KR20110121266A - Ａｂａ 호르몬을 통해 식물의 스트레스 반응을 조절하는 유전자 및 형질전환 식물체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 식물체의 비생물학적 스트레스 저항성 증진용 조성물, 상기 조성물이 도입된 형질전환 식물체, 상기 형질전환 식물체의 제조방법 및 식물체의 비생물학적 스트레스 저항성 증진 방법 및 식물체의 발아 촉진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 식물체의 비생물학적 스트레스, 보다 구체적으로는 건조, 저온 또는 염 스트레스에 대한 저항성 및 발아능에 관여를 하며, 이를 이용하여 식물체를 형질전환 또는 발현 억제를 함으로서 건조, 저온 또는 염 등의 비생물학적 스트레스에 대한 내성이 탁월하거나 또는 속성재배가 가능한 신기능 식물체로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

ＡＢＡ 호르몬을 통해 식물의 스트레스 반응을 조절하는 유전자 및 형질전환 식물체{Genes Related to ABA Mediated Abiotic Stress Resistances and Transformed Plants with the Same}
본 발명은 식물의 비생물학적 스트레스 반응을 조절하는 유전자 및 형질전환 식물체에 관한 것이다.
고등식물은 이동이 불가하기 때문에 그들의 일생동안 다양한 환경 요인들인 가뭄, 고염(high salt), 중금속, 냉해, 열충격 및 오존과 같은 스트레스에 직면하게 된다. 이러한 비생물학적 스트레스는 작물의 생장과 발달의 제한 요인이 되며 이들 스트레스 중에서 수분 부족은 작물생산 감소의 주요 원인으로 여겨지는 가장 심각한 환경 요인이다. 세계적으로 물의 소비는 계속적으로 증가되어 왔으며, 깨끗한 물의 이용가능성은 인간에게 뿐만 아니라 고등식물에게 또한 중요한 문제가 될 수 있다. 식물은 단기적 또는 장기적인 물 부족에 대해 내성을 증가시키기 위해 신호 네트워크 경로를 조절하거나 스트레스-반응성 유전자들을 유도하는 등의 다양한 방어 전략을 작동시킨다. 이러한 수분 스트레스에 대한 세포적 또는 유전적 방어 메카니즘은 널리 알려져 있다(Shinozaki and Yamaguchi-shinozaki, 2007). 그러나 아직까지 고등식물에 있어서 스트레스에 대한 내성이나 민감성에 관여하는 스트레스-관련 유전자들의 생물학적 기능들에 대한 지식은 여전히 부족한 상태다. 그러므로 작물의 생산성을 증가시키기 위해 스트레스 반응 유전자들에 대한 기능 연구가 중요하다.
유비퀴틴은 모든 진핵생물에서 발현되는 76개의 아미노산으로 구성된 단백질로써, E1-E2-E3(유비퀴틴 활성화, 유비퀴틴 결합, 유비퀴틴 연결효소) 연쇄 효소반응에 의해서 다양한 기질 단백질에 공유결합이 되는 특성을 가진다. 유비퀴틴이 붙게 되는 기질 단백질은 매우 다양하여 세포 내의 거의 모든 생리활동에 영향을 주며, 많은 질병이 이러한 기작과 연결되어져 있다는 연구결과들이 잘 밝혀져 있다. 유비퀴틴의 처음 알려진 기능은 다른 단백질에 결합함으로써 단백질의 분해를 촉진하는 것이었으나 최근 들어 유비퀴틴의 다른 기능들이 속속 밝혀지고 있다.
유비퀴틴은 세 종류의 단백질, 즉 E1, E2 및 E3의 순차적인 작용에 의해 기질에 결합하게 된다. 유비퀴틴의 C쪽 말단 도메인에 있는 글리신이 기질 단백질의 라이신의 R기에 있는 NH3에 결합함으로써 기질과 공유 결합을 형성하게 된다. 일반적으로 유비퀴틴이 붙은 단백질은 프로테아좀에 의해 분해가 된다. 이 때, 프로테아좀에 의해 분해가 되기 위해서는 유비퀴틴이 여러 개가 붙은 폴리유비퀴틴이 기질에 붙어야 한다. 현재까지는 적어도 4개의 유비퀴틴이 결합한 폴리유비퀴틴이 기질에 붙을때만 기질의 프로테아좀 의존적인 분해가 일어난다고 알려져 있으나 이것은 in vitro 실험결과이기 때문에 논란의 여지는 있다. 프로테아좀 의존적인 분해를 일으키는 폴리유비퀴틴결합은, 유비퀴틴의 48번째 라이신에 다른 유비퀴틴이 결합하는 형태이다.
E1 효소는 개체 내에 한 종류만이 존재하고, 개수가 가장 많다. E2는 여러 종류가 존재하고, 일반적으로 유비퀴틴을 E1에서 E3 또는 기질로 전달해주는 역할을 한다. E3는 E3 리가아제(ligase) 효소라고도 하며, 유비퀴틴을 기질에 붙게 하는 마지막 단계의 효소이다. E3가 유비퀴티네이션이 될 기질의 특이성을 결정하게 된다. 즉, 주어진 E3 효소와 상호작용할 수 있는 기질은 특이적으로 결정되어 있다. E3 효소는 크게 2가지 형태로 나눌 수 있는데, RING 도메인을 갖는 것과 HECT 도메인을 갖는 것이 그것이다. RING 도메인을 갖는 E3 효소들은 E2와 기질이 서로 가깝게 위치하도록 도와주는 역할을 한다. 즉, E2와 기질 두 물질이 E3와 결합을 하면, E2에 있는 유비퀴틴과 기질 사이에 충분히 가까운 거리가 형성되고 이 때 화학적으로 E2에 있던 유비퀴틴이 기질로 이동을 하게 된다. 반면 HECT 도메인을 갖고 있는 E3 효소에 속하는 것들은, E2에서 유비퀴틴을 전달받은 후, 이것을 기질로 이동을 시키게 된다.
Atlg10560 유전자와 Atlg60190 유전자는 E3 유비퀴틴 리가아제 효소 활성을 가지는 단백질을 코딩하고 있다. 유비퀴티네이션은 식물 뿐 아니라 모든 고등 생명체가 가지는 하나의 메카니즘으로써, 다양한 기능을 담당하고 있는 것으로 알려져 있으나, 비생물학적 스트레스에 관여하는 유전자는 거의 알려진 바가 없다. 본 발명자들은 애기장대의 비생물학적 스트레스 및 ABA 호르몬에 의해 발현이 유도되는 At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자를 분리획득 한 후, 이들 유전자의 과다발현 형질전환체 및 발현 억제 돌연변이체를 제작하여 이들의 생리적인 표현형을 분석하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 식물체의 비생물학적 스트레스 저항성을 향상시킬 수 있는 유전자를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 서열목록 제3서열 또는 제4서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 바람직하게는 서열목록 제1서열 또는 제2사열의 뉴클레오타이드 서열이 상술한 식물체의 형질에 관여를 하고 이를 식물체에 형질전환시킨 경우에는 상술한 개선된 형질을 갖는 형질전환 식물체를 수득할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 비생물학적 스트레스 내성이 증진된 식물세포 및 식물체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 비생물학적 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 식물체의 발아 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제3서열, 제4서열 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 억제하는 핵산분자를 포함하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 식물체의 비생물학적 스트레스 저항성을 향상시킬 수 있는 유전자를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 서열목록 제3서열 또는 제4서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 바람직하게는 서열목록 제1서열 또는 제2사열의 뉴클레오타이드 서열이 상술한 식물체의 형질에 관여를 하고 이들 유전자의 발현을 억제할 경우 상술한 개선된 형질을 갖는 형질전환 식물체를 수득할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따르면, 서열목록 제1서열 및 제2서열의 뉴클레오타이드 서열은 각각 At1g10560 유전자 및 At1g60190 유전자의 뉴클레오타이드 서열이다.
본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 첨부한 서열목록에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.
뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 비생물학적 스트레스는 건조 스트레스, 저온 스트레스 및 염 스트레스로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명에 따르면, 본 발명자들은 식물체에 건조, 저온 또는 염 스트레스를 가할 경우 At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 발현이 증가하며, 상기 유전자의 발현을 억제시킬 경우 이러한 스트레스들에 대한 내성이 증가함을 확인하였다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산분자는 T-DNA, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 핵산분자는 T-DNA이다.
본 명세서에서 용어 “siRNA”는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.
siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음)등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 가장 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기 , 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 타겟 유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.
본 명세서에서 용어 “shRNA”는 단일 가닥으로 50-70개로 구성된 뉴클레오타이드를 의미하며, in vivo상에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루고 있다. 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19-29개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성한다.
본 명세서에서 용어 “miRNA(microRNA)”는 유전자 발현을 조절하며, 전장 20-50개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 20-45개 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 20-40개 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 20-30개 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 21-23개의 뉴클레오타이드로 구성된 단일 가닥 RNA분자를 의미한다. miRNA는 세포내에서 발현되지 않는 올리고뉴클레오타이드이며, 짧은 스템-루프 구조를 가진다. miRNA는 1 또는 2이상의 mRNA(messenger RNA)와 전체 또는 부분적으로 상동성을 가지며, 상기 mRNA와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제시킨다.
본 명세서에서 용어 “리보자임(ribozyme)”은 RNA의 일종으로 특정한 RNA의 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA 분자를 의미한다. 리보자임은 타겟 전령 RNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 되어 있다.
본 명세서에서 용어 “PNA(Peptide nucleic acid)”는 핵산과 단백질의 성질을 모두 가지고 있는 분자로서, DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합이 가능한 분자를 의미한다. PNA는 핵산염기(nucleobase)가 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1999년에 처음 보고되었다(문헌 [Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O, "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide", Science 1991, Vol. 254: pp1497-1500]). PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 펩티드 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이며, 이 경우 펩티드 핵산의 기본골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산염기는 공간적 크기와 핵산염기 사이의 거리가 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소(nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다.
본 명세서에서 용어 “안티센스 올리고뉴클레오타이드”이란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 오타이드 본 발명의 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 타겟 유전자의 mRNA에 상보적이고 타겟 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고 타겟 유전자의 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(trans의 cation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 10 내 40 염기이다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol ., 5(3):343-55, 1995). 올리고뉴클레오타이드 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸 피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다.
본 명세서에서 용어“T-DNA”는 Agrobacterium 종의 Ti(tumor-inducing) 플라스미드의 전달(transfer) DNA로서 숙주 식물세포의 핵으로 전달되는 DNA 절편을 말한다. T-DNA의 양 끝 가장자리에는 25 bp의 반복서열이 존재하며, 전달은 왼쪽 경계(border)에서 전달이 시작되어 오른쪽 경계에서 종료된다. 박테리아 T-DNA는 약 20,000 bp 길이로서 이들의 삽입에 의하여 타겟 유전자를 붕괴시킴으로서 삽입 돌연변이(insertional mutagenesis)를 일으키는 데에 사용되며, 삽입된 T-DNA 서열은 돌연변이를 일으킬 뿐 아니라 타겟 유전자를 표지하기도 한다. 본 발명에 따르면, 본 발명자들은 Ti 플라스미드의 형질도입을 통하여 Atlg10560 및 Atlg60190 유전자가 발현 억제된 애기장대의 종자(종자번호: Atlg10560 - salk_001831, Atlg60190 - salk_058791)를 SIGNAL Salk Institute Genomuc Analysis Laboratory (http://signal.salk.edu/)에서 구입하였다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 상술한 조성물로 형질전환된 비생물학적 스트레스 내성이 증진된 식물세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 상술한 조성물로 형질전환된 비생물학적 스트레스 내성이 증진된 식물체를 제공한다.
본 발명의 형질전환 식물세포 및 형질전환 식물체를 제조하기 위하여 당업계에 일반적으로 공지된 방법(Methods of Enzymology, Vol. 153, (1987))에 따라 실시될 수 있다. 외래성 폴리뉴클레오티드를 플라스미드나 바이러스 등과 같은 벡터 등의 운반체에 삽입하여 식물을 형질전환시킬 수 있고, 아그로박테리움 박테리아를 매개체로 사용할 수 있으며(Chilton et ai. Cell 11:263:271(1977)), 직접 외래성 폴리뉴클레오티드를 식물 세포내로 도입시켜 식물을 형질전환시킬 수 있다(Lorz et ai. Mol . Genet . 199:178-182;(1985)). 예를 들어, T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는 전기천공법(electroporation), 입자충격법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake)을 이용할 수 있다.
일반적으로 식물을 형질전환시킴에 있어 많이 사용되는 것이 외래성 폴리뉴클레오티드로 형질전환 된 아그로박테리움 투메페이시언스(Agrobacterium tumefaciens)로 식물 세포나 종자 등을 감염시키는 방법이다(참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호). 당업자는 공지된 적절한 조건하에서 형질전환된 식물 세포나 종자를 배양 또는 재배하여 식물로 발육시킬 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “식물(체)”는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.
본 발명의 방법이 적용될 수 있는 식물체는 특별하게 제한되지 않는다. 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 식물로는 상치, 배추, 감자 및 무를 포함하는 대부분의 쌍자엽 식물(dicotyledonous plant) 또는 벼, 보리, 바나나 등의 단자엽 식물 (monocotyledonous plant)을 모두 이용될 수 있으며, 특히 토마토와 같이 과피가 얇아 노화에 따른 품질 저하가 급격히 나타나는 식용 채소 또는 과일 그리고 잎이 주된 상품으로 거래되는 식물 등에 적용할 경우 저장 효율을 높이는 데 효과적이다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택되는 식물체에 적용된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 비생물학적 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체를 제조하는 방법을 제공한다:
(a) 본 발명에서 개시하는 상기 조성물을 식물 세포에 도입시키는 단계; 및
(b) 상기 식물세포로부터 비생물학적 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체를 수득하는 단계.
식물발현용 재조합 벡터를 식물세포에 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시될 수 있다.
형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제(예: 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다. 예시적인 표지는, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자, 글리코포스페이트 내성 유전자 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptII) 시스템을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 식물 원형질 또는 다양한 익스플랜드로부터 식물체의 발달 또는 재분화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다(참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 비생물학적 스트레스는 건조 스트레스, 저온 스트레스 및 염 스트레스로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제3서열, 제4서열 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물체의 발아 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제4서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.
본 발명에 따르면, 서열목록 제1서열 및 제2서열의 뉴클레오타이드 서열은 각각 At1g10560 유전자 및 At1g60190 유전자의 뉴클레오타이드 서열이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 과다발현시킬 억제할 경우, 미숙발아를 억제하는 ABA 호르몬에 대한 민감성이 감소되면서 발아율이 증가된 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 본 발명에서 개시하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 발아 촉진용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.
본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al. Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있다.
본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열은 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (NOS 3' end) (Bevan et al. Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터 및 OCS 터미네이터(octopine synthase terminator)서열을 포함한다. 가장 바람직하게는 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-말단 폴리 A 시그널 서열은 NOS 서열이다.
선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 (예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (npt Ⅱ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt), 등)를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 식물발현용 재조합벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium) 바이너리 벡터이다.
본 명세서에서 용어“바이너리 벡터”는 Ti(tumor inducible) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB(left border)와 RB(right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 두 개로 나누어 놓은 벡터를 말한다. 본 발명의 형질전환용 아그로박테리움은 본 발명의 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고, 특히 본 발명에서 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)GV3101이 바람직하다.
본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움에 도입하는 방법은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있으며, 예를 들면 입자 충격법(particle bombardment), 전기천공법(electroporation), 형질감염법(transfection), 리튬아세테이트법(lithium acetate method) 및 열충격법(heat shock) 등이 있다. 바람직하게는 전기천공법을 사용한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 식물체의 비생물학적 스트레스 저항성 증진용 조성물, 상기 조성물이 도입된 형질전환 식물체, 상기 형질전환 식물체의 제조방법 및 식물체의 비생물학적 스트레스 저항성 증진 방법 및 식물체의 발아 촉진용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 건조, 저온 또는 염 등의 비생물학적 스트레스에 대한 내성이 탁월하거나 또는 속성재배가 가능한 신기능 식물체로서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 At1g10560 및 At1g60190 유전자의 구조와 단백질 상동성을 분석한 그림이다. 애기장대에 존재하는 UBOX 유전자 패밀리에 해당하는 61개의 유전자 중에서, 인 실리코 데이터의 분석 결과 ABA와 각종 비생물학학적 스트레스에 대해서 내성을 가질 것으로 예상되는 상동성(homology)이 가장 높은 두개의 유전자를 선택하여 연구를 시작하였다. 도 1 a에서 볼 수 있듯이, 이 두 유전자는 각각 At1g10560과 At1g60190이며 모두 UBOX 도메인과 ARM repeat이 존재하는 특징을 가진다. 도 1b에서 확인할 수 있듯이 UBOX 도메인은 76% 의 유사성을 가지며 총 약 67%의 단백질 서열의 상동성을 가지고 있다. 이러한 단백질 서열의 상동성은 두 유전자가 상호 보완적인 기능을 할 가능성이 있음을 보여준다.
도 2는 각종 비생물학적 스트레스와 ABA 호르몬 처리시 At1g10560 및 At1g60190 유전자의 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 그림이다. 상술한 바 대로, At1g10560과 At1g60190은 식물의 스트레스 반응에 중요한 작용을 하는 식물호르몬인 ABA(abscisic acid)에 의해서 유도될 것이라고 예상되었다. ABA를 처리시 At1g10560 mRNA와 At1g60190 mRNA 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있다(도 2a). 또한 mRNA의 발현 정도는 At1g60190 유전자가 At1g10560 유전자보다 상대적으로 높은 것을 확인할 수 있다. 건조, 저온 및 염 처리를 함으로써 이러한 각종 비생물학적 스트레스에 대한 상기 유전자들의 발현 정도를 분석하였다(도 2b). 그 결과 건조, 저온 및 염에 의해서 두 유전자 모두 정도의 차이는 있으나 mRNA 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 ABA처리에 의한 mRNA 발현 패턴과 동일하게 At1g60190 유전자가 At1g10560 유전자보다 더 강한 유도성(inducibility)을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 이는 두 유전자가 만일 상호 보완적인 기능을 가지고 있다면 아마도 At1g60190 유전자가 At1g10560 유전자보다 더 주된 인자로 작용할 가능성이 있음을 시사한다.
도 3은 조직염색화학 GUS 분석을 통한 At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 프로모터 활성 분석 결과를 나타낸 그림이다. ABA를 처리하거나 건조 스트레스를 주었을 경우 At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 프로모터 활성이 모두 증가하는 것을 확인할 수 있다. 건조 스트레스의 경우에는 새로 나는 어린 잎에서의 활성이 높은 것을 확인할 수 있는 반면 ABA를 처리한 경우 상대적으로 잎 전반에 걸쳐 발현이 되는 차이점이 있으나, 두 처리구에서 공통적으로 프로모터 활성이 관찰되었다. 이는 At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자가 건조 스트레스 상황에서 공변세포의 조절을 통해 식물체내 수분의 조절로 스트레스 저항성과 같은 반응에 연관될 가능성을 강하게 뒷받침해준다.
도 4는 At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 이중 녹-아웃(double Knock-out) 돌연변이체와 각각의 과다발현 식물체의 유전자 발현양상을 나타낸 그림이다.
도 5는 At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 녹-아웃 돌연변이체와 과다발현 식물체 및 야생종에 건조 스트레스를 준 후 그 표현형의 차이를 관찰한 결과를 나타낸 그림이다. 도 5a는 애기장대 야생종과 At1g10560 유전자 및 At1g60190 유전자의 녹-아웃 돌연변이체, 그리고 이를 교배하여 얻어진 이중 녹-아웃 돌연변이체를 약 3주간 키운 후 12일 동안 물을 주지 않고 건조 스트레스를 주고 다시 물을 준 후 3일 뒤의 사진이며, 3일 후와 10일 후의 생존 비율을 나타낸 그래프이다. 이 실험의 결과 각각의 유전자가 기능을 상실할 경우 건조 저항성이 증가하였으며, 두 유전자의 기능이 모두 사라진 이중 녹-아웃 돌연변이체에서 저항성이 더욱 크게 증가하였다.
도 5b는 At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 발현이 이중 녹-아웃 돌연변이체와 과다발현 식물체 야생종에서, 뿌리를 지상부와 지상부로의 시간이 지나면서 수분의 손실에 따른 질량의 감소를 그래프로 나타낸 것이다. 도 5a의 결과와 동일하게 이중 녹-아웃 돌연변이체는 야생종에 비해 상대적으로 수분 손실에 따른 질량의 감소 폭이 적으나 과다발현체의 경우 그 폭이 큰 것을 알 수 있다.
도 6은 At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 녹-아웃 돌연변이체와 과다발현체의 ABA 처리 하에서의 공변세포 표현형 분석 결과를 나타낸 그림이다.
녹-아웃 돌연변이체의 경우 야생종에 비해서 기공이 더 많이 닫히는 것을 알 수 있으며 과다발현체의 경우 야생종에 비하여 기공의 닫히는 정도가 덜한 것을 알 수 있다.
도 7은 At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 녹-아웃 돌연변이체와 과다발현체의 발아율을 분석한 결과를 나타낸 그림이다. 상기 유전자의 녹-아웃 돌연변이체는 그 발아율이 ABA에 의해서 야생종에 비해 상당히 낮아지게 되며, 과다발현 식물체는 야생종보다 그 발아 비율이 높아지는 것을 확인할 수 있다(도 7a). 도 7b는 At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 과다발현 식물체를 ABA가 함유되지 않은 기본 발아 배지에서 심은 후 2일 그리고 3일 후의 사진이다. 돌연변이체의 경우는 야생종과 큰 차이가 없지만 상대적으로 과다발현체의 경우는 기본 배지에서도 그 발아율과 초기 생장이 빨라지는 것을 확인할 수 있다.
도 8은 At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 녹-아웃 돌연변이체를 이용한 고염 스트레스 하에서의 표현형 분석결과를 나타낸 그림이다. 관찰 결과 기본배지에서의 생장은 별 차이가 없으나, 120 mM의 NaCl이 포함된 경우 야생종보다 돌연변이 식물체들의 뿌리 생장이 약간 증가한 것을 확인할 수 있다. 또한 120 mM과 140mM NaCl이 각각 포함된 배지에서 야생종의 백화현상이 각각의 유전자가 기능을 상실한 돌연변이체보다 상대적으로 빠르게 나타난 것을 확인할 수 있다.
도 9는 At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 녹-아웃 돌연변이체를 이용한 저온 스트레스 하에서의 표현형 분석결과를 나타낸 그림이다. 각각의 유전자가 기능을 상실한 돌연변이체의 경우 뿌리와 지상부의 성장이 야생종에 비해 증가한 것을 통해 저온 저항성이 증가하였음을 확인할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법
유전자의 분리 획득
본 발명자들은 ABA 호르몬 및 비생물학적 스트레스에 의해서 유도되는 At1g10560 및 At1g60190 유전자를 애기장대의 게놈 DNA로부터 분리 획득하였다. 3주간 키운 야생형 애기장대의 잎을 액체 질소를 사용하여 갈아 파우더로 만든 다음 700 μl/66 mg 의 추출 완충액(2% CTAB, 100 mM Tris pH8.0, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl 및 1% PVP40)을 혼합한 후 65℃에서 10분간 배양해줌으로써 추출하였다. 그 다음 570 μl의 CI(클로로포름 : 이소아밀알콜 = 24 : 1)를 넣고 혼합하여 5분간 흔들어 준다. 그리고 13,000 rpm에서 10분간 원심분리(eppendorf, 5415D)하였다. 원심분리 후 상층의 수용액 300 μl를 새로운 EP(eppendorf) tube에 옮긴 후 100% 에탄올을 700 μl 첨가하여 게놈 DNA를 침전시키고, 70% 에탄올을 이용하여 세척 과정을 거쳐 최종적으로 게놈 DNA를 분리하였다. 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하여 두 종류의 프라이머를 각각 10 pmole 씩, 10 x Taq 폴리머라제 완충용액(Takara) 5 ㎕, dNTP 혼합액(각 1.25 mM) 8 ㎕ 및 1 유닛의 Taq DNA 폴리머라제(Takara)를 넣어 총 부피를 50 ㎕ 로 만들었다. biorad C-1000 DNA 써멀 사이클러로 PCR을 수행하였다. 사용한 프라이머는 5'-CCGCTCGAGCATGATCCATACACCAACCGG-3'(Atlg10560 ORF FW), 5'-CCGCTCGAGTCACCAGGCGTGGACAA-3'(Atlg10560 ORF RV),5'-CCGCTCGAGCATGATCCATACGAAAACCGG-3'(Atlg60190 ORF FW), 5'-CCGCTCGAGTCACCAGGCGTGAACGA-3'(Atlg60190 ORF RV)이다. 먼저 94℃에서 2분간 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초 및 72℃에서 2분을 반복하는 것을 27회 수행하였고, 27회 반복이 끝난 후 72℃에서 5분간 추가로 중합반응을 수행한 다음 전기영동 방법을 이용하여 Atlg10560 유전자와 Atlg60190 유전자의 증폭을 확인하였고, 이 DNA를 시퀀싱하여 다시 한번 확인하였다.
식물 성장조건 및 시료 채취
AtAIRP1 유전자의 과다발현 형질전환체 제작을 위하여 Invitrogen gateway 시스템을 이용하여 컨스트럭트를 제작하였다. 먼저 pENTR SD Topo 벡터(Invitrogen, USA)에 Atlg10560 유전자와 Atlg60190 유전자를 넣어준 후, LR 클로네이즈 효소(Invitrogen)를 이용하여 식물체의 pBI121벡터(Arabidopsis research center, USA)에 치환시켰다. Atlg10560 유전자와 Atlg60190 유전자의 발현억제 돌연변이 식물체는 Atlg10560 유전자와 Atlg60190 유전자에 T-DNA가 삽입된 돌연변이 애기장대의 종자(종자번호: Atlg10560 - salk_001831, Atlg60190 - salk_058791)를 SIGNAL Salk Institute Genomuc Analysis Laboratory (http://signal.salk.edu/)에서 구입하였다.
그 다음 Atlg10560 유전자와 Atlg60190 유전자가 동시에 기능을 상실하는 이중 녹-아웃 돌연변이 식물체 제작을 위해 Atlg10560 동형접합 돌연변이 식물체와 Atlg60190 동형접합 돌연변이 식물체를 인공적으로 타가수정을 시켜 F1 세대의 종자를 확보하였다. Atlg10560 유전자와 Atlg60190 유전자가 각각 모두 이형접합 돌연변이인 F1 식물체에서 자가 수분을 통해 한 세대를 거침으로써 F2 세대에서 Atlg10560 유전자와 Atlg60190 유전자가 동시에 기능을 상실한 아중 녹-아웃 동형접합 돌연변이 식물체를 제작하였다.
이러한 Atlg10560 유전자와 Atlg60190 유전자의 과다발현 형질전환 식물체 그리고 각각의 유전자가 파괴된 돌연변이체 및 야생형 애기장대 종자를 30% 락스(유한-크로락스)와 0.025%의 트리톤 X-100에 10분간 살균 처리한 후 물로 10회 이상 세척하였다. 처리된 종자는 1% 수크로스, B5 비타민 (12 mg/L), 0.8% 아가로 구성된 MS 배지(Duchdfa Biochemie)에 수직으로 심은 후 약 2주간 생장 챔버(16시간 광 조건/ 8시간 암 조건)에서 키운 식물을 재료로 하여 수행하였다. 광 조건의 전체 식물체(Green whole plant)를 재료로 사용한 경우는 종자를 Sunshine MIX #5 (Sun GroHorticulture) 흙을 넣어 준 화분에 심어서 약 3주간 생장 챔버(16시간 광 조건/8시간 암 조건)에서 성장시킨 식물을 재료로 하여 수행하였다.
스트레스(염, 저온, 건조) 처리
At1g10560과 At1g60190은 식물의 스트레스 반응에 중요한 작용을 하는 식물 호르몬인 ABA(abscisic acid)에 의해서 유도될 것이라고 예상되었다. ABA는 식물에 특이적으로 존재하는 호르몬으로서 각종 스트레스, 특히 비생물학적에 의해서 생성되며 동시에 스트레스에 대한 식물체의 반응을 매개하는 중요한 기능을 담당하고 있다. 따라서 At1g10560과 At1g60190이 ABA에 의해 발현이 유도될 가능성이 있다는 것은 각종 비생물학적 스트레스에 대한 식물체의 반응에 이 두 유전자가 연관 될 가능성 또한 가진다는 것을 의미한다. 이러한 가능성을 확인하기 위해서 애기장대에 ABA 뿐만 아니라 각종 비생물학적 스트레스를 처리한 후 반정량적 RT-PCR을 통하여 At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 발현 정도를 분석하였다.
스트레스에 대한 Atlg10560 유전자와 Atlg60190 유전자의 발현을 확인하기 위해, 건조 스트레스는 배지에서 2주간 키운 야생형 애기장대 유묘를 공기 중에 노출한 후 1시간 및 2시간 후에 샘플링하였다. 염 스트레스는 2주간 키운 애기장대에 300 mM의 염화나트륨을 처리한 후 1시간 및 2시간이 경과한 후 샘플링하였다. 저온 스트레스는 배지에서 2주간 키운 애기장대 유묘를 4℃가 유지되는 인큐베이터에서 6시간, 12시간 동안 배양하고 조직을 샘플링하였다. ABA 호르몬 처리는 2주간 키운 애기장대 유묘를 100 μM의 ABA(SIGMA)를 처리한 후 1.5시간 및 3시간이 경과한 후 샘플링 하였다. 샘플링 된 조직을 액체 질소를 사용하여 막자 사발에서 갈아 가루로 만든 다음 2 ml/g의 추출 완충액(4 M 구아니딘-HCl 20 mM, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA(USB), 0.5% 사르코실(SIGMA), pH 9)과 β-머캅토에탄올(SIGMA-ALDRICH)을 이용하여 추출한 후 코니칼 튜브로 옮긴 다음 이를 동량의 PCI(페놀 : 클로로포름 : 이소아밀알콜 = 25 : 24 : 1)와 혼합하여 5분간 흔들어 준 다음 3,500 rpm에서 25분간 원심분리(한일 원심분리기, HA-1000-3)하였다. 원심분리 후 상층의 유기 용매층을 제거하고, 동량의 PCI를 혼합하여 흔든 다음 원심분리하는 과정을 2회 반복하여 수행하고, 이때 형성된 아래의 수용액 층을 2회 에탄올 침전 및 1회 LiCl 침전 방법을 사용하여 RNA를 분리하였다.
정량적 역전사효소(RT)-PCR
발현억제 돌연변이 식물체 및 과발현 형질전환 식물체와 야생종의 잎으로부터 전체 RNA를 추출하여 올리고 dT 프라이머와 MMLV 역전사효소(Fermentas)를 이용하여 단일가닥 cDNA를 합성하였다. PCR 수행을 위해 주형으로 20 ng의 cDNA를 사용하였으며 두 종류의 프라이머를 각각 10 pmole 씩, 10 x Taq 폴리머라제 완충용액(Intron) 5 ㎕, dNTP 혼합액(각 1.25 mM) 8 ㎕ 및 1 유닛의 Taq DNA 폴리머라제(intron)를 넣어 총 부피를 50 ㎕ 로 만들었다. BIORAD C-1000 DNA 써멀 사이클러로 PCR을 수행하였다. 먼저 94℃에서 2분간 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 72℃에서 1분을 반복하는 것을 25회 수행하였고, 25회 반복이 끝난 후 72℃에서 5분간 추가로 중합반응을 수행한 다음 -20℃에 냉동 보관하였다. 사용된 유전자의 프라이머는 아래의 표 1과 같다.
RT-PCR에 사용된 유전자의 프라이머
프라이머 서열
Atlg10560 FW 5'- CATGATGATGAACTCGGATCA -3'
Atlg10560 RV 5'- CATCTAACCGTTCTGCATCTATC -3'
Atlg60190 FW 5'- GCGATTCGGAGTTTGTTAATG -3'
Atlg60190 RV 5'- AACACTCAACAACACGTGCAG -3'
Rab18 FW 5'- GCGTCTTACCAGAACCGTCC -3'
Rab18 RV 5'-CCCTTCTTCTCGTGGTGC -3'
RD29a FW 5'- CAGGTGAATCAGGAGTTGTT -3'
RD29a RV 5'- CCGGAAATTTATCCTCTTCT -3'
UBC10 FW 5'- TGGATATGGCGTCGAAGC -3'
UBC10 RV 5'- GTGGGATTTTCCATTTAGCC -3'
T- DNA 가 삽입된 돌연변이체의 지놈 DNA 추출 및 동형접합 돌연변이체 획득
야생형 및 발현억제 돌연변이 애기장대의 종자를 흙에 심어 2주 동안 키운 뒤 각각의 잎을 샘플링한 후 액체질소를 이용하여 간 후 700 μl/66mg 의 추출 완충액(2% CTAB, 100 mM Tris pH8.0, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 1% PVP40)을 혼합한 후 65℃에서 10분간 배양해줌으로써 추출하였다. 그 다음 570 μl의 CI(클로로포름 : 이소아밀알콜 = 24 : 1)를 넣고 혼합하여 5분간 흔들어 주었다. 그리고 13,000 rpm에서 10분간 원심분리(eppendorf, 5425R)하였다. 원심분리 후 상층의 수용액 300 μl를 새로운 EP tube에 옮긴 후 100% 에탄올을 700 μl 첨가하여 게놈 DNA를 분리 하고, 70% 에탄올을 이용하여 세척과정을 거쳐 최종적으로 게놈 DNA를 분리한 후 3차 DW에 녹여서 사용하였다. 이후 T-DNA 보더 프라이머(boder primer)(LBa1)와 T-DNA가 삽입된 부위의 앞, 뒤 부분의 프라이머를 이용하여 지노타이핑 PCR을 진행하였다.
지노타이핑 PCR에 사용된 프라이머
프라이머 서열
Atlg10560 sen 5'- CTTGATCTGTTGAGATCGGG
Atlg10560 anti 5'- TGTCTTAAAAAGATTAAAACGACG
Atlg60190 sen 5'- GCGATTCGGAGTTTGTTAATG
Atlg60190 anti 5'- AACACTCAACAACACGTGCAG
LBa1 boder primer 5'- TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG -3'
Atlg10560 유전자와 Atlg60190 유전자의 벡터 구축물의 제조
말토오즈에 결합하는 단백질과 AtAIRP1을 융합시켜 발현시킬 플라스미드를 재조합하기 위해 Atlg10560 유전자와 Atlg60190 유전자의 코딩 부분의 5' 과 3'쪽에 각각 PstI 과 HindⅢ 제한효소에 해당하는 서열을 연결한 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 결과물과 pMAL-X 벡터(New England Biolabs, Beverly,MA)를 각각 PstI 과 HindⅢ 제한효소로 자른 다음 T4 DNA 리가아제(New England Bio Lab) 효소를 이용하여 라이게이션(ligation) 하였다. 재조합된 MBP-Atlg10560 과 MBP-Atlg60190을 대장균 BL21-CodonPlus(DE3) RIL(스트라테이진)에 발현시킨 후, 아밀로즈 컬럼 크로마토그래피를 이용해 정제하였다. 단백질은 표준 단백질로 BSA를 이용해 정량하였다. 또한, 본 발명에서는 형질전환체 제작을 위하여 Invitrogen gateway 시스템을 이용하여 컨스트럭션을 하였다. 먼저 pENTR SD topo 벡터(Invitrogen, USA)에 Atlg10560 ORF 와 Atlg60190 ORF를 넣어준 후, LR 클로네이즈 효소(Invitrogen)를 이용하여 식물체의 pBI121 벡터에 치환시켰다. 마지막으로 프로모터 활성 측정을 위한 형질전환체를 제작하였다. 먼저 Atlg10560 유전자와 Atlg60190 유전자의 프로모터 부위를 PCR을 이용하여 클로닝을 하였으며 모두 PstI 제한효소 서열을 이용하여 pCAMBIA1381 벡터에 삽입하였다.
아그로박테리움으로 AtAIRP1 형질전환 및 형질전환 애기장대 식물체의 제조
제작된 구축물은 아그로박테리움(GV3101)에 전기천공법을 이용하여 형질전환 하였으며 유전자의 존재 유무는 PCR을 이용하여 확인하였다. 약 4 주된 애기장대(columbia [Col-0])의 지상 부위를 0.05% 실웨트가 포함된 MS 배지(Duchefa Biochemie)에 1분 30초간 담구는 방법으로 형질전환 시켰다(clough and Bent, 1998, Plant J 16; 735-743). 3주간 23℃의 생장 챔버에서 배양하고, 종자를 받은 후(T1), 25 ㎍/㎖ 의 카나마이신과 250 ㎍/㎖의 카르베니실린이 포함된 배지에서 살아남는 개체들을 골라 형질전환 유전자의 존재 여부를 RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 통해 검증하였다.
식물체 생장 비교
발아의 조절은 식물체의 스트레스 반응 조절과 함께 식물호르몬 ABA가 가진 중요한 기능 중의 하나로, 발아에 적합하지 않은 환경에 처했을 경우 발아시기를 지연시키는 것을 포함한다.
ABA 호르몬에 대한 표현형을 비교하기 위해서 야생형, Atlg10560 유전자와 Atlg60190 유전자의 발현억제 돌연변이 식물체, Atlg10560 유전자와 Atlg60190 유전자의 과다발현 식물체에서 얻어진 종자를 ABA 호르몬이 0, 0.5, 1 및 1.5 μM 로 첨가된 배지에서 5일 동안 키운 후 발아된 정도를 비교하였다. 또한 식물의 성장을 비교하기 위해서 0, 0.5, 1 및 1.5 μM 로 첨가된 배지에서 10일 동안 키운 후 유묘의 생장 차이를 비교하였다.
성체 식물의 건조 스트레스에 대한 민감도 측정
야생형 및 Atlg10560 유전자와 Atlg60190 유전자의 발현억제 돌연변이 식물체, 과다발현 식물체의 종자를 흙에서 2주 동안 키운 뒤, 각각 10일 또는 12일 동안 물을 주지 않다가 다시 물을 준 후 건조 스트레스에 내성을 갖는 정도를 생존률 측정 및 질량 변화 측정을 통하여 검사하였다.
성체 식물의 고염 스트레스에 대한 민감도 측정
애기장대 야생종과 At1g10560 유전자 및 At1g60190 유전자의 녹-아웃 돌연변이체 및 이를 교배하여 얻어진 이중 녹-아웃(double knock-out) 돌연변이체를 1주간 키운 후 기본배지와 각각 120 mM과 140 mM 의 NaCl이 함유되어있는 염분 배지에 옮겨 고염 스트레스를 가하였다. 이후 1주일간 빛 조건에서 키운 후 뿌리 길이 생장과 지상부의 백화현상을 통해 고염 스트레스에 내성을 갖는 정도를 측정하였다.
성체 식물의 저온 스트레스에 대한 민감도 측정
야생형 및 Atlg10560 유전자와 Atlg60190 유전자의 발현억제 돌연변이 식물체, 과다발현 식물체의 종자를 기본배지에서 1주 동안 키운 뒤, 4℃로 7일 동안 순화처리를 하였다. 이후 -20℃ 에서 15분간 처리한 다음 빛 조건 배양실에서 7일간 키운 후 뿌리길이와 지상부의 생장 정도를 통해 저온 스트레스에 대한 내성 정도를 측정하였다.
기공개폐( stomatal aperture ) 측정
식물 호르몬 ABA에 의해 매개되는 식물의 반응성은 내부 신호전달 체계를 통한 관련 유전자군의 발현 유도 뿐만 아니라 직접적인 기공 개폐 조절을 통해서도 나타나게 된다. 일반적으로 스트레스 반응 호르몬인 ABA는 기공을 닫는 방향으로 조절한다는 것이 이미 많은 부분 밝혀져 있다.
5주 동안 흙에서 키운 야생형 및 Atlg10560 유전자와 Atlg60190 유전자의 발현억제 돌연변이 식물체, 과다발현 식물체의 잎을 딴 후 기공 개방 용액(10mM MES-KOH, 50mM CaCl2, 10 mM KCl)에 2시간 동안 담근 후 기공이 모두 열리면 농도별로 ABA호르몬이 첨가된 개방 용액으로 옮겨 2시간 동안 담궈 놓았다. 이후 광학 현미경을 통하여 기공개폐의 정도를 측정하였다.
GUS 분석을 통한 프로모터 활성 측정
모든 유전자는 정확한 시간적, 공간적 조절을 필요로 한다. 이러한 유전자의 조절은 해당 유전자의 프로모터에 의해서 이루어지므로 프로모터의 활성을 측정하면 해당 유전자가 발현되는 시기와 상황 그리고 조직까지도 분석이 가능하다. 이러한 프로모터 분석을 위해 At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 프로모터 지역을 pCAMBIA1381 벡터에 넣고 아그로 박테리움 . pCAMBIA 벡터의 구조를 통해 프로모터가 활성화 되는 경우 β-글루쿠로니다제 단백질이 발현이 되며, X-Gluc이 기질로 제공이 되면 β-글루쿠로니다제 단백질이 발현된 부위가 파랗게 변색됨으로써 프로모터 활성 양상을 분석할 수 있게 된다.
pCAMBIA1381 벡터에 Atlg10560 프로모터 부위와 Atlg60190 프로모터 부위가 각각 삽입되어있는 벡터 구축물을 제작하였으며, 아그로박테리움의 전기천공법을 이용하여 형질전환 식물체를 제작하였다. 이러한 형질전환 식물체는 프로모터가 활성을 가지게 되면 식물체내에 β-글루큐로니데이즈라는 효소를 합성하게 된다. 본 실험자는 Atlg10560 유전자와 Atlg60190 유전자의 프로모터 활성을 측정하기 위하여 각각의 형질전환체에 ABA 100 μM 또는 탈수 처리를 하여 프로모터가 활성화 되도록 하였다. 이와 같은 스트레스 처리를 한 형질전환 식물체를 100% 차가운 아세톤에 10분간 고정 시킨 후 린스 용액(50 mM NaPO4 (pH 7.2), 0.5 mM K3Fe(CN)6, 0.5 mM K4Fe(CN)6)을 이용하여 3회 이상 세척하였다. 그 후 염색 용액(50 mM NaPO4 (pH 7.2), 0.5 mM K3Fe(CN)6, 0.5 mM K4Fe(CN)6, 2mMX-Gluc)에 형질전환 식물체를 담궈준다. 약 1분간 진공 상태를 만들어 솔루션이 식물체 내에 흡수될 수 있도록 해준 후, 37℃ 암상태에서 15분간 배양하였다. 식물체 내에서 효소반응에 의해서 발색이 되면 100% 에탄올을 이용하여 식물체의 색소를 빼내어 발색이 선명하게 보이도록 하였다.
실험결과
ABA 및 스트레스(염, 저온, 건조) 처리에 따른 유전자 발현변화
애기장대에 ABA 및 각종 비생물학적 스트레스를 처리한 후 반정량적 RT-PCR을 통하여 At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 발현 정도를 분석하였다. ABA 를 처리하자 At1g10560 mRNA와 At1g60190 mRNA 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있다(도 2a). 또한 At1g60190 유전자의 mRNA가 At1g10560 유전자의 mRNA보다 상대적으로 높은 것을 확인할 수 있다. 아울러 건조, 냉해 및 염을 처리함으로써 이러한 각종 비생물학적 스트레스에 대한 이 유전자들의 발현 정도를 분석하였다(도 2b). 그 결과 건조, 냉해, 염에 의해서 두 유전자 모두 정도의 차이는 있으나 mRNA 발현량이 증가하였으며, ABA처리에 의한 mRNA발현 패턴과 동일하게 At1g60190 유전자가 At1g10560 유전자에 대해 더 강한 유도능을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 이는 두 유전자가 만일 상호 보완적인 기능을 가지고 있다면 아마도 At1g60190 유전자가 At1g10560 유전자보다 스트레스 저항성에 더 주된 역할을 작용할 가능성이 있음을 시사하고 있다.
성체 식물의 건조 스트레스에 대한 민감도 측정
At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 생체 내 기능 분석에 구체적으로 접근하기 위하여 앞서 제작한 녹-아웃 돌연변이체와 과다발현 식물체 그리고 야생종에 건조 스트레스를 준 후 그 표현형의 차이를 관찰하였다.
애기장대 야생종과 At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 녹-아웃 돌연변이체 그리고 이를 교배하여 얻어진 이중 녹-아웃 돌연변이체를 약 3주간 키운 후 12일 동안 물을 끊어 건조 스트레스를 주었다(도 5a). 그리고 다시 물을 준 후 3일 후의 사진이며, 3일 후와 10일 후의 생존 비율을 그래프로 나타내었다. 이 실험의 결과 각각의 유전자가 기능을 상실할 경우 건조 저항성이 증가하였으며, 두 유전자의 기능이 모두 사라진 이중 녹-아웃 돌연변이체에서 저항성이 더욱 크게 증가하였다.
At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 발현이 이중 넉-아웃 돌연변이체와 과다발현 식물체 야생종에서, 뿌리를 지상부와 지상부로의 시간이 지나면서 수분의 손실에 따른 질량의 감소를 측정한 결과, 도 5a의 결과와 일맥상통하게 이중 녹-아웃 돌연변이체는 야생종에 비해 상대적으로 수분 손실에 따른 질량의 감소 폭이 적으나 과다발현체의 경우 그 폭이 큰 것을 알 수 있다(도 5b).
성체 식물의 고염 스트레스에 대한 민감도 측정
애기장대 야생종과 At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 녹-아웃 돌연변이체 및 이를 교배하여 얻어진 이중 녹-아웃(double knock-out) 돌연변이체를 약 1주간 키운 후 기본배지와 NaCl이 함유되어있는 염분 배지에 옮겨 고염 스트레스를 준 결과, 기본배지에서의 생장은 별 차이가 없으나 120 mM의 NaCl이 포함된 경우 야생종보다 돌연변이 식물체들의 뿌리 생장이 약간 증가한 것을 확인할 수 있다. 또한 120 mM과 140mM NaCl이 각각 포함된 배지에서 야생종의 백화현상이 각각의 유전자가 기능을 상실한 돌연변이체보다 상대적으로 빠르게 나타난 것을 확인할 수 있다. 이로써 At1g10560 유전자 및 At1g60190 유전자에 의하여 높은 염분에 대한 저항성이 증가하였음을 알 수 있다.
성체 식물의 저온 스트레스에 대한 민감도 측정
애기장대 야생종과 At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 녹-아웃 돌연변이체 및 이중 녹-아웃(double knock-out) 돌연변이체를 대상으로 저온 스트레스에 대한 반응을 조사한 그 결과, 각각의 유전자가 기능을 상실한 돌연변이체의 경우 뿌리와 지상부의 성장이 야생종에 비해 증가하였다(도 9). 이를 통해 At1g10560 유전자 및 At1g60190 유전자에 의하여 저온 스트레스에 대한 저항성이 증가하였음을 확인할 수 있었다.
기공개폐( stomatal aperture ) 측정
At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 녹-아웃 돌연변이체와 과다발현 식물체 그리고 야생종에 ABA를 처리한 후 기공 관찰을 통해, 각각의 식물체들의 ABA에 대한 민감성을 측정하고 그 정도를 그래프로 나타내었다(도 6). 완전히 기공이 열리도록 개방 용액(opening solution)을 약 2시간 처리한 후 ABA를 처리했을 때, 녹-아웃 돌연변이체의 경우 야생종에 비해서 기공이 더 많이 닫히는 것을 알 수 있으며 과다발현체의 경우 반대로 야생종에 비해서 기공이 닫히는 정도가 덜한 것을 알 수 있다. 이는 녹-아웃 돌연변이체가 ABA에 대한 민감도가 높아졌음을 보여준다. 또한 ABA는 각종 비생물학적 스트레스에 의해서 생성되므로 녹-아웃 돌연변이체에서 ABA의 민감도가 높고 기공이 더 많이 닫히는 것은 건조 스트레스를 받았을 때 녹-아웃 돌연변이체에서 그 저항성이 높아지는 것과 일맥 상통하는 결과라고 볼 수 있다.
GUS assay 를 통한 프로모터 활성 측정
At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 프로모터 활성 양상을 분석한 결과, ABA를 처리하거나 건조 스트레스를 주었을 경우 At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 프로모터 활성이 모두 증가하는 것을 확인할 수 있다(도 3). 건조 스트레스의 경우에는 새로 나는 어린 잎에서의 활성이 높은 것을 확인할 수 있는 반면 ABA를 처리한 경우 상대적으로 잎 전반에 걸쳐 발현이 되는 차이점이 있으나 두 처리구에서 공통적으로 프로모터 활성이 관찰되었다. 이는 At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자가 건조 스트레스 상황에서 공변세포의 조절을 통해 식물체내 수분의 조절로 스트레스 저항성과 같은 반응에 연관될 가능성을 강하게 뒷받침해준다.
식물체 생장 비교
At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 녹-아웃 돌연변이체와 과다발현 식물체 그리고 야생종에 ABA를 처리한 후 그 발아율을 측정하였다(도 7a). 도 6에서 보았듯이, 녹-아웃 돌연변이체는 ABA에 민감한 성질을 가지고 있다. 상기 결과와 일맥상통하게 유전자의 녹-아웃 돌연변이체는 그 발아율이 ABA에 의해서 야생종에 비해 상당히 낮아지게 되며, 과다발현 식물체는 야생종보다 그 발아 비율이 높아지는 것을 확인할 수 있다. At1g10560 유전자와 At1g60190 유전자의 과다발현 식물체를 ABA가 함유되지 않은 기본 발아 배지에서 심은 후 2일 및 3일 간 성장시켰다(도 7b). 그 결과 돌연변이체의 경우는 큰 야생종과 큰 차이가 없지만 상대적으로 과다발현체의 경우는 기본 배지에서도 그 발아율과 초기 생장이 빨라지는 것을 확인할 수 있다. 이는 시험관을 이용한 공업적 대량 생산기술과 접목될 경우 바이오 매스로의 응용 또한 가능한 표현형으로 분석이 된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Industry-Academic cooperation foundation Yonsei University <120> Genes Related to ABA Mediated Abiotic Stress Resistance and Transformed Plants with the Same <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2094 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atgatccata cgaaaaccgg gtctggtcgt cggatcttga catttccgac tgtggaacca 60 tccgaatcaa tctccatagt caccctattg gactcactga ttcaactcgc cggcgacatt 120 ctcacattca agtcgaaaca cttctctacc aataaacaaa gcttcagaga aactctcagg 180 cggatccaaa acctacttgt tgtcttcgaa gagattcgga tccggatcag aaattcgaga 240 cgctacttcc atgactctgc cgccgcgtcg agcctcaagg agatccacgt cggcttccaa 300 aagctcaagt tccttctaga agactgcacg agagacggag ctagactatg catgatgatg 360 aactcggatc aagtctcgga tcatctccgg gtcctgactc gatccatttc caccagtctt 420 agtgcgtttc ctgtcgcctc cgttgactta acgaccgaag tcaacgagct aattgattta 480 gtggtgcggc aagctcgtaa gtacggagtc caacctgaaa caaatgataa acgggccgtg 540 agctccatta ataggatcct tgctctgttt gtgaacagag tcgtcccgga tccggatgaa 600 attaacagga tcttggatca cgtagggatc agaaaatggg gagattgcgt taaagagata 660 aactttctcg gagaagagat agatgcagaa cggttagatg agaagaagaa gaagagtagc 720 gatcaagtcg agcttctcag tagtttaatg ggattcatat gttattgcag atgcattata 780 cttggacgga tcgagagaga tgatcatcat aatcatcatg aagatggtat aaagaaagat 840 catgacttga tccgaggatt gaaagttgag gatctccttt gtccaatttc actagagatt 900 atgacggatc ctgtggttat agaaacaggc cacacttatg atcggagctc catcactaaa 960 tggttcggat ccgggaacat cacgtgccct ataaccggaa agattctgac tagtaccgag 1020 ttggttgata acgtatccgt gaggcaagtg attcgaaagc actgcaaaac aaacggcatc 1080 gttttggcgg ggattagtcg gagaagaaag agtcacgatg acgtggtccc ggagagtttg 1140 gctgcaaagg gagctgggaa actcatcgca aagtttctca cttcagagtt aatcaatggc 1200 ggtgaagaga tgatttacag agccgtgaga gagattcgtg ttcagaccaa gacaagcagt 1260 tttaataggt cttgtctggt taaagctggt gctgtgactc cacttttaaa gcttcttagc 1320 tccgtagata tcaggattca agaaaacgca atggctggga tcttgaatct ttccaagcac 1380 gttaccggaa aatctaagat tgcgggagaa gggttaaaga tacttgtaga gattctcaac 1440 gaaggagcta aaacagagac gagactatac tctgcttctg ctctgtttta tctctcttcc 1500 gttgaagatt acagcagatt gatcggagaa aatccagatg cgattccggg attgatgaat 1560 atcgttaaag gagatgatta cggcgattcc gccaaacgta gcgcgttgct tgcggttatg 1620 ggtttgttaa tgcaatccga taaccattgg cgtgttctcg ccgccggagc tgttccgatt 1680 cttcttgatc tgttgagatc gggggagatt agcggcggac tcacggcgga ttgtttagcg 1740 acgttggcga agctggcgga gtatcctgat gggacgattg gggtgattcg tcgtggcggt 1800 ttgaaactcg cggtgaagat tttgtcttcg tcggaggatt ctccggtggc ggtgaagcag 1860 cattgtgttg gtctgatttt gaacttgtgt cttaacggag gacgtgacgt cgttggggtt 1920 ctggtgaaga attcgttggt catggggtcg ctttacacgg tgttaagtaa cggcgaatat 1980 ggaggaagca agaaggctag tgcgctgatc agaatgatcc atgagttcca ggagaggaaa 2040 accggttcgg ttgaaccgaa tcttcaaaga ggacggttcg ttcacgcctg gtga 2094 <210> 2 <211> 2061 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 atgatccata caccaaccgg gtcgagtcgt cggattctga cctttccggc ggtgaatcca 60 tgcgaatcga tctctttaac cactctcgtc gactcacttt tacaactcgc cggcgagatt 120 cttagcttca aaccaaaaca cttctctacc aacaaaagaa gtgttaaaga aactctccga 180 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actccaagca aaacggtgta gttatgggtc aaaaggggaa gaagaaggtg 1080 gatgtggcgg agagtttagc ggcggaagaa gctggaaaac taacggcgga gtttctcgcc 1140 ggagaattga tcaagggaga cgaagaagag atggttaaag cattagtgga gattcgaatt 1200 ctcaccaaga cgagtacttt ttacagatcg tgtttagtgg aagctggagt tgttgaatcg 1260 ttgatgaaga ttcttcgttc ggatgatccg aggatccaag agaacgccat ggctgggatt 1320 atgaatttat cgaaagatat cgccggaaaa actcgaatcg tcggagaaga cggtggtgga 1380 ttaaggctaa tcgttgaggt tttaaacgat ggtgcgagaa gagagagcag acaatacgca 1440 gcagctgctc tgttttatct atcttctctc ggagattaca gcagattgat cggagaaatc 1500 tctgatgcga ttccgggatt ggtgagaatc gttaaaagtt gcgattacgg tgattcagcg 1560 aaacgcaacg cgttaatcgc gattcggagt ttgttaatga accaacctga taatcactgg 1620 cggatcctcg ccgccggaat tgttcctgtt cttctagatt tagtgaaatc ggaggagatt 1680 agcgacggag ttacggcgga ctcgatggcg attttagcga aaatggctga gtatcccgac 1740 gggatgatat cagtgctccg tcgtggggga ttaaaactcg cggtgaagat attgggttcg 1800 tcggaggttt cgccggcgac gaaacagcat tgtgttgctc tgcttttgaa tctgtgtcat 1860 aacggcggaa 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Val Asn Glu Leu Ile Asp Leu 145 150 155 160 Val Val Arg Gln Ala Arg Lys Tyr Gly Val Gln Pro Glu Thr Asn Asp 165 170 175 Lys Arg Ala Val Ser Ser Ile Asn Arg Ile Leu Ala Leu Phe Val Asn 180 185 190 Arg Val Val Pro Asp Pro Asp Glu Ile Asn Arg Ile Leu Asp His Val 195 200 205 Gly Ile Arg Lys Trp Gly Asp Cys Val Lys Glu Ile Asn Phe Leu Gly 210 215 220 Glu Glu Ile Asp Ala Glu Arg Leu Asp Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ser 225 230 235 240 Asp Gln Val Glu Leu Leu Ser Ser Leu Met Gly Phe Ile Cys Tyr Cys 245 250 255 Arg Cys Ile Ile Leu Gly Arg Ile Glu Arg Asp Asp His His Asn His 260 265 270 His Glu Asp Gly Ile Lys Lys Asp His Asp Leu Ile Arg Gly Leu Lys 275 280 285 Val Glu Asp Leu Leu Cys Pro Ile Ser Leu Glu Ile Met Thr Asp Pro 290 295 300 Val Val Ile Glu Thr Gly His Thr Tyr Asp Arg Ser Ser Ile Thr Lys 305 310 315 320 Trp Phe Gly Ser Gly Asn Ile Thr Cys Pro Ile Thr Gly Lys Ile Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Glu Leu Val Asp Asn Val Ser Val Arg Gln Val Ile Arg 340 345 350 Lys His Cys Lys Thr Asn Gly Ile Val Leu Ala Gly Ile Ser Arg Arg 355 360 365 Arg Lys Ser His Asp Asp Val Val Pro Glu Ser Leu Ala Ala Lys Gly 370 375 380 Ala Gly Lys Leu Ile Ala Lys Phe Leu Thr Ser Glu Leu Ile Asn Gly 385 390 395 400 Gly Glu Glu Met Ile Tyr Arg Ala Val Arg Glu Ile Arg Val Gln Thr 405 410 415 Lys Thr Ser Ser Phe Asn Arg Ser Cys Leu Val Lys Ala Gly Ala Val 420 425 430 Thr Pro Leu Leu Lys Leu Leu Ser Ser Val Asp Ile Arg Ile Gln Glu 435 440 445 Asn Ala Met Ala Gly Ile Leu Asn Leu Ser Lys His Val Thr Gly Lys 450 455 460 Ser Lys Ile Ala Gly Glu Gly Leu Lys Ile Leu Val Glu Ile Leu Asn 465 470 475 480 Glu Gly Ala Lys Thr Glu Thr Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Ala Leu Phe 485 490 495 Tyr Leu Ser Ser Val Glu Asp Tyr Ser Arg Leu Ile Gly Glu Asn Pro 500 505 510 Asp Ala Ile Pro Gly Leu Met Asn Ile Val Lys Gly Asp Asp Tyr Gly 515 520 525 Asp Ser Ala Lys Arg Ser Ala Leu Leu Ala Val Met Gly Leu Leu Met 530 535 540 Gln Ser Asp Asn His Trp Arg Val Leu Ala Ala Gly Ala Val Pro Ile 545 550 555 560 Leu Leu Asp Leu Leu Arg Ser Gly Glu Ile Ser Gly Gly Leu Thr Ala 565 570 575 Asp Cys Leu Ala Thr Leu Ala Lys Leu Ala Glu Tyr Pro Asp Gly Thr 580 585 590 Ile Gly Val Ile Arg Arg Gly Gly Leu Lys Leu Ala Val Lys Ile Leu 595 600 605 Ser Ser Ser Glu Asp Ser Pro Val Ala Val Lys Gln His Cys Val Gly 610 615 620 Leu Ile Leu Asn Leu Cys Leu Asn Gly Gly Arg Asp Val Val Gly Val 625 630 635 640 Leu Val Lys Asn Ser Leu Val Met Gly Ser Leu Tyr Thr Val Leu Ser 645 650 655 Asn Gly Glu Tyr Gly Gly Ser Lys Lys Ala Ser Ala Leu Ile Arg Met 660 665 670 Ile His Glu Phe Gln Glu Arg Lys Thr Gly Ser Val Glu Pro Asn Leu 675 680 685 Gln Arg Gly Arg Phe Val His Ala Trp 690 695 <210> 4 <211> 686 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 4 Met Ile His Thr Pro Thr Gly Ser Ser Arg Arg Ile Leu Thr Phe Pro 1 5 10 15 Ala Val Asn Pro Cys Glu Ser Ile Ser Leu Thr Thr Leu Val Asp Ser 20 25 30 Leu Leu Gln Leu Ala Gly Glu Ile Leu Ser Phe Lys Pro Lys His Phe 35 40 45 Ser Thr Asn Lys Arg Ser Val Lys Glu Thr Leu Arg His Val Gln Thr 50 55 60 Leu Val Ile Phe Phe Glu Glu Leu Arg Ile Gln Ile Arg Val Gly Ser 65 70 75 80 Ile Pro Ala Gly Arg Ser Val Ile Leu Ser Leu Ser Glu Leu His Val 85 90 95 Ile Phe Gln Lys Leu Lys Phe Leu Leu Asp Asp Cys Thr Arg Asp Gly 100 105 110 Ala Lys Leu Tyr Met Leu Met Asn Ser Gly Gln Val Ser Ala His Phe 115 120 125 Arg Asp Leu Thr Arg Ser Ile Ser Thr Ser Leu Asp Thr Phe Pro Val 130 135 140 Arg Ser Val Asp Leu Pro Gly Glu Val Asn Glu Leu Ile Tyr Leu Val 145 150 155 160 Met Arg Gln Thr Arg Lys Ser Glu Ala Arg Pro Asp Arg Asp Asp Lys 165 170 175 Arg Ala Ile Asp Ser Val Tyr Trp Phe Phe Asn Leu Phe Glu Asn Arg 180 185 190 Ile Asn Pro Asn Ser Asp Glu Ile Leu Arg Val Leu Asp His Ile Gly 195 200 205 Val Arg Lys Trp Arg Asp Cys Val Lys Glu Ile Asp Phe Leu Arg Glu 210 215 220 Glu Ile Ser Val Gly Lys Lys Ser Asn Ile Glu Ile Glu Leu Leu Ser 225 230 235 240 Asn Leu Met Gly Phe Ile Cys Tyr Cys Arg Cys Val Ile Leu Arg Gly 245 250 255 Ile Asp Val Asp Asp Glu Glu Lys Asp Lys Glu Glu Asp Asp Leu Met 260 265 270 Met Val Arg Ser Leu Asn Val Asp Asp Leu Arg Cys Pro Ile Ser Leu 275 280 285 Glu Ile Met Ser Asp Pro Val Val Leu Glu Ser Gly His Thr Tyr Asp 290 295 300 Arg Ser Ser Ile Thr Lys Trp Phe Ala Ser Gly Asn Ile Thr Cys Pro 305 310 315 320 Lys Thr Gly Lys Thr Leu Val Ser Thr Val Leu Val Asp Asn Phe Ser 325 330 335 Val Lys Gln Val Ile Gln Ser Tyr Ser Lys Gln Asn Gly Val Val Met 340 345 350 Gly Gln Lys Gly Lys Lys Lys Val Asp Val Ala Glu Ser Leu Ala Ala 355 360 365 Glu Glu Ala Gly Lys Leu Thr Ala Glu Phe Leu Ala Gly Glu Leu Ile 370 375 380 Lys Gly Asp Glu Glu Glu Met Val Lys Ala Leu Val Glu Ile Arg Ile 385 390 395 400 Leu Thr Lys Thr Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Cys Leu Val Glu Ala Gly 405 410 415 Val Val Glu Ser Leu Met Lys Ile Leu Arg Ser Asp Asp Pro Arg Ile 420 425 430 Gln Glu Asn Ala Met Ala Gly Ile Met Asn Leu Ser Lys Asp Ile Ala 435 440 445 Gly Lys Thr Arg Ile Val Gly Glu Asp Gly Gly Gly Leu Arg Leu Ile 450 455 460 Val Glu Val Leu Asn Asp Gly Ala Arg Arg Glu Ser Arg Gln Tyr Ala 465 470 475 480 Ala Ala Ala Leu Phe Tyr Leu Ser Ser Leu Gly Asp Tyr Ser Arg Leu 485 490 495 Ile Gly Glu Ile Ser Asp Ala Ile Pro Gly Leu Val Arg Ile Val Lys 500 505 510 Ser Cys Asp Tyr Gly Asp Ser Ala Lys Arg Asn Ala Leu Ile Ala Ile 515 520 525 Arg Ser Leu Leu Met Asn Gln Pro Asp Asn His Trp Arg Ile Leu Ala 530 535 540 Ala Gly Ile Val Pro Val Leu Leu Asp Leu Val Lys Ser Glu Glu Ile 545 550 555 560 Ser Asp Gly Val Thr Ala Asp Ser Met Ala Ile Leu Ala Lys Met Ala 565 570 575 Glu Tyr Pro Asp Gly Met Ile Ser Val Leu Arg Arg Gly Gly Leu Lys 580 585 590 Leu Ala Val Lys Ile Leu Gly Ser Ser Glu Val Ser Pro Ala Thr Lys 595 600 605 Gln His Cys Val Ala Leu Leu Leu Asn Leu Cys His Asn Gly Gly Ser 610 615 620 Asp Val Val Gly Ser Leu Ala Lys Asn Pro Ser Ile Met Gly Ser Leu 625 630 635 640 Tyr Thr Ala Ser Ser Asn Gly Glu Leu Gly Gly Gly Lys Lys Ala Ser 645 650 655 Ala Leu Ile Lys Met Ile His Glu Phe Gln Glu Arg Lys Thr Gly Pro 660 665 670 Gly Glu Pro Val Leu Glu Arg Glu Arg Phe Val His Ala Trp 675 680 685

Claims (15)

  1. 서열목록 제3서열, 제4서열 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 억제하는 핵산 분자를 포함하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 서열목록 제4서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 비생물학적 스트레스는 건조 스트레스, 저온 스트레스 및 염 스트레스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 T-DNA, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 T-DNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물로 형질전환된 비생물학적 스트레스 내성이 증진된 식물세포.
  8. 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물로 형질전환된 비생물학적 스트레스 내성이 증진된 식물체.
  9. 다음의 단계를 포함하는 비생물학적 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체를 제조하는 방법:
    (a) 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물을 식물 세포에 도입시키는 단계; 및
    (b) 상기 식물세포로부터 비생물학적 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체를 수득하는 단계.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 비생물학적 스트레스는 건조 스트레스, 저온 스트레스 및 염 스트레스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 서열목록 제3서열, 제4서열 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물체의 발아 촉진용 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물체의 발아 촉진용 조성물.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 서열목록 제4서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물체의 발아 촉진용 조성물.
  15. (a) 상기 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 발아 촉진용 조성물.
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