CN111455032B - 一种用于评估土壤微生物多样性的方法 - Google Patents

一种用于评估土壤微生物多样性的方法 Download PDF

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Abstract

本说明书一个或多个实施例提供一种用于评估土壤微生物多样性的方法，包括：采用嵌套取样的方法进行土壤样本的收集；分别从不同的土壤样本中提取微生物总DNA，并应用PCR扩增微生物DNA中的16S rRNA基因；将不同土壤样本的PCR扩增产物纯化后进行质量鉴定，然后进行混合；对混合样本的浓度进行定量检测，并进行高通量测序；获得微生物物种序列后，计算每个样本区域内所包含样本的丰富度值，得到每个样本区域内的物种数量；计算每个样本区域的采样面积；将每个样本区域内的物种数量与每个样本区域的采样面积进行模型拟合，根据模型拟合结果，得到当地的土壤微生物的物种数量。该方法更有说服力，更符合实际的自然情况。

Description

一种用于评估土壤微生物多样性的方法
技术领域
本说明书一个或多个实施例涉及土壤微生物分析技术领域，尤其涉及一种用于评估土壤微生物多样性的方法。
背景技术
土壤是一个复杂的、动态的微生物栖息地，土壤中微生物种类较多、数量巨大，1克土壤中可能存在几亿到几百亿个微生物。微生物作为生态系统的重要组成部分，承担了许多重要的生态功能，对维持稳定的生态功能对人类社会的可持续发展具有重要的意义。许多研究表明，微生物群落的物种数(richness)会随着土壤取样面积(area)的扩大而增加，即微生物多样性与区域面积是正相关关系，在空间尺度上具有种-面积增长的分布模式。通常情况下，大家普遍认为微生物多样性与区域面积呈一种幂律分布的规律。然而实际情况中，微生物的物种其实是有限的。因此，新的研究思路将有助于相关领域的完善。
发明内容
有鉴于此，本说明书一个或多个实施例的目的在于提出一种用于评估土壤微生物多样性的方法，该方法更有说服力，更符合实际的自然情况。
基于上述目的，本说明书一个或多个实施例提供了一种用于评估土壤微生物多样性的方法，包括以下步骤：
采用嵌套取样的方法进行土壤样本的收集；
分别从不同的土壤样本中提取微生物总DNA，并应用PCR扩增微生物DNA中的16SrRNA基因；
将不同土壤样本的PCR扩增产物纯化后进行质量鉴定，然后进行混合；
对混合样本的浓度进行定量检测，并进行高通量测序；
获得微生物物种序列后，计算每个样本区域内所包含样本的丰富度值，得到每个样本区域内的物种数量；
根据每个样本区域的位置坐标信息计算每个样本区域的采样面积；
将每个样本区域内的物种数量与每个样本区域的采样面积进行模型拟合，根据模型拟合结果，得到当地的土壤微生物的物种数量。
本说明书一个或多个实施例，可选的，所述嵌套取样的方法为将第一样本区域嵌套于第二样本区域内进行取样。
本说明书一个或多个实施例，可选的，所述第一样本区域为：设置参考点，依次按照距离参考点的距离递增的方式设置多个相邻的嵌套正方形，且前一个正方形的四个顶点分别位于后一个正方形的四条边的中点上；每个正方形作为样本区域，每个样本区域的采样面积为每个正方形的面积，参考点和各个正方形的顶点作为采样点，每个采样点取一个土壤样本。
本说明书一个或多个实施例，可选的，设置四个相邻的嵌套正方形，第一个正方形的任意一条边到参考点的垂直距离为0.5m，第二个正方形的任意一个顶点到参考点的距离为1m，第三个正方形的任意一条边到参考点的垂直距离为1m，第四个正方形的任意一个顶点到参考点的距离为2m。
本说明书一个或多个实施例，可选的，所述第二样本区域为：依次按照距离参考点的距离递增的方式设置多个相邻的嵌套正方形，且多个正方形的对角线在一条直线上；每个正方形作为样本区域，每个样本区域的采样面积为每个正方形的面积，各个正方形的顶点作为采样区域。
本说明书一个或多个实施例，可选的，设置三个相邻的嵌套正方形，第五个正方形、第六个正方形和第七个正方形的任意一个顶点到参考点的距离分别为10m、100m和1000m；每个采样区域均为面积1m2的正方形，每个采样区域设置五个采样点，分别为正方形的四个顶点和一个正方形的中心点，每个采样点取一个土壤样本。
本说明书一个或多个实施例，可选的，应用PCR扩增微生物DNA中的16S rRNA基因的V3-V4区域，上下游引物分别为：515F：5＇-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3＇；
806R：5＇-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3＇。
本说明书一个或多个实施例，可选的，所述将每个样本区域内的物种数量与每个样本区域的采样面积进行模型拟合的步骤包括：
将每个样本区域内的物种数量与每个样本区域的采样面积采用不同的拟合方程进行拟合，根据相关系数r2和AIC指数筛选最适合的模型；其中拟合方程包括：S＝cAz，S＝c+zlog(A)，S＝c(1-exp(-zA))，S＝(cA)/(z+A)，S＝c/(1+exp(-zA+f))，S＝(c+zA)/(1+fA)，S＝c/(1+zlog(f/A))和S＝c(1-exp(-zAf))；其中，S为物种数，A为采样面积，z为曲线的斜率，c、f为拟合参数。
本说明书一个或多个实施例，可选的，所述根据模型拟合结果，得到当地的土壤微生物的物种数量的步骤包括：
将各个样本区域的采样面积总和代入到筛选得到的模型中，得到当地的土壤微生物的物种数量。
本说明书一个或多个实施例，可选的，所述质量鉴定包括DNA浓度和纯度的鉴定，DNA浓度在10-60ng/μL，A260/280在1.8-2.0之间；所述混合为将不同土壤样本的PCR扩增产物按等质量进行混合；所述混合样本的浓度大于20ng/ul。
从上面所述可以看出，本说明书一个或多个实施例提供的一种用于评估土壤微生物多样性的方法，在该方法中，将每个样本区域内的物种数量与每个样本区域的采样面积进行模型拟合，以筛选最适合的模型，根据该最适合的模型得到当地的土壤微生物的物种数量，该方法更有说服力，更符合实际的自然情况。
附图说明
为了更清楚地说明本说明书一个或多个实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书一个或多个实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本说明书一个或多个实施例的用于评估土壤微生物多样性的方法流程图；
图2为本说明书一个或多个实施例中土壤样本获取方式示意图。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开进一步详细说明。
需要说明的是，除非另外定义，本说明书一个或多个实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
在传统生态学研究中，由于技术方法的限制，我们对土壤中的微生物多样性了解有限。近些年来，随着分子生物技术的发展，特别是高通量测序技术的大量使用和推广，使我们研究微生物的能力得到极大提升，改善了研究微生物的局限性。目前应用最多的测序技术为第二代扩增子测序技术，针对的是基因组中分子标记片段(例如16S核糖体RNA基因、真核核糖体RNA间隔区ITS等)，它能够以较低的测序成本集中地检测微生物的物种信息，具有较高的准确性。高通量测序结果提供的大量微生物群落物种信息数据，使我们可以对此进行统计分析，是我们可以尽可能去预测原位真实情况的基础。本说明书一个或多个实施例采用了高通量测序方法，该方法在分子水平上对微生物的数量多样性进行估计预测，通过对微生物数据在不同种面积关系模型之间的比较，得到了较为理性的分布关系，该方法可以在获取少量土壤样本的情况下，尽可能地估算出区域内接近真实的微生物数量多样性。
现有技术是根据微生物多样性与区域面积呈一种幂律分布的规律或者呈半对数模型等近似于相对简单的单调关系进行土壤微生物多样性的评估，然而实际情况中，微生物的物种其实是有限的，这种单调关系并不具有说服力，也不符合实际的自然情况。本说明书一个或多个实施例提供的一种用于评估土壤微生物多样性的方法，在该方法中，将每个样本区域内的物种数量与每个样本区域的采样面积进行模型拟合，以筛选最适合的模型，根据该最适合的模型得到当地的土壤微生物的物种数量，该方法更有说服力，更符合实际的自然情况。
以下，通过具体的实施例来详细说明本说明书一个或多个实施例的技术方案。
参考图1，本说明书一个实施例的用于评估土壤微生物多样性的方法，包括以下步骤：
步骤S101，采用嵌套取样的方法进行土壤样本的收集；
为了减少取样误差就要增加样本数，而过多的样本给分析造成困难，因此，需要在误差允许范围内减少样本数。在步骤S101中，改进了常规的嵌套取样方法，细化了区域内的样本区域的数量，既能够增加样本数，减少取样误差，又不会造成困难。可选的，所述嵌套取样的方法为将第一样本区域(较小的样本区域)嵌套于第二样本区域(较大的样本区域)内进行取样。
参照图2，可选的，所述第一样本区域(较小的样本区域)为：设置参考点(即中心区域，图中红点)，依次按照距离参考点的距离递增的方式设置多个相邻的嵌套正方形(图2中红点所组成的正方形)，且前一个正方形的四个顶点分别位于后一个正方形的四条边的中点上，即各个正方形以参考点为中心并以垂直交叉的方式设置；每个正方形作为样本区域，每个样本区域的采样面积为每个正方形的面积，参考点和各个正方形的顶点作为采样点，每个采样点取一个土壤样本。
参照图2，可选的，所述第二样本区域(较大的样本区域)为：依次按照距离参考点(即中心区域，图中红点)的距离递增的方式设置多个相邻的嵌套正方形(图2中灰色点所组成的正方形)，且多个正方形的对角线在一条直线上；每个正方形作为样本区域，每个样本区域的采样面积为每个正方形的面积，各个正方形的顶点作为采样区域，每个采样区域均为面积1m2的正方形，每个采样区域设置五个采样点，分别为正方形的四个顶点和一个正方形的中心点，每个采样点取一个土壤样本。
步骤S101采取了不同的巢式嵌套取样的方法来评估当地的微生物多样性。
步骤S102，分别从不同的土壤样本中提取微生物总DNA，并应用PCR扩增微生物DNA中的16S rRNA基因；
在步骤S102中，可选的，采用Spin Kit for Soil试剂盒进行微生物的总DNA提取，随后应用PCR扩增微生物DNA，使用的引物为针对原核生物16S核糖体RNA(16SrRNA)基因的V3-V4区域的通用引物集，分别为：515F(5＇-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3＇M代表C或A，其为SEQID NO:1所示)和806R(5＇-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3＇，H代表A，C，T；V代表A，C，G；W代表A或T，其为SEQ ID NO:2所示)；
16S rRNA总长约1540bp，包含9个可变区。由于高通量测序的测序长度的限制，不可能将16S rRNA的9个可变区全部测序，所以在PCR扩增时往往只能选择1-3个可变区作为扩增片段。发明人评估了Miseq测序仪分析的不同16S rRNA可变区的准确性发现，测定V3-V4区域效果最佳。因此，步骤S102中上下游引物用于扩增细菌群落的16SrRNA的V3-V4区域。
步骤S103，将不同土壤样本的PCR扩增产物纯化后进行质量鉴定，然后进行混合；
PCR产物鉴定与纯化，经过PCR之后，土壤原核生物DNA中的16S rRNA相应区域即可被扩增出来，使用琼脂糖凝胶电泳鉴定当前扩增产物是否为我们需要的目的片段，然后使用Gel Extraction Kit(D2500-02,OMEGA BioTek)琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化PCR产物。
使用Nanodrop2000对纯化过后的DNA浓度和纯度进行质量鉴定，所提取的DNA浓度可达到10-60ng/μL，A260/280在1.8-2.0之间，表明DNA质量较好。PCR产物合格后，需将不同样品PCR扩增产物按等质量进行混合。
步骤S104，对混合样本的浓度进行定量检测，并进行高通量测序；
可选的，使用Quibit对混合样本的浓度进行检测定量，浓度大于20ng/ul，构建测序文库并利用Illumina测序平台的Miseq进行高通量测序。
步骤S105，获得微生物物种序列后，进行生物信息学分析，计算每个样本区域内所包含样本的丰富度值，得到每个样本区域内的物种数量；
测序数据按照如下流程进行分析。将得到的原始序列根据不同的标签(barcode)划分到不同的样本中，去除引物和标签序列，并将正向和反向序列进行拼接。去掉低质量的序列后，利用16SrRNA序列作为参考数据库分析其中的嵌合体数量并去除嵌合体序列。对剩下来的非嵌合体序列进行BLAST比对，聚类成可操作分类单元，英语缩写为OTU；
在步骤S105中，主要使用微生物多样性指数-丰富度(richness)值，即物种多样性指数-丰富度：实际观测到的物种个数。OTU聚类后，与数据库进行比对，得到物种的丰富度值，物种丰富度值是指一个群落或生物环境中物种数目的多少，假如有甲、乙两群落，每个群落中各物种的个体数目都为100，甲群落中物种种类的数目为100，乙群落中物种种类的数目为1。虽然甲、乙两群落生物的个体数目相同，但甲群落的物种种类多于乙群落，所以甲群落的物种丰富度大。
步骤S106，根据每个样本区域的位置坐标信息计算每个样本区域的采样面积；
在步骤S106中，每个样本区域的采样面积即为每个正方形的面积。
步骤S107，将每个样本区域内的物种数量与每个样本区域的采样面积进行模型拟合，根据模型拟合结果，得到当地的土壤微生物的物种数量。
微生物群落的特性以及其他一些因素都可能影响种面积关系的拟合方程，因而生态学家们提出了很多不同种类的拟合方程。在此，利用R软件共拟合了八中非线性回归的方程(表1)，最后根据相关系数(r2)和AIC指数筛选最适合的模型。
表1不同的种面积关系拟合公式
Model name Formula
Power S＝cA<sup>z</sup>
Exponential S＝c+zlog(A)
Negative exponential S＝c(1-exp(-zA))
Monod S＝(cA)/(z+A)
Logistic S＝c/(1+exp(-zA+f))
Rational function S＝(c+zA)/(1+fA)
Lomolino S＝c/(1+z<sup>log(f/A)</sup>)
Cumulative Weibull S＝c(1-exp(-zA<sup>f</sup>))
其中，S为物种数，A为采样面积，z为曲线的斜率，c、f为拟合参数。
将各个样本区域的采样面积总和代入到筛选得到的模型中，得到当地的土壤微生物的物种数量。
本说明书的方法细化了区域内的取样面积数量，通过增加输入模型参数的组合，进而提供一种微生物群落多样性评估的方法，用于观测和统计微生物多样性。
下面将对本说明书的用于评估土壤微生物多样性的方法进行举例说明。
以某一草地土壤样本为例，分析此地土壤微生物群落的多样性。
采用嵌套取样的方法进行草地土壤样本的收集，第一样本区域(较小的样本区域)为：设置参考点(即中心区域，图中红点，面积为8平方米)，依次按照距离参考点的距离递增的方式设置四个相邻的嵌套正方形(图2中红点所组成的正方形)，形成图2中右边正方形的嵌套嵌套样方，第一个正方形的任意一条边到参考点的垂直距离为0.5m，第二个正方形的任意一个顶点到参考点的距离为1m，第三个正方形的任意一条边到参考点的垂直距离为1m，第四个正方形的任意一个顶点到参考点的距离为2m；四个正方形的顶点(16个红点)和一个参考点，总共17个红点作为采样点，每个采样点取一个土壤样本，收集到17个土壤样本。
所述第二样本区域(较大的样本区域)为：依次按照距离参考点(即中心区域，图中红点，面积为8平方米)的距离递增的方式设置三个相邻的嵌套正方形(图2中灰色点所组成的正方形)，形成图2中左边正方形的嵌套嵌套样方，第五个正方形、第六个正方形和第七个正方形的任意一个顶点到参考点的距离分别为10m、100m和1000m，从四个方向分别设定在距离参考点10m、100m和1000m的位置；每个采样区域均为面积1m2的正方形，12块1m2的采样区域(图2中虚框所示出)，每个采样区域设置五个采样点，每个采样点取一个土壤样本，分别为面积1m2的正方形的四个顶点和一个正方形的中心点。第七个正方形的任意一个顶点到参考点的距离为1000m，指的是第七个正方形的任意一个顶点处的面积1m2的正方形的中心点到参考点的距离为1000m，同理，第五个正方形和第六个正方形的任意一个顶点到参考点的距离分别为10m和100m，指的是第五个正方形和第六个正方形的任意一个顶点处的面积1m2的正方形的中心点到参考点的距离分别为10m和100m。
第二样本区域内总共12块1m2的采样区域，每个采样区域设置五个采样点，每个采样点取一个土壤样本，收集到60个土壤样本。第一样本区域内收集到17个土壤样本。按照嵌套取样的方法共收集到77个土壤样本，过筛除去砂砾及植物根系，-80℃保存。
分别从不同的土壤样本取0.5g用于提取微生物总DNA，根据Spin Kit for Soil试剂盒说明进行提取，随后应用PCR扩增微生物DNA，使用的引物为针对原核生物16S核糖体RNA(16s rRNA)基因的V3-V4区域的通用引物集，分别为：515F(5＇-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3＇M代表C或A，其为SEQ ID NO:1所示)和806R(5＇-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3＇，H代表A，C，T；V代表A，C，G；W代表A或T，其为SEQ ID NO:2所示)；
PCR反应体系及反应过程如表2和表3所示。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离并纯化
表2 HAPA HiFi PCR反应体系构成
PCR反应体系 体积(50μL)
1U/μL KAPA HiFi聚合酶 1ul
5×KAPA PCR buffer 10ul
10mM KAPA dNTP mix 1.5ul
正向引物515F(10μM) 1.5ul
正向引物806R(10μM) 1.5ul
模板DNA(16SrRNA) 1μL
ddH<sub>2</sub>O 33.5ul
表3 PCR过程
Figure BDA0002416698780000091
PCR产物鉴定与纯化，经过PCR之后，土壤原核生物DNA中的16S rRNA相应区域即可被扩增出来，使用琼脂糖凝胶电泳鉴定当前扩增产物是否为我们需要的目的片段，然后使用Gel Extraction Kit(D2500-02,OMEGABioTek)琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化PCR产物。
使用Nanodrop2000对纯化过后的DNA浓度和纯度进行质量鉴定，所提取的DNA浓度可达到10-60ng/μL，A260/280在1.8-2.0之间，表明DNA质量较好。PCR产物合格后，需将不同样品PCR扩增产物按等质量进行混合。
使用Quibit对混合样本的浓度进行检测定量，浓度大于20ng/ul，构建测序文库并利用Illumina测序平台的Miseq进行高通量测序。
获得微生物物种序列后，进行生物信息学分析，测序数据按照如下流程进行分析。将得到的原始序列根据不同的标签(barcode)划分到不同的样本中，去除引物和标签序列，并将正向和反向序列进行拼接。去掉低质量的序列后，利用16SrRNA序列作为参考数据库分析其中的嵌合体数量并去除嵌合体序列。对剩下来的非嵌合体序列进行BLAST比对，聚类成可操作分类单元，英语缩写为OTU；OTU聚类后，与数据库进行比对，得到物种的丰富度值，
根据图2中的正方形设置，计算相应正方形所包含样本的丰富度值，第一个正方形、第二个正方形、第三个正方形、第四个正方形、第五个正方形、第六个正方形和第七个正方形，所得物种数量分别为11230，14587，16786，18513，26071，30966，35055。
根据位置坐标信息计算微生物分布的不同面积，参照图2，包括7个面积样方，每个采样点到参考点的距离分别为
Figure BDA0002416698780000101
1,
Figure BDA0002416698780000102
2,10,100和1000m，计算得每个样本区域的采样面积分别为1,2,4,8,200,2×104和2×106m2，即分别为每个正方形的面积。
利用R软件mmSAR对八种非线性回归的方程拟合，拟合结果如表4所示
表4不同的种面积关系拟合结果
Figure BDA0002416698780000103
从以上结果来看，根据相关系数(r2)和AIC指数筛选最适合的模型，CumulativeWeibull分布是最优的。其中S为物种数，A为采样面积，z为曲线的斜率，c、f为拟合参数。根据Cumulative Weibull模型计算得到当地的土壤微生物物种数量应为75501(经验常数c的估计值)。同时这种分布模式体现了物种丰富度逐渐上升，斜率逐渐下将，最后增长趋于平缓的趋势。这类具有渐近性的拟合曲线，相较于幂率和半对数模型等近似于相对简单的单调关系，更有说服力，更符合实际的自然情况。
上述方法也可以用作比较不同微生物群落和不同生物环境内微生物的多样性变化特性，对实际生态系统管理有一定意义。
从上面所述可以看出，本说明书一个或多个实施例提供的一种用于评估土壤微生物多样性的方法，在该方法中，将每个样本区域内的物种数量与每个样本区域的采样面积进行模型拟合，以筛选最适合的模型，根据该最适合的模型得到当地的土壤微生物的物种数量，该方法更有说服力，更符合实际的自然情况。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本公开的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本说明书一个或多个实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本说明书一个或多个实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本说明书一个或多个实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
Figure BDA0002416698780000121
序列表
<110> 中国科学院生态环境研究中心 中国科学院大学
<120> 一种用于评估土壤微生物多样性的方法
<130> FI200136
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> 人工序列
<400> 1
gtgccagcmg ccgcggtaa 19
<210> 2
<211> 20
<212> 人工序列
<400> 2
ggactachvg ggtwtctaat 20

Claims (7)

1.一种用于评估土壤微生物多样性的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用嵌套取样的方法进行土壤样本的收集，所述嵌套取样的方法为将第一样本区域嵌套于第二样本区域内进行取样；
所述第一样本区域为：设置参考点，依次按照距离参考点的距离递增的方式设置多个相邻的嵌套正方形，且前一个正方形的四个顶点分别位于后一个正方形的四条边的中点上；所述第二样本区域为：依次按照距离参考点的距离递增的方式设置多个相邻的嵌套正方形，且多个正方形的对角线在一条直线上；
分别从不同的土壤样本中提取微生物总DNA，并应用PCR扩增微生物DNA中的16S rRNA基因；
将不同土壤样本的PCR扩增产物纯化后进行质量鉴定，然后进行混合；
对混合样本的浓度进行定量检测，并进行高通量测序；
获得微生物物种序列后，计算每个样本区域内所包含样本的丰富度值，得到每个样本区域内的物种数量；
根据每个样本区域的位置坐标信息计算每个样本区域的采样面积；将每个样本区域内的物种数量与每个样本区域的采样面积进行模型拟合，根据模型拟合结果，得到当地的土壤微生物的物种数量；
所述第一样本区域的每个正方形作为样本区域，每个样本区域的采样面积为每个正方形的面积，参考点和各个正方形的顶点作为采样点，每个采样点取一个土壤样本；
所述第二样本区域的每个正方形作为样本区域，每个样本区域的采样面积为每个正方形的面积，各个正方形的顶点作为采样区域。
2.根据权利要求1所述的用于评估土壤微生物多样性的方法，其特征在于，设置四个相邻的嵌套正方形，第一个正方形的任意一条边到参考点的垂直距离为0.5m，第二个正方形的任意一个顶点到参考点的距离为1m，第三个正方形的任意一条边到参考点的垂直距离为1m，第四个正方形的任意一个顶点到参考点的距离为2m。
3.根据权利要求1所述的用于评估土壤微生物多样性的方法，其特征在于，设置三个相邻的嵌套正方形，第五个正方形、第六个正方形和第七个正方形的任意一个顶点到参考点的距离分别为10m、100m和1000m；每个采样区域均为面积1m2的正方形，每个采样区域设置五个采样点，分别为正方形的四个顶点和一个正方形的中心点，每个采样点取一个土壤样本。
4.根据权利要求1所述的用于评估土壤微生物多样性的方法，其特征在于，应用PCR扩增微生物DNA中的16S rRNA基因的V3-V4区域，上下游引物分别为：515F：5＇-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3＇；806R：5＇-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3＇。
5.根据权利要求1所述的用于评估土壤微生物多样性的方法，其特征在于，所述将每个样本区域内的物种数量与每个样本区域的采样面积进行模型拟合的步骤包括：将每个样本区域内的物种数量与每个样本区域的采样面积采用不同的拟合方程进行拟合，根据相关系数r2和AIC指数筛选最适合的模型；其中拟合方程包括：S＝cAz，S＝c+zlog(A)，S＝c(1-exp(-zA))，S＝(cA)/(z+A)，S＝c/(1+exp(-zA+f))，S＝(c+zA)/(1+fA)，S＝c/(1+zlog(f/A))和S＝c(1-exp(-zAf))；其中，S为物种数，A为采样面积，z为曲线的斜率，c、f为拟合参数。
6.根据权利要求5所述的用于评估土壤微生物多样性的方法，其特征在于，所述根据模型拟合结果，得到当地的土壤微生物的物种数量的步骤包括：将各个样本区域的采样面积总和代入到筛选得到的模型中，得到当地的土壤微生物的物种数量。
7.根据权利要求1所述的用于评估土壤微生物多样性的方法，其特征在于，所述质量鉴定包括DNA浓度和纯度的鉴定，DNA浓度在10-60ng/μL，A260/280在1.8-2.0之间；所述混合为将不同土壤样本的PCR扩增产物按等质量进行混合；所述混合样本的浓度大于20ng/ul。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112626186A (zh) * 2020-10-15 2021-04-09 浙江大学 一种利用土壤菌群评估深海噬菌体生物安全性的方法
CN112729919A (zh) * 2020-12-29 2021-04-30 神华宝日希勒能源有限公司 一种露天矿区微生物动态监测方法
CN115572771A (zh) * 2022-09-20 2023-01-06 中国科学院广州地球化学研究所 一种微生物物种高通量鉴定解析方法
CN117133356B (zh) * 2023-09-18 2024-04-09 生态环境部南京环境科学研究所 一种生物多样性的能力建设及支助需求评估装置及方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105631246A (zh) * 2016-01-27 2016-06-01 广东省微生物研究所 一种分析微生物群落结构所需测序量的预测方法
CN110021337A (zh) * 2017-09-29 2019-07-16 中国科学院昆明动物研究所 一种基于多样性指数和区域范围关系的幂法则标度模型预测微生物群落结构的方法
CN110218807A (zh) * 2019-06-29 2019-09-10 浙江大学 土壤三域微生物高通量绝对定量方法
CN110669835A (zh) * 2019-11-22 2020-01-10 青海民族大学 基于高通量测序的蕨麻根际微生物多样性及菌群解析方法
CN110714061A (zh) * 2019-09-25 2020-01-21 国网安徽省电力有限公司电力科学研究院 基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105631246A (zh) * 2016-01-27 2016-06-01 广东省微生物研究所 一种分析微生物群落结构所需测序量的预测方法
CN110021337A (zh) * 2017-09-29 2019-07-16 中国科学院昆明动物研究所 一种基于多样性指数和区域范围关系的幂法则标度模型预测微生物群落结构的方法
CN110218807A (zh) * 2019-06-29 2019-09-10 浙江大学 土壤三域微生物高通量绝对定量方法
CN110714061A (zh) * 2019-09-25 2020-01-21 国网安徽省电力有限公司电力科学研究院 基于多维指标针对长期堆煤对土壤细菌影响操作方法
CN110669835A (zh) * 2019-11-22 2020-01-10 青海民族大学 基于高通量测序的蕨麻根际微生物多样性及菌群解析方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J.J. Ibáñez et al..Nested subset analysis and taxa-range size distributions of pedological assemblages: implications for biodiversity studies.《Ecological Modelling》.2005, *
土壤系统分类与生物系统分类体系中的多样性特征对比分析;张学雷等;《土壤学报》;20080131;第1页 *

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