysalustan osmoottinen potentiaali on pienentynyt vielä alle kypsytysalustan potentiaalin. Se on tavallisesti alle noin 150 mM/kg (kuten noin 100 mM/kg).

Esimerkki 2 Tämä esimerkki osoittaa, että epäkypsien loblolly-männyn (Pinus taeda) alkioiden inkubaatio kypsytysalustalla (+10 % PEG), jonka osmolaalisuus on 365 mM/kg, ja sen jälkeen samalla kypsytysalustalla seuraava stratifi-kaatio parantavat alkiosaantoa ja onnistunutta itämistä verrattuna alkioiden inkubaatioon kypsytysalustalla, jonka osmolaalisuus on 365 mM/kg, ja sitä seuraavaan stratifikaatioon stratifikaatioalustalla (0,0 % PEG), jonka osmolaa-lisuus on alle 150 mM/kg.

Menetelmät:

Tsygoottisia alkioita sisältäviä naarasgametofyyttejä poistettiin genotyypiltään seitsemästä erilaisesta siemenestä esimerkissä 1 kuvattujen menetelmien mukaisesti. Induktio-ja ylläpitovaiheet olivat esimerkin 1 kuvauksen mukaisia, ja embryonaalisten suspensorisolukkomassojen (ESM) viljelyvaras-toja pakastettiin. ESM-viljelmien palautus kryovarastosta:

Yksi ampulli kutakin genotyyppiä sulatettiin suodatinpaperilla ylläpi-toalustan BM2 päällä. Kun viljelmät olivat kasvattaneet riittävästi ESM-solukko-massaa leveydeltään noin 1 cm:n ja korkeudeltaan noin 0,4 cm kokoisen kasan muodostamiseksi, ESM kerättiin pois suodatinpaperilta ja siitä puhdistettiin kallus. Tämä siirtoprosessi jatkui 14 päivän jakson ajan, kunnes jokaisen genotyypin osalta oli kerätty 1 - 4 ESM-kasaa, jotka olivat noin 1 cm leveitä ja 0,4 cm korkeita.

Ylläpito ja moninkertaistaminen

Noin 7 viikkoa sen jälkeen kun ESM oli palautettu pakastevarastois-ta, ESM-viljelmät koottiin 500 ml:n pulloon, joka sisälsi 100 ml ylläpitoalustoja suhteessa 1:5.

Kypsytyn. ESM-viljelmä maljattiin nylonmembraanille 600 ml:Ile puolikiinteää kypsytysalustaa BM3 (+10 % PEG:iä, osmolaalisuus = 365 mM/kg) puolikkaissa (matalissa) Cambro-laatikoissa (syvyys 2”), jolloin tuloksena oli noin 1/4 tuuman alustasyvyys. Yhteensä maljattiin 24 ml soluja jokaisen genotyypin osalta kahdelle puolikkaalle Cambro-laatikolle. Jokaisessa Cambro-laatikon kehyksessä oli 6 ml soluja ja laatikkoa kohti oli yhteensä 12 ml soluja kahdentoista pisaran kokoonpanossa. Solut jaettiin 12 pisarana, joissa jokaisessa oli 0,5 ml solua kohti. Maljauksen jälkeen Cambo-laatikot sijoitettiin huoneenlämpöön pimeydessä 12 viikon kypsytysjakson ajaksi. Kypsytysjakson jälkeen testattiin seuraavia stratifikaatiokäsittelyjä, kuten alla olevassa taulukossa 3 kuvataan. Stratifikaatio:

Kypsytysalustalla BM3 toteutetun 12 viikon inkubaation jälkeen kä-sittelyryhmien 1 ja 8 alkiot siirrettiin alustalle 320 ml:n stratifikaatioalustan BM4 päälle (0,0 % PEG:iä, osmolaalisuus = 120 mM/kg) puolikkaissa Cambro-laatikoissa. Käsittelyryhmän 14 alkiot pidettiin kypsytysalustalla BM3 strafikaation aikana. Kaikkien käsittelyryhmien stratifikaatio toteutettiin 4 viikon ajan 4 °C - 7 °C:ssa.

Taulukko 3: Kuvaus kypsymisen jälkeisistä käsittelyolosuhteista

Viimeistely veden päällä (Conditioning over Water, COW) ja sin- gulointr.

Stratifikaation jälkeen alkiot singuloitiin ruiskuerottelulla ja asetettiin sitten kosteudeltaan 98-prosenttiseen ympäristöön ja viimeisteltiin veden päällä huoneenlämpötilassa yhden viikon ajan COW-laatikoissa.

Idätys: Veden päällä tapahtuneen viimeistelyn jälkeen jokaisesta käsittelystä siirrettiin käsin 75 alkiota (genotyyppiä kohti) idätysalustoille BMs (150 ml alustaa Cambro-laatikkoa kohti). Nämä alkiot asetettiin idätysalustojen päälle eikä niitä istutettu. Jokaiseen laatikkoon sijoitettiin 25 alkiota, jolloin tuloksena oli 3 idätyslaatikkoa käsittelyä kohti ja genotyyppiä kohti. Mahdollisesti jäljelle jääneet alkiot laskettiin kokonaisalkiosaannon määrittämiseksi.

Alkiot valittiin visuaalisesti idätykseen seuraavin perustein: kolme tai useampia näkyviä sirkkalehtiä; sileä alkio (ei kalluksia); alkio väriltään norsun-luunvalkoinen, keltainen tai vihreä ja läpikuultamaton; fuusioituneita alkioita ei valittu; alkioita, joissa oli laajat litteät sirkkavarret ei valittu; ja pitkänomaiset alkiot hyväksyttiin.

Kun alkiot oli siirretty käsin idätyslaatikoihin, jotka sisälsivät idätys-alustaa, laatikot asetettiin 1 °C - 2 °C:een kolmen kuukauden ajaksi. Idätyslaa-tikot siirrettiin sitten huoneenlämpötilaan pimeyteen 7 päivän ajaksi ja sitten valoisaan huoneeseen idätyksen jatkamiseksi. Idätysalustalla tapahtuneen 8 viikon inkubaation jälkeen itäneet siemenet tarkistettiin, jotta saatiin määritettyä ovatko ne valmiita siirtoistutukseen kasvihuoneeseen. Käsittelyyn 1 (vertailu) otettavien itäneiden siementen muodostama sato korjattiin, kun suurin osa täytti valintakriteerit. Sen jälkeen kokeellisten käsittelyjen sato korjattiin käyttämällä vertailuitämisaikaa kullekin yksittäiselle genotyyppikloonille.

Tulokset:

Vertailu käsittelyn 1 (verrokki) ja käsittelyn 14 välillä Tässä kokeessa vertaillaan alkioiden inkubaatiota, joka stratifikaati-on aikana jatkuu kypsytysalustoilla (stratifikaatioalustojen käyttö jätetään pois) (käsittely 14), vertailukäsittelyyn 1, jossa alkioita inkuboitiin kypsytysalustoilla ja siirrettiin stratifikaatioalustoille ennen stratifikaatiota. Kuten alla olevasta taulukosta 4 nähdään, käsittely 14 tuotti alkioita, joilla oli korkeampi itämisfrek-venssi ja elinvoimaltaan parempia itäneitä siemeniä verrattuna käsittelyssä 1 tuotettuihin alkioihin.

Taulukko 4: Arvioitu keskimääräinen itämisfrekvenssi ja luotettavuusvälit käsittelyille 1 ja 14 (N = 15 genotyyppiä)

Kuten yllä olevasta taulukosta 4 nähdään, käsittely ryhmän 14 alkioiden itämisfrekvenssit olivat hieman korkeampia (37 %) kuin verrokkikäsittelys-sä 1 (34 %), vaikka havaittu ero ei ollut tilastollisesti merkittävä (p=0,42).

Taulukko 5: Arvioitu keskimääräinen eloonjäänti ja luotettavuusvälit käsittelyille 1 ja 14 (N = 15 genotyyppiä)

Kuten yllä olevasta taulukosta 5 nähdään, käsittelyllä 14 käsiteltyjen itäneiden siementen eloonjäänti oli hieman alhaisempi kuin käsittelyssä 1 (verrokki) (75 % versus 76 %), mutta ero ei ollut tilastollisesti merkittävä (p=0,87).

Itäneiden siementen elinvoimaisuudessa havaittiin parannusta käsittelyn 14 eduksi. Käsittelyryhmässä 14 olleista 15 genotyypistä kolmessatoista havaittiin enemmän elinvoimaisia epikotyylejä, pidempiä juuria tai molempia kuin käsittely ryhmän 1 alkioissa. Vaikka elinpituuksia ei mitattu tässä kokeessa, itäneistä siemenistä otettiin kuvia jokaisessa käsittelyryhmässä ennen siirtoistutusta. Kuvio 2 on valokuvaryhmä itäneistä siemenistä, jotka on tuotettu käsittelyryhmän 1 (verrokki) olosuhteissa (kuviot 2A - 2C), tai tuotettu käsittely-ryhmän 14 olosuhteissa (kuviot 2D - 2F). Kuten kuviosta 2 nähdään, parempi itäneiden siementen elinvoimaisuus saatiin aikaan käyttämällä käsittelyryhmän 14 olosuhteita (kuviot 2D-F) verrattuna käsittelyryhmään 1 (verrokki) (kuviot 2A-C). Käsittelyjen 1, 8 ja 14 vertailu Tässä analyysissä vertaillaan genotyypeille saatuja tuloksia, jotka olivat yhteisiä käsittelyille 1, 8 ja 14, jotta saadaan määritettyä oliko alkioiden siirto stratifikaatioalustoille inkubaation ja valinnaisen kypsytysalustoilla varastoinnin jälkeen haitallista alkioiden itävyydelle. Itämisfrekvenssin tulokset esitetään taulukossa 6.

Taulukko 6: Keskimääräinen itämisfrekvenssi ja luotettavuusvälit käsittelyille 1,8 ja 14 (N = 15 genotyyppiä)

Itämisfrekvenssien ero taulukossa 6 esitetty verrokin ja käsittelyjen välillä on tilastollisesti merkittävä (p=0,0005). Käsittelyjä 8 ja 14 suoraan verrattaessa käsittely 8 on merkittävästi alempi kuin käsittely 14 (p=0,0008) ja verrokki (p=0,0011). Lisäksi käsittelyn 8 alkiot havaittiin epämuodostuneiksi ruiskuerottelun jälkeen (tietoja ei ole esitetty).

Yhteenveto ja johtopäätös: Nämä tulokset osoittavat, että alkioiden jatkuva inkubaatio kypsytysalustoilla (10 % PEG:iä, osmolaalisuus = 365 mM/kg) stratifikaation aikana (stratifikaatioalustojen käyttö jätetään pois) (käsittelyryh-mä 14) tuottaa alkioita, joiden itämisfrekvenssi on korkeampi, ja itäneitä siemeniä, joiden elinvoimaisuus on parempi kuin alkioilla, jotka tuotetaan käsitte-lyryhmässä 1 ja käsittelyryhmässä 8, joissa alkioita inkuboitiin kypsytysalustoilla (10 % PEG:iä, osmolaalisuus = 365 mM/kg) ja siirrettiin stratifikaatioalustoil-le (0,0 % PEG:iä, osmolaalisuus = 120 mM/kg) ennen stratifikaatiota. Lisäksi, kuten kuviossa 2 on esitetty, itäneiden siementen elinvoimaisuudessa havaittiin parannusta käsittelyn 14 eduksi, jossa kolmellatoista käsittelyryhmään 14 kuuluneista viidestätoista genotyypistä havaittiin elinvoimaisempia epikotyylejä, pidempiä juuria tai molempia kuin käsittelyryhmän 1 alkioilla.

Esimerkki 3 Tämä esimerkki osoittaa, että alustojen vaihtovaiheen poistaminen kypsytyksen ja stratifikaation välillä tuottaa alkioita, joiden itämisfrekvenssi on suurempi.

Menetelmät:

Tsygoottisia alkioita sisältäviä naarasgametofyyttejä poistettiin neljän erilaisen genotyypin mukaisista siemenistä esimerkissä 1 kuvattujen mene telmien mukaisesti. Induktio-, ylläpito- ja kypsytysvaiheet olivat esimerkin 1 kuvauksen mukaisia.

Taulukossa 7 kuvataan kypsytyksen jälkeisiä kokeellisia käsittely-olosuhteita.

Taulukko 7: Kypsytyksen jälkeiset käsittelyolosuhteet

Yllä olevassa taulukossa 7 esitettyjen stratifikaatiokäsittelyjen jälkeen d-kehysten alkiot ruiskuerotettiin kolmelle s-kehykselle (täydet cambro-laatikot) genotyyppiä/käsittelyä kohti. Kaksi idätyslaatikkoa, joissa jokaisessa 25 alkiota, valittiin jokaisesta s-kehyksestä. Yhteensä 6 idätyslaatikkoa luotiin genotyyppiä/käsittelyä kohti. Alkiot asetettiin idätysalustoille eikä istutettu alustoihin. Itäneet siemenet arvioitiin idätysalustoilla 6 viikon ajan toteutetun inku-baation jälkeen. Myös juurten pituus mitattiin kaikilta kategorian 1 kasveilta.

Kategorian 1 itänyt siemen sisältää seuraavat piirteet: 1 mm:n juuri (ei kohoumia), noin 5 noin 5 mm pitkää epikotyylilehteä, ei laajoja murtumia sirkkavarsissa, ja sirkkavarret eivät ole taipuneet enemmän kuin 90 astetta.

Kategorian 1 + 2 itänyt siemen (bipolaarinen) sisältää seuraavat piirteet: 1 mm pitkä juuri (ei kohoumia) ja epikotyylilehtiä (ei kokoa tai lukumäärää), jotka ovat silmin erotettavissa.

Tilastoanalyysi-. Käsittelyjä oli neljä, 2 stratifikaatioalustaa käsittävä täysi faktorikoe (vakio- ja vanhan kypsytysalustan), kertaa kaksi kestoa (4 viikkoa ja 8 viikkoa). Useita erilaisia alustoja käytettiin testiyksiköiden koko alalla ja inkubaation kestoa käytettiin jaetuilla aloilla. Tuloksia arvioitiin itämistaajuuden (kat. 1 ja kat. 1 + kat. 2) ja juuren pituuden mukaan. Juuren pituus analysoitiin sekamallilla sen jälkeen kun oli tehty luonnollinen logaritmimuunnos vaihtelun tasapainottamiseksi. Kategorian 1 ja kategorian 1 + kategorian 2 itäneet siemenet analysoitiin käyttämällä yleistettyä lineaarista sekamallia.

Kategorian 1 itämisfrekvenssitulokset on esitetty alla olevassa taulukossa 8.

Taulukko 8: Keskimääräinen itämisfrekvenssi kategoriassa 1 (kaikki genotyypit mukana)

Kuten yllä olevasta taulukosta 8 nähdään, kategorian 1 itäneiden siementen itämisfrekvenssi oli korkeampi käsittelyissä 3 ja 4, joissa alkiot pidettiin kypsytysalustoilla stratifikaatiovaiheen ajan (eli inkubaatio 4 °C:ssa)

Bipolaarisen kokonaisitämisfrekvenssin (kat. 1 + kat. 2) tulokset on esitetty alla olevassa taulukossa 9.

Taulukko 9: Keskimääräinen bipolaarinen kokonaisitämisfrekvenssi (kat. 1 + kat. 2) (kaikki genotyypit mukana)

Kategorian 1 itämisfrekvenssin tai bipolaarisen (kat. 1 + kat. 2) keskiarvo jokaiselle neljälle testatulle genotyypille vaihteli vain noin 10-20 % (tietoja ei ole esitetty).

Juuren keskipituuden mittausten tulokset on esitetty taulukossa 10. Taulukko 10: Juuren keskipituus (kaikki genotyypit mukana)

Taulukko 11: Kolmen mallin testitulosten vertailu

P-arvot, jotka ovat <0,10 osoittavat merkittävää tulosta.

Yhteenveto tuloksista: Kategorian 1 itämisen osalta havaittiin tilastollisesti merkittävä ero (p=0,07) itämisfrekvenssissä alkioilla, joita pidettiin kypsy-tysalustoilla (muunneltu BM310 % PEG:iä, osmolaalisuus = 336 mM/kg) strati-fikaatiovaiheen ajan (eli inkubaatio 4 °C:ssa), kuten taulukosta 8 nähdään. Mitä kestoon tulee, kypsytysalustoilla (muunneltu BM3 10 % PEG:iä, osmolaalisuus 336 mM/kg) stratifioidut alkiot hyötyivät 4 lisäinkubaatioviikosta, kun taas stratif i kaatioalusto i I la (BM4 0,0 % PEG:iä, osmolaalisuus = 120 mM/kg) olleet eivät hyötyneet. Yleisesti havaittuja matalia itämisarvoja voidaan nostaa käyttämällä varhaista singulaatiota kypsytyksen aikana ja pitämällä sen jälkeen alkiot kypsytysalustoilla singulaation jälkeen koko stratifikaatiojakson ajan.

Kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että stratifikaatiovaiheen toteuttaminen alkuperäisillä kypsytysalustoilla (eli jätetään pois vaihe, jossa alkioita siirretään stratifikaatioalustoille) edesauttaa alkioiden saamista, joilla on voimakkaampi itäminen kategoriassa 1. Tämä on merkittävä tulos, koska stratifikaatioalustoille tapahtuvan siirron poistamisen ansiosta kypsytys, varastointi ja stratifikaatio voidaan toteuttaa kaikki samoilla kypsytysalustoilla, jolloin prosessista tulee paljon tehokkaampi. Esimerkiksi, kypsytysalustoilta stratifikaatioon tapahtuvan alkioiden siirron poisjättäminen vähentää työmäärää, stratifikaatio-alustojen valmistelua, eikä cambro-laatikoita tarvitse valmistella lisää.

Esimerkki 4 Tässä esimerkissä mitataan alustojen volyymin ja alustojen syvyyden vaikutusta somaattisten alkioiden itämisfrekvenssiin kypsytys- ja stratifi-kaatiokäsittelyssä.

Menetelmät:

Tsygoottisia alkioita sisältäviä naarasgametofyyttejä poistettiin neljän eri genotyypin mukaisista siemenistä esimerkissä 1 kuvattujen menetelmien mukaisesti. Induktio- ja ylläpitovaiheet olivat esimerkin 1 kuvauksen mukaisia, paitsi että ESM levitettiin verkon päälle kypsytyskehykselle eikä maljattu tiputtamalla.

Kypsytys- ja stratifikaatiovaiheet toteutettiin alla olevassa taulukossa 12 kuvatulla tavalla. Kaikki tämän kokeen alkiot inkuboitiin kypsytysalustalla, jonka alkuosmolaalisuus oli 336 mM/kg (10 % PEG:iä) 12 viikon ajan, minkä jälkeen seurasi stratifikaatio 4 viikon ajan taulukossa 12 kuvatulla tavalla.

Taulukko 12: Kypsytys-ja stratifikaatiokäsittelyt

Kypsytyksen jälkeen kaikki käsittelyt vietiin idätykseen alla kuvatulla tavalla.

Stratifikaatio: Kuten taulukosta 12 nähdään, käsittelyjen 1 - 6 osalta D-kehyksille maljatut alkiot siirrettiin stratifikaatioalustalle (BIVU, 0,0 % PEG:iä, osmol. = 120 mM/kg). Käsittelyissä 7-12 kypsytysalustoille D-kehykselle maljatut alkiot (muunneltu BM310 % PEG, osmol. = 336 mM/kg) pysyivät samoilla kypsytysalustoilla stratifikaation ajan.

Kokonaisalkiosaanto käsittelyä kohti määriteltiin kypsytysalustalla tapahtuneen 12 viikon inkubaation jälkeen. Viimeistely veden päällä (COW) tehtiin suuressa 1 x 1 cambro-laatikossa 1 viikon ajan.

Idätys: 100 alkiota käsittelyä kohti siirrettiin manuaalisesti idätyslaatikoihin. Alkioiden valintakriteerit idätykseen: Valittiin symmetrisiä alkioita, joilla oli kaikki kolme osaa (sirkkalehti, sirkkavarret ja alkeisjuurialueet) ja joissa ei ollut ilmeisiä vikoja, joilla oli neljä sirkkalehteä tai enemmän, ilman fuusioituneita sirkkalehtiä tai keskeltä kasvavia sirkkalehtiä. Alkioiden koko vaihteli. Alkiot olivat läpikuultamattomia, ja niiden väreinä oli kaikkia valkoisen, keltaisen tai vihreän sävyjä. Läpikuultavia tai lasimaisia vihreitä alkioita ei valittu. Itämisfrekvenssi arvioitiin 6 viikoksi.

Tulokset:

Taulukossa 13 nähdään alustojen volyymin, astian syvyyden ja alustojen syvyyden vaikutus keskimääräiseen alkiosaantoon kypsytyksen ja stratifikaation aikana lineaarisella sekamallilla analysoituna.

Taulukko 13: Alustojen volyymin, astian syvyyden ja alustojen syvyyden tilastollinen merkitys kypsytyksen ja stratifikaation aikana

Kuten yllä olevasta taulukosta 13 nähdään, cambro-laatikon syvyyden (astian syvyyden) vaikutus alkiosaantoon on tilastollisesti merkittävä p-arvolla 0,009. Alustojen volyymin vaikutus on heikosti merkittävä p-arvolla 0,073, kun taas mitään tilastollisesti merkittävää ei havaittu näiden muuttujien välisen keskinäisen vaikutuksen osalta.

Taulukossa 14 nähdään arvioitu keskimääräinen saanto (”LS keskiarvot”) jokaiselle alustojen volyymin ja astian syvyyden tasolle 95 %:n luottamusvälein. Kuten taulukon 14 ryhmäsarakkeesta nähdään, samaan ryhmä-kirjaimeen kuuluvat muuttujat eivät ole tilastollisesti merkittäviä 90 %:n luotta-mustasolla, kun taas tekijät, joilla on eri ryhmäkirjain ovat tilastollisesti erilaisia.

Taulukko 14: Alustojen volyymien ja laatikon syvyyden vaikutus alki-osaantoon kypsytyksen ja stratifikaation aikana

Kuten yllä olevasta taulukosta 14 nähdään, cambro-laatikot, joissa alustojen volyymit olivat 900 ml ja 1200 ml, antoivat tulokseksi tilastollisesti merkittävästi korkeamman alkiosaannon kuin laatikot, joissa alustojen volyymi oli 600 ml. Käsittelyt 900 ml:n ja 1200 ml:n volyymeillä eivät eronneet merkittävästi toisistaan, ja jokaisella oli arvioitu saanto, joka oli laatikkoa kohti noin 140 alkiota suurempi kuin saanto cambro-laatikosta, jonka volyymi oli 600 ml.

Taulukko 15: Alkiosaannon vertailu stratifikaation jälkeen (eli inkubaatio 4 °C:ssa) stratifikaatioalustoilla tai kypsytysalustoilla

Kuten yllä olevasta taulukosta 15 nähdään, alkioiden kypsytys ja stratifikaatio cambro-laatikoilla, joissa oli suurempia alustamääriä (900 ml ja 1200 ml) antoi tulokseksi tilastollisesti merkittävästi korkeampia alkiosaantoja kuin vertailualustamäärä (600 ml). Arvioitu ero näiden alustavolyymikäsittelyjen välillä oli noin 140 alkiota laatikkoa kohti. Lisäksi syvillä Cambro-laatikoilla (4”) alkiosaannot olivat tilastollisesti merkittävästi korkeampia kuin matalilla Cambro-laatikoilla (2”). Arvioitu ero näiden kahden laatikkosyvyyden mukaisissa käsittelyissä oli noin 170 laatikkoa kohti.

Osmolaalisuuden mittaukset Alustojen osmolaalisuus mitattiin kyp-sytysalustalla 12 viikon ajan tapahtuneen inkubaation jälkeen. Kypsytysalusto-jen alkuosmolaalisuus oli 336 mM/kg (10 % PEG). Nämä tulokset on esitetty taulukossa 16.

Taulukko 16: Muutos kypsytysalustojen osmolaalisuudessa 12 viikon kypsytysinkubaation jälkeen

Johtopäätös: Kuten taulukosta 16 nähdään, korkeammilla kypsytysalustojen volyymeillä osmolaalisuus pysyi korkeampana 12 viikon inkubaation jälkeen. Kuitenkin kun kypsytysalustojen alkuosmolaalisuus oli 336 mM/kg, niin lisäalustavolyymilläkään missään laatikoista osmolaalisuus ei pysynyt korkeampana kuin 250 mM/kg 12 viikon jälkeen.

Itämistietoia

Alustojen volyymin, laatikon syvyyden ja stratifikaatiokäsittelyn vaikutus alkioiden itämisfrekvenssiin analysoitiin käyttämällä yleistettyä lineaarista sekamallia. Satunnaisvaikutukset tässä mallissa olivat eriä ja cambro-laatikoita erien sisällä.

Kategoria 1, itävät siemenet:

Kategoriassa 1 itämistä arvioitiin esimerkissä 3 kuvatulla tavalla.

Taulukossa 17 nähdään arvioitu keskimääräinen itämisfrekvenssi kategorian 1 jokaiselle stratifikaatiokäsittelylle 90 %:n luottamusvälein.

Taulukossa 17 esitetyt käsittelyolosuhteet saman ryhmän tasolla eivät ole tilastollisesti merkittäviä 90 %:n luottamustasolla, kun taas käsittelyolosuhteet eri ryhmillä, joilla on eri kirjain, ovat merkittävästi erilaiset.

Kuten taulukosta 17 nähdään, kategoriassa 1 itämisfrekvenssissä oli merkittävä ero (p=0,007, luottamustaso 90 %), kun alkioita pidettiin kypsytys-alustoilla (+ PEG) stratifikaation aikana, verrattuna kategorian 1 itämisfrek-venssiin, kun alkioita siirrettiin kypsytysalustoilta stratifikaatioalustoille (ei PEG:iä) ennen stratifikaatiota.

Kategoriassa 1 + 2 itäneitä siemeniä arvioitiin seuraavasti: kategorian 1 + 2 (bipolaariseen) itäneeseen siemeneen kuuluu seuraavat piirteet: 1 mm pitkän juuren läsnäolo (ei kohoumia) ja silmillä erotettavissa olevien epiko-tyylilehtien (kokoja lukumäärää ei ole määritelty) läsnäolo.

Taulukossa 18 nähdään arvioitu keskimääräinen itämisfrekvenssi kategorian 1 jokaiselle stratifikaatiokäsittelylle 90 %:n luottamusvälein.

Taulukossa 18 esitetyt käsittelyolosuhteet saman ryhmän tasolla eivät ole tilastollisesti merkittäviä 90 %:n luottamustasolla, kun taas käsittelyolosuhteet eri ryhmillä, joilla on eri kirjain, ovat merkittävästi erilaiset.

Kuten taulukosta 18 nähdään, kategoriassa 1 itämisfrekvenssissä oli merkittävä ero (p=0,002, luottamustaso 90 %), joka oli tulosta alkioiden pitämisestä kypsytysalustoilla (+10 % PEG, osmolaalisuus = 336 mM/kg) stratifikaa-tion aikana, verrattuna kategorian 1 + 2 itämisfrekvenssiin, joka oli tulosta alkioiden siirtämisestä kypsytysalustoilta stratifikaatioalustoille (0,0 % PEG, osmolaalisuus = 120 mM/kg) ennen stratifikaatiota.

Itämisfrekvenssiä arvioitiin myös kategorian 1 ja kategorian 1+2 itävyyden osalta, joka oli seurausta alkioista, jotka tuotettiin taulukossa 12 kuvattuja käsittelyjä 1 - 6. Itämisfrekvensseissä havaittujen erojen tilastoanalyysin tulokset on esitetty alla olevassa taulukossa 19.

Taulukko 19: Itämiserojen tilastollinen merkitys useilla erilaisilla käsittelymenetelmillä havainnoituina

Kuten yllä olevasta taulukosta 19 nähdään, kun itämisfrekvenssin erojen merkitystä oli analysoitu sen jälkeen kun alkioita oli käsitelty eri alusta-määrillä, eri laatikon syvyyksillä ja eri stratifikaatioalustaolosuhteissa, ainoastaan eri stratifikaatioalustoihin liittyvissä olosuhteissa havaitut erot osoittautuivat tilastollisesti merkittäviksi. Tilastollisesti merkittävä ero stratifikaatioalustoihin liittyvissä olosuhteissa havaittiin sekä kategorian 1 mukaisten itäneiden siementen (0,007) että kategorian 1 + kategorian 2 mukaisten itäneiden siementen (0,002) kohdalla. Tämä on tärkeä tulos ja osoittaa, että menetelmässä, jossa alkioita inkuboidaan kypsytysalustoilla huoneenlämpötilassa 7-12 viikkoa kestävän ajanjakson ajan osmolaalisuuden ollessa aluksi vähintään 300 - 450 mM/kg ja jossa alkiot sitten stratifioidaan samalla kypsytysalustoilla, eli alkiot siirretään kypsytysalustoilla 0 °C -10 °C:een vähintään 1 viikon ajaksi, tuloksena on suurempi alkiosaanto (kuten esimerkeissä 2 - 3 on kuvattu) sekä suurempi alkio- frekvenssi ja itäneiden siemenien elinvoimaisuus on parempi (kuten on osoitettu esimerkissä 2 ja kuviossa 2 (joissa 15 genotyypistä 13:Ma oli elinvoimaisempi epikotyyli, pidemmät juuret tai molemmat). Näitä tuloksia verrattiin verrokki-menetelmään, jossa alkioita siirrettiin kypsytysalustoilta (osmolaalisuus vähintään 300 mM/kg) st rat if i kaat i oa lustoille (osmolaalisuus 120 mM/kg), minkä jälkeen seurasi stratifikaatio 1 °C -10 °C:ssa vähintään 1 viikon ajan.

Menetelmä, jossa alkiot pidetään kypsytysalustoilla stratifikaation ajan tarjoaa siis odottamatonta etua lisäämällä alkiosaantoa ja itämisfrekvens-siä. Keksinnön mukaisten menetelmien etuihin kuuluu myös helppous suurten alkiomäärien käsittelyssä, koska vaiheita on vähemmän, ja kyky stratifioida ja valinnaisesti varastoida alkioita jälkikypsytysvaiheessa lämpötilassa 1 °C -10 °C jopa 3-6 kuukautta ennen idätystä.

Vaikka edellä on havainnollistettu ja kuvattu keksinnön edullinen suoritusmuoto, on selvää, että siihen voidaan tehdä useita erilaisia muutoksia keksinnön tarkoituksesta ja laajuudesta poikkeamatta.

Claims (34)

1. Patentti vaati mu kset Keksinnön suoritusmuodot, joissa esitetään vaatimus yksinomaisesta omistuksesta tai oikeudesta, määritellään seuraavasti:

   1. Menetelmä stratifioitujen sirkkalehtisten somaattisten havupuual-kioiden tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää: (a) inkuboidaan epäkypsiä somaattisia havupuualkioita käsittävä viljelmä viljelyastiassa, joka käsittää kypsytysalustan, jonka osmolaalisuus on alueella 300 mM/kg - 450 mM/kg, 22 °C - 25 °C:n lämpötilassa ensimmäisen inkubaatiojakson ajan, joka on riittävän pitkä, jotta ainakin osa alkioista saavuttaa anatomisen kypsyyden, jolloin anatominen kypsyys käsittää, että alkiossa on kehittyneet sirkkalehdet ja sirkkavarsi; ja (b) ylläpidetään alkiot viljelyastiassa ja vaiheen (a) mukaisella kypsy-tysalustalla, jonka osmolaalisuus on alueella 300 mM/kg - 450 mM/kg, ja saatetaan kypsät alkiot 0 °C -10 °C:n lämpötilaan vähintään yhden viikon pituisen toisen inkubaatiojakson ajaksi stratifioitujen sirkkalehtisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi.
2. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa kypsytysalusta käsittää PEG:iä konsentraationa, joka on noin 1 % - noin 15 %.
3. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa kypsytysalusta käsittää PEG:iä konsentraationa, joka on noin 7 % - noin 15 %.
4. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa ensimmäinen inkubaatiojakso on 7 -12 viikkoa.
5. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa toinen inkubaatiojakso on 1 - 8 viikkoa.
6. 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa toinen inkubaatiojakso on 1 - 6 kuukautta.
7. 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, joka edelleen käsittää vaiheen (b) mukaisesti käsiteltyjen alkioiden viljelemisen idätysalustassa tai -alustalla itäneiden siementen tuottamiseksi.
8. 8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa kypsytysalustan osmolaalisuus pidetään tasolla, joka on vähintään 200 mM/kg toisen inkubaatiojakson ajan.
9. 9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa ensimmäisessä viljelmässä olevat alkiot singuloidaan ennen ensimmäistä inkubaatiojaksoa.
10. 10. Menetelmä sirkkalehtisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää: (a) inkuboidaan viljelmä, joka käsittää esisirkkalehtisiä somaattisia havupuualkioita kypsytysalustassa tai -alustalla, jonka osmolaalisuus on alueella 300 mM/kg - 450 mM/kg, ensimmäisen inkubaatiojakson ajan; (b) singuloidaan useita vaiheen (a) mukaisesti käsiteltyjä alkioita; (c) viljellään useita singuloituja sirkkalehtisiä somaattisia havupuualkioita viljelyastiassa, joka käsittää toisen kypsytysalustan, jonka osmolaalisuus on alueella 300 mM/kg - 450 mM/kg, lämpötilassa, joka on 22 °C - 25 °C, toisen inkubaatiojakson ajan, joka on riittävän pitkä, jotta ainakin osa alkioista saavuttaa anatomisen kypsyyden jolloin anatominen kypsyys käsittää, että alkiossa on kehittyneet sirkkalehdet ja sirkkavarsi; ja (d) ylläpidetään alkiot viljelyastiassa ja vaiheen (c) mukaisella kypsy-tysalustalla, jonka osmolaalisuus on alueella 300 mM/kg - 450 mM/kg ja saatetaan kypsät alkiot 0 °C -10 °C:n lämpötilaan vähintään yhden viikon mittaisen kolmannen inkubaatiojakson ajaksi stratifioitujen sirkkalehtisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi.
11. 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, jossa toinen kyp-sytysalusta käsittää PEG:iä konsentraationa, joka on noin 1 % - noin 15 %.
12. 12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, jossa ensimmäinen inkubaatiojakso on 6 - 8 viikkoa.
13. 13. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, jossa ensimmäisen inkubaatiojakson ja toisen inkubaatiojakson yhdistelmä on yhteensä ainakin 12 viikon pituinen ajanjakso.
14. 14. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, jossa kolmas inkubaatiojakso on 1 - 6 kuukautta.
15. 15. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, jossa kolmas inkubaatiojakso on 1 - 8 viikkoa.
16. 16. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, jossa viljelyastiassa olevat singuloidut alkiot eivät ole fyysisessä kosketuksessa toisiinsa.
17. 17. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, joka käsittää vielä vaiheen (d) mukaisesti käsiteltyjen alkioiden viljelyn idätysalustassa tai -alustalla itäneiden siementen tuottamiseksi. Patentkrav Uppfinningens utföringsformer, i vilka framförs krav på ensamt ägande eller rättighet, definieras enligt följande:
18. 1. Förfarande för produktion av stratifierade hjärtbladiga somatiska barrträdsembryon, vilket förfarande innefattar: (a) en odling innefattande omogna somatiska barrträdsembryon i ett odlingskärl, innefattande en mogningsplattform vars osmolalitet ligger i inter-vallet 300 mM/kg - 450 mM/kg, inkuberas i en temperatur i intervallet 22 °C -25 °C under den första inkubationsfasen, vilken är tillräckligt lång för att åtminstone en del av embryona ska uppnå anatomisk mognad, varvid anatomisk mognad innefattar att på embryona har utvecklats hjärtblad och hjärtstam; och (b) embryona behålls i odlingskärlet och på mogningsplattformen enligt moment (a) med en osmolalitet i intervallet 300 mM/kg - 450 mM/kg, och mogna embryon förs till temperaturen 0 °C - 10 °C under den minst en vecka långa andra inkubationsfasen för produktion av stratifierade hjärtbladiga somatiska embryon.
19. 2. Förfarande enligt patentkrav 1, i vilket mogningsplattformen innefattar PEG i en koncentration av cirka 1 - cirka 15 %.
20. 3. Förfarande enligt patentkrav 1, i vilket mogningsplattformen innefattar PEG i en koncentration av cirka 7 % - cirka 15 %.
21. 4. Förfarande enligt patentkrav 1, i vilket den första inkubationsfasen är 7 -12 veckor.
22. 5. Förfarande enligt patentkrav 1, i vilket den andra inkubationsfasen är 1 - 8 veckor.
23. 6. Förfarande enligt patentkrav 1, i vilket den andra inkubationsfasen är 1 - 6 månader.
24. 7. Förfarande enligt patentkrav 1, vilket vidare innefattar odling av embryon behandlade enligt moment (b) i eller på en groningsplattform för produktion av grodda frön.
25. 8. Förfarande enligt patentkrav 1, i vilket mogningskärlets osmolalitet hålls på en nivå som är minst 200 mM/kg under den andra inkubationsfasen.
26. 9. Förfarande enligt patentkrav 1, i vilket embryona i den första odlingen singuleras före den första inkubationsfasen.
27. 10. Förfarande för produktion av somatiska hjärtbladiga embryon, vilket förfarande innefattar: (a) en odling innefattande somatiska prehjärtbladiga barrträdsem-bryon inkuberas i eller på en mogningsplattform vars osmolalitet ligger i inter-vallet 300 mM/kg - 450 mM/kg under den första inkubationsfasen; (b) flera enligt moment (a) behandlade embryon singuleras; (c) flera singulerade somatiska hjärtbladiga barrträdsembryonodlas i ett odlingskärl innefattande en andra mogningsplattform, vars osmolalitet ligger i intervallet 300 mM/kg - 450 mM/kg, i en temperatur i intervallet 22 °C - 25 °C under den andra inkubationsfasen, vilken är tillräckligt lång för att åtminstone en del av embryona ska uppnå anatomisk mognad, varvid anatomisk mognad innefattar att på embryona har utvecklats hjärtblad och hjärtstam; och (d) embryona behålls i odlingskärlet och på mogningsplattformen enligt moment (c) med en osmolalitet i intervallet 300 mM/kg - 450 mM/kg, och mogna embryon förs till temperaturen 0 °C - 10 °C under den minst en vecka långa tredje inkubationsfasen för produktion av stratifierade hjärtbladiga somatiska embryon.
28. 11. Förfarande enligt patentkrav 10, i vilket den andra mogningsplattformen innefattar PEG i en koncentration av cirka 1 % - cirka 15 %.
29. 12. Förfarande enligt patentkrav 10, i vilket den första inkubationsfasen är 6 - 8 veckor.
30. 13. Förfarande enligt patentkrav 10, i vilket kombinationen av den första inkubationsfasen och den andra inkubationsfasen tillsammans är åtminstone en 12 veckor lång tidsperiod.
31. 14. Förfarande enligt patentkrav 10, i vilket den tredje inkubationsfasen är 1 - 6 månader.
32. 15. Förfarande enligt patentkrav 10, i vilket den tredje inkubationsfasen är 1 - 8 veckor.
33. 16. Förfarande enligt patentkrav 10, i vilket de singulerade embryona i odlingskärlet inte är i fysisk beröring med varandra.
34. 17. Förfarande enligt patentkrav 10, vilket dessutom innefattar odling av embryon behandlade enligt moment (d) i eller på en groningsplattform för produktion av grodda frön.