CN103952437A - 用于获得无标记转基因植物的农杆菌专用载体组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于获得无标记转基因植物的农杆菌专用载体组合物及其应用。本发明提供了一种用于获得无标记转基因植物的农杆菌专用载体组合物，由独立包装的重组载体A和重组载体B组成；所述重组载体A为将目的基因插入pClean系列载体的pClean-Green载体T-DNA区中，得到表达所述目的基因的重组载体A；所述重组载体B为将标记基因插入pClean系列载体的pClean-Soup载体的T-DNA区中，得到表达所述标记基因的重组载体B。本发明利用标记基因和目的基因在不同载体中的T-DNA区的5G7B组合物，转化效率高，后代可以获得较高比例的无选择标记转基因植株。因此，对转基因植物，尤其是小麦，无选择标记转基因植株的获得和利用具有重要意义。

Description

用于获得无标记转基因植物的农杆菌专用载体组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及用于获得无标记转基因植物的农杆菌专用载体组合物及其应用。 

背景技术

植物转基因技术是进行基因功能研究和通过基因工程进行植物遗传改良的重要工具。自1996年首例转基因作物商业化种植以来，目前世界各国已累计批准23种转基因作物进行商业化生产，涉及13类目标性状，包括抗虫、抗除草剂、抗病、育性改变、品质改良等。以抗除草剂和抗虫为主的大豆、玉米、棉花、油菜等转基因作物已经在全球22个国家和地区种植，2012年种植面积已达1.7亿公顷。转基因作物产业化已成为全球新的经济增长点，是增强农业国际竞争力的重要保障。 

目前植物遗传转化方法众多，其中根癌农杆菌介导法(Agrobacterium-mediatedtransformation)和基因枪轰击法(particle bombardment transformation)是植物遗传转化的主要方法。两种方法各有优缺点，农杆菌介导法外源基因在植物遗传转化中的转化机理清楚、整合位点较稳定、拷贝数低、整合后的外源基因结构变异较小、遗传稳定性好，但存在受体基因型限制和骨架序列整合的缺点；基因枪转化法基本不受材料基因型的限制，但却存在转基因植株中整合有载体骨架序列和抗生素标记、目的基因的多拷贝、转基因沉默以及转基因后代遗传稳定性差等问题。 

尽管多数国家对转基因产品的态度日趋积极，但转基因作物的潜在安全风险问题仍然受到公众的普遍关注，特别在欧洲一些国家转基因作物的争议非常激烈。在转基因作物中争议最大的是抗除草剂和抗生素类选择标记可能带来的潜在风险。如在环境方面，由于花粉飘移可能形成超级杂草、增加靶标生物抗性、对生物多样性影响等。在食品安全方面，包括标记基因所表达蛋白质致敏性，以及对受体作物本身营养成分、天然毒素和抗营养物质含量等方面的影响及其它可能的非预期效应。另外标记基因的存在也不利于基因的重复转化。因此建立安全转基因技术体系和培育无标记转基因植物已成为转基因技术研发的主要方向，也是各国在转基因技术领域进行技术创新的热点之一。 

双元载体的发展和Gateway克隆技术的应用大大促进了农杆菌介导的遗传转化在植物基因工程改良中的应用，同时也使其成为获得无选择标记转基因植物的重要工具。从1983年Hoekema等把根癌农杆菌Ti质粒上的vir区和T-DNA区分离并置于两个复制子中，提出双元载体策略以来，双元载体的发展已取得了突破性的进展。双元载体的种类从最早pBin19和pBI121的构建至今二十几年间，已发展了二十多个系列几十种载体，如：pCAMBIA，pMDC和pGreen双元载体系列等。与此同时，双元载体在以下几个方面得到了大幅度的优化：添加广适的复起制点，使其在大肠杆菌和农杆菌中能够自由复制；运用高拷贝复制子，以提高质粒的产量，便于体外亚克隆操作；降低载体质粒的长度和增加T-DNA内限制性内切酶位点，便于外源基因的亚克隆操作。在提高转化效率和增强外源基因表达稳定性方面，通过添加额外的vir基因、T-DNA转移增强序列（overdrive）、基因沉默抑制子等方面的改良，提高植物遗传转化效率和外源基因的稳定表达。双元载体的发展，使农杆菌介导的植物遗传转化技术广泛应用于植物基因研究的各个领域，如RNA干扰、基因过表达、多基因传递、功能基因组和蛋白质组研究等。然而通过传统的酶切、连接方法构建不同用途的载体，不仅耗时耗力， 而且还受到酶切位点的限制，特别是对于高通量的功能基因组和蛋白质组研究来说，载体构建是一个最大的‘瓶颈’。Gateway技术的出现，克服了传统载体构建中遇到的上述问题。 

Gateway克隆技术是Invitrogen公司基于λ噬菌体介导的位点特异性整合和删除系统而开发的。位于特异性位点att间的DNA片段，在重组酶BP Clonase或LR Clonase EnzymeMix的作用下，通过一步反应（attB×attP或attL×attR)便可将DNA片段转移到含相应重组位点的目的载体中，避免了载体构建中的酶切、连接等繁琐步骤。目前已报道了多种Gateway兼容的双元载体，如pW、pMDC、pEarleyGate系列载体，每种载体系列都含有多种不同用途的载体类型。如pW系列载体包括过表达和反义表达载体、用于启动子分析含有LUC、GUS和GFP-GUS等基因的载体、用于基因融合的含GFP基因的载体和用于基因沉默的RNA干扰载体。 

农杆菌介导的共转化标记基因剔除法以其操作简单、适用性广，且易产生非连锁位点而被广泛应用。共转化法将目的基因和标记基因分别置于两个独立的T-DNA中，农杆菌介导转化时，两个独立T-DNA可随机整合到染色体的不同位点，产生连锁或非连锁的共整合植株，这些非连锁的共整合植株通过自交和后代的分离便可获得无标记转化植株。两个独立的T-DNA可位于同一质粒上或各位于一个质粒上，共存于同一农杆菌中或各位于一个质粒上，存在于不同的农杆菌中。此外，其它形式结构的载体如利用载体骨架上的筛选基因和双RB边界等方法,也可通过农杆菌介导的共转化法获得无标记的转基因植株。 

Hellens等基于pBluescript载体构建了pGreen/pSoup双元载体。其具有以下特点：减少了质粒长度，提高了在E.coli中拷贝数，便于体外操作和克隆；pGreen质粒只含有pSa-ori基因，只有在辅助质粒pSoup中pSa-RepA的存在下，才能够在农杆菌中复制，这样pGreen在非选择性条件下是不稳定的，在一定程度上增强了质粒的生物安全性；适应性广，可适合于单双子叶植物的转化；便于载体的改良和构建不同用途的载体，如可在pSoup质粒的多克隆位点附加额外的vir基因，从而提高大片段基因的转化和提高谷类作物的转化效率。通过将pSoup上连接一个T-DNA，使得pGreen和pSoup载体中均含有独立的T-DNA，从而产生marker-free转基因植株。 

目前，pGreen载体已经广泛地应用于多种植物的转化，如拟南芥、烟草、豌豆、番茄等。此外，一些改良的新型pGreen/pSoup载体也已成功地应用于谷类作物如小麦、水稻的转化，用于提高转化效率或用于产生marker-free转基因植株的研究。如Wu等利用含Komari片段（包含VirB、VirC和VirG基因）pSoup载体，作为辅助质粒同pGreen载体转化四倍体小麦，结果表明，与pSoup载体（转化效率0）相比，含有Komari片段的改良载体可显著提高四倍体小麦Ofanto的转化效率（平均转化效率3.0%，最高可达9.7%）。用此改良载体在另一四倍体小麦Steward的转化中，也获得了一个较高的转化效率（平均转化效率4.7%，最高可达12.3%）。Afolabi等通过在pSoup质粒中引入T-DNA，使之成为T载体，期望与pGreen载体中独立T-DNA的共转化，可获得marker-free的植株。在水稻转化实验中，成功分离获得了无选择标记的转基因水稻植株，并发现在T₀阳性植株中，有50%的植株中标记基因和目的基因位于非连锁位点。 

Thole等通过对pGreen载体改良，构建了pClean系列载体。pClean系列双元载体，包括pClean-Green和pClean-Soup两种质粒。与pGreen载体相比，pClean系列载体具有如下特点：进一步减少了T-DNA中的非必需序列（全长102nt，包括52nt的多克隆位点，而pGreenT-DNA结构全长777nt，包含728nt的多克隆位点）；降低了pClean-G与pSoup载体的同源性，增加了质粒的稳定性，pClean-G/pClean-S可与pGreen/pSoup匹配使用；优化了部分 载体的LB序列，使其与胭脂型和章鱼碱型T-DNA的LB序列一致，扩大了宿主范围；部分质粒的RB外添加了额外VirGwt基因以提高转化效率；pClean-S质粒上添加了独立的T-DNA，可用于多基因的传递或marker-free植株的产生；pClean-G质粒LB外的骨架序列上含有多个单酶切位点，便于backnone的利用，如通过在backnone上插入选择标记基因，可获得maker-free植株的载体；部分载体含有双LB序列，以降低T-DNA的通读频率，减少骨架序列的整合。 

综上所述,上述研究只采用了一种载体构建策略并应用于个别植物的遗传转化，目前在小麦和其它作物中的应用尚未见报道。此外，大部分载体的构建是为了验证农杆菌传递2独立T-DNA，产生mark-free植株的可行性，因此很多载体只在模式植物如烟草等中进行了转化，并未在重要农作物如小麦中应用。另外，目前报道的用于产生marker-free植株的载体，多数是通过传统酶切连接构建的，很多载体是以gus基因为目的基因的，因为受酶切位点的限制，有些载体不便于用于目的基因的替换。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于获得无标记转基因植物的农杆菌专用载体组合物。 

本发明提供的组合物（5G7B），由独立包装的重组载体A和重组载体B组成； 

所述重组载体A（pG1851-UG）为将目的基因插入pClean系列载体的pClean-Green载体T-DNA区中，得到表达所述目的基因的重组载体A； 

所述重组载体B(pS167-UB)为将标记基因插入pClean系列载体的pClean-Soup载体的T-DNA区中，得到表达所述标记基因的重组载体B。 

上述的载体组合物中， 

所述目的基因通过gatway重组到pClean系列载体的pClean-Green载体T-DNA区； 

所述标记基因通过gatway重组到pClean系列载体的pClean-Soup载体的T-DNA区。 

上述的载体组合物中， 

所述pClean-Green载体为pCG181或pCG185；所述pClean-Green载体具体为pCG185； 

所述pClean-Soup载体为pCS167。 

上述的载体组合物中， 

所述目的基因为以目的基因表达盒的形式插入所述pClean-Green载体中；所述目的基因表达盒包括启动子ubi、目的基因和终止子Nos； 

所述标记基因以标记基因表达盒的形式插入所述pClean-Soup载体中；所述标记基因表达盒包括启动子ubi、标记基因和终止子Nos。 

上述的载体组合物中， 

所述目的基因为GUS基因，所述标记基因为bar基因。 

上述的载体组合物中， 

所述bar基因表达盒的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第114-3004位所示的核苷酸；其中，序列表中序列1自5’末端第1009-2592位核苷酸为启动子ubi，序列表中序列1自5’末端第421-972位核苷酸为bar基因，序列表中序列1自5’末端第147-406位核苷酸为终止子nos。 

所述gus基因表达盒的核苷酸序列为序列表中序列2所示的核苷酸。 

序列2所示的ubi:gus:nos表达盒，自5’末端第1-2034位核苷酸为ubi、自5’末端第2044-4059位核苷酸为gus、自5’末端第4069-4377位核苷酸为nos。 

上述的载体组合物中， 

所述重组载体A按照如下方法制备： 

1）将DNA片段attR1-cm^R-ccdB-attR2插入所述pClean-Green载体，得到中间载体A； 

2）将所述目的基因与入门载体进行TOPO反应得到入门重组载体，再将所述入门重组载体与所述中间载体A进行LR反应，得到重组载体A； 

所述重组载体B按照如下方法制备： 

1）将DNA片段attR1-cm^R-ccdB-attR2插入所述pClean-Soup载体，得到中间载体B； 

2）将所述标记基因与入门载体进行TOPO反应得到入门重组载体，再将所述入门重组载体与所述中间载体进行LR反应，得到重组载体B； 

所述DNA片段attR1-cm^R-ccdB-attR2的核苷酸序列为序列表中的序列3。 

上述的载体组合物在鉴定或培育无标记转基因植物中的应用也是本发明保护的范围；所述培育为利用农杆菌转染植物进行； 

所述植物为单子叶植物或双子叶植物； 

所述单子叶植物具体为小麦。 

本发明的另一个目的是提供一种用于获得无标记转基因植物的方法。 

本发明提供的方法，包括如下步骤： 

1）将上述的载体组合物中的重组载体A和重组载体B共转染到植物外植体中，得到T0代转基因植物； 

2）从T0代转基因植物中选取目的基因和标记基因共表达的T0代转基因植物，进行播种，收获T1代转基因植物； 

3）选取所述T1代转基因植物中无标记基因且有目的基因的植株，得到无标记转基因植株。 

上述选取所述T1代转基因植物中无标记基因且有目的基因的植株的方法如下： 

鉴定无标记基因bar的方法为PCR检测或BAR氨盐检测； 

鉴定有目的基因gus的方法为PCR检测或GUS染色。 

上述方法中，所述植物外植体为胚； 

所述目的基因为gus基因，所述标记基因为bar基因。 

上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物； 

所述单子叶植物具体为小麦。 

本发明利用pClean双元载体系列中的pClean-G181、pClean-G185和pClean-S167作为基础载体，对其T-DNA和载体骨架进行了一系列改良，如在pClean-G181、pClean-G185、pClean-S167T-DNA内引入Gateway系统，便于载体的快速构建；pClean-S167T-DNA内分别引入Ubiqutin启动子驱动的bar选择标记基因，可直接用于单子叶转化中的筛选标记；在pClean-G181和pClean-G185载体的backnone上插入了带不同T-DNA边界结构的bar表达盒，如含多个左边界或独立T-DNA等。构建了系列Gateway兼容的新型pClean安全高效双元载体，并用此转化小麦，成功获得了marker-free转化植株。 

本发明的实验证明，本发明通过gateway重组技术直接把目的基因或表达盒定向引入目的载体的T-DNA内，而另一T-DNA内含有选择标记基因bar。利用此系统，通过把目的基因和选择基因分别置于同一质粒的两T-DNA内或2质粒的T-DNA内或把标记基因置于载体骨架上，通过农杆菌转化，可获得无选择标记的转基因小麦。所述获得无标记转基因小麦的方法 是，通过2个独立的T-DNA或载体骨架与T-DNA共转化小麦未成熟胚，经筛选获得转基因植株，整合到染色体不同位点的非连锁的T-DNA植株，经自交和后代分离，通过PCR检测，便可获得无标记的转基因小麦植株。利用本发明可进行植物尤其是小麦、玉米和水稻表达载体的高通量构建和培育无选择标记的转基因小麦、玉米和水稻。 

从上述可以看出，本发明利用2种组合载体可以获得高的筛选无bar基因而只含有gus的无标记转基因植株效率，其中利用标记基因和目的基因在不同载体的T-DNA区5G7B组合物和利用标记基因和目的基因在同一载体的两个不同T-DNA区5TBTG154组合物，均可以获得高转化效率（分别为2.8±0.8%和4.0±2.1%）。结合后代获得无选择标记的转基因植株比例（分别为23.4%和19.7%），这两个载体组合更适合于获得无选择标记的转基因植物研究。 

附图说明

图1为pClean双元载体 

图2为Gateway兼容的pClean双元载体酶切鉴定 

图3为pENTR/D-TOPO_ubi:bar:nos载体构建及验证 

A：ubi:bar:nos表达盒的扩增；B：pENTR/D-TOPO_ubi:bar:nos菌液PCR检测；C：SspI酶切鉴定；D：载体结构。 

图4为中间载体pG185_ubi:bar:nos载体 

A：PmeI-PacI酶切验证；B：载体结构 

图5为pCG1852、pCG1853和pCG1854载体的构建 

图6为pCS1671-UB载体的构建 

A：菌液PCR检测结果；B：载体结构 

图7为TOPO_ubi:gus:nos载体构建 

图8为LR重组在各载体中引入gus cassette 

图9为用于农杆菌转化的5个载体组合 

图10为农杆菌介导的不同载体组合转化小麦过程 

图11为转5G7B载体部分植株的PCR检测 

M：Marker DL2000；CK：非转基因植株；1-15：转基因植株。其中株系1、2、4、6、9、11、12、13为bar、gus共整合植株；3、5、7、8、10、14、15为只含bar的植株。 

图12为T0代转5G7B小麦的Southern杂交 

左图为Southern杂交图；右图为pG1851-UG载体结构图 

图13为T₀代转5G7B小麦独立株系后代个体在T1代的分离分析 

图14为T₀代转5G7B小麦独立株系后代个体的遗传分离分析 

A：bar和gus基因的PCR检测。bar和gus PCR产物混合跑样；B：GUS染色验证；C：bar表达验证；图A、B、C中1-15相对应。 

图15为边界整合检测各引物位置示意图 

图16为5G7B株系边界整合PCR检测结果 

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 

质粒pGreenII-UB记载在如下文献中：Hellens RP,Edwards EA,Leyland NR,Bean S,Mullineaux PM.2000.pGreen:a versatile and flexible binary Ti vector for  Agrobacterium-mediated plant transformation.Plant Molecular Biology42,819–832，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。 

质粒pClean系列包括：pClean-G181(pCG181)、pClean-G185（pCG185）、pClean-S167(pCS167)，上述质粒均记载在如下文献中：Thole,V.,Worland B.,Snape JW.,Vain P.2007.The pCLEAN dual binary vector system for Agrobacterium-mediated planttransformation.Plant Physiology145:1211-1219.公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。 

质粒PAL156均记载在如下文献中：He,Y.,Jones,HD.,Chen,XM.,Chen,Wang,DW.,Li,KX.,Xia,LQ.2010.Agrobacterium-mediated transformation of durum wheat(Triticum turgidum L.var.durum cv Stewart)with improved efficiency.61:1567-1581.公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。 

质粒PAL154记载在如下文献中：He,Y.,Jones,HD.,Chen,XM.,Chen,Wang,DW.,Li,KX.,Xia,LQ.2010.Agrobacterium-mediated transformation of durum wheat(Triticumturgidum L.var.durum cv Stewart)with improved efficiency.61:1567-1581.公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。 

PrimerStar平末端高保真聚合酶、Taq DNA聚合酶、dNTP购自大连宝生物工程有限公司。碱性磷酸酶SAP（Shrimp Alkaline Phosphatase）、Klenow Fragment和T₄DNA聚合酶购自Ferments公司。各种限制性内切酶购自NEB公司。pENTR^TM Directional TOPO Cloning Kits、Gateway Vector Conversion System with One Shot ccdB Survival2T1Compenent Cells购自Invitrogen公司。DH5α感受态、克隆载体pEASY-Blunt购自北京全式金生物技术有限公司。质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自天根生化科技有限公司。其它试剂均为国产分析纯产品。 

实施例1、用于获得无标记转基因植物的农杆菌专用载体组合物 

一、Gateway兼容的pCG1811、pCG1851、pＣS1671通用双元载体的构建 

pCG181、pCG185、pCS167载体的结构如图1，分别在其T-DNA内插入ccdB读码框的DNA片段attR1-cm^R-ccdB-attR2(该DNA片段的核苷酸序列为序列表中的序列3,购自Invitrogen公司)，得到双元载体pCG1811、pCG1851、pＣS1671；具体过程如下： 

1、pCG1811载体的构建 

1）去P的平末端载体骨架的获得 

将pCG181载体用Not I酶切，回收2718bp的酶切产物；再将上述回收的酶切产物依次经Klenow片段补平突出末端、纯化、去P反应，得到去P的平末端pCG181载体骨架，具体步骤和体系如下： 

将上述回收的酶切产物经Klenow片段补平突出末端，得到补平产物； 

反应体系如表1所示： 

表1为补平突出末端反应体系 

将上述酶切产物补平产物进行纯化，过程如下： 

（1）柱平衡：吸附柱CB2放入收集管中，加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中； 

（2）加入纯化产物5倍体积的结合液PB，充分混匀； 

（3）将上一步所得溶液加入吸附柱CB2中，室温放置2min，12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中； 

（4）向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中； 

（5）重复操作步骤4； 

（6）将吸附柱CB2放回收集管中，12000rpm离心2min，将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，除去残留的漂洗液； 

（7）将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，加入40μl60℃预热的ddH2O，室温放置2min。12000rpm离心2min，收集DNA溶液； 

得到纯化产物。 

将上述纯化产物进行去P反应，体系如表2所示： 

表2为pG185酶切补平片段 

得到去P的平末端pCG181载体骨架。 

2）ccdB读码框的DNA片段attR1-cm^R-ccdB-attR2 

DNA片段attR1-cm^R-ccdB-attR2购自Invitrogen公司，产品目录号为：1828-029，其中序列3自5’末端第4-128位核苷酸为attR1，序列3自5’末端第237-896位核苷酸为cm^R，序列3自5’末端第1238-1543位核苷酸为ccdB，序列3自5’末端第1584-1708位核苷酸为attR2。 

3）pCG1811载体的构建 

将上述1）获得的去P的平末端pCG181载体骨架和的上述2）的DNA片段attR1-cm^R-ccdB-attR2连接，得到连接产物。 

表3为连接反应体系 

取5μl上述连接产物转化ccdB Survival2T1（购自Invitrogen公司，产品目录号为A104660）感受态细胞，涂板（LB+30mg/L氯霉素固体培养基），挑取阳性单克隆摇菌，提取质粒。 

将质粒送去测序，该质粒为将序列表中序列3所示的DNA片段attR1-cm^R-ccdB-attR2插入pCG181载体中，命名为重组载体pCG181_ccdB，简称为pCG1811。 

2、pCG1851载体的构建 

方法与上述1中构建pCG1811的基本相同，仅将载体替换为pCG185，得到重组载体pCG185_ccdB，简称为pCG1851，经过测序，该重组载体为将序列表中序列3所示的DNA片段attR1-cm^R-ccdB-attR2插入pCG185载体中得到的载体。 

3、pCS1671载体的构建 

按照上述1中构建pCG1811的方法，将pCS167载体经PacI酶切、补平，去P后，得到去P的平末端pCS167载体骨架，再与序列表中序列3所示的DNA片段attR1-cm^R-ccdB-attR2连接，得到重组载体pCG167_ccdB，简称为pCS1671。 

经过测序，该重组载体为将序列表中序列3所示的DNA片段attR1-cm^R-ccdB-attR2插入pCS167载体中的载体。 

4、重组质粒的验证 

ccdB读码框为1711bp，用载体上邻近ccdB序列两端的酶切位点进行鉴定，pG181_ccdB和pG185_ccdB用PacI-BglII酶切鉴定，pCS167_ccdB用SacI-ApaI酶切鉴定，以上四个酶在ccdB读码框内无切点，如正确连接，则会产生包含ccdB读码框的1.8kb的片段。 

鉴定结果如图2，1-4泳道：分别为pCG181、pCG1811、pCG185和pCG1851PacI-BglII双酶切结果；5、6泳道：分别为pCS167和pCS1671SacI-ApaI双酶切，结果说明已正确插入目标片段。 

酶切鉴定正确的送去测序，测序引物P1：5'-CACATTATACGAGCCGGAAGCAT-3'和P2：5'-CAGTGTGCCGGTCTCCGTTATCG-3'，测序结果经序列比对一致，说明ccdB已正确插入pCG181、pCG185和pCS167载体中，获得pCG181_ccdB、pCG185_ccdB和pCS167_ccdB，分别命名为pCG1811、pCG1851和pCS1671。 

上述载体可以通过Gateway技术将外源基因表达盒迅速克隆到载体上，用于单双子叶植物表达载体的快速构建。 

二、Backbone上插入不同bar表达盒的gateway兼容重组载体pCG1852、pCG1853、pCG1854和pCS1671-UB的构建 

1、含不同T-DNA结构的bar表达盒的扩增 

1）pENTR/D-TOPO_ubi:bar:nos入门载体的构建 

（1）ubi:bar:nos表达盒的扩增 

用高保真平末端酶PrimeStar，从质粒pGreenII-UB中扩增ubi:bar:Nos表达盒，正向引物Fubar：5-caccTCACCCAGTGCAGCGTGAC-3，反向引物Rtbar：5-TGTACAAGAAAGCTGGGTCGG-3，正向引物Fubar5’端加CACC四碱基，以便于下一步的TOPO克隆。 

结果如图3A所示，得到长度为2891bp DNA片段ubi:bar:nos，经过测序，其核苷酸序列为序列表中的序列1自5‘末端第114-3004位核苷酸，其中，序列表中序列1自5’末端第1009-2592位核苷酸为启动子ubi，序列表中序列1自5’末端第421-972位核苷酸为bar基因，序列表中序列1自5’末端第147-406位核苷酸为终止子nos。 

（2）、TOPO反应 

上述1）获得的ubi:bar:nos的PCR产物电泳切胶回收后与TOPO载体，进行TOPO反应，反应体系如下： 

表4为TOPO反应体系 

混匀后，室温反应5min，取2μl反应产物转化DH5α感受态，涂板（LB+100mg L^-1Kan固体培养基），37℃过夜培养，收集阳性克隆。 

阳性克隆作为模板，用以bar基因序列为模板设计引物barF：5'-GTCTGCACCATCGTCAACC-3'，barR：5'-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3'进行PCR扩增。 

结果如图3B所示，得到444bp的PCR产物。 

酶切验证：将PCR阳性克隆提质粒，用SspI酶切鉴定，SspI在TOPO载体上有一切点，在ubi:bar:Nos表达盒上无切点，如正确连接则酶切后产生约5.4kb大小的带，否则为TOPO载体2.5kb大小的带。 

酶切结果如图3C，与预期相符。 

酶切鉴定正确的送去测序，质粒为将序列表中该序列1自5’末端第114-3004位核苷酸ubi:bar:nos插入TOPO载体得到的重组载体pENTR/D-TOPO_ubi:bar:nos（图3D）。 

2）、LR重组反应在pCG1851中引入ubi:bar:Nos表达盒构建重组载体 

将上述1）制备的重组载体pENTR/D-TOPO_ubi:bar:nos和上述一获得的重组载体pCG1851进行LR重组反应，因两质粒都为Kan抗性，为了避免LR重组后，未发生重组的pENTR/D-TOPO_ubi:bar:nos质粒影响重组质粒的筛选，故把pENTR/D-TOPO_ubi:bar:nos质粒用SspI线性化，具体如下： 

用SspI酶切pENTR/D-TOPO_ubi:bar:nos质粒进行线性化，回收线性化载体pENTR/D-TOPO_ubi:bar:nos，将线性化载体pENTR/D-TOPO_ubi:bar:nos与重组载体pCG1851进行LR重组反应，反应体系如下： 

表5为LR重组反应体系 

25℃反应1h，加入1μl proteinase K，37℃反应10min，失活LR clonase II enzyme。 

取1ul反应产物转化DH5α感受态，得到转化子。 

转化子提质粒酶切验证，用邻近bar表达盒2侧的载体上的PmeI-PacI酶切，结果如图4A，可产生约3.0kb包含bar表达盒大小的电泳条带和3.7kb载体大小的条带，将该质粒命名为pCG1851_ubi:bar:nos（图4B）。 

3）、含不同T-DNA结构的bar表达盒的扩增 

PrimerStar高保真平末端酶扩增，引物5端加PmeI酶切位点。 

以上述2）制备的pCG1851_ubi:bar:nos为模板，采用引物Fubar：5-gtttaaacTCACCCAGTGCAGCGTGAC-3Rtbar：gtttaaacTGTACAAGAAAGCTGGGTCGG，扩增约2.9kb的ubi:bar:nos片段，经过测序，其核苷酸序列为序列1自5’末端第114-3004位核苷酸为ubi:bar:nos，第1009-3004位核苷酸为ubi，第421-972位核苷酸为bar，第147-406位核苷酸为nos。 

以pCG1851_ubi:bar:nos为模板，采用引物Fubar：5-gtttaaacTCACCCAGTGCAGCGTGAC-3，Rlb：5-gtttaaacGTCGAGATGGATCTTGGCAG-3扩增约2.9kb的LB-ubi:bar:nos片段，经过测序，其核苷酸序列为序列1自5’末端第47-3004位核苷酸，其中序列1自5’末端第61-85位核苷酸为LB，第1009-3004位核苷酸为ubi，第421-972位核苷酸为bar，第147-406位核苷酸为nos； 

以pCG1851_ubi:bar:nos为模板，采用引物F2lb：5-gtttaaacGTAAGATCTTGGCAGGATATATTG-3，Rro：5-gtttaaacCCTAGAGGATCTCAAACAAACA-3，扩增约3.1kb的2LB-ubi:bar:nos-RB-RB经过测序，其核苷酸序列为序列1自5’末端第1-3149位核苷酸，其中序列1自5’末端第10-34位核苷酸为LB序列，35-60为间隔序列，61-85为LB序列，第1009-3004位核苷酸为ubi，第421-972位核苷酸为bar，第147-406位核苷酸为nos，第3079-3103位核苷酸为RB。 

扩增结果如图5A，含不同T-DNA结构的ubi:bar:nos的PCR扩增；1：ubi:bar:nos；2：LB-ubi:bar:nos；3：2LB-ubi:bar:nos-RB-RB，扩增大小预预期一致。 

2、重组载体pCG1852、pCG1853和pCG1854的构建 

分别PmeI酶切上述1获得的3种扩增片段ubi:bar:nos、LB-ubi:bar:nos、2LB-ubi:bar:nos-RB-RB，得到的酶切产物分别与PmeI酶切去磷的pG1851作连接，PmeI位点位于T-DNA LB外侧的backnone上，因此连接后可得到目的载体：ubi:bar:nos与pG1851连接可得到pG1851_ubi:bar:nos，LB-nos:bar:ubi和pG1851连接得到pG1851_LB-ubi:bar:nos，2LB-nos:bar:ubi-RO和pG1851连接得到pG1851_2LB-nos:bar:ubi-RO。 

PmeI酶切验证上述重组载体pG1851_ubi:bar:nos、pG1851_LB-ubi:bar:nos和pG1851_2LB-nos:bar:ubi-RO，结果如图5B所示， 

pG1851_ubi:bar:nos得到2891bp的酶切产物，将该重组载体命名为pCG1852，该载体为将序列表中序列1自5’末端第114-3004位核苷酸ubi:bar:nos插入pG1851载体的PmeI酶切位点得到的载体； 

pG1851_LB-ubi:bar:nos得到2957bp的酶切产物，将该重组载体命名为pCG1853，该载体为将序列表中序列1自5’末端第47-3004位核苷酸LB-ubi:bar:nos插入pG1851载体的PmeI酶切位点得到的载体； 

pG1851_2LB-nos:bar:ubi-RO得到3149bp的酶切产物，将该重组载体命名为pCG1854， 该载体为将序列表中序列1自5’末端第1-3149位核苷酸2LB-ubi:bar:nos-RB-RB插入pG1851载体的PmeI酶切位点，形成T-DNA区，得到的载体。 

重组载体pCG1852、pCG1853、pCG1854的构建流程图如图5C所示。 

3、辅助复制质粒pCS1671-UB的构建 

按照上述一的方法，将重组载体pENTR/D-TOPO_ubi:bar:nos用SspI线性化，与与重组载体pCS1671进行LR重组反应，在pCS1671的T-DNA中引入ubi:bar:nos表达盒，得到重组载体pCS1671-UB。 

用引物barF/barR对重组载体pCS1671-UB进行PCR扩增，结果如图6A所示，得到444bp的PCR产物，为阳性。 

经过测序，该重组载体为将序列1自5’末端第114-3004位ubi:bar:nos通过LR重组到载体pCS167的T-DNA区，得到的重组载体，命名为pCS1671-UB（图6B）。 

三、插入目的片段gus表达盒的重组载体构建 

1）、TOPO_ubi:gus:nos载体的构建 

（1）ubi:gus:nos表达盒的扩增 

以引物Fugus：5-caccGTATCGATAAGCTTGCATGCCT-3；Rtgus：5-GGCCGCTCTAGAACTAGTGGAT-3，PrimerStar高保真平末端酶，从质粒PAL156中扩增4.3kb大小的ubi:gus:nos表达盒（核苷酸序列为序列2，图7A）。 

序列2所示的ubi:gus:nos表达盒，自5’末端第1-2034位核苷酸为ubi、自5’末端第2044-4059位核苷酸为gus、自5’末端第4069-4377位核苷酸为nos。 

（2）、TOPO反应 

上述1）获得的ubi:gus:nos的PCR产物电泳切胶回收后与TOPO载体反应，反应产物转化后，得到转化子。 

以转化子菌液作为模板，用gusF：5-caccGTATCGATAAGCTTGCATGCCT-3，gusR：5-GGCCGCTCTAGAACTAGTGGAT-3进行PCR扩增，得到1501bp的PCR产物，为阳性转化子（图7B）。 

提取阳性转化子的质粒，用AclI酶切验证，AscI在ubi:gus:nos表达盒内无切点，故正确连接酶切后可产生约6.9kb大小的带，否则为载体大小带2.5kb，酶切结果如图7C，质粒正确。 

酶切鉴定正确的送去测序，质粒为将序列表中该序列2所示的核苷酸ubi:gus:nos插入TOPO载体得到的重组载体TOPO_ubi:gus:nos（图7D）。 

2）、LR重组反应在pCG1811、pCG1851、pCG1852、pCG1853和pCG1854中引入ubi:gus:Nos表达盒构建重组载体 

TOPO_ubi:gus:nos与载体pCG1811、pCG1851、pCG1852、pCG1813和pCG1814进行LR重组反应。因为TOPO载体和目的载体都为Kan抗性，为了避免反应后TOPO_ubi:gus:nos载体对重组质粒的筛选，将TOPO_ubi:gus:nos用AclI酶切线性化，具体如下： 

用AclI酶切载体TOPO_ubi:gus:nos，回收线性化载体TOPO_ubi:gus:nos，将线性化载体TOPO_ubi:gus:nos分别与重组载体pCG1811、pCG1851、pCG1852、pCG1853和pCG1854进行LR重组反应，替换attR1-cm^R-ccdB-attR2DNA片段，获得pCG1811_ubi:gus:nos、pCG1851_ubi:gus:nos、pCG1852_ubi:gus:nos、pCG1853_ubi:gus:nos和pCG1854_ubi:gus:nos。 

将pCG1811_ubi:gus:nos、pCG1851_ubi:gus:nos、pCG1852_ubi:gus:nos、pCG1853_ubi:gus:nos和pCG1854_ubi:gus:nos用引物gusF/gusR进行PCR扩增，均得到1051bp的PCR产物，证明为阳性，将上述载体分别命名为pCG1811-UG、pCG1851-UG、pCG1852-UG、pCG1853-UG和pCG1854-UG（图8）。 

pCG1811-UG为将ubi:gus:nos通过gateway重组的LR反应同源重组到pCG181的T-DNA区得到的重组载体；无筛选标记基因； 

pCG1851-UG为将ubi:gus:nos通过gateway重组的LR反应同源重组到pCG185的T-DNA区得到的重组载体；无筛选标记基因； 

pCG1852-UG为将ubi:gus:nos通过gateway重组的LR反应同源重组pCG185的T-DNA区，且将ubi:bar:nos插入pCG185的PmeI酶切位点。 

pCG1853-UG将ubi:gus:nos通过gateway重组的LR反应同源重组pCG185的T-DNA区，且将LB-ubi:bar:nos插入pCG185的PmeI酶切位点。 

pCG1854-UG将ubi:gus:nos通过gateway重组的LR反应同源重组到的载体pCG185的T-DNA区，且在载体pCG185的PmeI酶切位点插入2LB-ubi:gus:nos形成的另一个T-DNA区。 

四、农杆菌专用载体组合物的获得 

由于pCG185和pCG181为克隆质粒在农杆菌中无法复制，因此必须辅助加入辅助复制质粒pS167或PAL154。 

因此农杆菌专用载体组合物如下： 

1G7B组合物：pG1811-UG和辅助复制质粒pS167-UB，标记基因和目的基因在不同载体的T-DNA区； 

5G7B组合物：pG1851-UG和辅助复制质粒pS167-UB，标记基因和目的基因在不同载体的T-DNA区； 

5BTG154组合物：pG1852-UG和辅助复制质粒PAL154，标记基因和目的基因在同一载体的T-DNA区和骨架上； 

5LBTG154组合物：pG1853-UG和辅助复制质粒PAL154，标记基因和目的基因在同一载体的T-DNA区和骨架上； 

5TBTG154组合物：pG1854-UG和辅助复制质粒PAL154，标记基因和目的基因在同一载体的连续的两个不同T-DNA区上。 

实施例2、用于获得无标记转基因植物的农杆菌专用载体组合物的应用 

1、农杆菌专用载体组合物转化农杆菌 

将实施例1获得的每个载体组合物中的各载体按照质量比为1：1混合后，转化农杆菌AGL1，在2×YT固体培养基（含200mgL^-1Carb、100mg/L Kan）上涂板，28℃暗培养48h，分别得到重组菌AGL1/pG1811-UG/pS167-UB（1G7B）、AGL1/pG1851-UG/pS167-UB（5G7B）、AGL1/pG1852-UG/154（5BTG154）、AGL1/pG1853-UG/154(5LBTG154)和AGL1/pG1854-UG/154(5TBTG154)（图9）。 

用gusF/R和baF/R引物扩增上述重组载体，得到1051bp和444bp的产物，即为阳性重组菌。 

鉴定为阳性的AGL1/pG1811-UG/pS167-UB（1G7B）命名为1G7B（pG1811-UG/pS167-UB）； 

鉴定为阳性的AGL1/pG1851-UG/pS167-UB（5G7B）命名为5G7B（pG1851-UG/pS167-UB）； 

鉴定为阳性的AGL1/pG1852-UG/154（5BTG154）命名为5BTG154（pG1852-UG/154）； 

鉴定为阳性的AGL1/pG1853-UG/154(5LBTG154)命名为5LBTG154（pG1853-UG/154）； 

鉴定为阳性的AGL1/pG1854-UG/154(5TBTG154)命名为5TBTG154（pG1854-UG/154）。 

2、农杆菌介导的小麦未成熟胚的转化 

1）农杆菌菌液的制备 

将上述重组菌1G7B（pG1811-UG/pS167-UB）、5G7B（pG1851-UG/pS167-UB）、5BTG154（pG1852-UG/154）、5LBTG154（pG1853-UG/154）、5TBTG154（pG1854-UG/154）在2×YT固体培养基上划线，28℃暗培养48h以上。挑取单菌落于10ml LB培养液中，28℃，250rpmmin^-1暗培养40h以上；菌液离心，去除培养液加入1ml10mM MgSO₄搅匀，加入3ml80%的甘油，500μl/每管分装到1.5ml离心管中，液氮冷冻后，-80℃保存待用，得到5种农杆菌菌液。 

2）农杆菌介导的小麦未成熟胚的转化 

小麦转化过程参照He Y,Jones H D,Chen S,Chen X M,Wang D W,Li K X,Wang D S,Xia L Q.Agrobacterium-mediated transformation of durum wheat(Triticum turgidum L.var.durum cv Stewart)with improved efficiency.2010,61(6):1567-1581记载的转化方法； 

具体取授粉后12-15天的小麦（小麦品种为Triticum turgidum L.var.durum cvStewart）穗子，剥取穗子中部大而饱满的种子，置于瓶中，70%酒精浸泡1-5min，然后用10%次氯酸钠浸泡15min，其间不停摇晃，最后用无菌水冲洗3次。超净台中切除胚芽后盾面向上将未成熟胚置于CM4C培养基中，未成熟胚适宜大小为0.8mm-1.5mm，得到待转化胚； 

取-80℃保存制备好上述1）的5种农杆菌菌液，于冰上解冻后，接种于10ml MG/L培养液（含200mgL^-1Carb、100mg L^-1的Kan、1mg L^-1的Biotin）中，28℃,250rpm min^-1暗培养12-24h，直到菌液浓度OD₆₀₀在1.0-1.2之间； 

将上述菌液在4℃,5000转/分离心5min，去除MG/L，加入8ml1×CM4C重悬，然后加入200μM As，以4ml/管分装于10ml离心管中，放入摇床重悬；使用时每管加入60μl1%silwet（15μl ml^-1），倒入已切好的胚中，避光侵染15-30min，期间轻轻晃动几次，然后吸干菌液，将胚转移至另一CM4C培养皿中，23℃-25℃暗处共培养2-3天。共培养后将将胚转移至诱导培养基中黑暗诱导培养3-4周；然后将愈伤转移至再生培养基中，光照培养3-4周；之后将再生苗移至2.5mg L^-1和3.5mg L^-1的R培养基上，分别筛选培养3-4周；存活的抗性苗移至Ｒ培养基上恢复培养2-3周；最后将植株转移到温室土钵中，正常条件管理，得到5种组合物的再生小麦株系：1G7B再生小麦株系、5G7B再生小麦株系、5BTG154再生小麦株系、5LBTG154再生小麦株系、5TBTG154再生小麦株系。 

小麦未成熟胚经转化、愈伤诱导、再生筛选获得再生小麦株系，过程见图10所示，其中，A：未成熟胚农杆菌侵染共培养后转移至诱导培养基中；B：诱导培养三天后GUS瞬时表达验证；C：愈伤的形成；D：愈伤中GUS表达检测；E：芽的分化；F：再生芽和根的生长；G：再生苗在2.5mg L^-1PPT再生培养基上筛选；H：再生苗在3.5mg L^-1PPT再生培养基上筛选；I：两次筛选后存活的植株；J：存活植株移入花盆中；K、L：存活植株的生长。 

3、转基因植株的鉴定 

1）转基因植株的PCR检测 

提取上述98株1G7B再生小麦、179株5G7B再生小麦、186株5BTG154再生小麦、152株5LBTG154再生小麦、163株5TBTG154再生小麦的基因组DNA，分别用gus引物gusF/R、bar引物barF/R共同进行PCR检测转基因植株中gus基因和bar基因。其中bar引物为： 

5’-GTCTGCACCATCGTCAACC-3’，5’-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3’；gus引物为:5’-AGTGTACGTATCACCGTTTGTGTGAAC-3’，’-ATCGCCGCTTTGGACATACCATCCGTA-3’。 

得到444bp为阳性PCR-bar⁺再生小麦；得到1051bp的为阳性PCR-gus⁺再生小麦，结果见表6。 

2）、GUS染色验证GUS表达 

GUS染色参照Wu等方法，阳性PCR-bar⁺再生小麦和阳性PCR-gus⁺PCR再生小麦叶片剪成小块与X-gluc染色液37℃暗处温育3-5h，75%乙醇光下脱色，观察染色情况。X-gluc染色液成份为：50mmol L^-1Na₃PO₄、0.1%Trition-100、20%甲醇和0.5mg mL^-1X-Gluc(pH7.0)。 

得到蓝色的为阳性GUS表达再生小麦，结果见表6。 

3）、BAR氨盐验证bar基因表达 

PPT抑制氨盐同化法检测bar基因的表达（Rasco-Gaunt S,Riley A,Lazzeri P,BarceloP.A facile method for screening for phosphinothricin(PPT)-resistant transgenicwheats.Molecular Breeding,1999,5(3):255-262.），取阳性GUS表达再生小麦幼嫩叶片，剪成小块，加入incubation medium，24-25℃，光照下温育4-6h；取200ul incubation medium加入1ml溶液1和1ml溶液2，37℃暗处温育15min，观察反应液颜色变化。 

非抗性叶片中谷氨酰胺合成酶受到PPT的抑制，氨同化受阻，叶片中积累的过量氨离子，释放到Incubation medium中，与溶液1和溶液2反应后，显示浅绿色到深蓝色的颜色。抗性叶片中可正常代谢氨盐，氨离子不积累，溶液呈现黄色。 

Incubation medium成分：50mM KPO3Buffer（PH5.8），2%蔗糖，25mg L^-1PPT，0.1mg L^-12,4-D，0.1%Tween2.0； 

溶液1成分：水杨酸钠：34g L^-1，柠檬酸钠：25g L^-1，酒石酸钠：25g L^-1，硝普钠：0.12g L^-1， 

溶液2成分：氢氧化钠：30g L^-1，二氯氰脲酸钠：0.52g L^-1

溶液呈现黄色的为GUS-BAR共表达植株，结果见表6。 

上述鉴定结果如表6所示。 

平均转化效率为(PCR-bar⁺株数/待转染胚数)*100% 

表65个载体组合转化小麦结果统计 

从上述结果可以看出，载体组合物5G7B和5TBTG154的转化效率显著高于其他组合物，表明目的基因GUS和标记基因BAR不同质粒的T-DNA区（5G7B）或在同一质粒的T-DNA区和载体骨架区（5TBTG154），都可以实现高转化效率，且在同一质粒中的转化效率更高。 

具体分析5G7B再生小麦的PCR鉴定部分结果如图11所示，其中M：Marker DL2000；CK：非转基因植株；1-15：转基因植株，其中株系1、2、4、6、9、11、12、13为bar、gus共整合植株；3、5、7、8、10、14、15为只含bar的植株，可以看出，用GUS染色和BAR氨盐验 证共整合植株中GUS和BAR的表达，发现有3棵株系中GUS未发生表达，其余24棵中GUS和BAR可共表达，共转化率为50%（24/48）。 

对中GUS和BAR共表达的5G7B再生小麦进行Southern杂交，具体如下： 

基因组的提取：利用CTAB法分别提取GUS-BAR共表达植株小麦基因组DNA。1-2g小麦叶片，液氮中充分研磨后置于10ml预冷的大离心管中；加4ml65℃预热的CTAB，同时加入400μlRNAase（10mg ml^-1），充分混匀后65℃温育1h，其间上下颠倒几次；加入等体积的酚-氯仿异-戊醇（25:24:1），充分混匀后，静置，待其分层后，4℃，12000rpm，离心10min；吸上清，于另一离心管中，重复步骤3；吸上清，于另一心管中，加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀后，-20℃沉淀10min；用枪头挑取沉淀于2ml的离心管中；1ml70%的乙醇，漂洗2次；通风厨中放置，待乙醇充分挥发后，加入500μl灭菌的ddH₂O，60℃助溶30min。 

基因组DNA的酶切及纯化：酶切基因组DNA，反应体系400μl。包括基因组DNA约40μg、10×Buffer340μl、10μl酶，ddH₂O补足到400μl。37℃过夜酶切。取5μl跑胶检测，如未切开可延长酶切时间或再加入酶切割。酶切后，酶切产物中加入等体积的氯仿，充分混匀，12000rpm，离心2min；取上清，于另一管中，加入0.7倍体积的异丙醇，-20℃沉淀10min；12000rpm，离心5min，沉淀用70%的乙醇洗2次；待乙醇充分挥发后，加入60℃预热的50μlddH₂O，使DNA完全溶解； 

转膜：酶切纯化后的DNA，经0.8%琼脂糖凝胶1×TAE buffer中30V分离12-14h。采用毛细管印迹法将DNA转移到带正电荷的尼龙膜上（Hybond⁺）。 

预杂交和杂交：Southern杂交采用Roch DNA地高辛标记和检测试剂盒I，按说明书操作：用gus引物扩增产物为模板，随机引物法地高辛标记法制备探针，约1μg模板DNA，ddH₂O补足到16ul，沸水浴中变性10min，迅速于冰水混合物中冷却2min。加入约4ul DIG-High Prime，37℃反应1-18h。 

将膜放入杂交瓶中，使膜与瓶壁间无气泡。加入提前预热的杂交液，42℃预杂1-3h；弃掉预杂交液，重新加入杂交液及沸水浴变性的探针。42℃杂交18h以上。 

洗膜及显色 

（1）2XSSC，0.1%SDS室温洗膜2次，每次5min； 

（2）0.5XSSC，0.1%SDS在65-68℃下，洗2次，每次15min。 

（3）100ml Washing buffer，洗膜1-5min； 

（4）100ml Blocking solution，30min； 

（5）20ml Antibody solution，30min； 

（6）100ml Washing buffer，洗2次，每次15min； 

（7）20ml Detection buffer平衡2-5min； 

（8）加入10ml新鲜配置的color substrate solution，使其覆盖于整个膜表面，暗处显示，直到条带清晰可见。 

结果如图12所示，显示gus基因已整合到目标基因组中，在各植株中的拷贝数不同，范围为1-5个拷贝。说明位于不同质粒上的两独立T-DNA可共整合到同一植株中，同时，含bar基因载体的T-DNA可单独整合到基因组中(图11)，获得只含标记基因而无gus基因的独立转基因植株。 

因此，GUS和BAR共表达的小麦为T0代转1G7B小麦（6棵）、T0代转5G7B小麦（24棵）、T0代转5BTG154小麦（5棵）、T0代转5LBTG154小麦（19株）、T0代转5TBTG154小麦（30 棵）。 

4、鉴定获得无筛选标记基因的转基因小麦 

1）鉴定无筛选标记基因T₁代转5G7B小麦 

将24棵同时含有gus和bar共整合T0代转5G7B小麦，收取T₁代种子，种植。对T₁代植株进行gus和bar基因PCR鉴定、bar表达验证、GUS染色检测，方法同3。 

部分植株结果如图13，A：bar和gus基因的PCR检测。bar和gus PCR产物混合跑样；B：GUS染色验证；C：bar表达验证；D：部分株系的gus和bar的southern杂交结果。基因组DNA用SacI和BglII酶切，可分别切下包含gus基因的3103bp的片段和含bar基因的1631bp的片段。先用gus探针杂交，剥膜后用bar探针杂交。 

图A、B、C、中1-22相对应。1-21：T₁代植株；22：CK；图D中1-10与A、B、C中1-10相对应。由图看出：植株1、2、8、19只含有bar基因无gus基因；植株3、6、7、9、13、16、18只有gus基因无bar基因，为marker-free植株；植株4、5、11、12、14、15、17、21bar和gus基因都有；植株10和20中bar和gus基因全无。PCR检测、GUS染色和BAR表达验证、与Southern结果一致。 

结果显示，部分T0代中gus和bar共整合的植株在T1代中发生了遗传分离，Southern杂交进一步证实了后代中gus和bar的分离（图13-D），后代部分植株中只含有GUS而无抗性选择标记；部分共整合植株后代未发生分离（图14）。在分析的24个T0株系中，有7个株系后代gus和bar可发生分离（表1），分离频率（分离株系/检测株系）为29.2%（7/24），在7个株系的T1后代中，无bar基因而只含有gus的无标记转基因植株的获得率（无标记转基因植株数/检测总植株数）为23.4%。 

2）鉴定无筛选标记基因T₁代转1G7B小麦 

对6棵同时含有gus和bar共整合T0代转1G7B小麦，收取T₁代种子，种植。对T₁代植株进行PCR、BAR、GUS染色检测，结果表明，部分共整合植株后代可发生分离。6棵共整合植株中1棵在T₁代中可发生分离，此株系的T₁后代中，无bar基因而只含有gus的无标记转基因植株的获得率为13.3%。PCR检测、GUS染色和BAR表达验证、结果一致。 

3）鉴定无筛选标记基因T1代转5BTG154小麦 

对同时含有gus和bar共整合5棵T0代转5BTG154小麦，收取T₁代种子，种植。对T₁代植株进行PCR、BAR、GUS染色检测，结果表明，在T₁代中gus和bar发生了遗传分离，分离效率为38.5%（5/13），在5个株系的T₁后代中，无bar基因而只含有gus的无标记转基因植株的获得率为21.4%。PCR检测、GUS染色和BAR表达验证、结果一致。 

在此载体中标记基因位于T-DNA左边界的backbone上，gus基因位于T-DNA内，说明把标记基因置于载体backnone上可获得较高频率的marker-free转基因植株。 

许多研究表明，农杆菌介导转化中，backbone序列的传递是十分普遍的，其传递频率幅度为20%-50%之间，有时可达75%。Wu等分析了34株转基因独立株系中T-DNA左边界backnone的整合情况，发现59%的株系含有backnone的整合；Huang等将目的基因置于T-DNA内，选择基因置于LB外的骨架序列上，用此双元载体转化玉米，成功获得了marker-free的植株，并发现此载体比一质粒双T-DNA的载体可获得较高频率的marker-free植株。 

4）鉴定无筛选标记基因T₁代转5LBTG154小麦 

对同时含有gus和bar共整合19株T0代转5LBTG154小麦，收取T₁代种子，种植。对T₁代植株进行PCR、BAR、GUS染色检测，结果表明，有9棵T₀代株系在T₁中bar和gus发生 了遗传分离，分离效率为47.3%，9个株系的T₁后代中，无bar基因而只含有gus的无标记转基因植株的获得率为25.4%。PCR检测、GUS染色和BAR表达验证、结果一致。 

此载体中gus位于T-DNA内而bar位于两LB间，bar的传递一方面类似于backnone的传递，另一方由于含1RB和2LB，有望形成2独立T-DNA，即‘RB-gus-2LB-bar-LB’和‘RB-gus-LB’结构，从而获得marker-free植株。与此类似，Lu等^[19]构建了双RB结构的载体，即T-DNA含有2个右边界和一个左边界，通过把筛选标记置于RB之间，目的基因置于RB和LB间，即形成RB-筛选标记-RB-目的基因-LB结构，形成‘RB-筛选标记-RB-目的基因-LB’和‘RB-目的基因-LB’2种形式的T链结构非连锁插入，从而产生marker-free的植株。实验结果表明，此结构的双元载体系统对于获得marker-free植株非常有效，其中36%-64%的T₀植株后代可发生分离，并成功获得含有水稻齿叶矮缩病毒抗性基因的marker-free转基因水稻。 

5）鉴定无筛选标记基因T₁代转5TBTG154小麦 

对同时含有gus和bar共整合30棵T₀代转5TBTG154小麦，收取T₁代种子，种植。对T₁代植株进行PCR、BAR、GUS染色检测，结果表明，9棵植株在T₁代中gus和bar发生了分离，分离效率为30%，9棵株系的T₁后代中，无bar基因而只含有gus的无标记转基因植株的获得率为19.7%。PCR检测、GUS染色和BAR表达验证、结果一致。 

5、各载体组合边界整合分析 

T-DNA整合中常伴随有LB终止失败而导致的边界序列的整合。以T-DNA左边界两侧序列设计引物，PCR检测各载体组合转基因植株中边界整合情况，根据是否扩增出特异条带，判断旁侧序列的整合。 

各载体检测引物序列位置、退火温度及扩增片段大小见表7和图15。 

表75个载体组合边界整合检测所用引物 

将24棵同时含有gus和bar共整合T0代转5G7B小麦、6棵同时含有gus和bar共整合T0代转1G7B小麦、同时含有gus和bar共整合5棵T0代转5BTG154小麦、同时含有gus和bar共整合19株T0代转5G7B小麦、同时含有gus和bar共整合30棵T₀代转5TBTG154小麦的叶片的基因组DNA分别用表7中对应的引物对进行扩增。 

结果如下： 

引物1检测5G7B的24棵共整合植株，3棵中可扩增出目的条带，边界序列整合率为12.5%； 

引物2检测1G7B的6棵共整合植株，1棵中检测出目的条带，边界序列整合率为16.7%； 

引物3检测5BTG154的13棵植株，8棵中扩增出目的条带，边界序列整合率为61.5%； 

引物4在5LBTG154的19棵植株中，10棵中可扩增出了目的条带，边界序列整合频率为52.6%； 

引物5在5TBTG154的30棵植株中，6棵中扩增出了目的条带，边界序列整合率为20.0%。 

部分株系PCR检测结果如图16。 

载体组合5G7B、1G7B和5TBTG中目的载体（pClean-G）所含T-DNA结构相同，为双LB边界。Kuraya等研究了T-DNA含多个LB时backnone的传递，结果表明增加LB的个数可显著降低backbone的传递，Wu等分析了含单LB T-DNA的pGree/pSoup载体转化小麦后，转基因植株中T-DNA边界整合情况，发现59%的株系伴随有LB外骨架序列的整合，本研究5G7B、1G7B和5TBTG伴随有LB外骨架序列整合的植株所占百分比分别为12.5%、16.7%、20.0%，远远低于Wu等的研究，说明本载体中的双LB可增强LB的终止，减少骨架序列的传递。对5LBTG的检测结果也说明双LB可降低骨架序列的传递，该植株中52.6%的株系含有骨架的整合，而相邻骨架的为单LB。然而载体5BTG中61.5%的株系可扩增出特异条带，该结果与5G7B、1G7B和5TBTG结果相矛盾，推测可能是由于偏向选择造成的。双LB可减少骨架的传递，从而降低bar基因的整合，理论上经过筛选后，应该获得很少的再生植株。为了获得更多再生植株，需经过进行大量的转化和筛选。所以在相同转化条件下，转化效率较低。的确，本实验也证明了该载体组合转化效率很低，只有0.7%。 

从上述可以看出，本发明利用2种组合载体可以获得高的无bar基因而只含有gus的无标记转基因植株效率，其中利用标记基因和目的基因在不同载体的T-DNA区5G7B组合物和利用标记基因和目的基因在同一载体的两个不同T-DNA区5TBTG154组合物，均可以获得高转化效率（分别为2.8±0.8%和4.0±2.1%）。结合边界序列整合率（分别为12.5%和20.0%，相对于其它载体较低）和后代获得无选择标记的转基因植株比例（分别为23.4%和19.7%），这两个载体组合更适合于获得无选择标记的转基因植物研究。 

Claims (10)

1.一种用于获得无标记转基因植物的农杆菌专用载体组合物，由独立包装的重组载体A和重组载体B组成；

所述重组载体A为将目的基因插入pClean系列载体的pClean-Green载体T-DNA区中，得到表达所述目的基因的重组载体A；

所述重组载体B为将标记基因插入pClean系列载体的pClean-Soup载体的T-DNA区中，得到表达所述标记基因的重组载体B。

2.根据权利要求1所述的载体组合物，其特征在于：

所述目的基因通过gatway重组到pClean-Green载体T-DNA区；

所述标记基因通过gatway重组到pClean-Soup载体的T-DNA区。

3.根据权利要求1或2所述的载体组合物，其特征在于：

所述pClean-Green载体为pCG181或pCG185；所述pClean-Green载体具体为pCG185；

所述pClean-Soup载体pClean-Soup载体为pCS167。

4.根据权利要求1-3中任一所述的载体组合物，其特征在于：

所述目的基因为以目的基因表达盒的形式插入所述pClean-Green载体中；所述目的基因表达盒包括启动子ubi、目的基因和终止子Nos；

所述标记基因以标记基因表达盒的形式插入所述pClean-Soup载体中；所述标记基因表达盒包括启动子ubi、标记基因和终止子Nos。

5.根据权利要求4所述的载体组合物，其特征在于：

所述目的基因为GUS基因，所述标记基因为bar基因。

6.根据权利要求5所述的载体组合物，其特征在于：

所述bar基因表达盒的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第114-3004位所示的核苷酸；

所述gus基因表达盒的核苷酸序列为序列表中序列2所示的核苷酸。

7.权利要求1-6中任一所述的载体组合物在鉴定或培育无标记转基因植物中的而应用；

所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

所述单子叶植物具体为小麦。

8.一种用于获得无标记转基因植物的方法，包括如下步骤：

1）将权利要求1-6中任一所述的载体组合物中的重组载体A和重组载体B共转染到植物外植体中，得到T0代转基因植物；

2）从T0代转基因植物中选取目的基因和标记基因共表达的T0代转基因植物，进行播种，收获T1代转基因植物；

3）选取所述T1代转基因植物中无标记基因且有目的基因的植株，得到无标记转基因植株。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述植物外植体为胚；

所述目的基因为gus基因，所述标记基因为bar基因。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：

所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

所述单子叶植物具体为小麦。