CN110714061A - 基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法，包括以下步骤：(1)研究区域选择及土壤样品采集；(2)土壤理化性质分析；(3)DNA提取、PCR扩增和Illumina MiSeq测序；(4)16S和18S测序数据的处理；(5)长期堆煤对土壤性质和微生物群落影响分析；通过上述步骤，能够分析电厂长期堆煤对土壤有机质和土壤细菌多样性的影响，对指导燃煤电厂煤堆场环境影响评价和土植被恢复具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及土壤微生物生态学领域，尤其涉及基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法。
背景技术
中国是世界上最大的煤炭生产和消费国。在中国，煤炭约占其每年能源消耗的74％，且预计煤炭作为主要能源在不久的将来可能会进一步增加。煤炭资源的开发利用不可避免地带来一系列生态环境问题，如土地破坏，植被减少和生物多样性减少等。特别是在煤矿区，以前的研究提供了煤炭开采导致的生态系统退化的证据，表现为植物和微生物多样性的减少以及土壤结构和性质的改变。采矿后，大量煤炭被运往发电厂的煤场。自燃煤电厂运行以来，煤场堆满了数十年甚至更长时间的煤。然而，到目前为止，很少有研究调查过在煤场堆煤的土壤生态效应的方法。
土壤微生物在维持生态系统功能方面发挥着重要作用。任何环境干扰都可能对土壤微生物群落产生重大影响。煤是一种复杂的植物残体混合物，在水淹环境中积累，并已被微生物和其他成岩活动转化为棕色或黑色。在煤堆积过程中，煤中的化学成分可能渗透到土壤中，改变土壤性质，进而影响微生物。比如由于煤中复杂的高分子有机组分的输入，土壤有机质(SOM)可能增加。此外，由于硫和重金属元素的释放，土壤可能会对微生物产生酸化或毒性。所以，能够获取对长期堆积煤对土壤微生物群落的潜在影响及数据是至关重要的，从而如何获取这些数据和分析潜在影响的标准是至关重要的。
发明内容
本发明的目的是为了研究长期堆积煤对土壤微生物群落的影响以及时间效应，本发明是为了解决如何能够获取对长期堆积煤对土壤微生物群落的潜在影响数据，以及如何分析数据来评判长期堆积煤对土壤微生物群落影响的程度。
本发明是通过以下技术方案实现：
基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法，包括以下步骤：
步骤一：研究区域选择及土壤样品采集。
从多个发电厂采集土壤样品，每个发电厂采集的样品分别进行DNA提取和测量土壤理化性质。
步骤二：土壤理化性质分析。
采用水土悬浮液，测量其pH值、土壤有机质、总氮、总磷、总钾含量，之后提取土壤溶解有机物质，随后将悬浮液离心，离心后获取其上清液，并通过无菌膜过滤，确定提取的土壤DOM的官能团，记录土壤DOM的三维激发-发射矩阵荧光光谱。
步骤三：DNA提取、PCR扩增和IlluminaMiSeq测序。
在步骤一种所采集的土壤中提取DNA，选择扩增16S rRNA基因V4区的引物组
515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和
806R(5'-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3')扩增原核生物的细菌和古细菌，引物组Euk1391F(5'-GTACACACCGCCCGTC-3')和EukBR(5'-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3')扩增18S rRNA基因以扩增真核谱系，对扩增进行测序。
使用土壤微生物DNA强力提取试剂盒从上述采集的土壤中提取DNA，选择扩增16SrRNA基因V4区的引物组
515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和
806R(5'-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3')扩增原核生物的细菌和古细菌，引物组Euk1391F(5'-GTACACACCGCCCGTC-3')和EukBR(5'-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3')扩增18S rRNA基因以扩增真核谱系，再用荧光计定量后，在二代高通量测序平台上对扩增进行测序。
步骤四：16S和18S测序数据的处理。
测序获得的序列进行处理和分析，将低质量序列舍去，再将剩余的序列进行分类，并进一步分析。
步骤五：长期堆煤对土壤性质和微生物群落影响分析。
对草坪的测试对照组和煤场土之间的土壤性质进行比较，研究长期堆煤对土壤PH、总氮、总钾、总磷的影响。
进一步的，在步骤一中，从多个发电厂采集土壤样品，每个发电厂包含两个采样点，其中一个在煤场采集，另一个在草坪土壤中采集作为对照组，从每个采样点的煤层和草坪层下面的土壤岩心采用立体网状采样法收集土壤样品，将新鲜土壤样品过筛，除去可见的根和其他残留物，将样品中的每一个分成两个子样品，其中一个用于DNA提取，另一个用于测量土壤理化性质。
进一步的，在步骤二中，采用水土悬浮液，并进行摇动均匀，使用pH计测量土壤pH值，用重铬酸钾法测定土壤有机质，通过元素分析仪测量总氮含量，通过HF-HClO4消解有机物和还原性物质，然后分别使用钼蓝分光光度法和火焰光度法测定土壤中总磷和总钾的含量。
摇动悬浮液，提取土壤溶解有机物质，随后将悬浮液离心，离心后获取其上清液，并通过无菌膜过滤。
应用三维激发-发射矩阵荧光光谱确定提取的土壤DOM的官能团，用氙弧灯作为激发源的荧光分光光度计记录土壤DOM的三维激发-发射矩阵荧光光谱。
应用500～900V的PMT电压和自动响应时间，使用2～8nm激发和发射狭缝记录光谱，波长设定为200～400nm用于激发，并且220～550nm用于发射。
进一步的，在步骤四中，使用二代高通量测序平台测序获得的序列使用微生物群落的分析软件处理和分析，将低质量序列舍去，低质量序列的判断标准为：Q phred得分<25和序列片段长度短于200bp的舍去，之后，使用UPARSE算法将剩余序列聚类成具有97％相似性阈值的操作分类单位，使用QIIME版本的Greengenes数据库的核糖体数据库项目分类器，将分类标准分配给细菌和古细菌的操作分类单位，根据SILVA_132数据库将分类标准分配给真核操作分类单位，每个样品的相等序列被随机二次取样以将数据集稀释到相同水平用于进一步分析，使用原核分类群的功能注释数据库预测基于检测到的原核分类群的功能。
进一步的，在步骤五中，根据每个样品观察到的操作分类单位的数量判断微生物群落丰度，进行单因素方差分析，以分析长期堆积煤对所有采样点的土壤和微生物特性的影响，在总体方差分析显著的情况下，P<0.05，进一步进行最小显著性差异分析，以测试对照组和煤场土之间的显著性，基于Bray-Curtis距离的聚类分析说明样本之间的整体群落变化，Mantel分析确定与群落组成Bray-Curtis距离显著相关的环境因素，使用QIIME、RStudio、SigmaPlot或SPSS进行分析。
进一步的，在步骤一中，每个发电厂采用立体网状采样法收集土壤样品，煤场土采集以煤场为圆心，在水平分别为120°、240°、360°三个方向，在距离圆心20～200米位置分别采集0-10cm深度的有机层土壤样品，并混合上述三个有机层土壤样品，对照的草坪土壤选择在煤场常年风上游直线距离2公里外选择一个点为圆心，按照煤场土采集的方法进行采集，且对于多个发电厂土壤样品采集的方法如下：选择一个城市，时间上按照电厂土壤堆煤时间序列N，10+N、20+N和这一城市历史最悠久的电厂N最。
进一步的，在步骤二中，EEM数据在操作上定义为五个区域，EEM峰与腐殖质样、酪氨酸样、色氨酸样或酚类有机化合物有关，较短激发波长小于250nm和较短发射波长小于350nm的峰与芳香族蛋白I区和II区有关，较短激发波长大于250nm和较长发射波长大于350nm的峰与富里酸样物质III区有关，中等激发波长250-280nm的和较短发射波长小于380nm的峰与可溶性微生物副产物样物质IV区有关，较长激发波长大于280nm和较长发射波长大于380nm的峰与腐殖酸样有机物V区有关。
进一步的，在步骤五中对微生物群落影响分析指标包含土壤理化性质、土壤有机质、微生物丰度、微生物距离区分四个指标。
进一步的，在步骤一中，将新鲜土壤样品过2mm筛，除去可见的根和其他残留物，将样品中的每一个分成两个子样品，用于DNA提取的子样品放置在-20℃～-60℃环境下存储，用于测量土壤理化性质的子样品放置在2℃～6℃环境下存储。
进一步的，在步骤二中，在20℃的环境下，在往复振荡器中以260rpm摇动土水比为1:5w/v的悬浮液，用蒸馏水提取土壤溶解有机物质，随后将悬浮液以4000×g离心10分钟，并将上清液通过0.1～0.8μm无菌膜过滤，最优选的采用0.45μm无菌膜过滤。
与现有的技术相比，本发明的有益效果是：
本发明公开了基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法，该方法操作简单，可行性高，提供了如何获取长期堆积煤对土壤微生物群落的潜在影响及数据的方法，提供了长期堆煤对土壤影响的分析模型与范例，研究出的数据能够提供长期堆积煤对土壤微生物群落的潜在影响的标准和影响程度，从而对指导燃煤电厂煤堆土植被恢复具有重要意义。
附图说明
图1为本发明基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法的工作流程示意图；
图2为长期堆煤对土壤特性影响的示意图；
图3为采样点土壤溶解有机质的三维激发-发射矩阵图；
图4为长期堆煤对所有采样点土壤微生物丰度的影响示意图；
图5为长期堆煤对所有采样点土壤微生物功能基因丰度的影响图；
图6为长期堆煤场土壤微生物群落组成主成分分析PCoA图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1，图1为本发明基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法的工作流程示意图。
基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法，包括以下步骤：
步骤一：研究区域选择及土壤样品采集。
从多个发电厂采集土壤样品，对于多个发电厂土壤样品采集的方法如下：选择一个城市，时间上按照电厂土壤堆煤时间序列N，10+N、20+N和这一城市历史最悠久的电厂N最。每个发电厂包含两个采样点，其中一个在煤场采集，另一个在草坪土壤中采集作为对照组，从每个采样点的煤层和草坪层下面的土壤岩心采用立体网状采样法收集土壤样品，每个发电厂采用立体网状采样法收集土壤样品，煤场土采集以煤场为圆心，在水平分别为120°、240°、360°三个方向，在距离圆心50米位置分别采集0-10cm深度的有机层土壤样品，并混合上述三个有机层土壤样品，对照的草坪土壤选择在煤场常年风上游直线距离2公里外选择一个点为圆心，按照煤场土采集的方法进行采集，将新鲜土壤样品过2mm筛，除去可见的根和其他残留物，将样品中的每一个分成两个子样品，其中一个在-40℃下储存，用于DNA提取，另一个在4℃下储存，用于测量土壤理化性质。
步骤二：土壤理化性质分析。
在用土水比1:5w/v悬浮液摇动30分钟后，使用pH计(FE20-FiveEasyTM pH，Mettler Toledo，Germany)测量土壤pH值，用重铬酸钾法测定土壤有机质，通过元素分析仪(Vario MAX，Elementar，Germany)测量总氮含量，通过HF-HClO4消解有机物和还原性物质，然后分别使用钼蓝分光光度法和火焰光度法测定土壤中总磷和总钾的含量。
消解是用酸液或碱液并在加热条件下破坏样品中的有机物或还原性物质。常用的酸解体系有：硝酸-硫酸，硝酸-高氯酸，氢氟酸，过氧化氢等，它们可将污水和沉积物中的有机物和还原性物质如氰化物、亚硝酸盐、硫化物、亚硫酸盐、硫代硫酸盐以及热不稳定的物质如硫氰盐等全部破坏，便于下一步测试。
20℃下，在往复振荡器中以260rpm摇动土水比1:5w/v的悬浮液，用蒸馏水提取土壤溶解有机物质，随后将悬浮液以4000×g离心10分钟，并将上清液通过0.45μm无菌膜(GN-6Metrice，Gelman Sciences，USA)过滤，三维激发-发射矩阵荧光光谱用于确定提取的土壤DOM的官能团，用配备有150W氙弧灯作为激发源的荧光分光光度计(Model F-7000，Hitachi，Japan)记录土壤DOM的三维激发-发射矩阵荧光光谱，应用700V的PMT电压和自动响应时间，使用5nm激发和发射狭缝记录光谱，波长设定为200至400nm用于激发，并且220至550nm用于发射，采用Origin软件处理EEM数据，EEM数据在操作上定义为五个区域，EEM峰与腐殖质样、酪氨酸样、色氨酸样或酚类有机化合物有关，较短激发波长小于250nm和较短发射波长小于350nm的峰与芳香族蛋白I区和II区有关，较短激发波长大于250nm和较长发射波长大于350nm的峰与富里酸样物质III区有关，中等激发波长250-280nm的和较短发射波长小于380nm的峰与可溶性微生物副产物样物质IV区有关，较长激发波长大于280nm和较长发射波长大于380nm的峰与腐殖酸样有机物V区有关。
步骤三：DNA提取、PCR扩增和IlluminaMiSeq测序。
使用MoBio PowerSoil DNA Isolation Ki(MO BIO，USA)，即美国mobio土壤微生物DNA强力提取试剂盒从上述采集的土壤中提取DNA，详细的PCR扩增子方案参考地球微生物组项目(http://www.earthmicrobiome.org/protocols-and-standards/)，选择扩增16SrRNA基因V4区的引物组
515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和
806R(5'-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3')扩增原核生物的细菌和古细菌，引物组Euk1391F(5'-GTACACACCGCCCGTC-3')和EukBR(5'-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3')扩增18S rRNA基因以扩增真核谱系，再用Qubit荧光计(Thermo Fisher Scientific Inc.，USA)定量后，在二代高通量测序平台上对扩增进行测序，主流的二代高通量测序平台是illumina，主要有Miseq、Hiseq、PE250不同系列，采用PE250测序长度短。
步骤四：16S和18S测序数据的处理。
二代高通量测序平台测序获得的序列使用QIIME v.1.9.0处理和分析，QIIMEv.1.9.0为专门针对于微生物群落的分析软件，可以进行OTU,以及多样性分析。是指第1.9.0版本，将低质量序列，即Q phred得分<25和序列片段长度短于200bp的舍去，
低质量序列判断标准：
碱基质量使用Q(Phred值)表示，其计算公式为：Q＝-10log10(P)，举例说明，当100个碱基中有1个错误，质量评分为q＝-10*log10(0.01)＝20，质量评分通常在0至40的范围内，Q phred得分<25判定为低质量序列；
序列片段长度短于200bp判定为低质量序列。
之后，使用UPARSE算法将剩余序列聚类成具有97％相似性阈值的操作分类单位，使用基于最新QIIME版本(gg_13_8)的Greengenes数据库的核糖体数据库项目分类器，将分类标准分配给细菌和古细菌的操作分类单位，根据SILVA_132数据库将分类标准分配给真核操作分类单位，每个样品的相等序列(细菌：40000个读数；古细菌：400个读数；真菌：3000个读数；原生生物：1500个读数)被随机二次取样以将数据集稀释到相同水平用于进一步分析，使用原核分类群的功能注释数据库预测基于检测到的原核分类群的功能。
步骤五：长期堆煤对土壤性质和微生物群落影响分析。
对草坪的测试对照组和煤场土之间的土壤性质进行比较，研究长期堆煤对土壤PH、总氮、总钾、总磷的影响。
根据每个样品观察到的操作分类单位的数量判断微生物群落丰度，进行单因素方差分析，以分析长期堆积煤对所有采样点的土壤和微生物特性的影响，在总体方差分析显著的情况下，P<0.05，进一步进行最小显著性差异分析，以测试对照组和煤场土之间的显著性，基于Bray-Curtis距离的聚类分析说明样本之间的整体群落变化，Mantel分析确定与群落组成Bray-Curtis距离显著相关的环境因素，使用QIIME、RStudio、SigmaPlot或SPSS进行分析，对微生物群落影响分析指标包含土壤理化性质、土壤有机质、微生物丰度、微生物距离区分四个指标，QIIME(Quantitative Insights Into Microbial Ecology)是一个专门针对于微生物群落的分析软件，可以进行OTU,以及多样性分析。
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实施例：
选取某市四个发电厂(TJ电厂：10年，PW电厂：20年，LH电厂：30年，TJA电厂：70年)作为研究对象，利用基于土壤理化性质和有机质指标分析长期堆煤对土壤有机质和土壤细菌多样性的影响。
(1)采集土壤样品
从四个发电厂采集土壤样品，每个发电厂包含两个采样点，一个在煤场，另一个在草坪土壤中作为对照。在每个采样点，划分三个6米×6米的采样点，并从每个采样点煤层或草坪层下面的土壤岩心0-10cm深度中随机收集并合并五个有机层土壤样品，总共24个样品。将新鲜土壤样品过2mm筛，除去可见的根和其他残留物。将24个样品中的每一个分成两个子样品，一个在－40℃下储存用于DNA提取，另一个在4℃下储存用于测量土壤物理化性质。
(2)土壤理化性质分析
将4℃下储存的24个样本分成A、B、C三类。
①PH测定
按照土水比(1：5w/v)将A类样本进行稀释，摇动30分钟后形成悬浮液，使用pH计(FE20-FiveEasyTM pH，Mettler Toledo，Germany)测量土壤pH，并将测试结果汇总统计。
②氮、磷、钾含量测定
选取B类样本，通过元素分析仪(Vario MAX，Elementar，Germany)测量所有样本的总氮(TN)含量。将样本通过HF-HClO4消解后，分别使用钼蓝分光光度法测定样本总磷(TP)含量，火焰光度法测定样本总钾(TK)含量。
③有机质测定
在室温20℃下，按照土水比(1：5w/v)将C类样本进行稀释，摇动30分钟后形成悬浮液，在往复振荡器中以260rpm摇动样本悬浮液，用蒸馏水提取土壤溶解有机物质(DOM)。随后将悬浮液以4000×g离心10分钟，并将上清液通过0.45μm无菌膜(GN-6Metrice，GelmanSciences，USA)过滤。如图3所示，图3为采样点土壤溶解有机质的三维激发-发射矩阵图，利用三维激发-发射矩阵(3-DEEM)荧光光谱技术确定提取的土壤DOM的官能团。用配备有150W氙弧灯作为激发源的荧光分光光度计(Model F-7000，Hitachi，Japan)记录土壤DOM的3-DEEM光谱。应用700V的PMT电压和自动响应时间。使用5nm激发和发射狭缝记录光谱。波长设定为200至400nm用于激发，并且220至550nm用于发射。Origin软件用于处理EEM数据。EEM数据可以在操作上定义为五个区域。EEM峰与腐殖质样，酪氨酸样，色氨酸样或酚类有机化合物有关。通常，较短激发波长(<250nm)和较短发射波长(<350nm)的峰与简单的芳香族蛋白如酪氨酸(I区和II区)有关。较短激发波长(＞250nm)和较长发射波长(>350nm)的峰与富里酸样物质(III区)有关。中等激发波长(250-280nm)和较短发射波长(<380nm)的峰与可溶性微生物副产物样物质(区域IV)有关。较长激发波长(>280nm)和较长发射波长(>380nm)的峰与腐殖酸样有机物(V区)有关。
(3)DNA提取、PCR扩增和Illumina MiSeq测序
使用MoBio PowerSoil DNA Isolation Ki(MO BIO，USA)从－40℃下储存的土壤样本中提取DNA。详细的PCR扩增子方案参考地球微生物组项目请参阅http://www.earthmicrobiome.org/protocols-and-standards/。选择扩增16S rRNA基因V4区的引物组515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806R(5'-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3')扩增原核生物(细菌和古细菌)，引物组Euk1391F(5'-GTACACACCGCCCGTC-3')和EukBR(5'-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3')扩增18S rRNA基因以扩增真核谱系。在用Qubit荧光计(Thermo Fisher Scientific Inc.，USA)定量后，在IlluminaMiSeq PE250平台上对扩增子进行测序。
(4)16S和18S测序数据的处理
Illumina Miseq测序获得的序列使用QIIME v.1.9.0处理和分析。低质量序列(Qphred得分<25，短于200bp)舍去。之后，使用UPARSE算法将剩余序列聚类成具有97％相似性阈值的操作分类单位(OTU)。使用基于最新QIIME版本(gg_13_8)的Greengenes数据库的核糖体数据库项目(RDP)分类器，将分类标准分配给细菌和古细菌OTU。根据SILVA_132数据库将分类标准分配给真核OTU。每个样品的相等序列(细菌：40000个读数；古细菌：400个读数；真菌：3000个读数；原生生物：1500个读数)被随机二次取样以将数据集稀释到相同水平用于进一步分析。此外，使用原核分类群的功能注释(FAPROTAX)数据库(http://www.zoology.ubc.ca/louca/FAPROTAX/)预测基于检测到的原核分类群的功能。
(5)长期堆煤对土壤性质的影响分析
分别从土壤PH、总氮(TN)、总磷(TP)、总钾(TK)和有机物(SOM)含量五方面对对照组(CK)和煤场土(coal soil)之间的土壤性质进行比较。
经过长时间堆煤，土壤有机质和总氮(TN)显著增加，而总钾(TK)的含量在4个地点减少，pH和总磷(TP)没有显著变化，而SOM随堆积时间增加显著增加(P<0.05，图1)。如图2所示，图2为长期堆煤对土壤特性影响的示意图，在4个地点，土壤中腐殖质和富里酸物质的荧光强度比对照土壤强。这些结果表明，在煤堆积过程中，高聚物有机成分，主要是腐殖质和富里酸可以渗透到土壤中并随时间积累，这一过程不可避免地改变了土壤的其他理化性质，如总氮和总钾。煤堆垛时土壤与煤场没有植被存在，推断煤中土壤中总钾含量较低可能是由浸出效应引起的。
(6)长期堆煤对土壤细菌多样性影响分析
根据C类每个样品观察到的OTU的数量估计微生物群落丰度。在验证正态性和方差均匀性之后，进行单因素方差分析，以分析长期堆积煤对所有采样点的土壤和微生物特性的影响。在总体方差分析显著(P<0.05)的情况下，进一步进行最小显著性差异(LSD)分析，以测试对照和煤场土之间的显著性(P<0.05)。基于Bray-Curtis距离的聚类分析(PCoA)用于说明样本之间的整体群落变化。Mantel测试用于确定与群落组成(Bray-Curtis距离)显著相关的环境因素。使用QIIME(http://qiime.org/)，RStudio(http：//www.r-project.org/)，SigmaPlot(http://www.sigmaplot.co.uk)或SPSS进行分析。比较对照组和煤场之间土壤中细菌，古细菌，真菌和原生生物的多样性。
如图4所示，图4为长期堆煤对所有采样点土壤微生物丰度的影响示意图，在3个地点，堆煤时间分别为20、30和70年，煤场土壤中细菌的多样性显著高于对照组，而长期堆煤也显著促进了两个地点的土壤原生生物多样性，请参阅堆煤30和70年数据。
如图5所示，图5为长期堆煤对所有采样点土壤微生物功能基因丰度的影响图，每个样本中细菌，真菌和原生生物群落的成对Bray-Curtis距离的主成分分析(PCoA)显示堆煤场土壤的样品聚集在一起，并且与对照组土壤中的样本明显不同，表明长期堆煤导致微生物群落的同质化(即微生物群落在煤场土样本之间变得更相似)。这两者说明土壤细菌多样性变化具有明显的时间效应。
如图6所示，图6为长期堆煤场土壤微生物群落组成主成分分析PCoA图，其中黑色为对照组土壤，灰色为长期堆煤场土，基于微生物分类信息预测的功能数据表明堆煤可能在土壤中形成厌氧环境并进一步激发铁呼吸和硫呼吸相关的功能微生物群落的活性。
通过上述指标分析，长期堆煤显著促进了土壤细菌的多样性，并通过有机质输入到土壤中导致细菌群落组成的变化。长期堆煤对土壤性质，主要是有机质及土壤微生物，主要是细菌的影响具有显著的时间效应关系。
与现有的技术相比，本发明的有益效果是：
本发明公开了基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法，该方法操作简单，可行性高，提供了如何获取长期堆积煤对土壤微生物群落的潜在影响及数据的方法，提供了长期堆煤对土壤影响的分析模型与范例，研究出的数据能够提供长期堆积煤对土壤微生物群落的潜在影响的标准和影响程度，从而对指导燃煤电厂煤堆土植被恢复具有重要意义。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：研究区域选择及土壤样品采集；
从多个发电厂采集土壤样品，每个发电厂采集的样品分别进行DNA提取和测量土壤理化性质；
步骤二：土壤理化性质分析；
采用水土悬浮液，测量其pH值、土壤有机质、总氮、总磷、总钾含量，之后提取土壤溶解有机物质，随后将悬浮液离心，离心后获取其上清液，并通过无菌膜过滤，确定提取的土壤DOM的官能团，记录土壤DOM的三维激发-发射矩阵荧光光谱；
步骤三：DNA提取、PCR扩增和IlluminaMiSeq测序；
在步骤一种所采集的土壤中提取DNA，选择扩增16S rRNA基因V4区的引物组
515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和
806R(5'-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3')扩增原核生物的细菌和古细菌，引物组Euk1391F(5'-GTACACACCGCCCGTC-3')和EukBR(5'-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3')扩增18S rRNA基因以扩增真核谱系，对扩增进行测序；
使用土壤微生物DNA强力提取试剂盒从上述采集的土壤中提取DNA，选择扩增16S rRNA基因V4区的引物组
515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和
806R(5'-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3')扩增原核生物的细菌和古细菌，引物组Euk1391F(5'-GTACACACCGCCCGTC-3')和EukBR(5'-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3')扩增18S rRNA基因以扩增真核谱系，再用荧光计定量后，在二代高通量测序平台上对扩增进行测序；
步骤四：16S和18S测序数据的处理；
测序获得的序列进行处理和分析，将低质量序列舍去，再将剩余的序列进行分类，并进一步分析；
步骤五：长期堆煤对土壤性质和微生物群落影响分析；
对草坪的测试对照组和煤场土之间的土壤性质进行比较，研究长期堆煤对土壤PH、总氮、总钾、总磷的影响。
2.根据权利要求1所述的基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法，其特征在于，在步骤一中，从多个发电厂采集土壤样品，每个发电厂包含两个采样点，其中一个在煤场采集，另一个在草坪土壤中采集作为对照组，从每个采样点的煤层和草坪层下面的土壤岩心采用立体网状采样法收集土壤样品，将新鲜土壤样品过筛，除去可见的根和其他残留物，将样品中的每一个分成两个子样品，其中一个用于DNA提取，另一个用于测量土壤理化性质。
3.根据权利要求2所述的基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法，其特征在于，在步骤二中，采用水土悬浮液，并进行摇动均匀，使用pH计测量土壤pH值，用重铬酸钾法测定土壤有机质，通过元素分析仪测量总氮含量，通过HF-HClO4消解有机物和还原性物质，然后分别使用钼蓝分光光度法和火焰光度法测定土壤中总磷和总钾的含量；
摇动悬浮液，提取土壤溶解有机物质，随后将悬浮液离心，离心后获取其上清液，并通过无菌膜过滤；
应用三维激发-发射矩阵荧光光谱确定提取的土壤DOM的官能团，用氙弧灯作为激发源的荧光分光光度计记录土壤DOM的三维激发-发射矩阵荧光光谱；
应用500～900V的PMT电压和自动响应时间，使用2～8nm激发和发射狭缝记录光谱，波长设定为200～400nm用于激发，并且220～550nm用于发射。
4.根据权利要求3所述的基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法，其特征在于，在步骤四中，使用二代高通量测序平台测序获得的序列使用微生物群落的分析软件处理和分析，将低质量序列舍去，低质量序列的判断标准为：Q phred得分<25和序列片段长度短于200bp的舍去，之后，使用UPARSE算法将剩余序列聚类成具有97％相似性阈值的操作分类单位，使用QIIME版本的Greengenes数据库的核糖体数据库项目分类器，将分类标准分配给细菌和古细菌的操作分类单位，根据SILVA_132数据库将分类标准分配给真核操作分类单位，每个样品的相等序列被随机二次取样以将数据集稀释到相同水平用于进一步分析，使用原核分类群的功能注释数据库预测基于检测到的原核分类群的功能。
5.根据权利要求4所述的基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法，其特征在于，在步骤五中，根据每个样品观察到的操作分类单位的数量判断微生物群落丰度，进行单因素方差分析，以分析长期堆积煤对所有采样点的土壤和微生物特性的影响，在总体方差分析显著的情况下，P<0.05，进一步进行最小显著性差异分析，以测试对照组和煤场土之间的显著性，基于Bray-Curtis距离的聚类分析说明样本之间的整体群落变化，Mantel分析确定与群落组成Bray-Curtis距离显著相关的环境因素，使用QIIME、RStudio、SigmaPlot或SPSS进行分析。
6.根据权利要求2所述的基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法，其特征在于，在步骤一中，每个发电厂采用立体网状采样法收集土壤样品，煤场土采集以煤场为圆心，在水平分别为120°、240°、360°三个方向，在距离圆心20～200米位置分别采集0-10cm深度的有机层土壤样品，并混合上述三个有机层土壤样品，对照的草坪土壤选择在煤场常年风上游直线距离2公里外选择一个点为圆心，按照煤场土采集的方法进行采集，且对于多个发电厂土壤样品采集的方法如下：选择一个城市，时间上按照电厂土壤堆煤时间序列N，10+N、20+N和这一城市历史最悠久的电厂N最。
7.根据权利要求3所述的基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法，其特征在于，在步骤二中，EEM数据在操作上定义为五个区域，EEM峰与腐殖质样、酪氨酸样、色氨酸样或酚类有机化合物有关，较短激发波长小于250nm和较短发射波长小于350nm的峰与芳香族蛋白I区和II区有关，较短激发波长大于250nm和较长发射波长大于350nm的峰与富里酸样物质III区有关，中等激发波长250-280nm的和较短发射波长小于380nm的峰与可溶性微生物副产物样物质IV区有关，较长激发波长大于280nm和较长发射波长大于380nm的峰与腐殖酸样有机物V区有关。
8.根据权利要求5所述的基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法，其特征在于，在步骤五中对微生物群落影响分析指标包含土壤理化性质、土壤有机质、微生物丰度、微生物距离区分四个指标。
9.根据权利要求2所述的基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法，其特征在于，在步骤一中，将新鲜土壤样品过2mm筛，除去可见的根和其他残留物，将样品中的每一个分成两个子样品，用于DNA提取的子样品放置在-20℃～-60℃环境下存储，用于测量土壤理化性质的子样品放置在2℃～6℃环境下存储。
10.根据权利要求3所述的基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法，其特征在于，在步骤二中，在20℃的环境下，在往复振荡器中以260rpm摇动土水比为1:5w/v的悬浮液，用蒸馏水提取土壤溶解有机物质，随后将悬浮液以4000×g离心10分钟，并将上清液通过0.1～0.8μm无菌膜过滤，最优选的采用0.45μm无菌膜过滤。
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| CN201910908753.5A Pending CN110714061A (zh) | 2019-09-25 | 2019-09-25 | 基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110714061A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111455032A (zh) * | 2020-03-18 | 2020-07-28 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种用于评估土壤微生物多样性的方法 |
| CN112626186A (zh) * | 2020-10-15 | 2021-04-09 | 浙江大学 | 一种利用土壤菌群评估深海噬菌体生物安全性的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103397099A (zh) * | 2013-08-16 | 2013-11-20 | 江苏省农业科学院 | 通过荧光定量pcr检测转基因小麦生长期内根际土壤中荧光假单胞菌数量的方法 |
| US20140162274A1 (en) * | 2012-06-28 | 2014-06-12 | Taxon Biosciences, Inc. | Compositions and methods for identifying and comparing members of microbial communities using amplicon sequences |
| CN104611432A (zh) * | 2015-01-27 | 2015-05-13 | 西北农林科技大学 | 一种魔芋软腐病株根域土壤微生物群落结构分析方法 |
-
2019
- 2019-09-25 CN CN201910908753.5A patent/CN110714061A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140162274A1 (en) * | 2012-06-28 | 2014-06-12 | Taxon Biosciences, Inc. | Compositions and methods for identifying and comparing members of microbial communities using amplicon sequences |
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| CN104611432A (zh) * | 2015-01-27 | 2015-05-13 | 西北农林科技大学 | 一种魔芋软腐病株根域土壤微生物群落结构分析方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CONGCONG SHEN ET AL.: "Long-term stacking coal promoted soil bacterial richness associated with increased soil organic matter in coal yards of power plants", 《JOURNAL OF SOILS AND SEDIMENTS》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111455032A (zh) * | 2020-03-18 | 2020-07-28 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种用于评估土壤微生物多样性的方法 |
| CN111455032B (zh) * | 2020-03-18 | 2023-01-17 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种用于评估土壤微生物多样性的方法 |
| CN112626186A (zh) * | 2020-10-15 | 2021-04-09 | 浙江大学 | 一种利用土壤菌群评估深海噬菌体生物安全性的方法 |
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