CN102102099B - 甘蓝型油菜BnGLABRA2启动子及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘蓝型油菜BnGLABRA2启动子及制备方法和应用，其步骤是：A、基因组步移克隆启动子序列：利用SDS裂解法提取基因组DNA，进行基因组步移，每次步移扩增两轮PCR克隆油菜。B、启动子序列生物信息学分析：将所克隆序列用BLASTN进行同源比对。启动子核心元件和上游顺式作用元件用启动子预测软件，得到启动子序列和上游启动子元件；C、全长启动子、缺失启动子的扩增以及pMD18-T-GP载体的构建：以基因组DNA为模板，根据前期得到的启动子序列，设计扩增各缺失片段的引物进行PCR扩增。一种甘蓝型油菜BnGL2基因全长启动子SEQ ID NO：1在叶片表皮毛、种子、根部、整个叶脉、中柱叶脉中的应用，操作简单，结果稳定可靠。具有生物安全性和开发应用价值。

Description

甘蓝型油菜BnGLABRA2启动子及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜BnGLABRA2启动子，还涉及油菜BnGLABRA2启动子的制备方法，同时还涉及油菜BnGLABRA2启动子在油菜基因工程中的应用。

背景技术

植物基因启动子在基因的表达调控中起着关键作用。基因的表达调控是多种因素综合作用的结果。一般按照一个事件的先后顺序，基因的调控分为转录水平的调控、翻译水平的调控以及蛋白质加工水平的调控等。基因编码的蛋白质和RNA及其次级代谢产物对于维持生物体的整个生命活动极其重要。任何基因表达调控的错误都会对生命造成严重后果。因此，对于基因表达调控的机理研究一直是分子生物学研究的热点。转录水平的调控最为重要。启动子是转录水平调控的重要元件，也是基因工程表达载体的一个重要组成部分。在某种程度上，启动子决定了基因表达的时空顺序以及表达强度。所以，研究启动子的功能序列对于基因表达调控机制以及日渐成熟的植物基因工程具有非常重要的意义。

构建能够高水平表达异源表达载体，启动子起到关键作用。它决定了外源基因的转录效率和基因的表达水平。植物转基因育种所用的启动子可分为组成型和特异型两类。组成型启动子驱动的外源基因在转基因的所有时期和组织中稳定的表达。对许多双子叶植物的转化，通常都使用含花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子或胭脂氨酸合成酶nos启动子的质粒载体，而在单子叶植物转化中最常用的是含有水稻肌动蛋白Act启动子，玉米泛素Ubi启动子及35S启动子的质粒载体(关丽英等，转基因植物中外源基因的有效表达及其安全评价首都师范大学学报2002，23(2)：52-56)。但是很多时候外源基因在受体植物中的持续高效表达不仅造成生物体内能源的浪费，而且在所有组织中的表达有可能对植株本身具有毒害作用，甚至引起转基因安全问题(Jia S-R(贾士荣).Environment andfoodbiosafty assessment of transgenic plants.Advanced of Bioengineer.1997，17(6)：37-42；Morris S H，Adley C.C.Irish public perceptions andattitudes to modern biotechnology：an overview with a focus on GM foods.Trends in Biotechnology，2001，19(2)：43-48)。因此，诱导型启动子和组织特异性启动子的研究和应用日益受到育种工作者的重视。在转基因植物中鉴定的诱导型启动子包括热激启动子，来源于菠菜硝酸还原酶的诱导型启动子等等。(关丽英等，转基因植物中外源基因的有效表达及其安全评价.首都师范大学学报.2002，23(2)：52-56)。诱导型启动子的应用也具有一定限制，对受体植物进行的外在条件处理，如热激，激素处理等可能引起生物体内一系列的生理生化反应而不利于植株的正常生长。而且化学调控系统中用作诱导物的甲基脱氢皮质醇(dex，dexamethasone)、雌二醇(estradiol)和四环素(tetracycline)都对生态环境有害，不宜用于生产实践。而使用植物体内本身的组织特异性启动子就可以避免这种问题。显然，转基因的组织特异性表达必将有效提高转基因作物的生物安全性。近年来在这方面已经取得很大成就。在不同组织特异性表达的各类启动子已不断得到研究(宋扬等，植物组织特异性启动子研究生物技术通报2007，(4)：21-24)。

油菜作为中国主要的油料作物，在长江流域广泛种植，对国计民生具有重要影响。因此提高油菜的品质，一直是科研工作者追求的目的。随着转基因技术的成熟，油菜必然会面临转基因安全风险的舆论。用不在油菜种子中表达的启动子来启动目的基因的表达是解决这个问题的一个可行方法。既可以达到提高油菜各方面品质，又不引起食用油安全风险。

因此，本实验开发了一系列甘蓝型油菜的内源启动子。通过检测报告基因GUS的表达特征证明各启动子的时空表达模式。我们的结果预示着这些启动子在转基因油菜中具有相当的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种甘蓝型油菜BnGLABRA2(简称BnGL2)启动子GP2。该启动子的时空表达模式可用于研究基因的表达形式，优点在于，来源于植物内源的组织特异性启动子能够精确定位所调控的基因，可应用于植物基因工程研究及籽用油菜安全转基因研究。

本发明的另一个目的是在于提供了一种甘蓝型油菜GL2启动子GP2的制备方法。该方法通过对功能区进行适当的缺失以及检测所调控的GUS基因活性部位来验证启动子的功能元件。其优点在于操作简单，结果稳定可靠。

本发明的再一个目的是在于提供了一种甘蓝型油菜BnGL2基因全长启动子SEQ ID NO：1在叶片表皮毛以及种子中的应用；一种甘蓝型油菜BnGL2基因部分缺失启动子SEQ ID NO：1(1555～2882)在根部以及整个叶脉中的应用；一种甘蓝型油菜BnGL2基因全长启动子SEQ ID NO：1(2098～2882)在叶片表皮毛以及中柱叶脉中的应用。全长启动子GP2的表达模式能够反映油菜GL2基因的功能，即在发育过程中具有重要功能；缺失启动子GP2C和GP2D因所调控的GUS基因表达组织各有特点，而且均不在种子中表达，可以用于籽用油菜转基因研究和育种应用，优点是具有生物安全性和开发应用价值。

为了完成上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种甘蓝型油菜GL2启动子GP2的制备方法，其步骤是：

1、基因组步移克隆启动子序列：

利用SDS裂解法提取基因组DNA，按照基因组步移试剂盒(购自Clontech公司)操作程序，进行基因组步移，每次步移扩增两轮PCR克隆油菜。具体步骤为：提取基因组DNA 25μL(0.1μg/μL)，分别用核酸内切酶Dra I、EcoR I、Pvu II和Stu I酶切，纯化后加入接头形成四个不同的基因组DNA库，用作首次基因组步移第一轮PCR模板，根据目的基因保守序列设计特异性引物GSP1(表1)与试剂盒内上游接头引物AP1(表1)进行扩增。第二轮PCR以第一轮PCR产物的50倍稀释液(水稀释液)为模板，同样方法设计的特异性引物GSP2和接头引物AP2(表1)进行扩增，随后进行第二轮基因组步移。所有PCR反应均为50μL扩增体系：模板1μL，dNTPs 0.2mM，引物0.5mM，LA Taq酶1.25单位，10×LA-PCR buffer(含MgCl₂)5μL，补水至50μL。反应条件均为：94℃预变性1min；98℃10s，72℃6min7个循环；98℃10s，67℃6min 33个循环；72延伸10min。PCR产物经1.0％(质量体积比，以下相同)琼脂糖凝胶电泳检测，Ge1 Extraction Kit(购自天根生化科技北京有限公司)纯化回收后，连接到pMD18-T载体(购自TaKaRa公司)，转化gold(购自大连宝生物生物制品公司)感受态细胞，挑取阳性克隆，酶切验证后测序，得到目的基因上游的侧翼序列。

2、启动子序列生物信息学分析：

将所克隆序列用BLASTN(http://www..ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行同源比对。启动子核心元件和上游顺式作用元件用启动子预测软件http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.btml和PLACE(Higo et al.，Plant cis-acting regulatory DNA elements(PLACE)database(J).NucleicAcids Research.1999，27：297～300)http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/进行预测。得到可能的核心启动子序列和上游启动子元件。

3、全长启动子、缺失启动子的扩增以及pMD18-T-GP载体的构建：

以基因组DNA为模板，根据前期得到的启动子序列，设计扩增各缺失片段的引物进行PCR扩增。所有引物的5′端含有Hind III酶切位点，3′端含有Xba I酶切位点。反应体系为25μL内含：1×PCR buffer.，MgCI 1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L(毫摩尔每升)、引物浓度为0.5mol/L，Pfu酶1.5单位，模板约100ng，根据具体情况设置循环参数。PCR产物1.0％(质量体积比，以下相同))琼脂糖凝胶检测，回收试剂盒回收各目的缺失片段。按各回收的缺失片段∶载体(0.3pmol缺失片段∶0.1pmol载体片段)＝3∶1的比例混合样品，加入T4DNA连接酶5单位，1×反应缓冲液，无菌水补充体积至25ml，16℃过夜连接反应。冻融法转化大肠杆菌gold菌(前面已述)感受态细胞(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社，96-99页)。涂布于含有Amp的LB固体平板上，37℃培养过夜，各挑选白斑三个，做菌落PCR检测，将阳性重组子接种于含Amp 50μg/mL的液体LB培养基，37℃200r/min振荡培养过夜，小量碱法提取质粒(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社)，Hind III/Xba I酶切质粒1μg，0.8％(质量体积比)琼脂糖凝胶检测。检测正确的阳性重组克隆，分别命名为pMD18-X(将目的片段连入pMD18-T载体构建而成，以下相同)(X可为1、2、3、4、5等)，为了确保载体中各启动子的序列信息，分别以M13F/M13R为引物(M13 R5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’；M13R5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’)，将pMD18-X(前面已述)进行序列测定，分析结果，一种分离的启动子，得到了一种甘蓝型油菜BnGL2基因全长启动子SEQ ID NO：1。

4、植物表达载体的构建和根癌农杆菌菌株EHA105(购于上海沪尚生物科技有限公司以下相同)的转化：

构建的重组载体是将质粒pBI121(购于大连宝生物工程有限公司以下相同)上的35S启动子用前期克隆得到的目的基因的启动子片段替换而来。为完成此目的，首先用Xba I/Hind III双酶切克隆载体pMD18-X(前面已述)的启动子片段，同时用Xba I/Hind III酶切pBI121(前面已述)质粒。酶切反应在37度培养箱中进行，约4-6个小时之后，用1％琼脂糖胶电泳检测。将克隆载体上切下的小片段和pBI121(前面已述)上切下的大片段用DNA凝胶回收试剂盒回收。按各pMD18-X(前面已述)上的启动子片段片段∶pBI121(前面已述)载体(150ng缺失片段、50ng载体片段)＝3∶1的比例(摩尔浓度比)混合样品，加入T4 DNA连接酶5单位，10×反应缓冲液，无菌水补充体积至20μL，16℃连接过夜。转化后，在Kan平板上筛选，挑斑做菌落PCR，以及提质粒，酶切验证正确的重组质粒命名为pBI121-X.然后利用冻融法将pBI121-X(前面已述)和pBI121(阳性对照)转入根癌农杆菌EHA105(前面已述)，Km+Rif抗性平板筛选，挑斑，菌落PCR检测验证。

5、拟南芥的遗传转化及转基因植株筛选：

参照文献中的方法进行拟南芥转化(Zhang X.R.et al.Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using thefloral dip method.Nature，2006，1：1-6)。制备含有构建好的载体的根癌农杆菌EHA105(购自大连宝生物生物制品公司)菌液，在转化前一天转入含有卡那霉素50μg/ml、利福平50μg/ml的LB大瓶培养基中，28℃过夜培养。第二天，当菌液浓度为1.6-2.0之间时取出。4000g室温(20-25℃以下相同)离心10min，弃上清，沉淀悬浮于等体积的5％(质量体积比，以下相同)蔗糖中。将浑浊的蔗糖溶液倒入一大培养皿中，转化前加入终浓度为0.02％(体积比)的Silwet 1-77。混匀后把待转化的拟南芥的整个花序轻轻的浸没在蔗糖中，默数15s，取出植株。同一个载体用一个黑色塑料袋包好，放在生长箱培养。第二天将塑料袋揭开，放在光强的地方培养。隔一周再做一次转化。培养一个月左右收获种子，在培养箱或者日光下干燥3-5天。将转化收获的T0代种子用70％(体积比)酒精和0.01％(体积比)的升汞表面消毒后用蒸馏水洗涤数次(5～7次)，然后均匀地吹打到1/2MS(3％蔗糖，0.8％琼脂，pH 5.8，大量元素减半，其余营养成分与MS培养基相同)固体筛选培养基表面。4℃春化4-6天，放入恒温培养箱培养。根据表达载体上所特有的卡那霉素抗性筛选阳性苗。叶片长到足够大小时，取少许绿苗叶片进行PCR阳性检测。

所用试剂配方如下：

(1)LB液体培养基：

分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠依次溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中，121℃，6.859×104Pa下高压消毒15分钟。4℃冷藏备用。

(2)LB固体培养基：

分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，8克琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中，121℃，6.859×104Pa下高压消毒15分钟。4℃冷藏备用。

(3)1/2MS固体筛选培养基：

硝酸铵(NH₄NO₃)                                1.65g

硝酸钾                                        1.9g

磷酸二氢钾                                    0.17g

硫酸镁                                        0.37g

氯化钙                                        0.44g

蔗糖                                          30g

琼脂                                          8g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8，煮沸(100℃)并定容至1000ml，分装到500ml三角瓶(250ml/瓶)，封口灭菌。

6、启动子功能分析：

用GL2基因启动子GP2替换pBI121(前面已述)质粒上的35S启动子序列，形成pBI121-GP2(前面已述)重组植物表达载体，其中的GUS基因受BnGL2启动子的调控。利用根癌农杆菌EHA105(前面已述)介导的花序侵染法转化拟南芥。T1代利用卡那霉素抗性和PCR检测筛选得到阳性植株。

将PCR验证是阳性的T1代转基因植株种子在1/2MS(前面已述)培养基上播种，4℃春化后在生长箱中萌发，出苗后5-7天开始取样染色。染色过程如下：将样品浸泡在GUS染液(X-gluc 0.5mg/mL，磷酸缓冲液50mmol/L，铁氰化钾和亚铁氰化钾各0.5mmol/L，EDTA 10mmol/L，Triton-x-100 0.001％(体积比)，甲醇20％(体积比)真空抽气5分钟，37℃过夜。第二天用酒精-乙酸(体积比为1∶1)进行脱色，直至叶片变白，之后用蒸馏水漂洗数次(5～7次)，体式显微镜(OLYMPUS SZX16)拍照。苗期取不同时间段的整个植株；生殖生长期，叶片取嫩叶和成熟叶片；花取开过的花朵和未开的花蕾的花序；角果取不同时期的角果；种子去开花后10天左右的种子。植株被染成蓝色的部位就是GUS基因表达的部位。通过检测不同时空下GUS基因的表达部位和表达强度来探索各目的启动子的时空表达模式，从而分析调空基因在特定部位表达的功能作用元件。

T2代转基因植株GUS组织化学染色结果表明，油菜BnGL2启动子具有如下生物学功能：全长启动子GP2在不同组织中均有表达，在叶片表皮毛和开花后10天左右的种子中表达量最高(图5，GP2)。这就预示着在BnGL2全长启动子的启动下，基因主要在毛状体发育和种子成熟过程中发挥作用。缺失启动子GP2C(1555～2882)能调控GUS基因主要在苗期根部和叶脉中活跃表达，而在种子中没有表达(图5GP2C)，因此推断该启动子主要参与根的发育和营养输送的功能。缺失启动子GP2D能调控GUS基因在中柱叶脉和幼嫩的叶片表皮毛中表达(图5GP2D)，但在种子中没有检测到GU基因的活性(图5GP2D)，因此GP2D(2098～2882)启动的基因主要在输送营养和表皮毛发育中扮演角色。也就是说GP2 D启动的基因的功能在输送营养和表皮毛发育中扮演主要角色。

一种甘蓝型油菜BnGL2基因全长启动子SEQ ID NO：1在叶片表皮毛以及种子中功能性表达的应用过程是：利用基因组步移法克隆得到甘蓝型油菜GL2基因的5′上游序列，经启动子核心元件和上游顺式作用元件用启动子预测软件http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html和PLACE(Higo et al.，Plant cis-acting regulatory DNA elements(PLACE)database(J).NucleicAcids Research.1999，27：297～300)http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/进行预测。得到可能的核心启动子序列和上游启动子元件。根据分析预测结果，确定BnGL2启动子序列长度。构建由该启动子调控的报告基因GUS的植物表达载体pBI121-GP2(前面已述)。采用农杆菌EHA105介导的花期侵染法转化拟南芥(前面已述)T1代在加有卡那霉素的1/2MS(前面已述)培养基上初步筛选转基因植株，待生长到一定阶段(播种后一个月)进行PCR检测，利用分子手段鉴定阳性株。T2代选择多个转基因株系进行GUS染色。GUS组织化学法染色表明，BnGL2调控下的GUS基因具有一定时空表达特性，主要在拟南芥的幼嫩组织中表达，如幼嫩叶片的早期表皮毛以及开花后10天左右的种子。这说明GL2全长启动子具有驱动下游报告基因GUS在受体植物中表达(图5)的功能。在该启动子的调控下，GUS基因能够主要在转基因植株的幼嫩组织如根尖、叶原基、发育早期的表皮毛以及开花后10天左右的种子中精细表达。

一种甘蓝型油菜BnGL2基因部分缺失启动子SEQ ID NO：1(2098～2882)在根部以及整个叶脉中的应用过程是：BnGL2启动子的缺失序列(2098～2882)片段是以连有GLABRA2全长启动子的pMD18-T-GP2(前面已述)载体为模板，依据BnGL2启动子序列设计特异性引物进行PCR扩增获得，命名为GP2C。将GP2C与报告基因GUS相连构建植物表达载体pBI121-GP2C。用同样方法转化拟南芥，筛选转基因植株。T2代取不同发育时期不同组织进行GUS组织化学染色。GUS染色结果表明，BnGP2C启动子调控制下的GUS基因在根部的整个细胞高水平表达；在早期的所有叶脉中表达也较为强烈；但是在种子的整个成熟时期都没有表达。这说明BnGP2C启动子具有启动下游基因在根和早期叶脉等非种子组织中表达的功能(图5)，可以运用于转基因安全(食用性安全)。

一种甘蓝型油菜BnGL2基因部分缺失启动子SEQ ID NO：1(1555～2882)在叶片表皮毛以及中柱叶脉中的应用过程是：BnGL2启动子的缺失序列(1555～2882)片段是以连有GLABRA2全长启动子的(前面已述)18-T-GP2载体为模板，依据BnGLABRA2启动子序列设计特异性引物进行PCR扩增获得，命名为GP2D。将GP2D与报告基因GUS相连构建植物表达载体pBI121-GP2D(前面已述)。用同样方法转化拟南芥，筛选转基因植株。T2代取不同发育时期不同组织进行GUS组织化学染色。结果显示，BnGP2D调控下的GUS基因的表达部位以及强度又表现出它特有的形式：主要在幼嫩的叶片表皮毛以及中柱叶脉中表达，这说明BnGP2D启动子具有启动下游基因在幼嫩的叶片表皮毛以及中柱叶脉等中非种子组织中表达的功能(图5)，可以运用于转基因安全(食用性安全)。

本发明的优点：

1 所提供的启动子克隆方法能够通过对GUS基因的调控和组化分析，获得具有组织特异性表达功能的油菜启动子。

2 克隆到油菜来源的GL2基因的启动子GP2，并人工构建了两个组织特异性启动子GP2C和GP2D。从油菜食用油安全性来考虑，这三种启动子具有应用潜力。GP2C在根部的表达强度启示申请人可以用此启动子来代替CaMV35S强启动子来启动与根发育相关的基因的表达，而不引起油菜转基因食用安全问题。而GP2D和GP2启动子在叶脉中的表达也就预示着它们可调控与营养输送相关的基因的功能分析，从而达到改良油菜品质目的，而又不存在食用油安全风险。

3 克隆得到的甘蓝型油菜GL2基因的启动子能调控基因在油菜的毛状体发育中起作用。

4 人工构建得到油菜GL2缺失型启动子，带有2098～2882区段的启动子GP2C包含多个在根部和叶脉强烈表达的顺式作用元件；带有1555～2071区段的启动子GP2D有调控基因在叶片表皮毛中表达的应答元件。

附图说明

图1为一种基因组步移扩增BnGL2启动子GP2片段电泳图

GL2A和GL2B是步移得到的两个不同的BnGLABRA2基因上游序列

图2为一种油菜BnGL2启动子的PCR扩增及重组载体pBI121-GP的酶切鉴定图

A图：PCR扩增GP2C、GP2D、GP2片段电泳图

B图：用Apa I/Hind III双酶切重组载体鉴定图

图3为一种转基因植株PCR阳性鉴定图

M：DL2000 marker；1：pBI121-GP2D阳性质粒；2、7、12：野生型拟南芥；3-5：pBI121-GP2D阳性株；6：pBI121-GP2阳性质粒；8-10：pBI121-GP2阳性株；11：pBI121-GP2C阳性质粒；13-14：pBI121-GP2C阳性株。

图4为一种BnGL2启动子序列生物信息学分析结果

双实线：TATA-box；单实线：CAAT-box；黑三角：可能的TSS位点；黑箭头：翻译起始位点；黑框：G-box；灰框：叶肉细胞组织特异性基因表达的顺式作用元件.双波浪线：种子中受赤霉素调控的蛋白激酶表达的应答元件。单波浪线：远距离调控启动子活性的应答元件。虚框：在根特异性表达的应答元件。此外，用PLACE软件分析发现在正负链上有1份生长素应答元件，20多份MYB结合位点，1份茉莉酸(SA)诱导的应答元件，13份光诱导和组织特异性表达的应答元件，26份MYB、BZIP、BHLH转录因子的结合位点。所有编号参照翻译起始位点。

图5为一种GUS组织化学染色结果

GUS组织化学染色结果A：子叶期；B：真叶萌发期：C：第一对真叶生长期；D：第二对真叶生长期；E：轮座期；F：开花后10天左右的种子。

具体实施方式

实施例1.：

一种油菜BnGL2启动子的制备步骤是：

1、油菜BnGL2基因启动子GL2B的克隆：

利用SDS裂解法提取甘蓝型油菜DNA(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译 分子克隆试验指南(第三版)科学出版社)，按照基因组步移试剂盒(购于Clontech公司)操作程序，进行两次基因组步移，每次步移扩增两轮PCR克隆油菜GL2基因启动子GL2B(2882bp)。两次步移所用引物如下表。

表1基因组步移克隆甘蓝型油菜GL2基因启动子GP2所用引物

2、油菜GL2启动子GL2B序列的生物信息学分析：

利用BLASTN比对拟南芥GL2基因启动子序列(约2Kb)(GenBank登录号：NM_106633)和油菜GL2基因的启动子GL2B序列，发现二者同源性很低，只有四个片段一致性在90％左右。通过在线软件

http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html预测发现其中起始密码子上游2.2Kb的序列已具有启动子的基本特征。包含有预测到的可能的转录起始位点，通过PLACE软件预测分析的可能的核心启动子元件和顺式作用元件。预测结果还发现其正负链上有多处光、茉莉酸(SA)诱导和组织特异性表达的应答元件，存在26个MYB、BZIP、BHLH(Higo et al.，Plant cis-acting regulatory DNAelements(PLACE)database(J).Nucleic Acids Research.1999，27：297～300)转录因子的结合位点。因此本发明以此2.2Kb的序列，将其命名为GP2，作为GL2基因全长启动子GP2进行功能和应用研究。

3、油菜GL2基因启动子全长和缺失片段(GP2和GP2C、GP2D)的扩增和pMD18-T-GP2(前面已述)和pMD18-T-GP2C(前面已述)、pMD18-T-GP2D(前面已述)载体的构建：

根据前期克隆得到的序列信息，设计扩增全长和缺失的引物(加入Xba I和Hind III酶切位点)，以油菜基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应为25μL体系：1×PCR buffer，MgCI 2.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L、引物浓度为0.5mol/L，Pfu酶1.5单位，模板约100ng，补ddH₂O至25uL。反应条件：95℃预变性5min，94℃45s，55℃45s，72℃3min扩增33个循环，72℃延伸10min。

表2  全长启动子和缺失启动子片段模式和引物设计

按照操作程序中的方法用将回收的各启动子片段与pMD18-T(前面已述)载体按照(0.3pmol缺失片段∶0.1pmol载体片段)＝3∶1的比例进行连接反应。冻融法转化大肠杆菌(前面已述)gold(前面已述)感受态细胞中。涂布于含有氨苄青霉素50mg/L(质量体积比，下面相同)的LB固体平板上，37℃培养过夜。小量碱法提取质粒(前面已述)，Hind III/Xba I酶切质粒1μg，1％琼脂糖凝胶检测。检测正确的阳性重组克隆，将pMD18-GP2(前面已述)和pMD18-GP2X(前面已述)进行序列测定，分析结果。一种分离的启动子，其序列为SEQ ID NO：1所示的基因启动子。

4、油菜GL2基因启动子GP2各片段重组表达载体的构建及根癌农杆菌转化：

用Xba I/Hind III双酶切连接有GL2启动子GP2的pMD18-GP2(前面已述)和pBI121(前面已述)质粒。凝胶回收酶切下来的各个启动子片段和pBI121(前面已述)片段，T4DNA连接酶16℃过夜连接这两个片段，构建成植物表达载体pBI121-GP2(前面已述)和pBI121-GP2X(X代表A-D)(前面已述)。最后用冻融法将该载体转入根癌农杆菌EHA105(前面已述)，卡那霉素(50mg/L)和利福平(50mg/L，质量体积比，下面相同)抗性平板上挑选阳性克隆后，酶切验证。

5、拟南芥转化及PCR检测：

按照上述文献(Zhang X R.et al.Agrobacterium-mediated transformationof Arabidopsis thaliana using the floral dip method.Nature，2006，1：1-6)中转化方法转化拟南芥。根据转基因植株所特有的卡那霉素抗性在1/2MS(前面已述)培养基上为绿苗的初步认为是阳性苗。待叶片长到足够大时取少许做PCR阳性鉴定。结果表明在三个表达载体已经成功转入拟南芥。pBI121-GP2(前面已述)、pBI121-GP2C(前面已述)、pBI121-GP2D(前面已述)分别得到6、5、10株阳性苗。

所用试剂配方如下：

(1)LB液体培养基：

分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠依次溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中，121℃，6.859×104Pa下高压消毒15分钟。4℃冷藏备用。

(2)LB固体培养基：

分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，8克琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中，121℃，6.859×104Pa下高压消毒15分钟。4℃冷藏备用。

(3)1/2MS固体筛选培养基：

硝酸铵(NH₄NO₃)                                1.65g

硝酸钾                  1.9g

磷酸二氢钾              0.17g

硫酸镁                  0.37g

氯化钙                  0.44g

蔗糖                    30g

琼脂                    8g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8，煮沸(100℃)并定容至1000ml，分装到500ml三角瓶(250ml/瓶)，封口灭菌。

6、油菜GL2基因启动子功能分析：

本发明首次克隆得到甘蓝型油菜GLABRA2基因的启动子GP2序列，并对其进行一系列缺失片段进行功能分析。

从实施案例1.5中筛选得到阳性苗T1代，自交收获种子(即T2代)。T2代取多个株系的不同时期组织进行GUS染色。染色过程如下：将样品浸泡在GUS染液(X-gluc 0.5mg/mL，磷酸缓冲液50mmol/L，铁氰化钾和亚铁氰化钾各0.5mmol/L，EDTA 10mmol/L，Triton-x-1000.001％，甲醇20％(体积比)真空抽气5分钟，37℃过夜。第二天用酒精-乙酸(体积比为1∶1)进行脱色，直至叶片变白，之后用蒸馏水漂洗数次，体式显微镜(OLYMPUS SZX16)拍照。苗期取不同时间段的整个植株；生殖生长期，叶片取嫩叶和成熟叶片；花取开过的花朵和未开的花蕾的花序；角果取不同时期的角果；种子去开花后10天左右的种子。植株被染成蓝色的部位就是GUS基因表达的部位。

染色结果发现，三个启动子序列都可以启动GUS基因的表达，并呈现出不同的组织偏好性。全长启动子GP2在整个生长时期都具有GUS活性。主要集中在拟南芥的幼嫩组织中表达。如早期的子叶、叶原基、叶片、根尖、茎以及开花后10天左右的种子中都有不同程度的GUS活性(表三)。缺失启动子GP2C中包含GL2基因5′上游序列近800bp的序列，GUS染色表明该序列也可以启动GUS基因表达。表达的部位重要在苗期的整个根部组织，其强度等同于阳性对照35S启动子调控下的GUS基因的表达。另外在幼嫩的子叶、真叶的叶脉中也有较强表达，但随植株发育成熟，在成熟的叶片以及其他组织中中不再检测到GUS的活性(表四)。缺失启动子GP2D中包含了GL2基因5′上游序列近1.4Kb的序列。在此片段的调控下GUS基因在苗期的子叶、真叶、根部同样有GUS表达，而且种子中也没有检测到GUS的活性(表五)。但是与GP2C的表达情况相比，GP2D在根部的表达更为精细，后者主要集中在根尖表达，而且在叶脉中的表达也只集中在中柱叶脉。

实验结果表明，油菜BnGL2启动子具有如下生物学功能：全长启动子GP2在不同组织中均有表达，在叶片表皮毛和开花后10天左右的种子中表达量最高(图5，GP2；表三)。这就预示着在BnGL2全长启动子的启动下，基因主要在毛状体发育和种子成熟过程中发挥作用。而在缺失启动子GP2C调控下GUS基因主要活跃在苗期根部和叶脉中，而在种子中没有表达(图5 GP2C，表四)。因此推断该启动子的调控下的基因主要参与根的发育和营养输送的功能。GP2D启动子调控下的GUS基因主要在中柱叶脉和幼嫩的叶片表皮毛中表达，但在种子中没有检测到GUS基因的活性(图5 GP2D，表五)，因此GP2D启动的基因的功能主要在输送营养和表皮毛发育中扮演角色。

本发明首次克隆得到甘蓝型油菜BnGL2基因的启动子GP2序列，并对其进行一系列缺失片段进行功能分析。申请人感兴趣的是GP2、缺失片段GP2C、缺失片段GP2D这三个启动子的表达差异，尤其是缺失启动子GP2C和GP2D的转基因植株在种子的整个发育时期都没有检测到活性。

表三、GL2全产启动子GP2转基因T2代株系的GUS染色统计表

表四、GL2部分全产启动子GP2C转基因T2代株系的GUS染色统计表

表五、GL2部分全产启动子GP2D转基因T2代株系的GUS染色统计表

一种甘蓝型油菜BnGL2基因全长启动子SEQ ID NO：1在叶片表皮毛和种子中的应用。利用基因组步移法克隆得到甘蓝型油菜GL2基因的5′上游序列。具体步骤为：提取基因组DNA 25μL(0.1μg/μL)，分别用核酸内切酶Dra I、EcoR I、Pvu II和Stu I酶切，纯化后加入接头形成四个不同的基因组DNA库，用作首次基因组步移第一轮PCR模板，根据目的基因保守序列设计特异性引物GSP1(表1)与试剂盒内上游接头引物AP1(表1)进行扩增。第二轮PCR以第一轮PCR产物的50倍稀释液(水稀释液)为模板，同样方法设计的特异性引物GSP2和接头引物AP2(表1)进行扩增，随后进行第二轮基因组步移。所有PCR反应均为50μL扩增体系：模板1μL，dNTPs 0.2mM，引物0.5mM，LA Taq酶1.25单位，10×LA-PCR buffer(含MgCl₂)5μL，补水至50μL。反应条件均为：94℃预变性1min；98℃10s，72℃6min 7个循环；98℃10s，67℃ 6min 33个循环；72延伸10min。PCR产物经1.0％(质量体积比)琼脂糖凝胶电泳检测，GelExtraction Kit(购自天根生化科技北京有限公司)纯化回收后，连接到pMD18-T载体(前面已述)，转化gold(前面已述)感受态细胞，挑取阳性克隆，酶切验证后测序，得到目的基因上游的侧翼序列。经启动子核心元件和上游顺式作用元件用启动子预测软件http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html和PLACE(Higo et al.，Plant cis-acting regulatory DNA elements(PLACE)database(J).Nucleic Acids Research.1999，27：297～300)http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/进行预测。得到可能的核心启动子序列和上游启动子元件。分析预测结果，确定BnGLABRA2启动子序列长度(2.2Kb)。用GL2基因启动子GP2替换pBI121(前面已述)质粒上的35S启动子序列，形成pBI121-GP2(前面已述)重组植物表达载体，其中的GUS基因受BnGLABRA2启动子的调控。具体构建流程为：用Xba I/Hind III双酶切连接有GL2启动子GP2的pMD18-T-GP2(前面已述)和pBI121(前面已述)质粒。凝胶回收酶切下来的各个启动子片段和pBI121片段，T4 DNA连接酶16℃过夜连接这两个片段，构建成植物表达载体pBI121-GP2和pBI121-GP2X(X代表A-D)。最后用冻融法将该载体转入根瘤农杆菌EHA105(前面已述)，卡那霉素(50mg/L)和利福平(50mg/L)抗性平板上挑选阳性克隆后，酶切验证。然后利用根癌农杆菌EHA105(前面已述)介导的花序侵染法转化拟南芥。T1代利用卡那霉素抗性和PCR检测筛选得到阳性苗。T2代取三个株系的不同时期组织进行GUS组织化学法染色染色。染色结果表明在BnGLABRA2启动子的调控下，全长启动子GP2在不同组织中均有表达，在叶片表皮毛和开花后10天左右的种子中表达量最高(图5，GP2；表三)。这就预示着在BnGLABRA2全长启动子的启动子，基因主要在毛状体发育和种子成熟过程中发挥作用。GUS基因的表达部位和表达水平都呈现出有规律的变化。GUS基因偏好在转基因植株的幼嫩组织中表达。如苗期的子叶、幼嫩的叶原基。叶片早期的表皮毛、根尖等部位。其时空表达模式基本与拟南芥GLABRA2基因保持一致。

一种甘蓝型油菜BnGL2基因部分缺失启动子SEQ ID NO：1(1555～2882)在根部和整个叶脉中的应用。BnGL2启动子的缺失序列(1555～288)片段(GP2C)的获得是根据BnGL2的序列信息，设计扩增全长和缺失的引物(表2GP2C)，以油菜基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应为25μL体系：1×PCR buffer，MgCI2.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L、引物浓度为0.5mol/L，Pfu酶1.5单位，模板约100ng，补ddH₂O至25uL。反应条件：95℃预变性5min，94℃45s，55℃45s，72℃3min扩增33个循环，72℃延伸10min。pBI121-GP2C(前面已述)植物表达载体的构建方法与pBI121-GP2的方法相同。然后采用用同样方法转化拟南芥，筛选转基因植株。T2代取不同发育时期不同组织进行GUS组织化学染色。在缺失启动子GP2C调控下GUS基因主要活跃在苗期根部和叶脉中，而在种子中没有表达(图5GP2C，表四)。因此推断该启动子的调控下的基因主要参与根的发育和营养输送的功能。

一种甘蓝型油菜BnGL2基因部分缺失启动子SEQ ID NO：1(2098～2882)在叶片表皮毛和中柱叶脉中的应用。BnGL2启动子的缺失序列(2098～2882)片段(GP2D)的获得是根据BnGL2的序列信息，设计扩增全长和缺失的引物(表2GP2D)，以油菜基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应为25μL体系：1×PCRbuffer，MgCI 2.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L、引物浓度为0.5mol/L，Pfu酶1.5单位，模板约100ng，补ddH₂O至25uL。反应条件：95℃预变性5min，94℃45s，55℃45s，72℃3min扩增33个循环，72℃延伸10min。pBI121-GP2C(前面已述)植物表达载体的构建方法与pBI121-GP2的方法相同。然后采用同样方法转化拟南芥，筛选转基因植株。T2代取不同发育时期不同组织进行GUS组织化学染色。染色结果表明，GP2D启动子调控下的GUS基因主要在中柱叶脉和幼嫩的叶片表皮毛中表达，但在种子中没有检测到GUS基因的活性(图5GP2D，表五)，因此GP2D启动的基因的功能主要在输送营养和表皮毛发育中扮演重要角色。

序列表

<110>中国农科院油料作物研究所

<120>甘蓝型油菜BnGLABRA2启动子及制备方法和应用

<130>甘监型油菜BnGLABRA2启动子及制备方法和应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2885

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜BnGLABRA2启动子全长

<400>1

tctcctatga caccattctc tccttacacg tttgaacact cagtgtcaca tttgcataac  60

acgtttgctt tagtgtgaga acatattttg gcgggtcaat tctctttatg gattgtagta  120

atttgtaagg atgtaaataa aaaggatggt cagttgttaa aaccagaaaa aatatagcca  180

gttgcatgaa ccaagctaga tgtttgtatt aattggttcg gtaggcccta cgcacacttc  240

caaagttcgt tgttttcttt cgccctgaat aaagaaaacc ccccaaaaaa aacggactgc  300

ctttggagtt tgccaacatg tgtaagagat ttatcgtgga aagggaaact tttacccaaa  360

atcctaagta gtaattgaaa gtaatacaga gaggatacag atatagatag gttaggcatt  420

aattaactaa agagaatgtg gtaaacgtaa atgttatggt tgcttccctc tattatacat  480

ttgctatcta tctacctttc ctaactaaca attcaatcgg ccgtacgact aacaaagaga  540

atagtagagg aagaaaatat gaattaatct gatgaaagct tttgataatt gcttctccat  600

cttaattgcc actacacatt ctctctctat atgtatatat aaattaatgt aattaataat  660

taacacctta aacagtttcc ttccctacac cttcctctat taacgtacgt ataggggttt  720

catttacgta cgtactctac tttgtttgaa cgatggttac aataacatat atatacgcaa  780

gtaacaacct gtgcgatatg tcatggatgt cgcatatccc ctatatatta atgtttaaac  840

tgtacaaatc tttccgtttt atataataag ataatcaaat taacatgtca agtagatcac  900

atgcatgtac ttagggggcg ttgtacatat atactccctc tgttatcgaa agtatgattt  960

tttaaaatgt tcacgcttat taataattca ataaatgttt aatatttaat ttttttttta  1020

ctttattata cacttttcaa taacttttca ccaatgaaat ttaatcaatt caaatttttt  1080

tcatttaatg tttcttaaaa gtataaaaag tactttaaac atatgaaaaa tatatctttg  1140

tggaacaaat aaaaaatcta aaacatctta atttcggaaa cggagtgagt atatattata    1200

atatatagag agagagagaa tgaaagatga tgatgtagag tatcatatgt aggtctaggt    1260

gcatggtgat taagtaataa agagaggctg aaggaaatgg aaaggggttg gaggcaaacc    1320

cattaagagc attcatttcc ttttaaggtc actgaaacta atgagtaacg atccgtcaat    1380

gccctctctc cctctcgttg accacccaaa ataaccccaa gttatctttc ccttgcaaat    1440

tgtatgtccc tgctcacgtc atcgttgacc acccaaaata accccaagtt atctttccct    1500

tgcaaattgt atgtccctgc tcacgtcatc tattattctt ttagctttca acaactcttc    1560

tccggccttc acaattaatt attagctact cctaattact agtactattg tttattacgg    1620

agtactatac actgcttgac tctacaagca tgtaattttg ggattcaggg aatatttatt    1680

agcattatta taattaagtt acagagcaca aggcatttaa ggtttccatg taagtactct    1740

gatactatta tcctgttctc tctaccaatg tttttttcat tttcctatgc tcacgcaatt    1800

acttgtttta tagttgcacc caagttttta tattgatatg tttttagaac aaaaatagag    1860

atgtaatgtt gcattctgta tacgcaagat tcttggatgt tgtttgaaag aagatgtcat    1920

attaatagat agtacatatt ataaatccta taactattac aatatctcta ataaagaaaa    1980

agaagtcata atattaggag taatgatggt aattaaggag gaaagaagaa agcagaaaaa    2040

gcggttggaa aattaggtgc ttaaaattag ttgagtctat cccagtatct aacagtcaac    2100

tctctctctc tctctctctt tacctagcta ttattattat ttttatttta aaacaatgac    2160

ctgacatatg catatgtctt ttctctctct actctctaca catgtaattc aattcaatta    2220

aagaagagac agagaagttc gtctttgttt gtataccctt aaatcatgca accccttatt    2280

ctcattccta ctccctgtct acagtaattt atatgaactt aattatgtag tttaaaccga    2340

ttaacttcat gagtaatggc aaacttatgt tcaaatacct aattttcaat cgtttgtgcg    2400

gtgcagaaat aatttgaaca ttttgttaac attttttttt gtttttttgt taacaaaatt    2460

aaatctgtat aggaacggat attttccaaa tccacaaccg aatttctcat acgaacatgt    2520

ctaatattta ttttttgaaa ataatctaca tcaatggctg cagtgatgta taagctggcc    2580

atgttttaaa gtaatcaagt gtgataattg taaactaaat ggtgagtata tatatgcata    2640

tgtatataac cagaaagaaa gggttaaatt ataattaaac gaagcaccta aaaggcaagc    2700

aatagagaaa tatctgaaaa acgaccgttt atataattgg aatatatata gccttatctg    2760

tatatgtaat ataagagtac attttggtat aaaataataa atagagacaa taaatataga    2820

gattaatata aatagaagga aggaggagag ggaagataaa gcaaattaag atttcggagc    2880

gtatg                                                                2885

Claims (5)

1.一种分离的启动子，其序列为SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述启动子在拟南芥根部上调下游目的基因的表达中的应用。

3.权利要求1所述启动子在拟南芥整个叶脉上调下游目的基因的表达中的应用。

4.权利要求1所述启动子在拟南芥叶片表皮毛上调下游目的基因的表达中的应用。

5.权利要求1所述启动子在拟南芥中柱叶脉上调下游目的基因的表达中的应用。

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