CN104642110A

CN104642110A - 石榴同源四倍体的诱导方法

Info

Publication number: CN104642110A
Application number: CN201510062131.7A
Authority: CN
Inventors: 潘宏兵; 李贵利; 张洪祥; 黄云; 刘斌; 杜邦
Original assignee: PANZHIHUA INSTITUTE OF AGRICULTURE AND FORESTRY SCIENCE
Current assignee: PANZHIHUA INSTITUTE OF AGRICULTURE AND FORESTRY SCIENCE
Priority date: 2015-02-06
Filing date: 2015-02-06
Publication date: 2015-05-27

Abstract

本发明提供一种石榴同源四倍体的诱导方法，该方法为：(1)采收自交成熟的石榴果实，取其种子并用清水洗净晾干，将晾干种子置于4℃条件下处理4d，再放入27℃恒温箱催芽至萌动状态；(2)用质量百分比浓度为0.3％的秋水仙碱溶液浸泡步骤1中萌动的石榴种子，同时将石榴种子置于25℃遮光恒温摇床上，以100r/min的速度振荡诱导培养24h，处理完后用自来水浸泡清洗3-5次，每次浸泡时间5min。本发明克服一般倍性诱导方法操作繁琐的缺陷,诱导方法操作简易，诱导成功率高，满足多倍体选种之用，使多倍体育种成为石榴遗传改良、新品种培育的重要方法。

Description

石榴同源四倍体的诱导方法

技术领域

本发明涉及植物种质资源创新技术领域，尤其涉及一种石榴同源四倍体的诱导方法。

背景技术

石榴是世界上栽培较早的果树，有1000余个品种，在全球热带、亚热带区域种植分布广，具有较高经济价值、药用价值和观赏价值。近年来，国内通过杂交育种、芽变选育、实生选育、国外品种引种驯化选育出了不少优良石榴品种，实现保存石榴品种类型达到280余个。据研究现有栽培石榴为二倍体，体细胞染色体数目有2n＝2x＝18和2n＝2x＝16两种类型，而植物多倍化后，易出现营养和生殖器官的变大，次生代谢物含量的提高，抗逆性、抗病性的增强。因此，诱导培育出同源四倍体石榴，可以较大幅度提高石榴品质、抗逆性、抗病性及药用价值等。而目前的诱导操作方法繁琐，且诱导成功率不高。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术存在的缺陷，提供一种操作简单，诱导成功率高的石榴同源四倍体的诱导方法。

一种石榴同源四倍体的诱导方法，包括以下步骤：

(1)采收自交成熟的石榴果实，取其种子并用清水洗净晾干，将晾干种子置于4℃条件下处理4d，再放入27℃恒温箱催芽至萌动状态；

(2)将步骤1中萌动的石榴种子浸泡在质量百分比浓度为0.3％的秋水仙碱溶液里，然后将其置于25℃遮光恒温摇床上，以100r/min的速度振荡诱导培养24h，处理完后用自来水浸泡清洗3-5次，每次浸泡时间5min。

进一步地，如上所述的石榴同源四倍体的诱导方法，所述质量百分比浓度为0.3％的秋水仙碱溶液中添加有二甲基亚砜，二甲基亚砜在秋水仙碱溶液中的质量百分比浓度为1％。

进一步地，如上所述的石榴同源四倍体的诱导方法，在步骤1中进行催芽过程中，每天用清水清洗一次催芽种子以及催芽过程中用到的纱布。

进一步地，如上所述的石榴同源四倍体的诱导方法，在步骤1之前，还包括：按照石榴生长特性进行常规栽培管理，在石榴盛花期进行自花或同株异花人工授粉，授粉前后套透气纸袋隔离；精心管理授粉石榴树，防止落花落果；其中，石榴授粉时间选上午9:00—10:00。

进一步地，如上所述的石榴同源四倍体的诱导方法，在步骤2之后，还包括以下步骤：

(3)将诱变处理后的萌动石榴种子播种于消毒处理过的苗床或育苗盘，适时浇水和病虫害防治，待苗长出真叶后，每周喷洒1次1/2MS营养液叶面肥；

(4)多倍体流式细胞仪检测，取正常二倍体植株的嫩叶0.10g作为对照组，另分别取所有诱变处理植株的嫩叶各0.10g，然后将正常二倍体和所有诱变处理植株的嫩叶分别置于含1ml WPB缓冲液的培养皿中用刀片剁碎，2min后用300目尼龙网过滤，滤液加入50μl 10mg/ml DAPI，5min后用流式细胞仪检测，利用正常二倍体植株的嫩叶的滤液作为对照，筛选出叶片单细胞DNA含量为两倍于二倍体植株的变异株，将该变异株拟定为四倍体，并将其编号作为下一步植株染色数目检测材料；

(5)多倍体染色体数目观察：从拟定为四倍体的植株上剪取5-7cm长嫩枝，生根处理后扦插于沙床，扦插苗培育生根2周后，取其幼嫩根尖长2-3mm，用质量百分比浓度为0.1％的秋水仙碱溶液预处理4h，蒸馏水洗2-3次后，在4℃冰箱用卡诺氏固定液固定24h，4℃冰箱中保存备用，将根尖蒸馏水清洗，置于1mol/L HCl于60℃水浴中酸解8min，然后用改良苯酚品红染色压片法制备染色体标本，用显微镜观察染色体数目，选染色体数目为两倍于二倍体染色体数目的植株，确定为加倍成功的同源四倍体石榴。

进一步地，如上所述的石榴同源四倍体的诱导方法，步骤4之前，包括：提前镜检诱变材料气孔大小，筛选气孔大于二倍体的变异植株用于多倍体流式细胞仪检测。

进一步地，如上所述的石榴同源四倍体的诱导方法，步骤5中，根尖盐酸裂解后，放入蒸馏水中低压渗透20分钟，促使细胞染色体分散。

本发明克服一般倍性诱导方法操作繁琐的缺陷。诱导方法操作简易，诱导成功率高，满足多倍体选种之用，使多倍体育种成为石榴遗传改良、新品种培育的重要方法。

附图说明

图1为本发明实验例石榴二倍体染色体图；

图2为本发明实验例石榴四倍体染色体图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供的一种石榴同源四倍体的诱导方法包括以下步骤：

(1)人工授粉及管理：按照石榴生长特性进行常规栽培管理，在石榴盛花期进行自花或同株异花人工授粉，授粉前后套透气纸袋隔离；精心管理授粉石榴树，防止落花落果；其中，石榴授粉时间选上午9:00—10:00，坐果后及时给树体补充养分、水分，减少生理落果，促进果实正常发育。

(2)种子预处理：采收自交成熟的石榴果实，取其种子并用清水洗净晾干。将晾干种子置于4℃低温处理4d，再放入27℃恒温箱催芽至萌动状态。由于石榴果肉难清洗干净，易少量残留在外种皮上，在恒温催芽过程中容易发霉，应注意每天用清水清洗一次纱布和催芽种子。

具体地，将石榴种子低温处理一段时间(置于4℃低温处理4d)是为了打破种子休眠，有利于种子催芽，减少种子催芽萌发时间，提高种子催芽萌发整齐度。

(3)同源四倍体诱导：将处理刚萌动的石榴种子浸泡在质量百分比浓度为0.3％的秋水仙碱溶液(添加1％的二甲基亚砜DMSO)里，然后将其置于25℃遮光恒温摇床上，以100r/min的速度振荡诱导培养24h，处理完后用自来水浸泡清洗3-5次，每次浸泡时间5min。

具体地，在相同处理时间长度下，高浓度比低浓度秋水仙碱溶液诱导多倍体效果好些，但高浓度比低浓度秋水仙碱溶液毒害损伤诱导材料要大些，因此，本发明用秋水仙碱溶液诱导多倍体时，选用0.3％的秋水仙碱溶液诱导石榴同源四倍体。二甲基亚砜作为渗透剂，能够促进秋水仙碱快速渗透到植物组织细胞中去，并提高秋水仙素的加倍效果。同时二甲基亚砜能减轻秋水仙碱的毒害作用，并降低嵌合体的发生率。添加质量百分比浓度为1％的DMSO能提高多倍体诱导效果。100r/min的速度振荡让秋水仙碱溶液充分与诱变种子材料接触，同时也可以增加处理溶液中的氧量含，利于种子萌发正常生理代谢进行。

(4)诱变苗培育：将诱变处理后的石榴种子播种于消毒处理过的苗床或育苗盘，适时浇水和病虫害防治，待苗期一周后给叶面喷洒1次1/2MS营养液。其中，土壤、基质、育苗盘等消毒可选用多菌灵、高锰酸钾等药剂，诱变石榴苗期喷施1/2MS营养液浓度范围700-1000倍液。

(5)多倍体流式细胞仪检测：取正常二倍体植株的嫩叶0.10g作为对照组，另分别取所有诱变处理植株的嫩叶各0.10g，然后将正常二倍体植株的嫩叶和所有诱变处理植株的嫩叶分别置于含1ml木本植物缓冲液(woody plant buffer,简称：WPB)缓冲液的培养皿中用刀片剁碎，2min后用300目尼龙网过滤，滤液加入50μl 10mg/ml 4',6-二脒基-2-苯基吲哚，(4',6-diamidino-2-phenylindole，简称：DAPI)，5min后用流式细胞仪检测，利用正常二倍体植株的嫩叶的滤液作为对照，筛选出叶片单细胞DNA含量为两倍于二倍体植株的变异株，将该变异株拟定为四倍体，并将其编号作为下一步植株染色数目检测材料。在该步骤中，可提前镜检诱变材料气孔大小，筛选气孔大于二倍体的变异植株用于多倍体流式细胞仪检测，以提高检测效率。

(6)多倍体染色体数目观察：从拟定为四倍体的植株上剪取5-7cm长嫩枝，生根处理后扦插于沙床。扦插苗培育生根2周后，取其幼嫩根尖长2-3mm，用质量百分比浓度为0.1％的秋水仙碱溶液预处理4h，蒸馏水洗2-3次后，在4℃冰箱用卡诺氏固定液(95％酒精：冰乙酸＝3:1)固定24h，4℃冰箱中保存备用。将根尖蒸馏水清洗，置于1mol/L HCl于60℃水浴中酸解8min，根尖盐酸裂解后，放入蒸馏水中低压渗透20min，促使细胞染色体分散，然后用改良苯酚品红染色压片法制备染色体标本，显微镜观察染色体数目。选染色体数目为两倍于二倍体染色体数目的植株，确定为加倍成功的同源四倍体石榴，观察到染色体数目非整倍于二倍体为嵌合体植株，不能直接使用。其中，可以对嵌合体进行分离纯化，具体的步骤为：对检测出的嵌合体石榴植株，可采用修剪、嫁接、组培等方法进行后期分离纯化，提高四倍体植株获得率。

四倍体石榴的栽培管理：

四倍体石榴种苗定植后，按常规的二倍体石榴进行栽培管理，与二倍体石榴进行对比观察记录，比较其物候期、形态学差异、产量变化、果实营养成分含量变化，为选育优良四倍体石榴、创新石榴育种资源奠定基础。

实验例：

(1)2013年11月于攀枝花市农林科学研究院，选用当年‘以色列软籽酸’石榴(染色体数目为2n＝2x＝16)自交种子为试验材料，将种子洗净晾干后置于4℃低温处理4d，再放入27℃恒温箱催芽至萌动状态。

(2)配置浓度为0.3％的秋水仙碱溶液(添加1％的DMSO)诱变试剂，遮光浸泡处理萌动‘以色列软籽酸’种子，置于25℃恒温摇床上以100r/min的速度振荡诱导培养。秋水仙碱溶液浸泡处理时间设0h、12h、24h、36h四个处理，每处理60粒萌动种子，试验重复3次。

(3)用自来水浸泡清洗经秋水仙碱溶液浸泡处理的‘以色列软籽酸’种子3-5次，每次浸泡时间5min。

(4)将自来水清洗干净后的‘以色列软籽酸’诱变种子，按每孔穴1粒种子播种于装满沙土的50孔穴育苗盘，置于温室育苗床上培育。适时浇水和病虫害防治，苗期一周喷洒1次1/2MS营养液。

(5)待诱导苗长到15-20cm高，取二倍体植株和诱变处理植株的嫩叶各0.10g，分别置于含1ml WPB缓冲液的培养皿中用刀片剁碎，2min后用300目尼龙网过滤，滤液加入50μl 10mg/ml DAPI，5min后用流式细胞仪检测。筛选出叶片单细胞NDA含量两倍于二倍体植株的变异株，拟定为四倍体‘以色列软籽酸’植株。

(6)从拟定四倍体‘以色列软籽酸’植株上剪取5-7cm长嫩枝，用500倍根旺(吲丁·萘乙酸)生根剂溶液浸泡处理1h后扦插于沙床。扦插苗培育生根2周后，取其幼嫩的根尖长2-3mm，用0.1％的秋水仙碱溶液于4℃冰箱预处理4h，蒸馏水洗2-3次后，于4℃条件下用卡诺氏固定液(95％酒精：冰乙酸＝3:1)固定24h，4℃冰箱中保存备用。将根尖蒸用馏水清洗后置于1mol/L HCl于60℃水浴中酸解8min，用改良苯酚品红染色压片法制备染色体标本，显微镜观察染色体数目，选取染色体数目为2n＝4x＝32的幼苗，确定为加倍成功的同源四倍体‘以色列软籽酸’石榴。‘以色列软籽酸’石榴的二倍体染色体(图1)和四倍体染色体(图2)。

表1秋水仙碱诱导四倍体的结果

处理	处理种子数	成活率/％	变异苗数	四倍体苗数	总变异率(％)	四倍体诱导率(％)
							0h	180	87.78	0	0	0.00	0.00
12h	180	81.11	5	1	2.78	0.56
							24h	180	78.89	9	2	5.00	1.11
36h	180	67.22	0	0	0.00	0.00

从表1可以看出，秋水仙碱溶液诱导四倍体‘以色列软籽酸’效果，处理24h诱导效果最好，四倍体诱导率为1.11％，其次为处理12h，处理36h未诱导出四倍体。

本发明是对石榴进行了遗传改良，建立了利用自交种子化学诱变培育四倍体石榴新品种方法，创造出同源四倍体石榴新种质。用0.3％的秋水仙碱溶液(添加1％的DMSO)对萌动种子进行诱变处理，操作方法简单，不受环境和季节等条件限制，四倍体诱导率达1.11％。同源四倍体石榴种苗变异性状稳定，经培育2年可试花，3年可试果，满足多倍体选种之用，使多倍体育种成为石榴遗传改良、新品种培育的重要方法。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种石榴同源四倍体的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的石榴同源四倍体的诱导方法，其特征在于，所述质量百分比浓度为0.3％的秋水仙碱溶液中添加有二甲基亚砜，二甲基亚砜在秋水仙碱溶液中的质量百分比浓度为1％。

3.根据权利要求1所述的石榴同源四倍体的诱导方法，其特征在于，在步骤1中进行催芽过程中，每天用清水清洗一次催芽种子以及催芽过程中用到的纱布。

4.根据权利要求1所述的石榴同源四倍体的诱导方法，其特征在于，在步骤1之前，还包括：按照石榴生长特性进行常规栽培管理，在石榴盛花期进行自花或同株异花人工授粉，授粉前后套透气纸袋隔离；精心管理授粉石榴树，防止落花落果；其中，石榴授粉时间选上午9:00—10:00。

5.根据权利要求1所述的石榴同源四倍体的诱导方法，其特征在于，在步骤2之后，还包括以下步骤：

(4)多倍体流式细胞仪检测，取正常二倍体植株的嫩叶0.10g作为对照组，另分别所有诱变处理植株的嫩叶各0.10g，然后将正常二倍体和所有诱变处理植株的嫩叶分别置于含1ml WPB缓冲液的培养皿中用刀片剁碎，2min后用300目尼龙网过滤，滤液加入50μl 10mg/ml DAPI，5min后用流式细胞仪检测，利用正常二倍体植株的嫩叶的滤液作为对照，筛选出叶片单细胞DNA含量为两倍于二倍体植株的变异株，将该变异株拟定为四倍体，并将其编号作为下一步植株染色数目检测材料；

6.根据权利要求5所述的石榴同源四倍体的诱导方法，其特征在于，步骤4之前，包括：提前镜检诱变材料气孔大小，筛选气孔大于二倍体的变异植株用于多倍体流式细胞仪检测。

7.根据权利要求5所述的石榴同源四倍体的诱导方法，其特征在于，步骤5中，根尖盐酸裂解后，放入蒸馏水中低压渗透20分钟，促使细胞染色体分散。