CN115281078A - 一种秋水仙素高效诱导马蔺多倍体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种秋水仙素高效诱导马蔺多倍体的方法，包括以下步骤：1）种子萌发诱导；2）诱导处理；3）子叶培养。本发明通过秋水仙素浸泡处理马蔺萌芽的种子诱导多倍体，并进行子叶培养，然后对得到的诱变苗进行染色体倍性和叶片气孔鉴定，最终获得了229个多倍体马蔺新种质；其方法操作简单，处理周期短，加倍率较高，嵌合体比例低，可作为培育马蔺新种质的重要方法，为马蔺多倍体育种奠定基础。

Description

一种秋水仙素高效诱导马蔺多倍体的方法

技术领域

本发明属于植物多倍体育种技术领域，具体涉及一种秋水仙素高效诱导马蔺多倍体的方法。

背景技术

马蔺(Iris lactea var.chinensis)是鸢尾科(Iridaceae)鸢尾属(Iris)多年生草本植物，在我国广泛分布，是重要的观赏植物。其适应性强，具有耐寒、耐旱、耐盐、耐贫瘠等特征，还可以用于盐碱地的改良，对有毒、有害气体有较强的抗性；植株高约50cm，可观花、观叶，花淡蓝或淡紫色，叶青绿色，在园林绿化中广泛应用。然而马蔺与其它鸢尾属植物杂交存在严重的生殖障碍，极难获得杂交后代，无法进行新种质创制。而多倍体育种可通过离体诱导，不依赖父母本杂交受精，为马蔺种质创新提供了新的途径。

多倍体植物由于染色体加倍，产生叠加效果，在形态性状、物质含量、细胞学特性、抗性等多个方面与普通二倍体存在着一定的差异。植株多倍体化后根、茎、叶、花、果等多个器官均有可能变大，生长势和抗逆性会一定程度增强，可提高花卉植物的观赏性和商业价值，为新种质创制和优异新品种培育提供了可能。

秋水仙素在观赏植物多倍体育种中发挥着重要作用，通过秋水仙素诱导获得了一些多倍体新种质，例如百合、月季、蝴蝶兰和菊花等。而鸢尾多倍体育种比较滞后，还未见秋水仙素诱导鸢尾多倍体的相关报道。因此，筛选一种操作简单、高效且适合马蔺多倍体诱导的方法对马蔺新种质创制和鸢尾多倍体育种具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明目的在于提供一种秋水仙素高效诱导马蔺多倍体的方法，提高马蔺多倍体的诱导效率，解决诱导中操作繁琐、诱变苗不易存活的技术问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种秋水仙素高效诱导马蔺多倍体的方法，包括如下步骤：

1)种子萌发诱导

筛选颗粒饱满的马蔺种子洗净，并用清水浸泡24h；取出浸泡后的种子消毒、清洗并吸干种子表面水分，放入培养皿中密封后置于23～25℃光照培养箱中催芽12～20d；

2)诱导处理

秋水仙素溶液配制：用少量酒精溶解秋水仙素，然后用二甲基亚砜配制质量浓度为0.025％～0.200％的秋水仙素溶液，并过滤；

将步骤1)获得的芽长为1～2mm的马蔺种子浸泡于过滤后的秋水仙素溶液中，并置于摇床上避光、震荡诱导12～24h；浸泡处理后，取出种子用无菌水冲洗2次，得到诱导后的种子；

3)子叶培养

将纱布折叠出小垄放入培养皿中，喷水保持纱布湿润，将步骤2)诱导得到的种子的胚根插入纱布的孔隙中，塑料膜密封保湿，放入25℃/20℃光照培养箱进行子叶培养，待种子长出2～3片子叶时移入基质采用纯草炭的营养钵中，放入温室培养90～120d，并用遮阳网进行遮阴处理，得到诱变苗。

进一步，所述步骤1)中消毒的方法为用质量浓度为0.50％的高锰酸钾溶液浸泡2h。

进一步，所述步骤1)中培养皿里垫有湿润纱布且开口处用塑料膜密封保湿。

进一步，所述步骤1)中光照培养箱为白天光照2000lux，时长14h；夜间黑暗条件，时长10h。

进一步，所述步骤2)中秋水仙素质量质量浓度为0.025％～0.100％。

进一步，所述步骤2)中二甲基亚砜的质量浓度为2％，秋水仙素质量浓度为0.025％、0.050％或0.100％，处理时间为12h、18h或24h。

进一步，所述步骤2)中过滤为利用0.22μm无菌微孔滤膜过滤。

进一步，所述步骤3)中将纱布折叠出小垄放入培养皿，喷水保持纱布湿润，然后将种子的胚根插入纱布的孔隙中，放入光照培养箱进行子叶培养；培养条件为白天25℃，光照2000lux，时长14h；夜间20℃，黑暗条件，时长10h。

进一步，还包括步骤4)对诱变苗进行倍性鉴定，选择幼嫩的叶片利用流式细胞仪技术进行倍性鉴定；选取生长旺盛的根尖利用常规染色体制片法进行染色体数目鉴定。

其中，对诱变苗进行气孔密度和大小观察时，选择鉴定出的多倍体马蔺为材料，撕下叶片表皮，在显微镜下观察气孔密度和大小。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明秋水仙素高效诱导马蔺多倍体的方法，成功获得了马蔺多倍体植株229株，且马蔺多倍体诱导率高、嵌合体少。质量浓度为0.050％的秋水仙素处理12h，马蔺多倍体诱导率高达12.44％，共获得129个多倍体植株，嵌合体为20个，占比仅为15.50％；多倍体诱导效果好。对马蔺多倍体诱导的方法简便、易实施，处理周期短。只需要秋水仙素溶液对萌发的马蔺种子(芽1～2mm)进行浸泡处理12h就行，不需组培诱导，不存在污染问题。

2、本发明还提供了促进诱导苗子叶生长的方法，提高了诱变苗子叶的成活率。

3、本发明还筛选出了流式细胞仪鉴定马蔺多倍体的方法，能够更加高效、准确、高质量的对马蔺多倍体进行鉴定。

附图说明

图1为本发明实施例1诱导马蔺种子萌发图片；

图2为本发明实施例1秋水仙素诱导处理后马蔺种子图片；

图3为本发明实施例1秋水仙素诱导处理后马蔺种子生长图片(上.秋水仙素处理；下.对照)；

图4为本发明实施例1马蔺诱导苗子叶培养图片；

图5为本发明马蔺四倍体苗流式细胞仪图片(a.对照；b～l.四倍体)；

图6为本发明马蔺嵌合多倍体苗流式细胞仪图片(a.对照；b～l.嵌合体)；

图7为本发明马蔺多倍体苗染色体数目图片(A.对照；B～I.多倍体植株)；

图8为本发明马蔺多倍体苗叶片气孔图片(a.对照；b～d.多倍体植株)。

具体实施方式

下面将结合本发明具体实施例和附图作进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例中试剂和方法没有特别说明均按常规方法配制和常规操作。

一、实施例一种秋水仙素高效诱导马蔺多倍体的方法

实施例1

一种秋水仙素高效诱导马蔺多倍体的方法，包括以下步骤：

1)种子萌发诱导：筛选颗粒饱满的马蔺种子，清水冲洗8min，浸泡24h；然后用质量浓度为0.50％的高锰酸钾溶液浸泡消毒2h，消毒后，清洗种子后吸干种子表面水分，放入垫有湿润纱布的培养皿中于23～25℃光照培养箱中催芽12～20d，得到发芽的种子(见图1)。所述光照为白天光照2000lux，时常14h；夜间黑暗条件，时长10h。

2)诱导处理：将秋水仙素用少量酒精溶解，然后用质量浓度为2％的二甲基亚砜配制质量浓度为0.025％的秋水仙素溶液，并用0.22μm无菌微孔滤膜过滤；将步骤1)获得的芽长为1～2mm的马蔺种子浸泡于上述秋水仙素溶液中，并置于摇床上避光、震荡诱导12h，浸泡处理后，再用无菌水冲洗种子2次，得到诱导后的种子(见图2、图3)。

3)子叶培养：将纱布折叠出小垄放入培养皿，喷水保持纱布湿润，将步骤2)诱导后种子的胚根插入纱布的孔隙中，塑料膜密封保湿，放入25℃/20℃(白天25℃，光照2000lux，时长14h；夜间20℃，黑暗条件，时长10h)光照培养箱进行子叶培养(如图4所示)；待种子长出2～3片子叶时移入13×13cm的营养钵中，基质采用纯草炭，放入温室培养(90～120d)，并用遮阳网进行遮阴处理，得到诱变苗。

实施例2～15与实施例1的制备方法相同，不同点在于，秋水仙素的浓度以及秋水仙素处理种子的时长不同。

表1不同实施例

本发明针对秋水仙素对马蔺种子萌发的影响进行了探究，结果如表2所示。

表2秋水仙素对马蔺种子萌发的影响

由表2可知，秋水仙素对马蔺种子的萌发具有一定的抑制作用，总体而言秋水仙素处理浓度越高、处理时间越长种子存活率越低。0.025％浓度秋水仙素处理12h的萌发率最高，达到38.48％，处理18h、24h的存活率均超过20％；0.050％浓度秋水仙素处理后存活率为9.37％～19.48％；0.100％浓度处理12h存活率为1.69％，处理18h和24h时没有种子存活；0.150％和0.200％浓度处理后没有种子存活。

二、倍性鉴定及气孔观察结果分析

1、倍性鉴定

鉴定步骤3)得到的诱变苗，选择幼嫩的叶片利用流式细胞仪技术进行倍性鉴定，选取生长旺盛的根尖利用常规染色体制片法进行染色体数目鉴定。

流式细胞仪鉴定方法步骤：首先取1～2片(约1g)幼嫩叶片放入预冷的塑料皿中，将培养皿放入冰盒上，然后加入1000μL4℃预冷20min的细胞提取液，用锋利刀片迅速将叶片切成匀浆状，用流式过滤器过滤至1.5mL离心管中得到细胞溶液，避光后放入4℃冰箱处理5min，再取500μL细胞溶液于样品管中，最后在样品管加入30μLPI染液放在冰盒中避光染色30min，最后在ACEA流式细胞仪上检测。

染色体制片步骤：上午8:00～11:00取样，取根尖1～2cm分裂旺盛的白色部分，清水将基质冲洗干净，0.002mol/L8-羟基喹啉溶液预处理2.5h，然后用卡诺固定液固定2h，移入75％的酒精中放入4℃冰箱中保存备用。取保存好的根尖，1mol/L盐酸常温下解离10～15min，清水洗净吸干后切取根尖分生组织置于载玻片上，加入3滴卡宝品红溶液，染色60min左右，常规压片，最后在OLYMPUSBX43光学显微镜下镜检。

本发明针对秋水仙素诱导马蔺多倍体的成功率进行了探究，结果如表3所示。

表3秋水仙素诱导马蔺多倍体成功率分析

流式细胞仪法鉴定结果如表3所示，0.150％和0.200％秋水仙素处理的各个时间所有种子均死亡，诱导率为0，未获得加倍植株。0.100％秋水仙素溶液处理仅有12h这个时间有植株存活，加倍成功了8株，多倍体诱导率为1.13％。在0.050％秋水仙素处理下，处理的时间与诱导率成反比；处理24h，加倍成功26株，诱导率为6.05％；处理18h诱导率为8.21％，获得了33个多倍体；处理12h诱导率最高为12.44％，获得了129个多倍体。0.025％浓度秋水仙素处理各个时间的诱导率较低，为1.50～5.50％(如图5所示，其中横坐标代表细胞核荧光强度，纵坐标代表细胞核数量，以此判断植株是否是多倍体；例如对照二倍体荧光强度为5，那么四倍体荧光强度应该在10左右)。由此可见，0.050％秋水仙素处理12h诱导马蔺多倍体的效果最好。

本实验一共获得加倍植株229株，其中嵌合体58株，占加倍植株的25.32％。嵌合体的占比跟秋水仙素溶液的浓度密切相关，在一定浓度范围内秋水仙素浓度越高，嵌合体概率越低。0.025％秋水仙素浓度的嵌合体比例最高，而0.050％浓度嵌合体比例最低。0.050％浓度秋水仙素处理中18h嵌合体占比最高，为27.27％；0.050％浓度秋水仙素处理12h嵌合体占比为15.50％。而0.025％浓度秋水仙素处理中，处理24h的嵌合体占比最高，为63.64％(如图6所示，其中横坐标代表细胞核荧光强度，纵坐标代表细胞核数量；以此判断植株是否是多倍体；例如对照二倍体荧光强度为5，那么嵌合体荧光强度应该在5和10均有分布，且细胞数量相当)。由此可见，0.050％浓度秋水仙素处理12h嵌合体占比最低。

参见图7，根据幼嫩茎尖细胞染色体的观察结果，未经处理的对照二倍体植株中的细胞染色体数为2n＝2x＝40。而加倍的植株中染色体数目明显多于未加倍材料，其中部分为纯合四倍体，染色体数目为2n＝4x＝80；嵌合体植株染色体数目为2n＝2x＝40和2n＝4x＝80。

对20个多倍体植株进行根尖染色体数目鉴定，由表4所示，其中纯合体四倍体马蔺植株染色体(2n＝4x＝80)10个，染色体数目存在2n＝2x＝40和2n＝4x＝80的嵌合体1个，以及非整倍体9个，其染色体数目为53～72条。由此可知，马蔺加倍过程中会出现染色体丢失，会产生一些四倍体、非整倍体和嵌合体。

综上所述，0.050％浓度秋水仙素处理12h获得的马蔺多倍体最多，嵌合体比例最小，诱导马蔺多倍体的效果最好。

表4多倍体植株的根尖染色体数目

2、气孔观察

以上述倍性鉴定出的多倍体马蔺为材料，每个多倍体取3个叶片进行气孔观察，用镊子或刀片轻轻撕下叶片表皮细胞，置于载玻片上，滴加1～2滴清水，压片观察(OLYMPUSBX43光学显微镜)，每份材料观察150个气孔，统计视野中气孔大小及数目并拍照，计算气孔密度。

对40个四倍体马蔺植株的气孔大小和密度进行了分析，四倍体植株气孔大小的变异系数为26.29％。22个四倍体植株的叶片气孔长、宽显著大于二倍体植株，占比为55.00％；其叶片气孔密度显著小于二倍体植株(如表5，图8所示)。可见，马蔺多倍体化后叶片气孔会变大，气孔密度会变小，其气孔特征可用于马蔺多倍体植株鉴定。

表5部分四倍体马蔺植株的叶片气孔密度与大小

综上，通过本发明秋水仙素高效诱导马蔺多倍体的方法，成功获得了马蔺多倍体植株229株，且马蔺多倍体的诱导率高、嵌合体少。其中，浓度为0.050％秋水仙素处理12h马蔺多倍体诱导率高达12.44％，共获得129个多倍体植株，嵌合体为20个，占比仅为15.50％；多倍体诱导效果好。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种秋水仙素高效诱导马蔺多倍体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）种子萌发诱导

筛选颗粒饱满的马蔺种子洗净，并用清水浸泡24 h；取出浸泡后的种子消毒、清洗并吸干种子表面水分，放入培养皿中密封后置于23~25 ℃光照培养箱中催芽12~20 d；

2）诱导处理

秋水仙素溶液配制：用少量酒精溶解秋水仙素，然后用二甲基亚砜配制质量浓度为0.025%~0.200%的秋水仙素溶液，并过滤；

将步骤1）获得的芽长为1~2 mm的马蔺种子浸泡于过滤后的秋水仙素溶液中，并置于摇床上避光、震荡诱导12~24 h；浸泡处理后，取出种子用无菌水冲洗2次，得到诱导后的种子；

3）子叶培养

将纱布折叠出小垄放入培养皿中，喷水保持纱布湿润，将步骤2）诱导得到的种子的胚根插入纱布的孔隙中，塑料膜密封保湿，放入25℃/20℃光照培养箱进行子叶培养，待种子长出2~3片子叶时移入基质采用纯草炭的营养钵中，放入温室培养90~120 d，并用遮阳网进行遮阴处理，得到诱变苗。

2.根据权利要求1所述的秋水仙素高效诱导马蔺多倍体的方法，其特征在于，所述步骤1）中消毒的方法为用质量浓度为0.50%的高锰酸钾溶液浸泡2 h。

3.根据权利要求1所述的秋水仙素高效诱导马蔺多倍体的方法，其特征在于，所述步骤1）中培养皿里垫有湿润纱布且开口处用塑料膜密封保湿。

4.根据权利要求1所述的秋水仙素高效诱导马蔺多倍体的方法，其特征在于，所述步骤1）中光照培养箱为白天光照2000 lux，时长14 h；夜间黑暗条件，时长10 h。

5.根据权利要求1所述的秋水仙素高效诱导马蔺多倍体的方法，其特征在于，所述步骤2）中秋水仙素质量质量浓度为0.025%~0.100%。

6.根据权利要求1所述的秋水仙素高效诱导马蔺多倍体的方法，其特征在于，所述步骤2）中二甲基亚砜的质量浓度为2%，秋水仙素质量浓度为0.025%、0.050%或0.100%，处理时间为12 h、18 h或24 h。

7.根据权利要求1所述的秋水仙素高效诱导马蔺多倍体的方法，其特征在于，所述步骤2）中过滤为利用0.22 μm无菌微孔滤膜过滤。

8.根据权利要求1所述的秋水仙素高效诱导马蔺多倍体的方法，其特征在于，所述步骤3）中光照培养箱的培养条件为白天25℃，光照2000 lux，时长14 h；夜间20℃，黑暗条件，时长10 h。

9.根据权利要求1所述的秋水仙素高效诱导马蔺多倍体的方法，其特征在于，还包括步骤4）对诱变苗进行倍性鉴定，选择幼嫩的叶片利用流式细胞仪技术进行倍性鉴定；选取生长旺盛的根尖利用常规染色体制片法进行染色体数目鉴定。

10.根据权利要求9所述的秋水仙素高效诱导马蔺多倍体的方法，其特征在于，对诱变苗进行气孔密度和大小观察时，选择鉴定出的多倍体马蔺为材料，撕下叶片表皮，在显微镜下观察气孔密度和大小。

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